CN106834521B - 一种河川沙塘鳢生长性状相关基因的snp分子标记及其扩增引物与应用 - Google Patents

一种河川沙塘鳢生长性状相关基因的snp分子标记及其扩增引物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种河川沙塘鳢生长性状相关基因的SNP分子标记及其扩增引物与应用。所述SNP分子标记来自IGF‑1R基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1上第1392位碱基为A或G，所述引物为SEQ ID NO：2‑3。通过对河川沙塘鳢基因组DNA提取，PCR扩增，扩增产物测序，以及基于测序结果确定所述待测河川沙塘鳢的SNP位点位于IGF‑1R基因外显子区域的基因型，利用SPSS 19.0软件进行数据处理，GLM程序分析碱基变异信息为SNPg.1392 A>G与河川沙塘鳢的生长性状显著相关。本发明实现短时间、低成本、高准确性地选育河川沙塘鳢优良品种。

Description

一种河川沙塘鳢生长性状相关基因的SNP分子标记及其扩增 引物与应用
技术领域
本发明属于水产生物技术领域，涉及一种河川沙塘鳢生长性状相关基因的SNP分子标记及其扩增引物与应用。
背景技术
河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)属鲈形目(Perciformes)，沙塘鳢科(Odontobutidae)，沙塘鳢属(Odontobutis)，俗称：虎头鲨、虎头呆子等。在我国广泛分布于长江中下游、钱塘江、闽江等水系，属中国特有种。该鱼肉质鲜美细嫩，市场价格坚挺，已成为一种具有较高经济价值的水产养殖品种。目前全国已零星开展了河川沙塘鳢的混养和套养，但产量还远不能满足市场的消费需求。在生产的过程中苗种出现生长速度慢、抗病能力弱、病害增加等种质退化现象。良种问题已成为制约河川沙塘鳢养殖业稳定发展的主要“瓶颈”之一。因此，培育出具有生长快、产量高等优良生长性状的河川沙塘鳢新品种，是保障其养殖业可持续发展的必要条件。
伴随着分子生物学的发展，单核苷酸多态性(SNP)作为新一代分子标记已经在育种领域得到认可，目前在鱼类中，关于生长、抗病等相关的SNP分子标记有较多报道，而这些SNP位点较少应用在分子标记的辅助育种，对应到生长相关基因(如IGF-1R)联合SNP位点进行分子辅助育种应用的报道更少。IGF-1R基因是生长轴上的关键基因，与IGF-1结合能引起酪氨酸残基自身磷酸化，有激活细胞内信号传导通路(MAPK和P13K-KT通路)，调控生物生长发育，控制细胞凋亡、增殖、分化等功能。对于IGF-1R的研究主要集中在序列、结构分析、表达和分子系统等方面，而有关在河川沙塘鳢与生长性状相关IGF-1R基因的SNPs研究至今尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种河川沙塘鳢生长性状相关基因的SNP分子标记及其扩增引物与应用，基于本发明SNP引物，通过SPSS 19.0GLM程序，对IGF-1R基因中SNP与河川沙塘鳢生长性状进行关联分析，获得了一个与生长性状相关的SNP，所述SNP引物可用于识别河川沙塘鳢的所属生长性状，实现短时间、低成本、高准确性地选育河川沙塘鳢优良品种。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种河川沙塘鳢生长性状相关基因的SNP分子标记，所述SNP分子标记来自IGF-1R基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中第1392位碱基为A或G；
其中SNP分子标记引物的上游引物如SEQ ID NO：2所示，
序列为5’-CACTCTGAGTTCCCTGGCTTTC-3’；
下游引物如SEQ ID NO：3所示，序列为5’-AAACCGAGGAGGAAAGGAGTG-3’。
上述SNP分子标记在选育河川沙塘鳢优良品种上的应用，通过对河川沙塘鳢基因组DNA提取，PCR扩增，扩增产物测序，以及基于测序结果确定所述待测河川沙塘鳢的SNP位点位于IGF-1R基因外显子区域的基因型，利用SPSS 19.0软件进行数据处理，GLM程序分析碱基变异信息为SNPg.1392G>A与河川沙塘鳢的全长、体长、体高、尾柄长、体重、体宽重要生长性状显著相关；所述待测河川沙塘鳢的SNP位点位于IGF-1R基因外显子区域的基因型为AG时，个体的生长性状均高于GG基因型的个体；所述个体的生长性状为河川沙塘鳢的全长、体长、体高、尾柄长、体重、体宽。
有益效果
本发明以河川沙塘鳢IGF-1R基因的单核苷酸多态位点为研究目标，发现位于IGF-1R基因转录组核苷酸序列1392位处的SNP位点(SNPg.1392G>A)与河川沙塘鳢的全长、体长、体高、尾柄长、体重、体宽重要生长性状之间存在着显著的相关性，其中AG基因型个体的上述性状显著高于GG基因型(P<0.05)个体。在以生长性状为选育指标的河川沙塘鳢遗传育种研究过程中，通过对河川沙塘鳢育种群体进行SNPg.1392G>A基因分型，结合形态学特征分析，可以优先选择基因型为AG的个体作为育种亲本，实现短时间、低成本、高准确性地选育河川沙塘鳢优良品种，本研究对于选育优良生长性状的新品系具有重要的指导意义。
具体优点如下：
(1)本发明提供的SNP位点和识别河川沙塘鳢生长性状SNP引物对不受河川沙塘鳢的年龄、性别等限制，可用于河川沙塘鳢的早期选育，可显著促进河川沙塘鳢的育种进程；
(2)通过基于SEQ ID NO:2-3所示的SNP引物对，检测如SEQ ID NO:1所示自5’端起第1392位SNP位点的方法，准确可靠，操作方便；
(3)河川沙塘鳢如SEQ ID NO:2-3所示SNP引物对，为河川沙塘鳢生长性状的早期准确性选育提供了科学依据。
附图说明
图1为Chromas version 1.62软件分析显示了SNPg.1392G>A位点处GG基因型的测序峰图；
图2为Chromas version 1.62软件分析显示了SNPg.1392G>A位点处AG基因型的测序峰图。
具体实施方式
基于本发明的SNP引物，通过SPSS 19.0GLM程序，对IGF-1R基因中SNP与河川沙塘鳢生长性状进行关联分析，获得了一个与生长性状相关的SNP位点，位点A1392G与河川沙塘鳢全长、体长、体高、尾柄长、体重、体宽重要生长性状显著相关，所述SNP引物可用于识别河川沙塘鳢生长性状。
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
a)河川沙塘鳢群体的获得
b)河川沙塘鳢尾鳍DNA提取；
c)基于所述SNP引物，对河川沙塘鳢的基因组DNA进行PCR扩增；
d)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP的基因型；
e)位点A1392G基因型与生长性状的相关性分析；
f)SNPg.1392G>A辅助高产河川沙塘鳢选育的应用。
具体操作如下：
a)河川沙塘鳢群体的获得
所采用的河川沙塘鳢群体处于同样培育条件下，随机选取不同规格的河川沙塘鳢195个个体，用游标卡尺测量每个个体的体长、全长、头长、尾柄长、尾柄高、体宽、体高，用电子天平称量每个个体的体重。剪取鱼体尾鳍于95％乙醇-20℃保存，用于基因组DNA提取。
b)河川沙塘鳢尾鳍DNA提取
(1)取15mg尾鳍于1.5mL离心管中，加入400μL ACL Solution，剪碎，再加10μL的Proteinase K，震荡混匀1min，置于55℃裂解约3h，至裂解液澄清。
(2)在经过预处理好的样品中，依次加入300μL Ext solution和300μLABsolution，用力摇匀，在12,000rpm离心5min。
(3)将枪头穿过上层溶液，深入到下层溶液中，将下层溶液仔细吸出到GenCleanColumn中，尽量避免吸到上层溶液及中间层的沉淀。
(4)8,000rpm离心1min，取下GenClean Column，倒掉收集管中废液。
(5)将GenClean Column放回收集管中，加入500μLWash Solution，8,000rpm室温离心1min。
(6)重复上述步骤(5)一次。
(7)取下GenClean柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，12,000rpm室温离心1min，以除去残留Wash Solution。
(8)将柱放入新的洁净1.5mL离心管中，在柱中央加入60μl Elution Buffer，室温放置2min。然后12,000rpm室温离心1min。离心管中的液体即为所提取的DNA，-20℃保存。
1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品，分光光度计检测浓度及纯度。
c)基于所述SNP引物，对河川沙塘鳢不同个体进行PCR扩增；
PCR产物扩增长度为305bp，PCR引物为：
上游引物：5’-CACTCTGAGTTCCCTGGCTTTC-3’(SEQ ID NO：2)
下游引物：5’-AAACCGAGGAGGAAAGGAGTG-3’(SEQ ID NO：3)
PCR扩增的反应体系为20μL:2×Taq Master Max 10μL，正反向引物各0.8μL，DNA模板1μl，灭菌水7.4μl。
PCR扩增共30个循环，循环前95℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后于72℃延伸5min。
扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后的PCR产物于-20℃保存用于后续的测序反应。
d)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP位点的基因型；
基于Hiseq2000高通量测序平台，对上述的195个个体的PCR扩增产物于ABI3730测序仪上进行双向测序。基于测序结果，确定河川沙塘鳢各个个体位点A1392G的基因型。其中GG、AG基因型的测序峰图分别如图1和图2所示。195个待测河川沙塘鳢个体该SNP位点的基因型及生长性状指标如下表1所示。
表1 195个个体该SNP位点的基因型及生长性状指标
Figure GDA0002580914060000041
Figure GDA0002580914060000051
Figure GDA0002580914060000061
Figure GDA0002580914060000071
Figure GDA0002580914060000081
Figure GDA0002580914060000091
注：表中OL、BL、TW、HL、CPL、CPW、BWT、BWH、K分别表示全长、体长、体高、头长、尾柄长、尾柄高、体重、体宽、肥满度。
e)不同基因型个体与生长性状的相关性分析。
基于表1的结果，利用SPSS 19.0GLM程序，根据性状及试验群体的特点，构建线性分析模型从而进行基因多态性与性状间的关联分析：yij＝u+Gi+eij式中，yij为性状表型值，u为群体均值，Gi为基因型效应(i＝1，2，1，4)，eij为随机残差效应。统计数据用平均值±标准误表示。SNP位点的基因型与河川沙塘鳢生长性状的关联分析结果见下表2。
表2 IGF-1R基因SNP g.1392G>A位点与河川沙塘鳢生长性状的关联分析
Figure GDA0002580914060000092
注：表中OL、BL、TW、CPL、BWT、BWH分别表示全长、体长、体高、尾柄长、体重、体宽。
表2所示结果表明，GG杂合型个体数显著高于AG型，G等位基因为优势基因。其中，AG基因型全长、尾柄长、体重极显著高于GG型(P<0.01)，AG基因型体长、体高、体宽显著高于GG型个体(P<0.05)。因此，证明SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第1392位碱基A或G，与河川沙塘鳢生长性状显著相关。
在以生长性状为选育指标的河川沙塘鳢遗传育种研究过程中，通过对河川沙塘鳢育种群体进行SNPg.1392G>A基因分型，结合形态学特征分析，可以优先选择基因型为AG的个体作为育种亲本，本研究对于河川沙塘鳢的分子辅助育种具有重要的指导意义。
f)SNPg.1392G>A辅助高产河川沙塘鳢选育的应用。
如前所述，SNPg.1392G>A位点处基因型为杂合AG河川沙塘鳢的平均全长、体长、体高、尾柄长、体重、体宽重要生长性状显著高于此处基因型为纯合GG的河川沙塘鳢，例如当该SNP位点的基因型为AG时，则待测河川沙塘鳢属于生长速度快的个体。因此，在高产河川沙塘鳢的选择育种过程中，优先选择AG基因型的个体作为高产河川沙塘鳢的亲本或者进行规模养殖，能够有效辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育河川沙塘鳢优良品种。
本发明选取了195个河川沙塘鳢的样本，通过对每个个体IGF-1R基因的单核苷酸多态位点分析，发现SNPg.1392G>A与河川沙塘鳢的全长、体长、体高、尾柄长、体重、体宽重要生长性状之间存在着显著的相关性，并且能够有效的支持此次实验结果，即AG基因型个体的全长、体长、体高、尾柄长、体重、体宽性状显著高于GG基因型(P<0.05)个体，实现短时间、低成本、高准确性地选育河川沙塘鳢优良品种，对于选育优良生长性状的新品系具有重要的指导意义。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 一种河川沙塘鳢生长性状相关基因的SNP分子标记及其扩增引物与应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1659
<212> DNA
<213> IGF-1R gene sequence
<400> 1
tcagcccatg tcatcagagg agggactcca gccctctgtg aaaagctctc acaagaacaa 60
cctccagacc accaacacag agagtgtgtg gcctgagcat tgacattgga aatgacatca 120
ctgaattcag acgcctagaa aattgtacgg ttgtggaagg ttacttgagg attcttctaa 180
taggagacaa aagcaacaac agtatcaacc gggaagtctt ccagtctatc agcttcccta 240
agctaaccat gattactgat tacctgctgc tattccgcgt gtctggcctg gacagcctaa 300
gcacgctctt ccctaacctg tctgtcatcc gcggccggaa cctcttgtat aactatgctc 360
ttgtaatatt tgaaatgacc agtttgaagg atatcggcct ttacaacctg aggaacatca 420
cgcggggggc tgtccgaatc gagaagaacc ccgagctctg ctatctggac tctatagact 480
ggtcccttat catggacgca gagttgaata attacattgc aggaaataaa caggcaggag 540
agtgtggtga tatttgtccc ggaacattgg aggaccaacc tcagtgcaaa aagactgtct 600
tcaataacaa ctccaactac cgctgctgga attccaatca ctgccagaaa gagtgccctg 660
agaggtgtcc aaggcgagcc tccacagccg atggacagtg ctgccaccct cagtgtctgg 720
gcagctgcac agcagctggt agtgacagag cttgtgctgc atgtgtgcat tactaccatg 780
aaggccgctg tgtcccagac tgtcccccag gtacttacaa gtttgaaggc tggaggtgca 840
tcagtgctga gctttgctcc aaagtccatc cgacagaaaa tgacctccac ggaggagagt 900
gcatgcctga atgcccatct gggtacacgc gcaacacacc caacagcatg tcctgtgctg 960
cctgcaatgg tctgtgtgat aaagtatgtg aggggatggt catcgactcc ttggatgcca 1020
ctcagtctct caaaggctgc actgttatca aaggcaacct cgatatcaac atccacagag 1080
acaacatggt ggcagagctg gagagtttca cgggtttgat ccaaagggtg aattagatat 1140
tcgaattatg ttcgaattag atattccaac actctgagtt ccctggcttt ccttcacagc 1200
ctcaaatcca ttgatggaga aatgctcatt gaagagtagg acctcacaca caaagacatc 1260
ttattttctt gttacagctt atgttaaggc tgcagtatgg cagactggct tgtttggatt 1320
taagaactgt aatatcacaa ggtcattata ctgtaaagta aatacagatt gaagctaata 1380
aatctctcgc agttttcata aggctttgga tggagcacaa caacaacagg ttctcatggt 1440
cacagcaagt ccttcactcc tttcctcctc ggtttagaga aatcattcca aagtgttact 1500
aaacagtact ggcattacac accacagaat taaaagaaaa gaaaagaatg aaatgacacc 1560
attaatctga catatttgtt ttgtgaaatt gtaatgaagc tgcacattgt tgactaatca 1620
gtcattttat attctagcat gtacgccttc tcagcagtc 1659
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 上游引物
<400> 2
cactctgagt tccctggctt tc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 下游引物
<400> 3
aaaccgagga ggaaaggagt g 21

Claims (2)

1.一种河川沙塘鳢生长性状相关基因的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记来自IGF-1R基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中第1392位碱基为A或G；所述SNP分子标记引物的上游引物如SEQ ID NO：2 所示，序列为5’-CACTCTGAGTTCCCTGGCTTTC-3’； 下游引物如SEQ ID NO：3 ，序列为5’-AAACCGAGGAGGAAAGGAGTG-3’。
2.基于权利要求1所述的SNP分子标记在选育河川沙塘鳢优良品种上的应用，其特征在于，通过对河川沙塘鳢基因组DNA提取，PCR扩增，扩增产物测序，以及基于测序结果确定所述待测河川沙塘鳢的SNP位点位于IGF-1R基因外显子区域的基因型，利用SPSS 19.0软件进行数据处理，GLM程序分析碱基变异信息为SNPg.1392 G > A与河川沙塘鳢的全长、体长、体高、尾柄长、体重、体宽重要生长性状显著相关；所述待测河川沙塘鳢的SNP位点位于IGF-1R基因外显子区域的基因型为AG时，个体的生长性状均高于GG基因型的个体；所述个体的生长性状为河川沙塘鳢的全长、体长、体高、尾柄长、体重、体宽。
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