CN103667499B - 一种鉴别河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢的引物和方法 - Google Patents

一种鉴别河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢的引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢的鉴别引物和方法，具体涉及应用微卫星标记对河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢进行鉴别。本发明的一对引物命名为OP34a，序列如SEQ ID NO.1和2所示。鉴定时用该对引物对3种沙塘鳢DNA样品进行PCR扩增，再用1.5%琼脂糖凝胶(EB染色)电泳对PCR产物进行检测，221～251bp大小条带的为河川沙塘鳢，337～351bp大小条带的为鸭绿沙塘鳢，465～471bp大小条带的为中华沙塘鳢。本发明在不处死鱼种的基础上，只需剪取少量尾鳍或其它鱼体组织部分即可进行鉴别，具有稳定性高、操作简单重复性好、实用性强并可快速准确鉴别等优点。

Description

一种鉴别河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢的引物和方法
技术领域
本发明涉及DNA分子标记鉴别同属鱼种方法，具体地说，本发明涉及应用微卫星标记对河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢进行鉴别。
背景技术
河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)、鸭绿沙塘鳢(O.yaluensis)及中华沙塘鳢(O.sinensis）隶属于鲈形目、虾虎鱼亚目、沙塘鳢科、沙塘鳢属。沙塘鳢的分布颇有规律,河川沙塘鳢地方名为塘鳢鱼、虎头鲨、呆子鱼等，仅分布于长江中、下游,钱塘江及闽江各水系,不见于珠江流域及长江上游，在长江水系的分布西限可上溯至湖北的荆州(沙市)、九江、黄梅,江西的鹰潭、宜春等地，因其肉质细嫩、味道鲜美、肌间刺少等优点成为江苏省特色水产业中具有良好发展前景的鱼类品种之一；而中华沙塘鳢的分布区域较广,主要见于珠江流域、海南岛及长江中上游的贵州、湖北、湖南及江西各省,不见于闽江、钱塘江及长江下游各地；而地处长江中游的荆州、九江、黄梅、鹰潭、宜春等地水域则是中华沙塘鳢的分布东限,可以认为这些地区亦是河川沙塘鳢和中华沙塘鳢的混栖区,相互渗透和交汇，该鱼成鱼体长达170mm，个体虽小，但肉质鲜美，细嫩可口，属上品食用鱼类；鸭绿沙塘鳢俗称瞎胖鱼，仅分布于辽河及鸭绿江水系，具有抗寒、耐粗饲、个体较大、生长速度快等优点，属于易危物种，已被列入中国物种红色名录。沙塘鳢属鱼类经济价值较高，市场需求量逐日扩大，从而刺激了其捕捞强度，使得自然资源急剧下降，再者，由于环境污染等原因导致生存空间受到严重威胁，并且产卵环境也屡遭破坏使得其野生资源、品质急剧下降。近年来沙塘鳢属鱼类的养殖规模也不断扩大，为防止养殖者将品种搞混，必须尽快掌握其种质资源状况，从而制定和实施更科学的渔业管理政策，有必要发明一种鉴别三种沙塘鳢属鱼类的方法。
河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢三者的亲缘关系十分相近，外形极其相似。目前主要依据形态学特征进行区分：第一，头顶部鳞片、眼前下方横行感觉乳突呈现的排列方式不同以及眼后方有无感觉管孔；第二，一些可量性状(头长、吻长、眼径等)及可数性状(胸鳍、背鳍、臀鳍等)的多少；一般情况下，这些外部特征并不是固定特征，尤其是育苗的不同阶段会随着环境等因素的影响出现差别，因此不能作为判断三种沙塘鳢的主要依据。由此可见，这种仅凭肉眼识别的形态学鉴别方法要求具有专业分类学知识，而且是在不受外界环境的影响下进行的。
微卫星DNA广泛分布于真核生物基因组中，信息含量大、共显性标记、实验操作简单、结果便于PCR检测，稳定可靠等优点，成为当前研究者最喜爱的分子生物学方法之一，它在鱼类的群体遗传结构的分析、物种遗传多样性的鉴定以及遗传基因连锁图谱的构建等方面已得到应用。应用结果表明：微卫星侧翼序列在亲缘关系较近或种属间是相当保守的。因此，鉴于沙塘鳢属鱼类形态学鉴定的不确定性，我们利用微卫星分子标记法对三种沙塘鳢进行鉴别。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速准确鉴别河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢的鉴别引物和方法，以克服现有从形态学上鉴定存在主观性强且不能有效地鉴定三种鱼种的缺陷，本发明在不处死鱼种的基础上，只需剪取少量尾鳍或其它鱼体组织部分即可进行鉴别，具有稳定性高、操作简单重复性好、实用性强并可快速准确鉴别等优点。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案是
一种河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢的鉴别引物，命名为OP34a，序列如下：
F：5′-AATCTCAGCTCTTTGGAATG-3′（SEQ ID NO.1）；
R：5′-CGAGGAATCAAGCAGAACAC-3′（SEQ ID NO.2）。
本发明还公开了一种河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢的鉴别方法，包括下列步骤：
1)用上述引物对3种沙塘鳢鉴定样本进行DNA扩增，获得PCR产物；
2)用1.5%琼脂糖凝胶(EB染色)电泳对PCR产物进行检测，221～251bp大小条带的为河川沙塘鳢，337～351bp大小条带的为鸭绿沙塘鳢，465～471bp大小条带的为中华沙塘鳢。
本发明是首次基于分子生物学手段建立起对河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢进行鉴别的方法，利用本实验室从河川沙塘鳢中合成、筛选的特异微卫星引物OP34a，建立了一个普通的PCR反应就可以实现鉴别三种沙塘鳢种质的新方法。本方法无需依赖专业的鱼类分类学知识，也不需要具有长期从事鱼类鉴别的丰富经验，仅需取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测得到稳定、清晰、差异明显的扩增条带，成本低，操作简单，实用性强，可以用于指导沙塘鳢养殖生产。
附图说明
图1：OP34a引物在河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢3个群体中的扩增结果。
M-Marker；1-8为河川沙塘鳢；9-16为鸭绿沙塘鳢；17-24为中华沙塘鳢。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例
1.河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢总DNA的提取及定量
1)取实验鱼的尾鳍0.1～0.3g加入450μLDNA抽提缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，5mmol/LEDTA，75mmol/L NaCl)，混匀后依次加入SDS和蛋白酶K至终浓度分别为0.5%和200μg/mL，然后于55℃水浴消化过夜。
2)加入等体积饱和苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿/异戊醇(24:1)各抽提一次。每次抽提均轻柔混合10分钟后，4℃，12000rpm离心20分钟，取上清。
3)将所得上清液加入2.5mol/L NaCl(终浓度为0.2mol/L)和预冷的2倍体积的无水乙醇沉淀，12000rpm离心20分钟取沉淀；用70%乙醇漂洗2次后在室温下自然干燥，待乙醇挥发后溶于200μL的TE中，置于4℃冰箱备用。在核酸蛋白测定仪上测定其纯度及浓度，琼脂糖凝胶电泳检测。
2.确定PCR扩增体系
PCR扩增反应体系如下：各成分及其终浓度分别为：10×buffer缓冲液，2mM的dNTP，2.5mM的Mg2+，5U的Taq酶，10uM正反引物，沙塘鳢模板DNA50ng，用灭菌水补足至20μL，所述的引物序列为：
F：5′-AATCTCAGCTCTTTGGAATG-3′；
R：5′-CGAGGAATCAAGCAGAACAC-3′。
3.PCR扩增反应
在PCR仪上于95℃预变性5min，30个循环：94℃变性30sec，47℃下退火30sec，72℃延伸1min，最后72℃延伸5min，4℃保存。
4.琼脂糖凝胶电泳检测
取PCR扩增反应产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色并用紫外凝胶成像系统拍照，如图1所示，根据电泳条带与标准Marker比较：221～251bp大小条带的为河川沙塘鳢；337～351bp条带大小的为鸭绿沙塘鳢；465～471bp条带大小的为中华沙塘鳢。

Claims (2)

1.一种河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢的鉴别引物，其特征在于所述引物命名为OP34a，其序列如下：
F：5′-AATCTCAGCTCTTTGGAATG-3′；
R：5′-CGAGGAATCAAGCAGAACAC-3′。
2.一种河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及中华沙塘鳢的鉴别方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)用权利要求1所述引物对3种沙塘鳢鉴定样本进行DNA扩增，获得PCR产物；
2)用1.5%琼脂糖凝胶EB染色电泳对PCR产物进行检测，221～251bp大小条带的为河川沙塘鳢，337～351bp大小条带的为鸭绿沙塘鳢，465～471bp大小条带的为中华沙塘鳢。
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