CN113088574A - 一种检测大鲵分布的环境dna方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子技术领域，具体涉及一种检测大鲵分布的环境DNA方法。具体技术方案为：一种检测大鲵分布的环境DNA方法，使用至少一对引物对待测样品进行PCR扩增检测，电泳结果中出现158～224bp的阳性条带，则认为待测样品来源的环境中分布有大鲵，所述引物对为Ad_Cytb_E1，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。本发明利用残留水体中的中国大鲵粪便、皮肤脱落物及尸体等环境DNA，结合分子生物学技术，开发出具有高特异性、高灵敏度和通用性强的引物，建立了一种可针对大鲵属不同物种的分布进行快速、标准化检测的方法。

Description

一种检测大鲵分布的环境DNA方法

技术领域

本发明属于分子技术领域，具体涉及一种检测大鲵分布的环境DNA方法。

背景技术

中国大鲵(Andrias davidianus complex)是全球两栖动物保护的旗舰物种，由于过度利用、栖息地质量下降和面积减少、环境污染等原因，其野生种群急剧减少,被中国生物多样性红色名录和世界自然保护联盟红色名录列为极危物种。栖息地保护和人工种群增殖放流是该物种的重要保护措施，而检测原始或放流个体及其种群的分布是制定和评估保护措施的基础。

但由于该物种栖于水下、活动隐秘、自然种群数量极少，传统的调查方法难以凑效、耗时耗力且成本很高，亟待开发新的技术手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以快速、标准化检测大鲵分布的环境DNA方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一组引物对，序列为SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2。

相应的，所述引物对在检测大鲵中的应用。

相应的，利用所述引物对制备的试剂盒、试纸、检测卡纸。

相应的，一种检测大鲵分布的方法，使用至少一对引物对对待测样品进行PCR扩增检测，电泳结果中出现158～224bp的条带，则认为待测样品来源的环境中分布有大鲵，所述引物对为Ad_Cytb_E1，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。

优选的，引物对包括Ad_Cytb_E3或Ad_Cytb_E5中的任意一对或两对，Ad_Cytb_E3的序列为：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6，Ad_Cytb_E5的序列为：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10。

优选的，进行2个样品重复的PCR扩增检测，若两次重复结果不一致，则再检测一次，如果两次检测为阳性，则判定待测样品来源的环境中分布有大鲵。

优选的，PCR扩增后，对扩增产物进行测序，将测序结果在NCBI网站用Nucleotideblast程序比对，序列第一相似结果为中国大鲵(Andrias davidianus)则判定待测样品来源的环境中分布有大鲵。

优选的，PCR扩增体系为25μL，包括10μL Mix，12.5μL ddH₂O，正反向引物各0.5μL，模板2μL，模板为提取的待测样品的DNA。

优选的，PCR扩增反应条件为：预变性95℃4min，变性95℃40s，退火51.2℃60s，延伸72℃30s，再延伸72℃8min，累计35个循环。

本发明具有以下有益效果：本发明利用残留水体中的中国大鲵粪便、皮肤脱落物及尸体等环境DNA，结合分子生物学技术，开发出具有特异性和扩增效率高的引物，建立了一种可针对大鲵属不同物种的分布进行快速、标准化检测的方法。

附图说明

图1为Ad_Cytb_E1引物扩增中国大鲵组织样的扩增产物电泳图；

图2为Ad_Cytb_E3引物扩增中国大鲵组织样的扩增产物电泳图；

图3为Ad_Cytb_E5引物扩增中国大鲵组织样的扩增产物电泳图；

图4为Ad_Cytb_E1引物检测中国大鲵的灵敏度展示图；

图5为Ad_Cytb_E1引物铜马沟大鲵野化训练基地水样扩增产物电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种使用eDNA技术进行大鲵分布检测的方法，具体包括如下步骤：

使用序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2(Ad_Cytb_E1，目标片段长度224bp)，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4(Ad_Cytb_E2，目标片段长度158bp)，SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6(Ad_Cytb_E3，目标片段长度160bp)，SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8(Ad_Cytb_E4，，目标片段长度164bp)，SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10(Ad_Cytb_E5，目标片段长度162bp)所示的5对引物中的任意一对或几对，对待测样品进行PCR扩增检测(序列顺序均为5’-3’)。电泳结果中出现158～224bp的条带，则判定为阳性，认为待测样品来源的环境中分布有大鲵。

优选的方案为：使用引物对Ad_Cytb_E1、Ad_Cytb_E3、Ad_Cytb_E5中的任意一对或几对。更优选的方案为：使用引物对Ad_Cytb_E1。

为避免假阳性的发生，可选的操作为：进行两个样品重复，两个重复的结果不一致时，则再检测一次，如果两次检测为阳性，则判定为阳性，如果两次检测为阴性，则判定为阴性；还可选的操作为：在eDNA扩增后对产物进行测序，将测序结果在NCBI网站用Nucleotideblast程序比对，序列第一相似结果为中国大鲵则确认为阳性结果。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：引物灵敏度验证

1、中国大鲵组织样DNA使用TIANamp Genomic DNA Kit进行提取。使用前文所述5对引物分别PCR扩增从浙江古田山捕获的22尾中国大鲵的组织样DNA(浓度为1.55ng/μL，编号1～22)。扩增结果在琼脂糖凝胶电泳后均能出现唯一清楚的条带，条带的序列长度介于150～250bp。

根据扩增条带的亮度也即扩增效率，判断引物Ad_Cytb_E1、Ad_Cytb_E3、Ad_Cytb_E5的扩增效果好于Ad_Cytb_E2、Ad_Cytb_E4。

2、选取扩增效果稍差的6个DNA样品，将DNA原液稀释20倍后(样品浓度0.0775ng/μL)，分别使用上述扩增效果较好的3对引物进行PCR扩增。扩增结果如图1、2、3所示，分别表示Ad_Cytb_E1、Ad_Cytb_E3、Ad_Cytb_E5的扩增结果；1～6为DNA样品编号，M为条带分别为100～600bp的marker，NC为阴性对照样品(纯净水)。Ad_Cytb_E1的扩增效果最好。

3、对Ad_Cytb_E1进行灵敏度梯度试验。模板(编号20)的最初浓度为13ng/μL，稀释浓度梯度为10^-1～10^-12，每个浓度进行5次独立的PCR扩增，然后通过凝胶电泳检测扩增效果。结果如图4所示。在常规PCR扩增下，PCR阴性对照未扩增出条带，Ad_Cytb_E1引物对可检测浓度为1.3×10^-7ng/μL。

需要说明的是，本实施例中，PCR扩增体系均为25μL，包括10μLMix，12μL ddH2O，正反向引物各0.5μL，模板2μL。反应条件为预变性4℃4min，变性95℃40s，退火51.2℃60s，延伸72℃30s，再延伸72℃8min，累计35个循环。

实施例二：引物特异性验证

应用两种方法进行引物特异性验证：

(1)在NCBI网站，利用primer BLAST功能(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)对GenBank数据库进行Ad_Cytb_E1引物特异性模拟验证。Ad_Cytb_E1经primer BLAST后证明：特异性较高，与其完全匹配的202条序列均来源于中国大鲵，源自其他物种的序列均不能完全匹配，不匹配碱基数4～10个，大鲵属近缘物种日本大鲵有一条序列不完全匹配，不匹配碱基数为1，显示也可能能够扩增该样品。

(2)将中国大鲵和同域分布的其它7种两栖动物：中国瘰螈(Paramesotritonchinesis)、西藏山溪鲵(Batrachuperus tibetanus)、淡肩角蟾(Megophrys boetteri)、镇海林蛙(Rana zhenhaiensis)、花臭蛙(Odorrana schmackeri)、华南湍蛙(Amolopsricketti)和棘胸蛙(Quasipaa spinosa)的组织样品(如表1所示)以及空白对照用Ad_Cytb_E1引物进行PCR扩增。

表1中国大鲵同域7种两栖动物物种信息

PCR扩增结果显示：与中国大鲵同域分布的2个有尾类和5个无尾类物种均无目的条带，即确为阴性结果。证实该引物在野外实地调查中具有良好的抗干扰性。

实施例三：引物通用性验证

1、检验Ad_Cytb_E1引物扩增中国大鲵各支系的情况。检验方法为：从中国大鲵4个遗传支系中选取7尾有代表性的个体(如表2)，分别提取这7个个体的DNA，使用Ad_Cytb_E1引物进行PCR扩增，凝胶电泳后均可见目标条带，通过一代测序验证确为大鲵细胞色素b基因序列，显示Ad_Cytb_E1引物对中国大鲵不同遗传支系均具有良好的扩增效力。

表2不同支系大鲵样品信息

2、为进一步验证能否同时扩增不同支系大鲵的环境DNA，进行二代测序。将表2中各样品DNA稀释5倍，在Ad_Cytb_E1正反向引物的5’端添加不同的6bp识别接头，共计7对接头标记，以区分不同的样品，如表3所示。实践中，可以根据需要自由组合样品与接头标记的关系，本实施例中，将表2、3中编号相同的样品与接头标记一一对应。

表3 7对标记序列信息展示

样品编号	Barcode号	对应碱基序列	Barcode号	对应碱基序列
					H1	Barcode1	ATCACG	Barcode25	ACTGAT
H2	Barcode2	CGATGT	Barcode26	ATGAGC
					H3	Barcode3	TTAGGC	Barcode27	ATTCCT
H4	Barcode5	ACAGTG	Barcode29	CAACTA
					H5	Barcode6	GCCAAT	Barcode30	CACCGG
H6	Barcode7	CAGATC	Barcode31	CACGAT
					H7	Barcode11	GGCTAC	Barcode35	CATTTT

从各扩增产物中分别取2μg，将全部扩增产物混合后，送北京诺禾致源科技股份有限公司，通过Illumina Novaseq 6000的PE-150策略建库，进行高通量测序。

最终获得高质量序列1046343条，其中目标序列960201条(91.76％)，非目标序列86142条。经匹配接头识别，7个样品获得的序列数介于506～21019条。各样品样品的目的单倍型所占平均比例为92.06％±2.87％(mean±SD)，证明Ad_Cytb_E1引物对不同遗传背景的中国大鲵的DNA扩增具有高效性和通用性。

本实施例中，PCR扩增体系为：50μL，包括25μL高保真Mix，21μL N-F water，正反向引物各1μL，模板2μL。反应条件为：预变性94℃4min，变性94℃20s，退火51.2℃20s，延伸72℃10s，72℃8min，累计35个循环。测序数据用PEAR软件拼接(Zhang et al.,2014)，设置参数为拼接后序列长度必须为236bp，重叠片段长度为30bp，修剪后最小长度86bp。拼接后再经fastx_toolkit软件的fastq_quality_filter质控命令过滤低质量的拼接序列，设置每个reads中最少有90％的碱基需要有30的质量值，然后应用fastx_toolkit软件的fastx_barcode_splitter.pl命令匹配接头。最后应用Seqkit软件(Shen et al.,2016)的seqkitrmdup命令去除重复后，用seqkit grep、awk、cut、sed命令提取和统计目标序列。其中，fastx_toolkit的网址为：http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html。

实施例四：使用引物进行水样检测的效果展示

水样取样的样本量按照中国大鲵放流位点的分布和密度设计。2018年10月和2019年9月，分别在成都市郫都区中国大鲵养殖场(4个养殖池)、四川都江堰铜马沟中国大鲵野化训练基地(7个位点)和浙江古田山自然保护区(15个位点)采集水样，水样采自表层(水下0.3～0.6m)，每位点取水量为4.5L，取样两份(一份备用)。取样前先用84消毒液将塑料桶清洗一遍，再用超纯水冲清洗三遍，再用取样地水源润洗采样桶三遍。每次取样须更换橡胶手套，采集的水样须在6小时内带回实验室或在采样地立即进行真空抽滤。

真空抽滤采用真空泵抽滤系统，玻璃砂芯、滤膜、镊子先用自来水清洗后，再用超纯水润洗并经高温高压灭菌处理。抽滤后，将垫于滤芯上的0.45μm混合纤维素滤膜用消毒后的镊子折叠装入含95％酒精的2mL EP管中保存，或者直接放进2mL EP管中-20℃保存。

为排除不同取样点间的交叉污染，于两个取水点之间过滤4.5L超纯水，收集滤膜并提取DNA作为阴性对照。

过滤水样后，在与组织样提取不同的房间采用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取DNA。提取DNA后，用实施例一的扩增方法和Ad_Cytb_E1引物，对每个eDNA样品进行三次重复的PCR扩增，并同时设置阴性对照及阳性对照，阳性对照为从大鲵肌肉样品中提取的DNA。

PCR产物经1.2％凝胶电泳检测，DNA分子量标准选用Marker B(100～600bp)，若电泳结果中出现分子量约224bp的条带，则判定为水样eDNA检测呈阳性。为避免假阳性和假阴性结果的出现，对所有PCR产物扩增结果进行一代测序验证。各个地点阳性结果检出率计算公式为：

阳性检出率＝检出位点数/检测位点总数×100％。检测结果如表4。

表4水样检测结果展示

并以铜马沟大鲵野化训练基地为例，展示扩增产物电泳图，如图5所示。图5中，NC表示阴性对照(纯净水)，PC表示阳性对照，M是条带为100～600bp的marker。其中，1～7为取样点位置，1为大鲵放归点上游，2～6为实际放归点，7为放归点下游。

结果表明：本发明提供的eDNA引物能够检测中国大鲵残留DNA，但存在一定假阴性结果，其检出率随种群密度的降低而下降。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种检测大鲵分布的环境DNA方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物(Ad_Cytb_E1)

<400> 1

tcttcagcat tttcatcmgt gg 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 反向引物(Ad_Cytb_E1)

<400> 2

ggaaggacat aaccaacaaa agc 23

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 正向引物(Ad_Cytb_E2)

<400> 3

gatgtaaact atggctgg 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 反向引物(Ad_Cytb_E2)

<400> 4

attactaaga ataggagaac 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 正向引物(Ad_Cytb_E3)

<400> 5

gagatgtaaa ctatggct 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 反向引物(Ad_Cytb_E3)

<400> 6

attactaaga ataggagaac 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 正向引物(Ad_Cytb_E4)

<400> 7

tgccgagatg taaactat 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 反向引物(Ad_Cytb_E4)

<400> 8

attactaaga ataggagaac 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 正向引物(Ad_Cytb_E5)

<400> 9

ccgagatgta aactatgg 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 反向引物(Ad_Cytb_E5)

<400> 10

attactaaga ataggagaac 20

Claims (9)

1.一组引物对，其特征在于：序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。

2.权利要求1所述引物对在检测大鲵中的应用。

3.利用权利要求1所述引物对制备的试剂盒、试纸、试剂或检测卡纸。

4.一种检测大鲵分布的环境DNA方法，其特征在于：使用至少一对引物对对待测样品进行PCR扩增检测，电泳结果中出现158～224bp的条带，则认为待测样品来源的环境中分布有大鲵，所述引物对为Ad_Cytb_E1，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。

5.根据权利要求4所述检测大鲵分布的方法，其特征在于：引物对包括Ad_Cytb_E3或Ad_Cytb_E5中的任意一对或两对，Ad_Cytb_E3的序列为：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6，Ad_Cytb_E5的序列为：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10。

6.根据权利要求4所述检测大鲵分布的方法，其特征在于：进行2个样品重复的PCR扩增检测，若两次重复结果不一致，则再检测一次，如果两次检测为阳性，则判定待测样品来源的环境中分布有大鲵。

7.根据权利要求4所述检测大鲵分布的方法，其特征在于：PCR扩增后，对扩增产物进行测序，将测序结果在NCBI网站用Nucleotide blast程序比对，序列第一相似结果为中国大鲵则判定待测样品来源的环境中分布有大鲵。

8.根据权利要求4所述检测大鲵分布的方法，其特征在于：PCR扩增体系为25μL，包括10μL 2×Taq PCR Mix，12.5μL ddH₂O，正反向引物各0.5μL，模板2μL，模板为提取的待测样品的DNA。

9.根据权利要求4所述检测大鲵分布的方法，其特征在于：PCR扩增反应条件为：预变性95℃4min，变性95℃40s，退火51.2℃60s，延伸72℃30s，再延伸72℃8min，累计35个循环。

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