CN105586338A - 基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的est-ssr引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组，共52对引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCE？ID？NO.1～104所示。本发明还涉及EST-SSR标记引物在牛鞭草遗传多样性分析和在禾本科物种上的转移性方面的应用。本发明所述的52对基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的SSR引物组具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，可有效用于牛鞭草种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、指纹图谱构建、分子标记辅助育种等研究领域以及运用在其他禾本科牧草物种的相关研究上。

Description

基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用
技术领域
本发明涉及SSR引物组领域，具体涉及一种基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用。
背景技术
牛鞭草是禾本科(Gramineae)牛鞭草属(HemarthriaR.Br.)植物的总称，别名牛仔草、铁马鞭，广泛分布于我国长江以南各省(区)及河北、山东、陕西等地。东南亚、印尼、印度及美国、巴西等暖温带和热带地区也有分布。它的种类较多，全世界有近20种，其中扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa)和其近缘种高牛鞭草(Hemarthriaaltissima)是牛鞭草属中尤为重要的2个多年生优良暖季型饲草物种，主要分别分布于我国与非洲地区。因具有生长速度快，高产优质，营养丰富，适口性好，耐贫瘠土壤，高抗及较强的竞争性等优点，该两个牛鞭草物种已在热带、亚热带地区得到广泛的研究与利用。牛鞭草即可放牧利用，又可调制干草、青贮，以及保持水土、绿化环境，因此其在畜牧业发展、生态环境建设和草地农业系统中占有着重要的地位。
尽管牛鞭草具有重要的生态和经济效益，但其种质资源研究工作仍较为薄弱，尤其分子水平研究较少，主要集中于扁穗牛鞭草和高牛鞭草野生种质资源遗传多样性的研究与DNA指纹图谱的构建。虽较多分子标记如AFLP、ISSR、SRAP、SSR、EST-SSR和SCoT等运用于牛鞭草研究中，但它们大多采用运用于其他物种上的通用引物，而有关牛鞭草特异引物却尚无报道。牛鞭草由于种子结实率低，缺乏有效的有性繁育系统，多表现为以茎节扦插为主的无性繁殖，因而常规的育种技术无法加以利用，导致牛鞭草的育种进程停滞不前，现有的品种均为野生驯化而来，分子辅助育种将成为牛鞭草育种的重要手段。但目前牛鞭草的研究成果对于牛鞭草分子育种是远远不足的。因此，丰富牛鞭草基因组资源已成为当务之急。
简单重复序列(SSR，SimpleSequenceRepeat)又称为微卫星DNA，是分子标记辅助育种首选标记之一。其以2-6个核苷酸为基本单位的串联重复序列组成的DNA片段，长度大多为100-200个碱基对，具有分布广泛，多态性丰富，重复性好，共显性遗传，物种间转移性好等特点，已被广泛应用于品种鉴定，种质资源保存和利用、遗传多样性分析、分子标记辅助选育等研究领域。SSR虽是以测序技术为基础的分子标记，但随着目前二代测序的越来越普遍以及三代测序的新起，其开发费用的逐渐降低，加速了它在物种上的开发利用。其中EST-SSR是基于EST序列或cDNA数据开发的一种SSR分子标记。而转录组数据正是开发EST-SSR标记的理想资源，并基于转录组的EST-SSR标记除具有一般分子标记的特点外，还有其特殊优势。第一，信息量大。如果发现一个基因标记与某一性状连锁，那么该转录本就可能与控制此性状的基因相关。第二，通用性好。由于转录本保守性较高，故具有较好的通用性，在亲缘物种之间校正连锁图谱和比较作图方面有很高的利用价值。迄今，未见转录组测序技术运用于牛鞭草植物中，也没有牛鞭草某物种关于EST-SSR分子标记开发应用的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组，所述引物组包括52对引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCEIDNO.1～104所示。
本发明还提供了上述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组在牛鞭草分子遗传多样性分析中以及在牛鞭草种质遗传系谱分析中的应用。
本发明还提供了上述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组在禾本科其它牧草物种上进行遗传多样性分析的应用。
本发明还提供了一种上述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组进行牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析的方法，包括如下步骤：
A、提取待测牛鞭草样品基因组DNA；
B、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEIDNO.1～104所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
C、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；
D、利用步骤C的统计结果进行牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析。
进一步的是，在步骤B中，所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括1.5μL浓度为20ng/μL的模板DNA，7.5μL的2XReactionMix，0.3μL的GoldenDNAPolymerase，0.6μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.6μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。
进一步的是，在步骤B中，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-56℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
进一步的是，所述牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析的统计方法为：利用NTSYS-PC2.l0软件计算遗传相似系数，并进一步基于UPGMA法进行聚类分析，采用POPGENv1.32软件计算Shannon信息多样性指数(I)、Nei’s遗传多样性指数(He)和遗传相似系数。
本发明还提供了一种上述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组在禾本科其它牧草物种上进行遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：
a、提取待测禾本科物种样品基因组DNA；
b、以步骤a提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEIDNO.1～104所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
c、将步骤b得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；
d、利用步骤c的统计结果在禾本科其它牧草物种上进行转移性分析。
进一步的是，在步骤b中，所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括1.5μL浓度为20ng/μL的模板DNA，7.5μL的2XReactionMix，0.3μL的GoldenDNAPolymerase，0.6μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.6μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。
进一步的是，：在步骤b中，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-56℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
本发明的有益效果在于：本发明所述的52对EST-SSR引物组来自扁穗牛鞭草与高牛鞭草幼叶与根系转录组序列，比以往的禾本科共用EST-SSR引物相比具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，同时这些引物成功运用到牛鞭草遗传多样性分析与转移到禾本科其他物种上，丰富了牛鞭草可用SSR引物的数量，并可有效用于牛鞭草种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、指纹图谱构建、分子标记辅助育种等研究以及运用在其他禾本科物种的相关研究上。
附图说明
图1是本发明实施例所述44份牛鞭草材料的UPGMA聚类图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
对扁穗牛鞭草和高牛鞭草幼叶与根系进行转录组测序，得到的大于1kb拼接好的Unigene进行合并后利用软件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)进行EST-SSR位点的扫描。筛选标准为2个碱基至少重复六次，3，4，5，6个碱基至少重复五次才被识别为SSR位点。最后获得了10,888个EST-SSR位点，随后利用Primer3v2.23(http:// primer3.sourceforge.net)对这些候选位点进行了引物设计，设计参数设定为：引物长度范围在18-23nt间，最适长度为21nt；PCR产物的长度在100bp和300bp范围内；引物退火温度为52-58℃，其中55℃为最优温度；GC含量范围在40％到60％间，最适GC含量为50％。最后成功设计了4,846对EST-SSR引物。其中，本发明对其中52对EST-SSR引物组进行了验证和转移性研究，52对EST-SSR引物序列如下表1所示，其核苷酸序列如序列表SEQUENCEIDNO.1～104所示。
表1基于扁穗牛鞭草和高牛鞭草转录组序列开发的52对EST-SSR引物信息
上述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组能够在牛鞭草遗传多样性分析中以及在牛鞭草种质遗传系谱分析中的应用，其分析方法，包括如下步骤：
A、提取待测牛鞭草样品基因组DNA；
首先，筛选出44份牛鞭草材料来验证开发的SSR标记性能，其供试牛鞭草材料的详细情况见表2，其中包括34份高牛鞭草(H.altissima)材料，8份扁穗牛鞭草(H.compressa)材料，以及H.uncinata和H.japonica材料各一份。因牛鞭草为严格营养体繁殖材料，各材料内单株间遗传背景一致，故1份材料只选取1个单株提取DNA。
表2验证开发的EST-SSR引物性能所用的牛鞭草供试材料
接着，进行基因组DNA的提取，选取上述44份牛鞭草材料的健康幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA的浓度与纯度，将合格DNA样品放置于–20℃冰箱中保存备用。
B、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEIDNO.1～104所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括1.5μL浓度为20ng/μL的模板DNA，7.5μL的2XReactionMix，0.3μL的GoldenDNAPolymerase，0.6μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.6μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-56℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
C、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；具体的，先将步骤B得到的PCR扩增产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺＝19∶1，7.5mol/L尿素，1×TBE缓冲液)进行检测，样品点样5μL，以博瑞克公司的D50Marker为对照，350V电压下电泳140min，银染法显影，照相保存。
D、对SSR标记扩增产物的电泳图谱进行人工比对、校正，统计强带或清晰弱带，按照扩增条带的分子量从大到小编号和读取，有扩增条带出现记为“1”，无条带出现记为“0”，建立原始距阵。根据原始距阵，统计EST-SSR标记扩增产物的条带总数和多态性条带数，计算多态性条带百分率(PPB)和引物多态性信息含量(PIC)，PICi＝1-∑Pij 2，其中，PICi表示标记i的多态性信息含量，Pij表示标记i的第j个带型出现的频率，标记i的总带型从1到n。
E、利用步骤D的统计结果进行牛鞭草遗传多样性分析，其具体统计方法为：利用NTSYS-PC2.l0软件计算遗传相似系数，并进一步基于UPGMA法进行聚类分析，采用POPGENv1.32软件计算Shannon信息多样性指数(I)、Nei’s遗传多样性指数(He)。
用44份牛鞭草供试材料的基因组DNA对52对EST-SSR引物进行多态性筛选，基于扩增条带清晰、多态性丰富、稳定性强的原则，共选出34对多态性较理想的EST-SSR引物。其引物扩增详细情况见表3；
表3筛选出的34对EST-SSR引物对44份牛鞭草供试材料的扩增情况
注：Ta,annealingtemperatureofprimerpair；NTA,numberoftotalalleles；NPA,numberofpolymorphicalleles；PA,polymorphicalleles(％)；PIC,polymorphicinformationcontent(％)。
筛选出的34对多态性EST-SSR引物，共扩增出441条谱带，其中多态性谱带420条，多态性条带比率为95.24％，平均每个引物扩增出12.35条多态性谱带，平均多态性信息量(PIC)为0.7136，以及平均Nei’s基因多样性指数和平均Shannon信息指数分别为0.2553和0.3991。表明供试的牛鞭草种质遗传多样性丰富，以及基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组能应用于牛鞭草遗传多样性分析中以及牛鞭草种质遗传系谱分析。
以牛鞭草44份材料和441个位点的谱带数据为原始矩阵，利用NTSY-PC2.10软件对其进行聚类分析，得到44份牛鞭草材料的UPGMA聚类图，如图1所示。材料间的遗传相似系数最大的为0.961(‘广益’与‘雅安’)，最小的为0.578(H244与H215)。基于遗传相似系数的聚类分析表明，在遗传相似系数为0.614处可以很明显地把牛鞭草材料分为3大类。第I类包括扁穗牛鞭草(H.compressa)和高牛鞭草(H.altissima)的所有材料，说明此两个种亲缘关系较近。第II类只包括1份H.japonica材料H244。第III类也只包括1份材料，为H.uncinata的H242材料。在相似系数为0.740处，第I类可分为6个小组，其中，第1至5个小组的材料全属于高牛鞭草(H.altissima)，而第6个小组由所有的扁穗牛鞭草(H.compressa)材料组成。可见，44份牛鞭草材料间的差异明显，来自同一种类的材料基本上都聚为同一类。
本发明所述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组能够在禾本科其它牧草物种上进行遗传多样性分析的应用，其分析方法，包括如下步骤：
a、提取待测禾本科物种样品基因组DNA；
首先，选取禾本科物种，本实施例中选取鸭茅、芒、多花黑麦草以及狼尾草材料，其用于EST-SSR转移性研究的材料的详细情况见表4。禾本科物种的各个材料，采用3个单株混合的方式提取DNA；
表4EST-SSR转移性研究所用材料
接着，进行基因组DNA的提取，选取上述22份材料的健康幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA的浓度与纯度，将合格DNA样品放置于–20℃冰箱中保存备用。
b、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEIDNO.1～104所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括1.5μL浓度为20ng/μL的模板DNA，7.5μL的2XReactionMix，0.3μL的GoldenDNAPolymerase，0.6μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.6μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-56℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存；
c、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；具体的，先将步骤B得到的PCR扩增产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺＝19∶1，7.5mol/L尿素，1×TBE缓冲液)进行检测，样品点样5μL，以博瑞克公司的D50Marker为对照，350V电压下电泳140min，银染法显影，照相保存。对SSR标记扩增产物的电泳图谱进行人工比对、校正，统计强带或清晰弱带，按照扩增条带的分子量从大到小编号和读取，有扩增条带出现记为“1”，无条带出现记为“0”，建立原始距阵。根据原始距阵，统计牛鞭草EST-SSR引物在其他禾本科物种上的可转移的引物数与可转移的引物比率(TR)。
d、利用步骤c的统计结果在禾本科物种上进行转移性分析。
本实施例采用设计出的52对EST-SSR引物对7个鸭茅品种、4个野生芒材料、6个多花黑麦草品种以及5个狼尾草品种进行了扩增分析，结果表明，基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组具有较好的可转移性，结果见表5：
表5牛鞭草SSR引物对4个禾本科物种的可转移性
基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的52对EST-SSR引物组，在多花黑麦草中表现多态的有47对EST-SSR引物，可转移率高达90.38％；在芒中表现多态的有45对EST-SSR引物，可转移率达到86.54％；在鸭茅中表现多态的有42对EST-SSR引物，可转移率为80.77％；在狼尾草中表现多态的EST-SSR引物最少，为33对，可转移率为63.46％。表明基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组可运用于禾本科其它牧草物种上进行遗传多样性分析。

Claims (10)

1.基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组，其特征在于：所述引物组包括52对引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCEIDNO.1～104所示。
2.根据权利要求1所述的基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组在牛鞭草遗传多样性分析中以及在牛鞭草种质遗传系谱分析中的应用。
3.根据权利要求1所述的基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组在禾本科其它牧草物种上进行遗传多样性分析的应用。
4.利用权利要求1所述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组进行牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析的方法，包括如下步骤：
A、提取待测牛鞭草样品基因组DNA；
B、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEIDNO.1～104所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
C、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；
D、利用步骤C的统计结果进行牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析。
5.根据权利要求4所述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组进行牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析的方法，其特征在于：在步骤B中，所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括1.5μL浓度为20ng/μL的模板DNA，7.5μL的2XReactionMix，0.3μL的GoldenDNAPolymerase，0.6μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.6μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。
6.根据权利要求5所述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组进行牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析的方法，其特征在于：在步骤B中，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-56℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
7.根据权利要求4所述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组进行牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析的方法，其特征在于：所述牛鞭草遗传多样性分析、牛鞭草种质遗传系谱分析的统计方法为：利用NTSYS-PC2.l0软件计算遗传相似系数，并进一步基于UPGMA法进行聚类分析，采用POPGENv1.32软件计算Shannon信息多样性指数(I)、Nei’s遗传多样性指数(He)和遗传相似系数。
8.利用权利要求1所述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组在禾本科其它牧草物种上进行遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：
a、提取待测禾本科物种样品基因组DNA；
b、以步骤a提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEIDNO.1～104所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
c、将步骤b得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；
d、利用步骤c的统计结果在禾本科其它牧草物种上进行转移性分析。
9.根据权利要求8所述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组在禾本科其它牧草物种上进行遗传多样性分析的方法，其特征在于：在步骤b中，所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括1.5μL浓度为20ng/μL的模板DNA，7.5μL的2XReactionMix，0.3μL的GoldenDNAPolymerase，0.6μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.6μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。
10.根据权利要求9所述基于扁穗牛鞭草与高牛鞭草转录组序列开发的EST-SSR引物组在在禾本科其它牧草物种上进行遗传多样性分析的方法，其特征在于：在步骤b中，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-56℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
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