CN116716423B - 一种基于虉草转录组序列开发的est-ssr标记引物对及虉草品种的鉴定方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于虉草转录组序列开发的EST‑SSR标记引物对及虉草品种的鉴定方法和应用。本发明的目的在于提供一种基于虉草转录组序列开发的EST‑SSR标记，包括45个微卫星标记及对应对引物。本发明提供的引物的多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，是稳定存在的新标记，填补了虉草基于转录组开发SSR引物的空白。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于虉草转录组序列开发的EST-SSR标记引物对及虉草品种的鉴定方法和应用。
背景技术
虉草(Phalaris arundinacea L.)为禾本科虉草属多年生草本植物，是一种优良的饲草和生态治理草资源。虉草环境适应性强、分布广，可在海拔75～3200m的地方生长。由于其广泛的地理和海拔分布造就了虉草种质资源丰富的遗传多样性，形成了不同的资源种类，使得不同的虉草种质资源在环境适应性、抗逆性、饲用性能等特性上差异明显。
搞清楚物种的遗传多样性及遗传背景是合理保护利用该资源的前提，分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是研究物质遗传多样性及遗传背景的强大工具。目前对虉草遗传多样性和遗传背景的研究还很少，虽然利用了RAPD、ISSR、AFLP、EST-SSR和TRAP等其他物种上的通用引物进行虉草遗传多样性、遗传连锁图谱等方面研究，但是有关虉草特异引物的报道却较少，导致虉草多样性和虉草背景研究较少，育种进程缓慢。因此，丰富虉草特异引物库已成为当务之急。
简单重复序列(SSR，Simple Sequence Repeat)又称为微卫星DNA，是分子标记辅助育种首选标记之一。其以2～6个核苷酸为基本单位的串联重复序列组成的DNA片段，长度大多为100～200个碱基对，具有分布广泛，多态性丰富，重复性好，共显性遗传等特点，已被广泛应用于种质资源遗传多样性及遗传背景研究、品种鉴定、分子标记辅助育种等方面。转录组测序(RNA-seq)技术是利用高通量测序技术对某一状态下的组织或者细胞中的RNA进行深度测序的技术，是一种在转录组水平上高通量、低成本分析基因表达差异的有效手段，尤其对于参考基因组未知的物种，RNA-seq技术是高效率、高通量、低成本地获得大量的转录本信息的主要手段。虉草的基因组信息还未知，通过转录组测序开发虉草特异SSR引物的主要方法，但是目前并未发现利用转录组测序进行虉草SSR引物开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于虉草转录组序列开发的EST-SSR标记，45对EST-SSR标记引物来自于虉草叶片转录组序列，引物的多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，是稳定存在的新标记，填补了虉草基于转录组开发SSR引物的空白。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于虉草转录组序列开发的EST-SSR标记引物对，包括45个微卫星标记及对应对引物，具体为；
Ph-SSR1：序列如SEQ ID NO：1和2所示；
Ph-SSR2：序列如SEQ ID NO：3和4所示；
Ph-SSR3：序列如SEQ ID NO：5和6所示；
Ph-SSR4：序列如SEQ ID NO：7和8所示；
Ph-SSR5：序列如SEQ ID NO：9和10所示；
Ph-SSR6：序列如SEQ ID NO：11和12所示；
Ph-SSR7：序列如SEQ ID NO：13和14所示；
Ph-SSR8：序列如SEQ ID NO：15和16所示；
Ph-SSR9：序列如SEQ ID NO：17和18所示；
Ph-SSR10：序列如SEQ ID NO：19和20所示；
Ph-SSR11：序列如SEQ ID NO：21和22所示；
Ph-SSR12：序列如SEQ ID NO：23和24所示；
Ph-SSR13：序列如SEQ ID NO：25和26所示；
Ph-SSR14：序列如SEQ ID NO：27和28所示；
Ph-SSR15：序列如SEQ ID NO：29和30所示；
Ph-SSR16：序列如SEQ ID NO：31和32所示；
Ph-SSR17：序列如SEQ ID NO：33和34所示；
Ph-SSR18：序列如SEQ ID NO：35和36所示；
Ph-SSR19：序列如SEQ ID NO：37和38所示；
Ph-SSR20：序列如SEQ ID NO：39和40所示；
Ph-SSR21：序列如SEQ ID NO：41和42所示；
Ph-SSR22：序列如SEQ ID NO：43和44所示；
Ph-SSR23：序列如SEQ ID NO：45和46所示；
Ph-SSR24：序列如SEQ ID NO：47和48所示；
Ph-SSR25：序列如SEQ ID NO：49和50所示；
Ph-SSR26：序列如SEQ ID NO：51和52所示；
Ph-SSR27：序列如SEQ ID NO：53和54所示；
Ph-SSR28：序列如SEQ ID NO：55和56所示；
Ph-SSR29：序列如SEQ ID NO：57和58所示；
Ph-SSR30：序列如SEQ ID NO：59和60所示；
Ph-SSR31：序列如SEQ ID NO：61和62所示；
Ph-SSR32：序列如SEQ ID NO：63和64所示；
Ph-SSR33：序列如SEQ ID NO：65和66所示；
Ph-SSR34：序列如SEQ ID NO：67和68所示；
Ph-SSR35：序列如SEQ ID NO：69和70所示；
Ph-SSR36：序列如SEQ ID NO：71和72所示；
Ph-SSR37：序列如SEQ ID NO：73和74所示；
Ph-SSR38：序列如SEQ ID NO：75和76所示；
Ph-SSR39：序列如SEQ ID NO：77和78所示；
Ph-SSR40：序列如SEQ ID NO：79和80所示；
Ph-SSR41：序列如SEQ ID NO：81和82所示；
Ph-SSR42：序列如SEQ ID NO：83和84所示；
Ph-SSR43：序列如SEQ ID NO：85和86所示；
Ph-SSR44：序列如SEQ ID NO：87和88所示；
Ph-SSR45：序列如SEQ ID NO：89和90所示。
本发明还提供了一种虉草品种的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取虉草的基因组DNA；
(2)使用所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行丙烯酰胺凝胶电泳；
(4)对步骤(3)的电泳条带进行分析。
优选的，步骤(2)所述PCR扩增体系以20μL计，包括以下组分：4ul20ng/mL模板DNA、上下游引物各0.5ul、0.5ul DNATaq聚合酶，10ul 2XMasterMix(10X buffer,4mM MgCl2,0.4mM ofdNTPs，天根生化科技(北京)有限公司)，4.5ul dd H2O。
优选的，步骤(2)所述PCR扩增程序包括95℃预变性2min，运行30个循环，每个循环包括：95℃变性30s，45℃复性30s，72℃延伸60s，最后再延伸2min。
优选的，步骤(3)所述丙烯酰胺凝胶的浓度为7～9％。
优选的，步骤(1)所述基因组DNA的浓度为18～22ng/ml。
本发明还进一步提供了所述的引物对在虉草遗传谱系分析或遗传图谱构建中的应用。
本发明还进一步提供了所述的引物对在虉草种质资源的保护或辅助育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明提供的基于转录组的虉草EST-SSR引物可以应用在虉草品种鉴定、遗传谱系分析、遗传图谱构建、种质资源的保护和辅助育种领域：利用45对SSR引物对19个虉草种质资源进行遗传多样性分析，具有重复性好，谱带清晰，多态性高等特点，可广泛应用于虉草品种鉴定、高密度遗传连锁图谱构建、多样性分析和分子辅助育种中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为利用45对SSR引物在19个虉草品种资源的聚类分析图；
图2为45对SSR引物对19份虉草材料的PCoA图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于虉草转录组序列开发的EST-SSR标记引物对，包括45个微卫星标记及对应对引物，具体为；
Ph-SSR1：序列如SEQ ID NO：1和2所示；
Ph-SSR2：序列如SEQ ID NO：3和4所示；
Ph-SSR3：序列如SEQ ID NO：5和6所示；
Ph-SSR4：序列如SEQ ID NO：7和8所示；
Ph-SSR5：序列如SEQ ID NO：9和10所示；
Ph-SSR6：序列如SEQ ID NO：11和12所示；
Ph-SSR7：序列如SEQ ID NO：13和14所示；
Ph-SSR8：序列如SEQ ID NO：15和16所示；
Ph-SSR9：序列如SEQ ID NO：17和18所示；
Ph-SSR10：序列如SEQ ID NO：19和20所示；
Ph-SSR11：序列如SEQ ID NO：21和22所示；
Ph-SSR12：序列如SEQ ID NO：23和24所示；
Ph-SSR13：序列如SEQ ID NO：25和26所示；
Ph-SSR14：序列如SEQ ID NO：27和28所示；
Ph-SSR15：序列如SEQ ID NO：29和30所示；
Ph-SSR16：序列如SEQ ID NO：31和32所示；
Ph-SSR17：序列如SEQ ID NO：33和34所示；
Ph-SSR18：序列如SEQ ID NO：35和36所示；
Ph-SSR19：序列如SEQ ID NO：37和38所示；
Ph-SSR20：序列如SEQ ID NO：39和40所示；
Ph-SSR21：序列如SEQ ID NO：41和42所示；
Ph-SSR22：序列如SEQ ID NO：43和44所示；
Ph-SSR23：序列如SEQ ID NO：45和46所示；
Ph-SSR24：序列如SEQ ID NO：47和48所示；
Ph-SSR25：序列如SEQ ID NO：49和50所示；
Ph-SSR26：序列如SEQ ID NO：51和52所示；
Ph-SSR27：序列如SEQ ID NO：53和54所示；
Ph-SSR28：序列如SEQ ID NO：55和56所示；
Ph-SSR29：序列如SEQ ID NO：57和58所示；
Ph-SSR30：序列如SEQ ID NO：59和60所示；
Ph-SSR31：序列如SEQ ID NO：61和62所示；
Ph-SSR32：序列如SEQ ID NO：63和64所示；
Ph-SSR33：序列如SEQ ID NO：65和66所示；
Ph-SSR34：序列如SEQ ID NO：67和68所示；
Ph-SSR35：序列如SEQ ID NO：69和70所示；
Ph-SSR36：序列如SEQ ID NO：71和72所示；
Ph-SSR37：序列如SEQ ID NO：73和74所示；
Ph-SSR38：序列如SEQ ID NO：75和76所示；
Ph-SSR39：序列如SEQ ID NO：77和78所示；
Ph-SSR40：序列如SEQ ID NO：79和80所示；
Ph-SSR41：序列如SEQ ID NO：81和82所示；
Ph-SSR42：序列如SEQ ID NO：83和84所示；
Ph-SSR43：序列如SEQ ID NO：85和86所示；
Ph-SSR44：序列如SEQ ID NO：87和88所示；
Ph-SSR45：序列如SEQ ID NO：89和90所示。
本发明还提供了一种虉草品种的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取虉草的基因组DNA；
(2)使用所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行丙烯酰胺凝胶电泳；
(4)对步骤(3)的电泳条带进行分析。
优选的，步骤(2)所述PCR扩增体系以20μL计，包括以下组分：
4ul 20ng/mL模板DNA、上下游引物各0.5ul、0.5ul DNATaq聚合酶，10ul 2XMasterMix(10X buffer,4mM MgCl2,0.4mM ofdNTPs，天根生化科技(北京)有限公司)，4.5ul dd H2O。
优选的，步骤(2)所述PCR扩增程序包括95℃预变性2min，运行30个循环，每个循环包括：95℃变性30s，45℃复性30s，72℃延伸60s，循环结束，再延伸2min。
优选的，步骤(3)所述丙烯酰胺凝胶的浓度为7～9％。
优选的，步骤(1)所述基因组DNA的浓度为18～22ng/ml。
本发明还进一步提供了所述的引物对在虉草遗传谱系分析或遗传图谱构建中的应用。
本发明还进一步提供了所述的引物对在虉草种质资源的保护或辅助育种中的应用。本发明前期进行了虉草叶片转录组测序，获得了大量的虉草转录组测序数据。在获得的转录组序列中，采用Microsatellite(MISA)软件识别和定位SSR位点，并用Premier 5.0软件设计SSR引物，引物设计选择位点的重复单元为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最少重复次数分别为9次、7次、6次、5次、4次，且位点距离序列两端大于50bp的序列利用设计引物，引物长度控制在17～24bp，预期产物长度100～300bp，最终筛选300对引物。以4个品种的虉草DNA为模板，利用上述300对SSR引物进行PCR扩增，选择条带清晰、多态性好的引物。
PCR反应体系为20μL，其中包括
4ul 20ng/mL模板DNA、上下游引物各0.5ul、0.5ul DNATaq聚合酶，10ul 2XMasterMix(10X buffer,4mM MgCl2,0.4mM ofdNTPs，天根生化科技(北京)有限公司)，4.5ul dd H2O。
反应程序为95℃预变性2min，然后进行30个循环，每个循环包括：95℃变性30s，45℃复性30s，72℃延伸60s，循环结束，最后延伸2min。PCR产物经过8％丙烯酰胺垂直板电泳，最终获得45对条带清晰、多态性高、重复性好的SSR标记引物；
表1虉草EST-SSR引物序列表
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1多态性高的虉草的EST-SSR引物的开发
本发明提供的基于转录组高通量测序，并结合生物信息学方法进行SSR序列查找和SSR标记引物设计和验证，其具体实施方式如下：
富含SSR位点的Unigene序列筛选：选取虉草嫩叶提取总RNA，构建转录组测序文库，采用Illumina二代测序仪进行高通量测序。测序数据经过严格的过滤后进行组装，得到Unigene，将其作为后续SSR引物开发的背景数据。采用MISA软件对Unigene进行SSR位点搜索，搜索标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸，最少重复次数分别为9、7、6、5、4次。从虉草转录组的272327条Unigene序列中发现了13241个SSR位点，分布在11494个Unigene中，发生频率为4.22％。其中，含有2个及2个以上SSR位点的Unigene序列有1493条，平均每13.09kb出现1个SSR位点。转录组中检测到的SSR位点种类包括一、二、三、四、五、六核苷酸重复单元类型以及混合SSR，其中，二、三核苷酸重复单元的位点较多，分别有2095个和4350个，出现的频率分别为15.82％和32.85％。
用PrimerPremier5.0软件设计SSR引物，引物设计选择位点的重复单元为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最少重复次数分别为9次、7次、6次、5次、4次，且位点距离序列两端大于50bp的序列利用设计引物，引物长度控制在17～24bp，预期产物长度100～300bp，随机挑选300对引物用于扩增。
采集4个虉草材料的幼嫩叶片，置于硅胶中干燥，采用CTAB法提取待测样品的DNA，操作按照CTAB法提取植物DNA方法进行，获得的DNA稀释至20ng/ml，采用琼脂糖凝胶电泳检测样品的DNA质量，母液保存于-80℃超低温冰箱。
以4个遗传材料的虉草DNA为模板，利用上述300对SSR引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20μL，其中包括：
4ul 20ng/mL模板DNA、上下游引物各0.5ul、0.5ul DNATaq聚合酶，10ul 2XMasterMix(10Xbuffer,4mM MgCl2,0.4mM ofdNTPs，天根生化科技(北京)有限公司)，4.5ulddH2O。
反应程序为95℃预变性2min，然后进行30个循环，每个循环包括：95℃变性30s，45℃复性30s，72℃延伸60s，循环结束，最后延伸2min。PCR产物经过8％丙烯酰胺垂直板电泳，最终获得45对条带清晰、多态性高、重复性好的SSR标记引物，获得的45对引物对19份材料进行PCR扩增(如SEQ ID NO：1～90所示)，其后进行垂直板电泳，反应程序上同。
实施例2 45个标记应用于19个虉草品种材料遗传多样性分析
(1)提取表2中虉草品种的基因组DNA，调整浓度至20ng/ml。
表2虉草材料信息
(2)以上述DNA为模板，利用表1中所示引物进行扩增，PCR反应体系为20μL，其中包括：
4ul 20ng/mL模板DNA、上下游引物各0.5ul、0.5ul DNATaq聚合酶，10ul 2XMasterMix(10X buffer,4mM MgCl2,0.4mM ofdNTPs，天根生化科技(北京)有限公司)，4.5ul dd H2O。
反应程序为95℃预变性2min，然后进行30个循环，每个循环包括：95℃变性30s，45℃复性30s，72℃延伸60s，循环结束，最后延伸2min。PCR产物通过8％丙烯酰胺垂直板电泳显示条带，扩增条带通过EXCEL 2016统计，软件GenAlex 6.51b2进行遗传距离、主坐标等相关分析。
(3)获得的条带数据通过FREETREE和FigTree V1.4.3软件进行聚类图构建，获得19个虉草品种的聚类分析图。
基于DICE系数，使用FREETREE软件进一步使用二进制矩阵计算种质对之间的遗传相似性(GS)。然后，使用带算术的未加权对组方法(UPGMA)方法。通过Fig Tree V 1.4.3软件使用引导值(1,000次替换)测试了树状图的稳定性。
聚类分析见图1，在0.7094处可以将19个品种划分为3个进化枝，分别为1、2、3。三个群中，聚类差异较大。其中，进化枝1中种质多来自于北美洲，但来自中国的虉草品种川草3号，群体A的PI505893和PI578092，以及群体OT的PI 272123也在进化枝1中。进化枝2中，包括群体OT和NoA种质。进化枝3中包括中国虉草新品种川西虉草和来自美国的材料。
(4)
表3 45对SSR引物对19份虉草材料的扩增情况
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注：PIC,polymorphic information content,多态性指数；TNB,the totalnumberofbands，总条带数；NPB,the numberofpolymorphic bands，多态性条带；PPB,thepercentage ofpolymorphicbands，多态性条带百分比；MI,markerIndex，标记指数；Rp,resolvingpower，分辨力；I,Shannon diversity index，香农多样性指数；H,heterozygosity，杂合性。
由上表知，基于虉草转录组数据开发的45对标记引物，鉴定为可靠的多态性条带为118条，每个引物对的多态性条带(NPB)数量从1个(SSR17、SSR19等)变为9个(SSR2)，平均条带数为9.48，每个引物对扩增的条带总数(TNB)从4个(SSR17、SSR19等)到16个(SSR2)不等，平均条带数为5.13。各引物多态性条带百分比(PPB)从20.00％(SSR9)变为100％(SSR17、SSR18)，平均为62.15％。此外，还计算了PIC(范围从0.214到0.498)、MI(范围从0.409到3.378)、H(范围从0.214到0.480)、I(范围从0.483到0.723)和Rp(范围从0.684到1.421)评估引物的多态性及其对材料的分辨率。
(5)45对SSR引物对19份虉草材料的PCOA(如图2所示)。
GenAlex 6.51程序可计算种质之间的遗传相似性(GS)。然后，进行主坐标分析(PCoA)。由主坐标图知，群体NoA中大多种质集中于第一象限，但群体A和OT的种质较为分散，群体OT种质分布于二、四象限，群体A种质则除第一象限外均有分布。
(6)
表4遗传多样性指数
19份虉草种质根据地理来源分为三个地理组：NoA(北美洲，包括澳大利亚)，OT(其他地区，波兰，匈牙利)和A(亚洲)，其中NoA具有最高水平的变异性(Na＝3.000，Ne＝1.277，I＝0.266和He＝0.174)。OT组内遗传多样性最高(He＝0.179)，其次是NoA和A组(分别为He＝0.174和0.132)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种基于虉草转录组序列开发的EST-SSR标记引物对，其特征在于，由45个微卫星标记对应的引物对组成，具体为；
Ph-SSR1：序列如SEQ ID NO：1和2所示；
Ph-SSR2：序列如SEQ ID NO：3和4所示；
Ph-SSR3：序列如SEQ ID NO：5和6所示；
Ph-SSR4：序列如SEQ ID NO：7和8所示；
Ph-SSR5：序列如SEQ ID NO：9和10所示；
Ph-SSR6：序列如SEQ ID NO：11和12所示；
Ph-SSR7：序列如SEQ ID NO：13和14所示；
Ph-SSR8：序列如SEQ ID NO：15和16所示；
Ph-SSR9：序列如SEQ ID NO：17和18所示；
Ph-SSR10：序列如SEQ ID NO：19和20所示；
Ph-SSR11：序列如SEQ ID NO：21和22所示；
Ph-SSR12：序列如SEQ ID NO：23和24所示；
Ph-SSR13：序列如SEQ ID NO：25和26所示；
Ph-SSR14：序列如SEQ ID NO：27和28所示；
Ph-SSR15：序列如SEQ ID NO：29和30所示；
Ph-SSR16：序列如SEQ ID NO：31和32所示；
Ph-SSR17：序列如SEQ ID NO：33和34所示；
Ph-SSR18：序列如SEQ ID NO：35和36所示；
Ph-SSR19：序列如SEQ ID NO：37和38所示；
Ph-SSR20：序列如SEQ ID NO：39和40所示；
Ph-SSR21：序列如SEQ ID NO：41和42所示；
Ph-SSR22：序列如SEQ ID NO：43和44所示；
Ph-SSR23：序列如SEQ ID NO：45和46所示；
Ph-SSR24：序列如SEQ ID NO：47和48所示；
Ph-SSR25：序列如SEQ ID NO：49和50所示；
Ph-SSR26：序列如SEQ ID NO：51和52所示；
Ph-SSR27：序列如SEQ ID NO：53和54所示；
Ph-SSR28：序列如SEQ ID NO：55和56所示；
Ph-SSR29：序列如SEQ ID NO：57和58所示；
Ph-SSR30：序列如SEQ ID NO：59和60所示；
Ph-SSR31：序列如SEQ ID NO：61和62所示；
Ph-SSR32：序列如SEQ ID NO：63和64所示；
Ph-SSR33：序列如SEQ ID NO：65和66所示；
Ph-SSR34：序列如SEQ ID NO：67和68所示；
Ph-SSR35：序列如SEQ ID NO：69和70所示；
Ph-SSR36：序列如SEQ ID NO：71和72所示；
Ph-SSR37：序列如SEQ ID NO：73和74所示；
Ph-SSR38：序列如SEQ ID NO：75和76所示；
Ph-SSR39：序列如SEQ ID NO：77和78所示；
Ph-SSR40：序列如SEQ ID NO：79和80所示；
Ph-SSR41：序列如SEQ ID NO：81和82所示；
Ph-SSR42：序列如SEQ ID NO：83和84所示；
Ph-SSR43：序列如SEQ ID NO：85和86所示；
Ph-SSR44：序列如SEQ ID NO：87和88所示；
Ph-SSR45：序列如SEQ ID NO：89和90所示。
2.一种虉草品种的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取虉草的基因组DNA；
（2）使用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
（3）将步骤（2）得到的PCR产物进行丙烯酰胺凝胶电泳；
（4）对步骤（3）的电泳条带进行分析。
3.根据权利要求2所述的一种虉草品种的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增体系以20μL计，包括以下组分：4ul 20 ng/mL模板DNA、上下游引物各0.5 ul、0.5ul DNATaq 聚合酶，10 ul 2X Master Mix，4.5 ul dd H2O。
4.根据权利要求2所述的一种虉草品种的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增程序包括95℃预变性2min，运行30个循环，每个循环包括：95℃变性30s，45℃复性30s，72℃延伸60s，循环结束，最后延伸2min。
5.根据权利要求2所述的一种虉草品种的鉴定方法，其特征在于，步骤（3）所述丙烯酰胺凝胶的浓度为7～9％。
6.根据权利要求2所述的一种虉草品种的鉴定方法，其特征在于，步骤（1）所述基因组DNA的浓度为18～22 ng/ml。
7.权利要求1所述的引物对在虉草遗传谱系分析或遗传图谱构建中的应用。
8.权利要求1所述的引物对在虉草种质资源的保护或辅助育种中的应用。
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| 22份草种质资源遗传多样性的ISSR分析;张永亮;骆秀梅;刘鹏;刘杨;;草地学报(02);全文 * |
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