CN113930535B - 一种梅片树ssr分子标记、引物、试剂盒及开发方法与应用 - Google Patents

一种梅片树ssr分子标记、引物、试剂盒及开发方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农林领域，涉及一种梅片树SSR分子标记、引物、试剂盒及开发方法与应用。本发明基于全长转录本数据，开发了梅片树SSR分子标记并提供了可以鉴定上述SSR分子标记的引物和试剂盒，该SSR分子标记、引物和试剂盒能够将梅片树与其他近缘物种有效地区分，对梅片树遗传多样性分析和亲缘关系分析、梅片树种质资源的筛选和分子辅助育种具有重要意义。

Description

一种梅片树SSR分子标记、引物、试剂盒及开发方法与应用
技术领域
本发明涉及农林领域，涉及一种梅片树SSR分子标记、引物、试剂盒及开发方法与应用。
背景技术
植物分子标记是继形态标记、细胞标记、生化标记之后发展起来的一种基于植物个体遗传物质核苷酸序列差异的标记技术，被广泛地应用于植物遗传育种中，如基因定位、辅助标记选择、种质资源评价、基因克隆、杂种优势预测、杂交育种及跟踪育种过程等方面。常用的植物分子标记技术有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR和SNP等。
简单序列重复(SSR)是一类由1-6个碱基组成的基元串联重复而成的DNA序列，在同种不同的植物个体中有不同的重复次数，可以作为一种分子标记。这种分子标记，分布广，多态性丰富，遗传信息量大，通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，具有很好的稳定性和多态性。但扩增SSR时所用的引物，必须基于特定的植物基因组序列或转录组序列进行设计。随着测序技术的不断提高，基于Pacbio Sequel的全长转录组测序，可以比较容易地获得植物的全长转录本。基于全长转录本，在SSR两端设计引物，扩增SSR序列，构建个体图谱，可以对植物个体进行分析。这种基于全长转录组序列的SSR分子标记，DNA用量少，技术要求低，成本低廉，可重复性高，被广泛地应用于植物资源的分子鉴定方面。
梅片树是樟科樟属植物阴香(Cinnammonia burmannii)的一个化学型，其枝叶富含右旋龙脑，是天然右旋龙脑的一种良好资源植物。但是在外观形态上，梅片树与其他近缘物种如樟科樟属的芳樟、龙脑樟、油樟等较难区分。利用分子标记技术有望能够有效地鉴定梅片树种质资源。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种梅片树SSR分子标记。
本发明的再一目的在于提供上述梅片树SSR分子标记的开发方法，该方法基于全长转录本测序，开发得到上述梅片树SSR分子标记。
本发明的另一目的在于提供上述梅片树SSR分子标记的应用。
本发明的第四目的在于提供一种用于鉴定上述梅片树SSR分子标记的引物组。
本发明的第五个目的在于提供一种用于鉴定上述梅片树SSR分子标记的试剂盒，该试剂盒包含上述鉴定梅片树SSR分子标记的引物组。
本发明的第六个目的在于提供上述引物组和试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种梅片树SSR分子标记，为引物对P1、P2、P3、P4、P5、P6和P7扩增得到的片段中的至少一种，其中，引物对P1、P2、P3、P4、P5、P6和P7的核苷酸序列如下所示：
引物P1-F：5’-CCTTTCATTTTGCGTGTTTG-3’；
引物P1-R：5’-AGATGGGGTGATGAACTTCG-3’；
引物P2-F：5’-GGTGTTGCATACGTTCATGG-3’；
引物P2-R：5’-TCATCAACTAAAGAGACTATACTTCCA-3’；
引物P3-F：5’-GCTCAGAGCGCTTTCTCTTC-3’；
引物P3-R：5’-GAGACTCGGCAGGTTTCTTG-3’；
引物P4-F：5’-ATCCTTTCTCTGCCACCCTC-3’；
引物P4-R：5’-TTTGCTGGAATCCAAGAAGG-3’；
引物P5-F：5’-ACTAAAATCAAAGCGCCCAC-3’；
引物P5-R：5’-CACCGGAGGAGAATATTGGA-3’；
引物P6-F：5’-GTCAAGGCTCCTGCAAACTC-3’；
引物P6-R：5’-GGAATCGAGCAGAAAAGCAG-3’；
引物P7-F：5’-TGCTGACGTCATCTTTCTGC-3’；
引物P7-R：5’-TTCGAGCTTTCCTCCTTAACC-3’；
所述的梅片树SSR分子标记的开发方法，包含如下步骤：
(1)对梅片树全长转录本进行测序，将测序结果去冗余、校正，得到梅片树全长转录本；
(2)对梅片树全长转录本的所有序列进行搜索，寻找序列中的SSR；
(3)根据SSR信息在SSR序列两侧进行引物设计；
(4)采用梅片树与其他近缘物种作为模板，进行SSR-PCR扩增、电泳及数据分析，得到扩增效果良好的引物对；该引物对扩增得到的基因型对应梅片树SSR分子标记；
步骤(1)所述的测序优选：采用Pacbio Sequel方法；
步骤(2)所述的搜索优选采用软件MISA参数配置为：definition(unit_size,min_repeats):2-6 3-5 4-4 5-4 6-4；interruptions(max_difference_between_2_SSRs):100；
步骤(3)所述的引物设计方法为：用primer3(version 1.1.4)在SSR序列两侧进行引物设计，引物长度18-27bp，退火温度(Tm)57-63℃之间，PCR产物长度在100-280bp之间，尽量避免引物二级结构如发卡结构、二聚体、错配的出现；
所述的梅片树SSR分子标记在梅片树遗传多样性分析和亲缘关系分析中的应用；
所述的梅片树SSR分子标记在梅片树种质资源筛选中的应用；
所述的梅片树SSR分子标记在梅片树育种中的应用；
一种用于鉴定上述梅片树SSR分子标记的引物组，包含引物对P1、P2、P3、P4、P5、P6和P7，其核苷酸序列如下所示：
引物P1-F：5’-CCTTTCATTTTGCGTGTTTG-3’；
引物P1-R：5’-AGATGGGGTGATGAACTTCG-3’；
引物P2-F：5’-GGTGTTGCATACGTTCATGG-3’；
引物P2-R：5’-TCATCAACTAAAGAGACTATACTTCCA-3’；
引物P3-F：5’-GCTCAGAGCGCTTTCTCTTC-3’；
引物P3-R：5’-GAGACTCGGCAGGTTTCTTG-3’；
引物P4-F：5’-ATCCTTTCTCTGCCACCCTC-3’；
引物P4-R：5’-TTTGCTGGAATCCAAGAAGG-3’；
引物P5-F：5’-ACTAAAATCAAAGCGCCCAC-3’；
引物P5-R：5’-CACCGGAGGAGAATATTGGA-3’；
引物P6-F：5’-GTCAAGGCTCCTGCAAACTC-3’；
引物P6-R：5’-GGAATCGAGCAGAAAAGCAG-3’；
引物P7-F：5’-TGCTGACGTCATCTTTCTGC-3’；
引物P7-R：5’-TTCGAGCTTTCCTCCTTAACC-3’；
一种用于鉴定上述梅片树SSR分子标记的试剂盒，包含上述鉴定梅片树SSR分子标记的引物组；
所述的用于鉴定上述梅片树SSR分子标记的试剂盒优选还包含如下组分：
DNA Buffer、dNTP、Taq酶和ddH2O；
所述的引物组和试剂盒在梅片树遗传多样性分析和亲缘关系分析中的应用；
所述的引物组和试剂盒在梅片树种质资源筛选中的应用；
所述的引物组和试剂盒在梅片树育种中的应用；
本发明基于全长转录本数据，开发了梅片树SSR分子标记。通过BioPac Sequel进行全长转录组测序，序列经过去冗余，校正后获得全长转录本。基于梅片树的全长转录本，使用软件MISA对转录组的所有序列进行搜索，寻找序列中的SSR位点。用primer3(version1.1.4)在SSR序列两侧进行引物设计，优化SSR-PCR扩增体系，在特定的扩增条件下进行扩增，扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凝胶成像仪成像，SPSS进行聚类分析，从32条引物中筛选获得7条能够显著较好地区分同的梅片树及樟属其他近缘植物的SSR引物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明基于全长转录本序列，搜索SSR序列；同时在SSR序列两侧设计引物，优化SSR-PCR反应体系，进行扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后银染，电泳条带数据经过聚类分析。结果显示7对引物共扩增出条带115条，其中多态性条带114，多态性比率为99.13％。平均每对引物扩增出的多态性条带为16.29条。从聚类的结果看，基本符合物种的系统进化关系。
(2)本发明提供的SSR分子标记能够将梅片树与其他近缘物种有效地区分，对梅片树遗传多样性分析和亲缘关系分析、梅片树种质资源的筛选和分子辅助育种具有重要意义。
(3)本发明还提供了鉴定梅片树SSR分子标记的引物组和试剂盒，该引物组和试剂盒可应用于梅片树遗传多样性分析和亲缘关系分析、种质资源筛选和分子辅助育种等中。
附图说明
图1是不同串联重复单元类型的SSR在总SSR中所占比例的统计图。
图2是SSR分布图，其中，X坐标为SSR类型，Y坐标数值是m个碱基重复n次发生的次数，具体重复的次数应按照颜色与图例对应，Z坐标是SSR数目。
图3是SSR-PCR DNA浓度优化的琼脂糖凝胶电泳检测结果分析图，其中，泳道1-3(扩增引物为P1)、5-7(扩增引物为P5)分别为在20μL反应体系中DNA模板含量为20、30、40ng时的扩增结果，泳道4为500DNA Marker，扩增模板为梅片树M11，反应体系其他组分为DNABuffer 2μL，上下游引物各0.2μmol/L，dNTP 0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶1U，ddH2O补足20μL。
图4是SSR-PCR引物浓度优化的琼脂糖凝胶电泳检测结果分析图，其中，泳道1-4(扩增引物为P1)、6-9(扩增引物为P5)分别为在20μL反应体系中引物总浓度为0.1、0.2、0.3、0.4μmol/L时的扩增结果，泳道5为500DNA Marker，扩增模板为梅片树M11，反应体系其他组分为DNA Buffer 2μL，DNA含量30ng，dNTP 0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶1U，ddH2O补足20μL。
图5是SSR-PCR dNTP浓度优化的琼脂糖凝胶电泳检测结果分析图，其中，泳道1-3(扩增引物为P1)、5-7(扩增引物为P5)分别为在20μL反应体系中dNTP浓度为0.20、0.15、0.10mmol/L时的扩增结果，泳道4为500DNA Marker，扩增模板为梅片树M11，反应体系其他组分为DNA Buffer 2μL，DNA含量30ng，上下游引物各0.2μmol/L，Taq DNA聚合酶1U，ddH2O补足20μL。
图6是SSR-PCR Taq DNA聚合酶浓度优化的琼脂糖凝胶电泳检测结果分析图，其中，泳道1-4(扩增引物为P1)、6-9(扩增引物为P5)分别为在20μL反应体系中Taq DNA聚合酶浓度为0.5、1.0、1.5、2.0U时的扩增结果，泳道5为500DNA Marker，扩增模板为梅片树M11，反应体系其他组分为DNA Buffer2μL，DNA含量30ng，上下游引物各0.2μmol/L，dNTP0.2mmol/L，ddH2O补足20μL。
图7是SSR-PCR扩增条件流程图。
图8是引物P2的SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳银染图，其中，泳道从左至右分别为50bpLander、m、Za-Zd、R1、R3、R4、X2、100bpLander、50bpLander、U1-U3、U5、L1-3、L6、100bpLander、50bpLander、M4、M7、Mh、M11、Y1、Y3、Yr3、Y7，其中m为500marker。
图9是SSR银染聚类结果分析图，其中，M：梅片树；Y：阴香；U：桉樟；L、X：龙脑樟；Z：香樟；R：肉桂。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例基于Pacbio Sequel的方法对梅片树全长转录本进行测序并进行数据统计，具体方法如下所示：
(1)全长转录组测序：提取梅片树(Cinnammonia burmannii B1)(见表2，样本名称：M，种植于校园内，由广东华清园生物科技有限公司提供)RNA，反转录成cDNA，采用Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit进行文库构建，上机测序。从下机数据中提取CCS(Circular Consensus Sequence)序列，根据CCS序列是否含3’端引物和5’端引物以及是否嵌合对CCS进行分类，对全长序列进行去冗余聚类，并用非全长序列对其进行校正，得到全长转录本(广州基迪奥生物科技有限公司完成)。
(2)全长转录组原始数据统计：测序平台PacBio测序后，共获得33.83Gb的原始数据，总碱基数为36323230896bp；总序列数目为16646838，序列的平均长度是2181；N50(将所有序列从大到小排序，并依次相加，当累加到所有序列总长度的50％时，该序列的长度即为N50)为2610。统计结果如表1所示。
表1subreads统计表
Figure BDA0003297568110000061
实施例2串联序列重复(SSR)分析及引物设计
(1)SSR分析：使用软件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对实施例1获得的全长转录本数据的所有Isoform进行搜索，寻找Isoform中的SSR。配置参数：definition(unit_size,min_repeats):2-6 3-5 4-4 5-4 6-4；interruptions(max_difference_between_2_SSRs):100。
(2)梅片树中SSR结构的统计分析：基于实施例1获得的全长转录本数据，发现共有7669个SSR序列分布在全长转录组序列中。不同串联重复类型的SSR在总的SSR中所占的比例见图1，在短的串联重复序列中AG/CT所占的比例最高，为39.5％，其次为AAG/CTT，占15.6％。SSR的分布图见图2，2-3个碱基的SSR数量最多。
(3)引物设计：根据找到的SSR信息使用primer3(version 1.1.4)在SSR序列两侧进行引物设计：引物设计的主要参数为：引物长度18-27bp，退火温度(Tm)57-63℃之间，PCR产物长度在100-280bp之间，尽量避免引物二级结构如发卡结构、二聚体、错配的出现。
实施例3SSR引物验证
(1)样本收集：植物材料来源见表2。
表2植物样本
Figure BDA0003297568110000071
(2)植物叶片DNA的提取：剪取步骤(1)收集的植物样本的嫩叶，清洗擦干后剪碎至0.5cm*0.5cm，液氮中研磨至粉末状，采用改良后的CTAB法进行DNA提取，得到植物样品DNA；
(3)SSR-PCR体系确立及优化：根据梅片树全长转录本数据设计了32对引物，探究dNTP、DNA、引物以及Taq DNA聚合酶在SSR-PCR反应中的最佳浓度，扩增产物采用质量百分比为0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。各影响因素的梯度设置如表3：
表3 SSR-PCR影响因素及试验梯度
Figure BDA0003297568110000072
Figure BDA0003297568110000081
(4)引物序列及退火温度确定：根据梅片树全长转录本数据设计了32对引物，探究引物序列、扩增条件对SSR-PCR反应的影响，其中，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，一定退火温度退火30s，72℃延伸30s，38个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
结果显示，最佳反应体系为：DNA Buffer 2μL，模板DNA含量30ng(见图3)，引物浓度0.4μmol·L-1(见图4)，dNTP浓度0.15mmol·L-1(见图5)，Taq酶1U(见图6)，ddH2O补足至20μL，PCR扩增条件见图7。
经过预实验筛选出7对扩增效果较好的引物并确定了引物的退火温度，结果如表4。
表4 SSR引物序列
Figure BDA0003297568110000082
实施例4电泳条带数据分析
(1)SSR-PCR扩增及电泳：采用7对根据梅片树转录组设计的SSR引物(表4)，以表2中24个样本(表2，除去M样本)的叶片DNA作为对象，在实施例3获得的最佳反应体系中按照最佳反应程序进行SSR-PCR扩增，扩增产物采用质量百分比为12％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，其中，电泳条件为150V、100mA，电泳时间6h；电泳后的银染显色，拍照后进行带型分析，其中，引物对P2的SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳银染图见图8。
(2)条带数据分析：扩增产物使用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后通过银染的方式查看扩增结果，SSR的电泳图采用Quantity one和Gel pro软件进行条带读取和统计，有条带的位点输出数据为1，无条带的位点输出数据为0，得到0，1矩阵。对该表格的数据用SPSS19.0采用平方Euclidean距离通过组间联接的方式进行系统聚类。
结果见图9，SSR体系的7对引物共扩增出条带115条，其中多态性条带114，多态性比率为99.13％。引物P2扩增的条带最少为17条，而引物P3扩增条带数量最多，共有28条，平均每对引物扩增出的多态性条带为16.29条。对以上数据采用SPSS19.0进行聚类分析，当相对遗传距离为20.5时24个样本被分为四类(见图9)。龙脑樟、桉樟聚成一类，香樟和肉桂分别为第二、第三类，第四类为梅片树和阴香。从相似性矩阵看，发现种内遗传相似性中L2和L3的相似性最高，相似度达到0.743。而在24个样本中种间遗传相似性最高的是U3和X，相似度达到0.392。从SSR结果来看，香樟与其他右旋龙脑资源植物的跨度较大，亲缘关系较远，比较容易区分。其次肉桂也能通过银染法处理的SSR结果进行区分。而对于第四类的梅片树和阴香，第一类的龙脑樟、桉樟区分度不大。
上述实验结果说明SSR体系具有良好的多态性，能够对樟科植物及其近缘种的亲缘关系进行有效区分。在实际应用中使用上述引物进行SSR分子标记并采用银染法得出的结果能够有效将不含右旋龙脑的香樟和肉桂以及含有右旋龙脑的樟科植物进行区分，提供了一种基于分子层面的樟科植物鉴定方法，这种鉴定方法具有高的稳定性和准确性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东工业大学
<120> 一种梅片树SSR分子标记、引物、试剂盒及开发方法与应用
<130> 1
<160> 14
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<223> 引物P5-R
<400> 10
caccggagga gaatattgga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物P6-F
<400> 11
gtcaaggctc ctgcaaactc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物P6-R
<400> 12
ggaatcgagc agaaaagcag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物P7-F
<400> 13
tgctgacgtc atctttctgc 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物P7-R
<400> 14
ttcgagcttt cctccttaac c 21

Claims (5)

1.一种用于鉴定梅片树SSR分子标记的引物组，其特征在于由引物对P1、P2、P3、P4、P5、P6和P7组成，其核苷酸序列如下所示：
引物P1-F： 5’-CCTTTCATTTTGCGTGTTTG-3’；
引物P1-R： 5’-AGATGGGGTGATGAACTTCG-3’；
引物P2-F： 5’-GGTGTTGCATACGTTCATGG-3’；
引物P2-R： 5’-TCATCAACTAAAGAGACTATACTTCCA-3’；
引物P3-F： 5’-GCTCAGAGCGCTTTCTCTTC-3’；
引物P3-R： 5’-GAGACTCGGCAGGTTTCTTG-3’；
引物P4-F： 5’-ATCCTTTCTCTGCCACCCTC-3’；
引物P4-R： 5’-TTTGCTGGAATCCAAGAAGG-3’；
引物P5-F： 5’-ACTAAAATCAAAGCGCCCAC-3’；
引物P5-R： 5’-CACCGGAGGAGAATATTGGA-3’；
引物P6-F： 5’-GTCAAGGCTCCTGCAAACTC-3’；
引物P6-R： 5’-GGAATCGAGCAGAAAAGCAG-3’；
引物P7-F： 5’-TGCTGACGTCATCTTTCTGC-3’；
引物P7-R： 5’-TTCGAGCTTTCCTCCTTAACC-3’。
2.一种用于鉴定梅片树SSR分子标记的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的鉴定梅片树SSR分子标记的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包含如下组分：
DNA Buffer、dNTP、Taq酶和ddH2O。
4.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂盒在梅片树遗传多样性分析和亲缘关系分析中的应用。
5.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂盒在梅片树种质资源筛选中的应用。
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