CN104152447A

CN104152447A - 一种snp分子标记及hrm法进行猪肉dna溯源法

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Publication number: CN104152447A
Application number: CN201410390913.9A
Authority: CN
Inventors: 周光宏; 杨萨萨; 李春保; 徐幸莲; 吴洽宇
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2014-08-08
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2034-08-08
Also published as: CN104152447B

Abstract

本发明属于食品技术领域，提供猪肉DNA溯源的SNPs分子标记，同时提供利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法。本发明提供了10个SNP分子标记，彼此间相互独立，基因杂合度均至少是0.4，适合作为猪肉溯源的SNPs分子标记。本发明通过HRM法即高分辨率熔解曲线分析方法获得10个SNP分子标记，再由所获得的有效SNPs位点组成一个猪肉的SNPs信息组，进而进行猪肉DNA溯源。本发明基于SNPs分子标记采用的HRM法进行猪肉DNA溯源具有简单、快捷、低成本的特点，10个SNPs分子标记稳定广泛的存在于猪基因组DNA中，有助于DNA溯源技术的大规模推广。

Description

一种SNP分子标记及HRM法进行猪肉DNA溯源法

技术领域

本发明属于食品技术领域，涉及猪肉DNA溯源的SNP分子标记即单核苷酸多态性标记，具体涉及利用HRM法即高分辨率熔解曲线分析方法进行猪肉DNA溯源的方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，食品的安全性越来越受到人们的关注。肉制品作为人类食物中蛋白质的主要来源，其安全性自然也备受关注，溯源技术越来越成为肉品安全保障和监管的重要手段。

肉类食品溯源的技术方法有很多，如标签溯源技术、虹膜溯源技术和DNA溯源技术等。与其他溯源技术相比，DNA溯源技术具有易分型、便于规模化自动化检测等优点。它不仅可以对活体动物进行溯源，还可以对胴体分割后的每一块肉，甚至是经过加工后的熟肉进行溯源，能够真正的做到从生产到餐桌的全程溯源。可以大大强化政府部门的肉品质量安全监管，提供有用的信息处理食品安全应急事件，将有助于社会的稳定。

DNA溯源技术的产生源于DNA的遗传与变异。它是通过分析特定的DNA分子标记，获得动物个体的DNA指纹图谱从而达到鉴别个体、品种或是物种的目的。本研究选取了第三代分子标记——SNPs标记(单核苷酸多态性标记)。目前，国内外相关的研究中，对于SNPs标记的检测，主要采用两种方法，RFLP-PCR法和TaqMan探针法。但是RFLP-PCR法检测时间长，TaqMan探针法检测费用高的缺点，这成为了DNA溯源技术广泛应用的一个障碍。因此，若能找到一种简单、快捷、低成本的检测方法，来代替这两种检测方法，将有助于DNA溯源技术的大规模推广。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中，猪肉DNA溯源方法操作复杂，检测周期长，成本高等问题，通过HRM法即高分辨率熔解曲线分析方法检测取自猪肉的SNPs分子标记，达到快速准确检测猪肉来源的目的。

本发明的目的通过以下方法获得

本发明提供一种用于猪肉DNA溯源的SNP分子标记，分别为：

SNP1：序列如SEQ ID NO.1所示，等位基因突变位点为：A/G；

SNP2：序列如SEQ ID NO.2所示，等位基因突变位点为：C/T；

SNP3：序列如SEQ ID NO.3所示，等位基因突变位点为：C/G；

SNP4：序列如SEQ ID NO.4所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP5：序列如SEQ ID NO.5所示，等位基因突变位点为：C/T

SNP6：序列如SEQ ID NO.6所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP7：序列如SEQ ID NO.7所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP8：序列如SEQ ID NO.8所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP9：序列如SEQ ID NO.9所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP10：序列如SEQ ID NO.10所示，等位基因突变位点为：A/G

序列表中的n分别代表各个分子标记的突变位点。

本发明还提供一种利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，包括如下步骤：

1)从已发表文献或NCBI中选取SNPs位点，其中，SNPs位点应满足以下要求：A.任意相邻的SNP间的距离≥1Mb，保证SNPs间相互独立，不存在连锁现象；B.任意SNP位点与其他SNP位点不存在任何关联；3)SNP侧翼序列不存在任何变异；

2)取猪肉、猪血或猪毛发样品≥299个，提取其DNA；

3)根据选取的SNPs位点，设计引物，利用HRM法对每个样品进行SNPs位点基因型分析；计算出每个单核苷酸多态性SNP的等位基因频率及杂合度；

4)记录每一样品的SNPs位点信息；

5)后期，选择的步骤2)中的猪有问题，将有问题的猪肉按照步骤2)到4)的方法，对作为DNA溯源的SNPs位点进行检测；

6)将步骤5)得到的SNPs位点信息与步骤4)中记录的信息进行对比；

7)根据溯源标记的SNPs的特征信息追溯猪肉来源。

其中，步骤1)中选择的文献为Rohrer G A,Freking B A,Nonneman D.Single nucleotidepolymorphisms for pig identification and parentage exclusion[J].Animal Genetics,2007,38(3):253-258.

SNPs位点均为猪DNA基因组中的突变位点；猪肉、猪血或者猪毛的样品均取自不同猪体，即每头猪身上要么取猪肉要么取猪血要么取猪毛发，猪样品均取自江苏淮安苏食屠宰场。当然，本发明所用的猪肉样品的来源并无限制，任何需要进行跟踪溯源的猪肉都可以作为检测样品，记录其SNPs位点信息，从而对猪肉样品进行溯源追踪，检测其质量。

利用HRM法对每个样品进行SNPs位点基因型分析指的是利用设计好的测序引物在实时荧光PCR扩增仪上进行荧光PCR扩增，通过获得的熔解曲线，进行分析从而得到每个样品的每个SNP位点的基因型。本发明只提供10个SNP位点，即每个样品将获得10个SNP位点的基因型。

步骤6)中的SNPs位点信息指的是该猪肉样品中，在步骤1)中选择的10个SNP位点上的基因型。

3.上述2提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中所用引物分别为：

SNP1：上游引物snp1-f如SEQ ID NO.11所示；下游引物snp1-r如SEQ ID NO.12所示；

SNP2：上游引物snp2-f如SEQ ID NO.13所示；下游引物snp2-r如SEQ ID NO.14所示；

SNP3：上游引物snp3-f如SEQ ID NO.15所示；下游引物snp3-r如SEQ ID NO.16所示；

SNP4：上游引物snp4-f如SEQ ID NO.17所示；下游引物snp4-r如SEQ ID NO.18所示；

SNP5：上游引物snp5-f如SEQ ID NO.19所示；下游引物snp5-r如SEQ ID NO.20所示；

SNP6：上游引物snp6-f如SEQ ID NO.21所示；下游引物snp6-r如SEQ ID NO.22所示；

SNP7：上游引物snp7-f如SEQ ID NO.23所示；下游引物snp7-r如SEQ ID NO.24所示；

SNP8：上游引物snp8-f如SEQ ID NO.25所示；下游引物snp8-r如SEQ ID NO.26所示；

SNP9：上游引物snp9-f如SEQ ID NO.27所示；下游引物snp9-r如SEQ ID NO.28所示；

SNP10：上游引物snp10-f如SEQ ID NO.29所示；下游引物snp10-r如SEQ ID NO.30所示。

4.上述3提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中进行SNPs位点基因型分析时，反应条件为：95℃热启动反应10min；95℃反应10s，touchdown程序20s，72℃反应20s，20s末收集单个荧光，共进行40个循环；95℃反应1min，60℃反应2min，同时收集荧光信号，1个循环；60-95℃读取熔解曲线，20次/℃。

touchdown程序又叫递减程序。

5.上述4提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中touchdown程序为：

SNP1：64℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP2：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP3：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP4：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP5：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP6：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP7：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP8：62℃-52℃，每个循环下降0.5℃；

SNP9：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP10：62℃-52℃，每个循环下降0.5℃；

6.上述5提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中计算每个单核苷酸多态性SNP的公式为

根据个体的基因型计算等位基因频率，如位点1的299个样品中有AA型135个，AB型65个，BB型99个，则基因A的等位基因频率为：(2*135+1*65)/(299*2)＝0.56；基因B的等位基因频率为(2*99+1*65)/(299*2)＝0.44，位点1的基因杂合度则为1-0.56*0.56-0.44*0.44＝0.4928。如此，得到SNP位点基因杂合度的通用计算公式。

7.本发明还提供上述SNP分子标记在猪肉检测中的应用。

本发明具有如下优点：

1.本发明选择的SNPs分子标记的杂合度均至少是0.4，基因多态性较高，适合应用于猪肉的DNA溯源中，尤其是其中的SNP1、SNP6、SNP7和SNP8的基因杂合度均在0.49以上，十分适合应用于DNA溯源中。

2.本发明通过HRM法获得SNPs分子标记的方法，具有快速、简便的特点，整个过程仅需2个小时完成，而传统的RFLP-PCR法检测时间长，通常需要20个小时。HRM法不需要合成探针，在PCR结束后直接通过荧光强度与时间曲线获得SNP分子标记，具有快速、准确、简便的特点。相较TaqMan探针法检测法每个样品检测费用(平均每个样品为5元)，HRM法平均每个样品为2.5元，检测成本较低。因此，本发明是一种简单、快捷、低成本的检测方法，来代替上述两种检测方法，将有助于DNA溯源技术的大规模推广。

3.利用本发明获得的SNPs分子标记对猪肉DNA进行溯源检测，从猪生长开始进行标识，可以使其从屠宰、加工和销售过程都达到可检测状态，从而可以随时快速对猪肉质量进行监控，达到连续动态的目的，为今后食品安全监控系统建立提供基础。

4.每个SNP分子标记，理论上可以检测3个基因型样品，那么，有n个SNP分子标记，理论上能够检测3ⁿ个样品。本发明提供10个可检测的SNP分子标记，理论上可以检测3¹⁰样品，满足了一批猪肉样品的溯源追踪。并且，通过本发明提供的方法，为今后大规模利用SNPs分子标记对猪肉DNA溯源奠定了基础。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明。

实施例1：

(1)SNPs位点的选取

从NCBI上选取SNPs位点，保证①任意相邻的SNP间的距离≥1Mb，保证SNPs间相互独立，不存在连锁现象；②任意SNP位点与其他分子标记不存在任何关联；③SNPs侧翼序列不存在任何变异。本研究中选取的SNPs位点见表1。

表1 SNP位点相关信息

如表1所示，选择的10个SNP位点，SNP1位于猪基因组1号染色体，SNP2位于猪基因组2号染色体，SNP3位于猪基因组12号染色体，SNP4位于猪基因组14号染色体，SNP5位于猪基因组3号染色体，SNP6位于猪基因组13号染色体，SNP7位于猪基因组17号染色体，SNP8位于猪基因组8号染色体，SNP9位于猪基因组6号染色体，SNP10位于猪基因组10号染色体，由此可见，该10个SNP位点均位于猪不同染色体上，保证了彼此独立，不存在发生连锁反应。等位基因位点表示各个SNP位点的突变基因，具体位置见序列表。其中，SNP1的序列如SEQ ID NO.1；SNP2的序列如SEQ ID NO.2所示；SNP3的序列如SEQ ID NO.3所示；SNP4的序列如SEQ ID NO.4所示；SNP5的序列如SEQ ID NO.5所示；SNP6的序列如SEQ ID NO.6所示；SNP7的序列如SEQ ID NO.7所示；SNP8的序列如SEQ ID NO.8所示；SNP9的序列如SEQ ID NO.9所示；SNP10的序列如SEQID NO.10所示。

2)猪的DNA样品制备

采集299个猪样品，其中，血样155份，肉样144份；肉样每份采集刚宰杀的猪胴体肌肉组织5g，标准抗凝血管收集血样，每份样品准确进行编号。用天根试剂盒法从猪的肌肉、血液提取其总DNA，并经紫外分光光度计检测后稀释，保证每份样品中DNA的浓度为18ng/ul。

3)HRM法即高分辨率熔解曲线法检测

根据选取的SNPs分子上下游序列的信息，设计HRM法检测的引物。本发明中所用的引物信息见表2，由生工生物(上海)有限公司合成。

表2 HRM法检测的引物信息

其中，长度指的是经过PCR扩增后的核苷酸序列。

实时荧光PCR反应条件见表3：

表3 HRM法PCR反应体系

Evagreen qPCR Master Mix是一种荧光定量PCR中使用的DNA结合染料。

实时荧光PCR反应条件为：95℃热启动反应10min；95℃反应10s，touchdown程序20s，72℃反应20s，20s末收集单个荧光，共进行40个循环；95℃反应1min，60℃反应2min，同时收集荧光信号，1个循环；60-95℃读取熔解曲线，20次/℃

其中，touchdown程序为：

SNP1：64℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP2：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP3：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP4：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP5：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP6：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP7：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP8：62℃-52℃，每个循环下降0.5℃；

SNP9：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP10：62℃-52℃，每个循环下降0.5℃。

4)基因杂合度分析

利用提取的猪DNA样品对选取的位点进行基因杂合度分析。基因杂合度大于0.3的位点即可应用于猪肉的DNA溯源中。基因杂合度越接近于0.5，说明该位点的基因多态性越丰富，也就越适合应用于DNA溯源中。本研究选取了299个样品对10个SNP位点进行了杂合度分析。基因杂合度的计算公式如下：

根据公式个体的基因型计算等位基因频率，如位点1的299个样品中有AA型135个，AB型65个，BB型99个，则基因A的等位基因频率为：(2*135+1*65)/(299*2)＝0.56；基因B的等位基因频率为(2*99+1*65)/(299*2)＝0.44，位点1的基因杂合度则为1-0.56*0.56-0.44*0.44＝0.4928。如此，得到SNP位点基因杂合度的通用计算公式计算结果详见表4。SNP1分子中的突变位点中1代表纯合子AA型，2代表杂合子AG型，3代表纯合子GG型，该突变位点的基因杂合度为0.4975；SNP2分子突变位点中1代表纯合子TT型，2代表杂合子CT型，3代表纯合子CC型，该突变位点的基因杂合度为0.4805；SNP3分子中突变位点1代表纯合子CC型，2代表杂合子CG型，3代表纯合子GG型，该突变位点的基因杂合度为0.4527；SNP4分子中突变位点1代表纯合子AG型，2代表杂合子AA型，3代表纯合子GG型，该突变位点的基因杂合度为0.4250；SNP5分子中突变位点中1代表纯合子CC型，2代表杂合子CT型，3代表纯合子TT型，该突变位点的基因杂合度为0.4799；SNP6分子中突变位点1代表杂合子AG型，2代表杂合子GG型，3代表纯合子AA型，该突变位点的基因杂合度为0.4996；SNP7分子中突变位点1代表杂合子AG型，2代表纯合子GG型，3代表纯合子AA型，该突变位点的基因杂合度为0.4962；SNP8分子中突变位点1代表纯合子GG型，2代表杂合子AG型，3代表纯合子AA型，该突变位点的基因杂合度为0.4999；SNP9分子突变位点1代表纯合子AA型，2代表纯合子GG型，3代表杂合子AG型，该突变位点的基因杂合度为0.4026；SNP10分子中突变位点1代表纯合子GG型，2代表杂合子AG型，3代表纯合子AA型，该位点的基因杂合度为0.4831。等位基因1分别表示1所代表基因型的基因频率，等位基因2分别表示2所代表基因型的基因频率。

表4 各位点基因杂合度信息

从计算结果可以看出10个SNP位点的基因杂合度均在0.4以上，其中SNP1、SNP6、SNP7和SNP8的基因杂合度均在0.49以上，十分适合应用于DNA溯源。而SNP9的基因杂合度仅为0.40，相对来说，比其他位点低，但仍可用于猪肉的DNA溯源中。

本试验利用HRM法检测技术对299个样品的10个SNP标记分别进行了检测。在这些样品中有个别样品的个别位点没能检测到相应的基因型，这些样品为SNP1位点的样品47，SNP4位点的样品284和样品289，SNP6位点的样品241和样品282。造成这种结果的原因可能是由于提取的DNA不够完整或是DNA浓度过低所引起的，此外也有可能是由于在采样或是提取过程中造成了交叉污染，使得无法检测出样品的基因型。其余各位点各样品的基因型如表5所示。从表5中可以看出，除上述已经说明的个别情况外，选取的299个样品中，均检测到各SNP突变位点中存在的基因型。说明选择的10个SNP分子标记稳定广泛的存在于猪基因组DNA中。利用选择的10个SNP分子标记记录在养殖生产中各头猪的基因型，获得基因信息，利用HRM法快速获得相应待检测猪样品中的10个SNP位点的基因型，从而能快速实时监测猪肉动态，保证猪肉安全质量。

实施例2：

1)猪DNA样品制备

选择上述299个样品中的1、2、5、6、30、31、40、48、49、53号的新鲜猪肉个体，在实施例1采集猪肌肉组织和血液的同时，于此10个猪个体上切取带猪毛的猪皮样本10个，记录每个样本的个体编号，标记样本，并打乱待检测样本。

从每份样品的猪皮上拔取带有完整毛囊的猪毛15根，尽量剪短只剩下毛囊的部分，放入干净的1.5ml离心管中，加入200ulDNA裂解液及蛋白酶K10ul，充分混匀。56℃消化2h，期间用手指轻弹样品以加速消化过程。加入5mol/L NaCl60ul，充分混匀；加入饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)260ul，颠倒混匀5min，使蛋白质充分变性，1000r/min离心5min，取上清液于另一新离心管中，加入2倍上清液体积的冰乙醇，轻轻颠倒混匀5min，置于冰上静置30min，使DNA成沉淀析出，1200r/min离心5min,使DNA沉淀至离心管管底，弃掉上清液。将沉淀用乙醇70％漂洗2此，吸除剩余乙醇，自然晾干得DNA，溶于50ul的TE缓冲液中，-20℃保存。

2)HRM法检测

选择实施例1中的10个SNP检测位点作为分子标记，进行HRM法检测。实时荧光PCR反应体系和过程同实施例1。

3)记录每一个样品的10个SNP位点信息。与表4中获得的299样品中的10个SNP位点基因型进行比较，确定每个样品对应的个体编号，与采样时记录的样品对应的个体编号进行比较，检验结果相一致。即通过HRM法检测样品，确定的样品号为1、2、5、6、30、31、40、48、49、53号，对应的样品在采集过程中的个体编号为1、2、5、6、30、31、40、48、49、53号。检测结果准确，用HRM法可有效进行猪肉DNA溯源。

本实验共选取10个SNP检测位点，理论上可以检测3¹⁰个个体，当一批待监控的猪个体数>3¹⁰个时，可以按照本发明提供的方法选择SNP检测位点个数>10个。

表5 选择的299样品中对于10个SNP位点的基因型。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于猪肉DNA溯源的SNP分子标记，其特征在于：SNP分子标记为：

SNP1：序列如SEQ ID NO.1所示，等位基因突变位点为：A/G；

SNP2：序列如SEQ ID NO.2所示，等位基因突变位点为：C/T；

SNP3：序列如SEQ ID NO.3所示，等位基因突变位点为：C/G；

SNP4：序列如SEQ ID NO.4所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP5：序列如SEQ ID NO.5所示，等位基因突变位点为：C/T

SNP6：序列如SEQ ID NO.6所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP7：序列如SEQ ID NO.7所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP8：序列如SEQ ID NO.8所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP9：序列如SEQ ID NO.9所示，等位基因突变位点为：A/G

SNP10：序列如SEQ ID NO.10所示，等位基因突变位点为：A/G 。

2.一种利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，特征在于：包括如下步骤：

1)从已发表文献或NCBI中选取SNPs位点，其中，SNPs位点应满足以下要求：A.任意相邻的SNP间的距离≥1Mb，保证SNPs间相互独立，不存在连锁现象；B.任意SNP位点与其他SNP位点不存在任何关联；C.SNP侧翼序列不存在任何变异；

2)取猪肉、猪血或猪毛发样品≥299个，提取其DNA；

4)记录每一样品的SNPs位点信息；

7)根据溯源标记的SNPs的特征信息追溯猪肉来源。

3.权利要求2所述的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，特征在于：步骤3)中所用引物分别为：

4.权利要求3所述的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，特征在于：步骤3)中进行SNPs位点基因型分析时，反应条件为：95℃热启动反应10min；95℃反应10s，touchdown程序20s，72℃反应20s，20s末收集单个荧光，共进行40个循环；95℃反应1min，60℃反应2min，同时收集荧光信号，1个循环；60-95℃读取熔解曲线，20次/℃。

5.权利要求4所述的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，特征在于：步骤3)中touchdown程序为：

SNP1：64℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP2：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP3：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP4：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP5：65℃-56℃，每个循环下降0.5℃；

SNP6：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP7：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP8：62℃-52℃，每个循环下降0.5℃；

SNP9：64℃-54℃，每个循环下降0.5℃；

SNP10：62℃-52℃，每个循环下降0.5℃。

6.权利要求5所述的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，特征在于：步骤3)中计算每个单核苷酸多态性SNP的的公式为

7.权利要求1所述的SNP分子标记在猪肉检测中的应用。