CN108950007A - 用于鉴定河鲀及其他鱼肉制品的hrm引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种HRM引物在鉴定河鲀及其他鱼肉制品中的应用，其中，HRM引物序列为：正向引物COIHRM168：5’‑CCCCTTATAATCGGAGCCCC‑3’，反向引物COIHRM255：5’‑GCAGAAGGAGGAAGGATGGG‑3’；或，正向引物COIHRM175，5’‑TAATCGGAGCCCCAGACATG‑3’；反向引物COIHRM262，5’‑GATGCGAGCAGAAGGAGGAA‑3’。

Description

用于鉴定河鲀及其他鱼肉制品的HRM引物及方法

技术领域

本发明涉及河鲀鉴定方法，特别涉及一种用于鉴定河鲀及其他鱼肉制品的HRM引物及方法。

背景技术

食品安全关系国计民生，食品物种鉴定是食品安全链的重要环节。自然界物种丰富，某些物种会给特定人群的健康造成威胁，如各类有毒动植物、过敏原和致病菌等。原料来源不明或成分组成不明的食物会对食品安全带来巨大的风险。河鲀(英语：Pufferfish)俗称肺鱼、气鼓鱼或气泡鱼等，是对鲀形目(Tetraodontiformes)中二齿鲀科(Diodontidae)、三齿鲀科 (Triodontidae)、四齿鲀科(Tetraodontidae)以及箱鲀科(Ostraciontidae)所属鱼类的一种统称。河鲀常被误写作“河鲀”，实际上，“河鲀”指的是淡水豚总科(Platanistoidea)的哺乳动物。河鲀主要是海水鱼，但有些物种栖息在含盐水和淡水中，一般分布在北纬45°至南纬45°。据《中国动物志》记载我国共有河鲀10科61属131种。生活中的“河鲀”泛指鲀形目中4科7 属57种的河鲀，其中东方鲀属(Takifugu)22种，占比例最大。我国沿海地区较为常见的河鲀有黄鳍东方鲀(Takifugu xanthopterus)、暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)、菊黄东方鲀 (Takifugu flavidus)和红鳍东方鲀(Takifugurubripes)等。

河鲀味道鲜美，肉质细嫩，是“长江三鲜”(河鲀、刀鱼、鲥鱼)之首，同时，河鲀还是一种观赏鱼类，一般称为狗头鱼或娃娃鱼。但是河鲀全身含毒，肝、鱼子和血液的毒性尤为强烈，不少人因为馋于肝的鲜美，食用后中毒。系统性地统计了过去5年时间发生在世界上的河鲀中毒事件，共计430例，其中造成死亡52例。不仅直接食用河鲀会造成中毒，河鲀毒素还能够随着食物链在处于食物链较顶端的物种中富集，最后威胁人类健康。因此准确、快速的鉴定食品中的河鲀成分十分重要。

食品鉴定主要有传统形态学方法、理化分析以及分子生物学方法。经过深加工的食品，完全不具备活体状态下的形态后，形态学鉴定的方法完全不能使用。食品的理化分析是指借助测量工具或仪器，针对蛋白质和脂肪等性质进行分析，常见方法有酶联免疫吸附分析 (ELISA)、免疫荧光技术(IFT)和高效液相色等方法。但是这些方法往往需要较为新鲜的样品，一旦食品变质，就会对鉴定结果产生影响。此外，近些年新兴的无损检测技术也受到越来越多的关注。该技术可以利用光学、电磁学和声学的技术，对食品的表面或内部的结构和性质进行检测。例如：X射线法、太赫兹技术和红外光谱法。这些方法虽然快速、无损、信息量大，但是其仪器的维护成本和模型的建立与改进需要的后期成本和技术门槛太高。

随着科学的发展，食品鉴定已从传统形态学、理化分析等发展到基于核酸的分子生物学方法。鉴于不少深加工食品会经过油炸、高压、高温的处理，形态学和理化性质分析在这些情况下往往不起作用，而DNA却能够保存下来。核酸鉴定的方法基于DNA序列的稳定性和多态性，能够在较极端的情况下发挥作用。核酸鉴定在食品真伪鉴定中的应用一般有：物种特异性PCR、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、短串联重复序列(STR)分析、扩增长度多态性(AFLP)分析和单链构象长度多态性(SSCP)分析。

DNA条形码是当今用于物种分类、食品鉴定中的一种核酸鉴定方法，最初由Hebert提出。他利用细胞色素c氧化酶亚基I(cytochrome c oxidase subunit I，COI)基因，分类了7门8 目中的200多个不同物种，并且成功率达到了96.4％以上。目前，DNA条形码被生命条形码协会(Consortium for the Barcode of Life，CBOL)定义为：一段可以高效鉴定物种的标准DNA 区域。DNA条形码的分析针对序列之间的相似性，不同序列之间的序列差异与分类学等级一致。DNA条形码的原理是利用一段短的标准DNA片段来进行物种的鉴定。线粒体基因不含内含子，基因排列紧凑，相对于核基因，更适合作为这一种标准DNA序列。理想的DNA条形码能够提供适中的序列变异，使得种间的遗传距离足够大，而种内的遗传距离足够小，最终在种内种间遗传距离的分布之间存在一个明显的间隔，称为Barcodinggap。DNA条形码是当今可用于物种分类、食品鉴定等多种领域的一门新兴技术，它利用短的DNA序列对物种进行鉴定。

鱼类是目前数量最多也最为多样化的脊椎动物。根据FishBase数据库的数据，目前鱼类共有33,900种(截至2018年2月)，占所有脊椎动物数目约50％。鱼类数目庞大，在趋同进化的影响下，其中不乏隐存种，这一类物种很难通过形态学进行鉴定。另外，有些物种在不同生长阶段会有不同的外形，颜色和形态上的多态性也对鱼类的形态学鉴定造成了影响。而 DNA条形码的使用则灵活许多，大多数情况下只要获得DNA条形码序列，通过和数据库数据进行比对，就能够快速分析不同样品之间的相似性，从而对物种进行鉴定。DNA条形码应用广泛，能够以鱼卵、鱼鳍、鱼鳞和加工过的食品为对象，鉴定其所属物种。Ward等对澳大利亚270种鱼类的COI基因进行扩增和测序，共获得了754条序列。平均种内、属内、科内、目内和科内平局种内遗传距离分别为0.39％，9.93％，15.46％，22.18％和23.27％，并且系统发育树显示同一个物种的鱼类总是聚在一起。Bariche等搜集了地中海中43个物种的156份鱼类标本，利用DNA条形码揭示了地中海种可能有来自红海中的入侵物种。Amaral等利用COI基因分析Colomesus属的河鲀，并发现了一种新物种。

除了传统的PCR技术，荧光定量PCR(Real-time PCR)技术在反应中加入了荧光染料或者荧光探针，使得每一次循环都能够通过荧光信号的强弱进行监控，也能通过最终的荧光信号，计算出初始的模板量。以荧光为检测对象使得荧光定量PCR拥有极高的灵敏度，因此也常被用在核酸检测中。曲勤凤等利用荧光探针检测15种市售鱼丸的鱼肉含量，发现只有4种鱼丸的鱼肉含量符合行业标准规定(不低于10％)。宋丽萍利用荧光探针定量检测了羊肉中的猪肉成分。

高分辨熔解分析(High resolution melting，HRM)是在荧光定量PCR基础上发展出来的新技术，是分子生物学中用于检测双链DNA样品突变，多态性和表观遗传差异的技术。HRM 检测是基于染料和DNA双链结合的原理。一般在HRM分析之前，需要通过PCR对检测的片段进行扩增，扩增过程可以在普通PCR仪上进行，也可以直接在荧光定量仪上进行。扩增结束后，进行从低温到高温的升温过程，升温过程中，目的片段双链逐渐变性成单链。而荧光染料一般结合在双链DNA上，因而在升温过程中，荧光染料脱落，荧光信号逐渐下降。双链DNA的熔解温度基于双链之间的氢键类型，如果某个个体发生了基因突变，那么对应基因的序列就会和野生型序列不同，其氢键类型就可能会不同，从而对熔解温度产生影响。

HRM所使用的染料不同于SYBR GREEN，它需要的是饱和染料，如LCGreen、EvaGreen、 Chromofy和SYTO Dye。普通荧光染料，如SYBR GREEN是非饱和染料，这种染料不能将 DNA双链上所有位点都完全结合，因而会产生荧光染料的重排，而且高浓度情况下会对PCR 过程产生抑制。在热变性过程中，当DNA双链发生部分变性时，变性部分上脱落的非饱和染料会和未变性部分结合，重新产生荧光信号，因为总荧光信号变化不大。饱和染料能将所有位点都结合上，因而在升温变性、荧光染料脱落的过程中，未变性的DNA双链没有染料可以结合的部位。所以只要发生变性，荧光信号强度就会有变化，因而饱和染料的分辨率比普通染料高，可以检测到单个碱基的变异。

由于熔解曲线取决于产物的GC含量、长度、序列和链的互补性，因此即使是相同的基因，即使只有一个碱基不同，也能够通过熔解曲线的不同来进行分辨。Pereira等以葡萄叶、葡萄汁和葡萄酒为对象进行HRM分析，设计并筛选出了1对能够同时在3种样品都起效的引物。类似地，HRM还应用于过敏原、致病微生物和中草药中有毒植物成分的检测。HRM以其快速以及高灵敏度的优势，越来越多的在食品掺假、有毒有害成分检测中发挥作用。HRM广泛应用在鱼类和食品检测当中，但在河鲀鱼种类检测中鲜有报道。

本发明旨在以4种我国东部沿海地区常见的河鲀为研究对象，即河鲀有黄鳍东方鲀 (Takifugu xanthopterus)、暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)、菊黄东方鲀(Takifuguflavidus) 和红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)，筛选构建适合的DNA条形码COI序列，并在此基础上，设计2对HRM引物，提供一种基于COI序列的河鲀及其他鱼肉制品的HRM快速鉴定方法。另外，针对市售鱼肉制品的DNA高度降解，难以获得全长的COI序列。因此本实验利用自己设计的两对引物进行HRM实验，自行设计的HRM引物具有较高的特异性，对河鲀DNA 具有很好的扩增能力，几乎不扩增非河鲀鱼类DNA。

发明内容

本发明旨在以4种我国东部沿海地区常见的河鲀为研究对象，即河鲀有黄鳍东方鲀 (Takifugu xanthopterus)、暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)、菊黄东方鲀(Takifuguflavidus) 和红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)，筛选构建适合的DNA条形码COI序列，并在此基础上提供一种基于COI序列的河鲀及其他鱼肉制品的快速鉴定方法。

本发明的发明人发现COI序列在快速鉴定河鲀及其鱼肉制品的应用。在本发明一些优选地实施例中，所述河鲀选自黄鳍东方鲀(Takifugu xanthopterus)、暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)、菊黄东方鲀(Takifugu flavidus)和红鳍东方鲀(Takifugurubripes)。

本发明结合东部沿海地区的河鲀养殖市场，选取常见的4种河鲀(红鳍东方鲀、暗纹东方鲀、菊黄东方鲀和黄鳍东方鲀)为研究对象。PCR并测序获得了4种河鲀的3种线粒体DNA 条形码基因：细胞色素c氧化酶亚基I基因(COI)、细胞色素b氧化酶基因(Cytb)和控制区序列(D-loop)。综合比对4种河鲀的3种DNA条形码的碱基组成，我们发现D-loop序列的AT含量最高，而且种内碱基组成差异最大，COI和Cytb的碱基组成相似，而且种内几乎没有变异；通过对比3种DNA条形码的内种间K2P遗传距离箱形图和直方图，我们发现D-loop 的种内种间遗传距离的分布范围最大，几乎观察不到DNA barcoding，其次是Cytb，而COI 的种内种间遗传距离分布范围最小，Barcoding gap最为明显；最后我们比对了3种DNA条形码的系统发育树结构，发现COI的种内分支最少，支长最短；Cytb适中，而D-loop的分支最多，支长而明显。综合以上结论本发明提出COI基因用来鉴定该4种河鲀的最适DNA 条形码。

本发明提供一种HRM引物在鉴定河鲀及其他鱼肉制品中的应用，其中，HRM引物序列为：正向引物COIHRM168：5’-CCCCTTATAATCGGAGCCCC-3’，反向引物COIHRM255： 5’-GCAGAAGGAGGAAGGATGGG-3’；或，正向引物COIHRM175， 5’-TAATCGGAGCCCCAGACATG-3’；反向引物COIHRM262， 5’-GATGCGAGCAGAAGGAGGAA-3’。

在本发明一个优选地实施例中，本发明提供的HRM引物在鉴定河鲀及其他鱼肉制品中的应用，包括如下步骤：

步骤1)基因组DNA的提取；

步骤2)HRM反应程序，HRM程序分别包括河鲀模板DNA，正向和反向引物，HRM 预混液。

更优选地，步骤1)河鲀鱼肉食品的DNA提取采用的是CTAB法裂解，并用酚-氯仿进行DNA抽提；

在本发明一个具体实施方式中，HRM体系是20μL，分别包括河鲀模板DNA，120ng；正向和反向引物(10μM)，0.4μL；2×HRM预混液，10μL，最后用无RNase的灭菌水补足体积至20μL。反应程序是95℃预变性，10min；95℃变性，5s；60℃退火，10s；75℃-95℃ HRM，2s/0.1℃。

本发明通过对4种河鲀的COI序列进行比对分析，以4种河鲀COI都具有较多变异处为目标序列，设计得到了2对HRM引物。其中第一对引物COIHRM168为正向引物，COIHRM255为反向引物；第二对引物COIHRM175为正向引物，COIHRM262为反向引物。引物序列如下：第一对引物：COIHRM168，5’-CCCCTTATAATCGGAGCCCC-3’；COIHRM255， 5’-GCAGAAGGAGGAAGGATGGG-3’。第二对引物：COIHRM175， 5’-TAATCGGAGCCCCAGACATG-3’；COIHRM262，5’-GATGCGAGCAGAAGGAGGAA-3’。

本实验所用的HRM体系是20μL，分别包括河鲀模板DNA，120ng；正向和反向引物(10μM)，0.4μL；2×HRM预混液，10μL，最后用无RNase的灭菌水补足体积至20μL。反应程序是95℃预变性，10min；95℃变性，5s；60℃退火，10s；75℃-95℃HRM，2s/0.1℃。

本发明通过设计得到2对HRM引物，并完成了对4种河鲀高分辨熔解曲线的分析、市售河鲀肉制品的分析、江浙地区市场常见鱼类的分析和市售无明确标注来源的鱼类食品的分析。通过对比2对引物的扩增曲线、高分辨熔解曲线和鉴定结果，可以确定该2对引物对于河鲀 COI序列具有较高的特异性，其他鱼类的COI序列均得不到有效的扩增，同时引物COIHRM168的鉴定能力强于引物COIHRM175。

附图说明

图1为4种河鲀COI基因电泳图；

图2为4种河鲀COI基因的碱基组成图；

图3为基于COI遗传距离箱形图；

图4为基于COI的遗传距离直方图；

图5为基于COI遗传距离的ABGD建议分组图

图6为4种河鲀基于COI的系统发育树；

图7为4种河鲀扩增曲线；

图8为4种河鲀高分辨率熔解曲线；

图9为9种鱼肉制品的扩增曲线；

图10为9种鱼肉制品的高分辨率熔解曲线；

图11为大黄鱼、小黄鱼、白姑鱼以及大头白姑鱼扩增曲线

图12为未明确标注来源的鱼肉制品扩增曲线

具体实施方式

实施例1河鲀的3种DNA条形码鉴定

1.1实验材料、试剂和仪器

实验材料为4种常见河鲀：黄鳍东方鲀18尾、暗纹东方鲀18尾、菊黄东方鲀18尾、红鳍东方鲀19尾。同时以秋刀鱼(Cololabis saira)作为外群。

主要试剂有：灭菌水、海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技，DP324)、引物(上海生工)、PCR试剂盒(日本TAKARA，Ex Taq)、琼脂糖(上海生工，低电渗琼脂糖 B)，核酸染料(北京庄盟，GoldView)，DNAmarker(日本TAKARA，DL2,000)。

主要仪器有：灭菌锅(上海立德泰勀，LT-CPS50C)、烘箱(上海博迅，GZX-9023MBE)、电子天平(常州奥豪斯仪器，AR224CN)、均质仪(杭州奥盛仪器，Bioprep-24)、恒温水浴锅(杭州雪中炭，XT5205-R10-D31)、离心机(美国Beckman Coulter，Microfuge 20R)、微量紫外分光光度计(杭州奥盛仪器，Nanodrop-100)、PCR仪(德国AnalytikJena，SpeedCycler2)、电泳仪(上海天能，EPS 300)、凝胶成像系统(上海天能，5200Multi)。

1.2实验方法

1.2.1基因组DNA的提取

首先对待提取鱼样品进行预处理。用手术刀片去新鲜鱼表皮组织后，切取鱼的背部肌肉。取25mg肌肉组织，用剪刀剪碎或加液氮碾碎、研磨。预处理后的鱼肉组织的基因组DNA提取方法参照天根生化科技的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP324)，具体操作如下：

1)向已经称好并磨碎的鱼肉组织中加入200μL缓冲液GA，并振荡20s，简短离心；

2)加入20μL蛋白酶K溶液，56℃水浴至组织溶解，简短离心；

3)加入200μL缓冲液GB，颠倒混匀转入70℃水浴至溶液变得清澈透明，简短离心；

4)加入200μL无水乙醇并振荡20s，简短离心；

5)将以上所得转移到吸附柱中，13,400×g离心30s，倒去废液；

6)加入500μL缓冲液GD，13,400×g离心30s，倒去废液；

7)加入600μL漂洗液PW，13,400×g离心30s，倒去废液，并重复一次；

8)空管13,400×g离心2min，倒去废液后晾干吸附柱；

9)将吸附柱转移到新离心管中，加入50μL TE，室温放置2-5min；

10)13,400×g离心2min。

制备好的DNA用Nanodrop-2000核酸蛋白分析仪检测浓度和纯度，-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增的体系与程序

3种DNA条形码候选基因PCR反应体系为50μL，包括模板DNA 500ng，正向和反向引物(10μM)1.5μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTPMix 4μL，Ex Taq酶0.25μL，最后用灭菌水补足体积至50μL。

PCR所用引物分别为COI基因，FishF1，5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；FishR1，5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；FishF2， 5’-TCGACTAATCATAAGATATCGGCAC-3’；FishR2， 5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’。

Cytb，CytbF，5’-TGACTTGAARAACCAYCGTTG-3’；CytbR， 5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’。D-loop，L15998， 5’-TACCCCAAACTCCCAAAGCTA-3’；CSBDH，5’-TGAATTAGGAACCAGATGCCAG-3’。所用PCR程序为：95℃预变性，10min；95℃变性，5min；52℃退火，30s；72℃延伸 30s；最后72℃延伸10min，PCR产物放4℃保存。

1.2.3 PCR产物的测序和生物信息学分析

本实验的DNA序列由上海生工测序完成。对于测序成功获得的序列，首先使用NCBI(美国国家生物技术信息中心，The National Center for Biotechnology Information)的BLAST(The Basic Local Alignment Search Tool)工具在数据库中进行比对。同时对于获得的基因序列，利用MEGA7.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)软件进行多序列比对，算法为ClustalW 最后人工进行序列的删减。遗传距离的计算、邻接树(Neighbor joining，NJ)的构建使用的是Kimura 2-parameter(K2P)模型]，Bootstrap次数为1000次，并舍去支持率低于50％的值。基于种内种间遗传距离的分组使用的是ABGD(Automatic Barcode Gap Discovery)软件。

1.3基于COI基因的DNA条形码鉴定结果与分析

1.3.1 COI基因的PCR扩增及测序

我们对4种河鲀的COI基因进行了扩增。如图1所示，图中M表示DNAmarker，N表示阴性对照(Negative)，可以看到在约750bp处有明显条带。

1.3.2 COI基因序列信息分析

COI基因的碱基组成由MEGA软件计算，结果如图2所示。图中白底黑点、黑底白点、灰色和竖条，分别表示T、C、A、G四种碱基。可以看到4种河鲀的碱基组成相似，AT含量与GC含量接近，略高于GC含量。T、C、A、G含量都在26.6％±0.3％、29.9％±0.3％、 24.7％±0.2％、18.7％±0.2％附近且标准差都极小。

1.3.3种内种间遗传距离分析

基于COI的遗传距离通过MEGA软件计算，使用的是K2P模型，Bootstrap次数为1000次，一共获得2556组种内种间遗传距离信息。基于COI的种内种间遗传距离箱形图如图3 所示，深灰表示种间遗传距离，浅灰表示种内遗传距离，一般箱形图从上至下依次为上边界、上四分位数、中位数、下四分位数和下边界，另外部分异常值由点表示。图3显示，种间遗传距离的上边界和上四分位线重合，说明种间遗传距离的靠上，大量数据集中在上四分位数以后；种内遗传距离的分布则更为极端，四个主要参数基本重合成一条线，说明基本所有的种内遗传距离都集中在0附近，仅有2个异常值。

基于COI的4种河鲀遗传距离直方图如图4所示，深灰柱子表示种间遗传距离，浅灰柱子表示种内遗传距离。直方图可以更为细致的看到数据的分布，其分布和图3箱形图所展示的基本一致，种内遗传距离基本集中在0附近，而中间遗传距离集中在上四分位数之后。另外，最大种内遗传距离小于最小种间遗传距离，种内种间具有明显的Barcodinggap，符合作为DNA条形码的要求。

ABGD是DNA条形码研究中常用的确定DNAbarcoding和分组建议的软件。该软件使用种内差异(P)来推断出针对种内差异的单侧置信限，然后用该置信限作为DNAbarcoding检测超出此限制的第一个显着差距，并用它来分割数据。然后递归地将置信限和DNAbarcoding 检测的推断应用于上一步获得的分组，以获得更精细的分区，如此反复直到没有进一步的分区为止。

如图5所示，随着用于估计单侧置信限的种内遗传距离的增大，ABGD给出的递归分组和原始分组趋于一致，并收敛于5个。具体分组情况为：4种河鲀各自聚在一个分组内，另外一个外群(Outgroup)单独为一组。另外随着种内遗传距离继续增大，分组情况又继续收敛于2个分组，该情况是因为在比对计算中加入了外群，软件认为所有河鲀是一组，剩下的一个外群是一组。

1.3.4系统发育树的构建

根据比对好并人工修剪对其后的数据，构建的NJ系统发育树如图6所示，从上至下分别是菊黄东方鲀、红鳍东方鲀、暗纹东方鲀、黄鳍东方鲀和外群秋刀鱼，依次标记为黑，深灰，灰和浅灰圆点，相应的物种名和照片在各自的右侧展示。

根据分支的先后，可以确定菊黄东方鲀和红鳍东方鲀亲缘关系最近，其次和暗纹东方鲀聚在一起，最后和黄鳍东方鲀聚在一起，而且同一个物种的所有个体均被分配到同一个支上。同时根据ABGD的分组，我们将同一个分组的河鲀个体用框连接，发现系统发育树上的物种分类和ABGD所给出的分组建议是一致的。进一步说明COI基因的进化速率确实和物种的分类等级相关。

1.4基于Cytb基因的DNA条形码鉴定结果与分析

1.4.1 Cytb基因的PCR扩增及测序

我们对4种河鲀的Cytb基因进行了扩增。同样可以看到在约750bp处有明显条带。

1.4.2 Cytb基因序列的比对与信息分析

Cytb基因的碱基组成由MEGA软件计算，结果显示4种河鲀的Cytb碱基组成相似和COI 基因相似，都是AT含量与GC行两接近且AT略高于GC。4种河鲀的T、C、A、G含量都在28.5％、30.6％、25.4％和15.6％附近且标准差都极小，分别为0.3％、0.3％、0.3％和0.2％。

1.4.3种内种间遗传距离分析

基于Cytb基因的种内种间遗传距离箱形图，统计2628组种内种间遗传距离。Cytb基因的分布范围比较大，无论种内还是种间遗传距离，箱形都比COI的明显。种间遗传距的中位数靠上，接近上四分位数，且离上边界较远，说明数据集中在中位数和上四分位数之间。种内遗传距离下边界、中位数重合，说明种内遗传距离基本集中在0附近，但是异常值比COI 明显增多。

基于Cytb的遗传距离直方图，居于箱形图的遗传距离分布解释和直方图体现的基本一致，种内种间遗传距离之间存在明显的Barcodinggap，符合作为DNA条形码的要求。

基于Cytb的ABGD建议分组，其分组结果和COI基因的结果一致，每一个建议分组内都只有一种河鲀，其余一个组也是外群。同时该算法继续收敛于2个分组，详细分组同样是4种河鲀在一个分组，外群单独在一个分组。

1.4.4系统发育树的构建

使用NJ算法的Cytb系统发育树，对比COI的NJ树，Cytb的种内变异比COI大，暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的种内分支数比COI的多，支的长度也有所增加，但每个物种都还聚在同一支上。同时ABGD的建议分组和系统发育树的拓扑结构也是重合的，说明Cytb也满足作为DNA条形码的条件。

1.5基于D-loop序列的DNA条形码鉴定结果与分析

1.5.1 D-loop序列的PCR扩增及测序

我们对4种河鲀的D-loop序列进行了扩增，在约500bp处有明显条带。

1.5.2 D-loop序列的比对与信息分析

D-loop序列图中4种河鲀的碱基组成相似，但是分布与前两种条形码基因不同，D-loop 序列的AT含量明显高于GC含量，这一点与它非翻译序列的特点吻合。T、C、A、G含量分别在27.5％、17.4％、43.2％和11.8％附近，除了红鳍东方鲀以外，标准差都极小。碱基含量的标准差暗示红鳍东方鲀的D-loop序列可能存在较大的种内变异。

1.5.3种内种间遗传距离分析

D-loop的种内种间遗传距离共计2279组。对比前两个DNA条形码，D-loop的箱形更为明显，说明总体的分布比较分散，数据跨度较大。种间遗传距离上下边界、上下四分位数和中位数明显，箱形完整。中位数靠近上四分位，说明数据在后半部比前半部集中。种内遗传距离的中位数大约处在上下四分位的中间，但是下边界和下四分位重合，说明除了0附近高度集中外，还有一部分数据较为贴近正态分布。

种内遗传距离的分布和箱形图的解读基本一致，但是种间遗传的分布存在连个峰，这一点箱形图没有表现出来。另外，4种河鲀的最大种内遗传距离和最小中间遗传距离接近，存在一个狭小且不明显的Barcodinggap。

针对D-loop序列ABGD给出的建议分组和前两种DNA条形码一致，当算法收敛于5个分组时，每一种建议分组内部只有一种河鲀物种，外群单独成一种；当算法收敛于2个分组时，4种河鲀为一个分组，外群单独为一个分组。

1.5.4系统发育树的构建

基于D-loop序列的NJ树，除了菊黄东方鲀外，其他3种河鲀的D-loop序列在种内也有较大变异。根据分支的先后，D-loop序列的系统发育树认为暗纹东方鲀和红鳍东方鲀亲缘关系较近，其次和菊黄东方鲀汇在一支，最后和黄鳍东方鲀聚在一起。根据ABGD的建议分组，将同一个分组的个体进行框选，可以看到分组情况同样是和系统发育树的分支情况是一致的。

1.6 3种DNA条形码鉴定结果比较分析

PCR扩增并测序获得3种DNA条形码序列后，我们将获得的序列与BOLD数据库和GeneBank数据库进行比对，以确定各个序列所对应的物种。具体结果如表4所示，可以看到，无论是BOLD数据库还是GeneBank数据库，3种DNA条形码的比对结果均和形态学的标记结果一致。

表4数据库比对结果

对比3种DNA条形码的序列信息，针对每一种条形码，4种河鲀的碱基组成相似，而且 4种河鲀的COI和Cytb碱基组成的标准差都极小，红鳍东方鲀的D-loop碱基组成标准差较大。另外COI和Cytb的GC含量接近，都是AT和GC参半，AT略高于GC，而D-loop序列的AT含量远高于GC。由于D-loop在线粒体序列上属于控制区，因而GC含量不高，通过比较碱基组成的标准差，可以看出D-loop存在较高的种内变异。

种内种间遗传距离箱形图显示：COI的种内种间遗传距离的分布范围最小，其次是Cytb，而D-loop的种内种间遗传距离的分布箱形明显、范围最广。这一点和上文碱基组成中分析的 D-loop存在较高程度的种内变异相对应。

种内种间遗传距离直方图显示：COI和Cytb的最大种内遗传距离小于最小种间遗传距离，含有明显的Barcoding gap。基于K2P遗传距离的ABGD建议分组能够给出完美区分4种河鲀的分组建议；而D-loop虽然最大种内遗传距离同样小于最小种间遗传距离，但是两者分布过于接近，Barcoding gap不够明显。

基于3种DNA条形码的系统发育树的拓扑结构接近，从树的形状上能够较好的区分4种河鲀。另外从系统发育树上可以看出不同河鲀之间的亲缘关系远近，如果以外群秋刀鱼为基准，COI认为亲缘关系远近依次为：(菊黄东方鲀≈红鳍东方鲀)>暗纹东方鲀>黄鳍东方鲀； Cytb认为：(红鳍东方鲀≈暗纹东方鲀)≈(菊黄东方鲀≈黄鳍东方鲀)；D-loop序列认为：(暗纹东方鲀≈红鳍东方鲀)>菊黄东方鲀>黄鳍东方鲀。

综合种内种间遗传距离和系统发育树的分析，可以确定是COI为最适合的DNA条形码基因。完全以形态学作为分类手段的方法存在缺陷与不足，在形态学特征不够完整、形态学指标不全以及测量存在误差的情况下，容易造成误判和漏判。同时以COI作为条形码的分类方法，因其适应性广、准确度高的优点，能够在极端情况下对样品进行分类和鉴定。

实施例2基于COI基因的河鲀及其他鱼肉制品快速鉴定方法

结合实施例1得到的最适DNA条形码COI序列和已经获得的经过鉴定的4种河鲀，本实施例结合HRM技术提供一种基于COI基因的河鲀及其他鱼肉制品快速鉴定方法

2.1实验材料、试剂和仪器

材料：9种市售河鲀鱼肉食品、5种市售非河鲀鱼肉食品、10种未明确标注来源的鱼肉食品。具体种类见表5：

表5售鱼肉食品样品表

试剂：NaCl、Tris Base、Na₂-EDTA、CTAB、Tris饱和酚(pH＝8.0)异戊醇、乙醇、异丙醇、HRM分析试剂盒(天根生化科技，FP210)。

仪器：恒温金属浴(杭州奥盛仪器，MK200-1A)、荧光定量PCR仪(德国Qiagen，Rotor-Gene Q)。

2.2实验方法

2.2.1基因组DNA的提取

市售河鲀鱼肉食品的DNA提取采用的是CTAB法裂解，并用酚-氯仿进行DNA抽提，具体操作如下：

1)称取50mg样品在液氮中磨碎并转入2mL离心管中，加入600μL CTAB裂解液，充分振荡混匀；

2)加入600μL酚-氯仿-异戊醇混合试剂，充分震荡30s，12000×g离心3min；

3)取上清，加80％体积的异丙醇，轻轻摇动30s，12000×g离心4min；

4)弃上清，加入500μL70％乙醇清洗1次；

5)弃上清，加入500μL无水乙醇清洗1次，室温晾干；

6)加入50μL TE(pH＝8.0)溶液溶解，-20℃保存备用。

其中CTAB裂解液由0.02g/mLCTAB、0.08g/mLNaCl、0.01g/mLTrisBase、和 0.01g/mLNa₂-EDTA配置而成；酚-氯仿-异戊醇混合试剂由Tris饱和酚、氯仿和异戊醇按照体积比25︰24︰1混合配制而成。

2.2.2特异性HRM引物设计及HRM程序

对筛选到的COI序列进行序列比对，找到4种河鲀COI序列之间同源性较高和同源性较低的部分，一般同源性高的区域和同源性低的区域间隔分布，通过在序列一致性较高区域设计引物，可以扩增同源性低的区域。引物的设计参考了一般荧光定量引物的设计要求，具体设计步骤如下：

1)一般地，目的片段长度为60-90bp，引物长度为18-27bp，Tm值为57-63℃，GC含量为20-80％。本论文引物设计采用的是在线引物设计软件Primer3；

2)挑选得分较高的几条序列，检查引物的二级结构，尽量避免引物二聚体、发夹结构和错配的产生。本实验采用DINAMelt对设计的引物在多个温度和离子浓度下进行二级结构检查；

3)由于引物是根据特定基因设计的，还需要检查该引物在全基因组中的特异性，一般采用引物序列在相应基因组序列中BLAST的方法。

市售鱼肉制品的DNA高度降解，难以获得全长的COI序列。因此本实验利用COI序列，自己设计的两对引物进行HRM实验。其中第一对引物COIHRM168为正向引物，COIHRM255为反向引物；第二对引物COIHRM175为正向引物，COIHRM262为反向引物。

2对HRM引物序列如下所示。第一对引物：COIHRM168，5’- CCCCTTATAATCGGAGCCCC-3’；COIHRM255，5’-GCAGAAGGAGGAAGGATGGG-3’。第二对引物：COIHRM175，5’-TAATCGGAGCCCCAGACATG-3’；COIHRM262，5’-GATGCGAGCAGAAGGAGGAA-3’。

本实验所用的HRM体系是20μL，分别包括河鲀模板DNA，120ng；正向和反向引物(10μM)，0.4μL；2×HRM预混液，10μL，最后用无RNase的灭菌水补足体积至20μL。反应程序是95℃预变性，10min；95℃变性，5s；60℃退火，10s；75℃-95℃HRM，2s/0.1℃

2.2.3 HRM鉴定4种河鲀

以4种河鲀为对象，检验2对引物的鉴别能力。从扩增曲线(图7)可以看出引物两对引物的扩增效率均较高，在25个循环之后基本都达到了扩增的平台期。两对引物标准化后的熔解曲线如图8所示，实线表示菊黄东方鲀、虚线(2个破折号线)表示红鳍东方鲀、点线表示黄鳍东方鲀、长短线表示暗纹东方鲀、。4种河鲀的熔解曲线有明显的差异。对比两对引物的熔解曲线，可以看到忽略个别极端值后引物COIHRM168的红鳍东方鲀和菊黄东方鲀的曲线分布更为紧凑，而黄鳍东方鲀的曲线更为松散，暗纹东方鲀曲线分布较引物COIHRM175基本一致。

具体的鉴定结果见表8和表9中缺失的编号是实验过程中的异常值，已经被剔除，另外无法鉴定或错误的鉴定结果在表中以灰底标出。标准样品的具体鉴定结果正确，引物COIHRM168的鉴定结果置信度均在95％以上，引物COIHRM175的鉴定结果置信度在94％以上。对比两表可以发现引物COIHRM168的鉴定结果准确度更高、也没有错误或无法鉴定的值。

表8种河鲀高分辨率熔解分析鉴定结果(COIHRM168)

表9种河鲀高分辨率熔解分析鉴定结果(COIHRM175)

实施例3几种市售鱼肉制品的快速鉴定结果与分析

基于实施例1和2，我们用两对引物对市售的9种常见“河鲀肉”制品进行HRM分析，检测食品包装上的标注是否真实。标准样品由上文的黄鳍东方鲀、暗纹东方鲀、菊黄东方鲀和红鳍东方鲀组成，分别由点线、实线、长短线和虚线表示，灰色点线表示待鉴定的“河鲀肉”制品。扩增曲线如图9所示，除去个别异常值，对比两张扩增曲线，所有的样品都有明显的扩增曲线，初步确定样品是河鲀。

高分辨率熔解曲线如图9所示，引物COIHRM168红鳍东方鲀的曲线比引物COIHRM175 的更为松散。另外可以看到灰色的线分布范围和蓝色线分布范围有较大的重合。

最终通过HRM鉴定结果表可以看到具体每一个个体的鉴定结果(表10和表11)，表中标灰底的为鉴定不出或者鉴定错误的样品，每个样品有三个重复。另外两个表中前36个样品为标准样品，因此没有展示。表10展示的是引物COIHRM168的鉴定结果，每个样品的鉴定结果以其三个平行鉴定结果中的多数为准。可以看到7号样品和9号样品各有一个平行存在鉴定错误，总体置信度均在93％以上。表11表示的是引物COIHRM175的鉴定结果，可以看到表中被准确鉴定出来的样品不多，鉴定能力明显不如引物COIHRM168。

表10 9种鱼肉制品分辨率熔解分析鉴定结果表(COIHRM168)

表11 9种种鱼肉制品分辨率熔解分析鉴定结果表(COIHRM175)

实施例4

我们利用上述自行设计的引物对市售的5种非河鲀食品(大黄鱼、小黄鱼、白姑鱼以及大头白姑鱼)进行了HRM实验，如图11所示，各种鱼类的荧光信号几乎不变，即使有起跳趋势，也处在30个循环之后，说明自行设计的引物具有较高的特异性，在对河鲀DNA具有很好的扩增能力，几乎不扩增非河鲀鱼类DNA。

实施例5

最后我们对市售的几种未明确标注鱼肉种类的食品进行了HRM检测，如图12所示，可以看到荧光信号很低，起跳趋势均在30个循环之后才有所表现。本论文认为这些样品中不含有河鲀源DNA。

实施例3、4、5上对9种市售河鲀肉制品、5种非河鲀食品和10种未注明来源的鱼肉制品进行河鲀源成分的检测。结果显示本研究检测的9种市售河鲀肉制品均为红鳍东方鲀，5 种非河鲀食品和10种未注明来源的鱼肉制品均检测不到河鲀源成分。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 用于鉴定河鲀及其他鱼肉制品的HRM引物及方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tcaaccaacc acaaagacat tggcac 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tagacttctg ggtggccaaa gaatca 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcgactaatc ataagatatc ggcac 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

acttcagggt gaccgaagaa tcagaa 26

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tgacttgaar aaccaycgtt g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ccggtctgaa ctcagatcac gt 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

taccccaaac tcccaaagct a 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tgaattagga accagatgcc ag 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ccccttataa tcggagcccc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gcagaaggag gaaggatggg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

taatcggagc cccagacatg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gatgcgagca gaaggaggaa 20

Claims (5)

1.HRM引物在鉴定河鲀及其他鱼肉制品中的应用，其中，HRM引物序列为：

正向引物COIHRM168：5’-CCCCTTATAATCGGAGCCCC-3’，

反向引物COIHRM255：5’-GCAGAAGGAGGAAGGATGGG-3’；

或，

正向引物COIHRM175，5’-TAATCGGAGCCCCAGACATG-3’；

反向引物COIHRM262，5’-GATGCGAGCAGAAGGAGGAA-3’。

2.根据权利要求1所述的HRM引物在鉴定河鲀及其他鱼肉制品中的应用，其中，该应用包括如下步骤：

步骤1)基因组DNA的提取；

步骤2)HRM反应程序，HRM程序分别包括河鲀模板DNA，正向和反向引物，HRM预混液。

3.根据权利要求2所述的HRM引物在鉴定河鲀及其他鱼肉制品中的应用，其中，HRM反应程序是95℃预变性，10min；95℃变性，5s；60℃退火，10s；75℃-95℃HRM，2s/0.1℃。

4.根据权利要求3所述的HRM引物在鉴定河鲀及其他鱼肉制品中的应用，其中，该应用包括如下步骤：步骤1)河鲀鱼肉食品的DNA提取采用的是CTAB法裂解，并用酚-氯仿进行DNA抽提。

5.根据权利要求1～4所述的HRM引物在鉴定河鲀及其他鱼肉制品中的应用，HRM引物序列为：

正向引物COIHRM168：5’-CCCCTTATAATCGGAGCCCC-3’，

反向引物COIHRM255：5’-GCAGAAGGAGGAAGGATGGG-3’。