CN115873986B - 一种est-ssr分子标记引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种EST‑SSR分子标记引物组及其应用，属于EST‑SSR分子标记技术领域，本发明提供的EST‑SSR分子标记引物组具有重复性好，谱带清晰，多态性高等的特点，是一种稳定存在的新标记，填补了假俭草基于转录组开发SSR引物的空白。同时，本发明提供的EST‑SSR分子标记引物组可应用于假俭草种质资源鉴定、遗传谱系分析、遗传图谱构建、种质资源保护和辅助育种等领域。
Description
技术领域
本发明属于EST-SSR分子标记技术领域，尤其涉及一种EST-SSR分子标记引物及其应用。
背景技术
假俭草[Eremochloa ophiuroides(Munro)Hack]是C4结构的暖季型多年生草本植物，属禾本科黍亚科蜈蚣草属，在蜈蚣草属中只有假俭草具有蔓延速度快、匍匍茎发达，可以用做草坪草的特点，并列于全球三大暖季型草坪草之一。假俭草除了少量分布于斯里兰卡等东南亚及其他一些国家和地区之外，在我国也分布着大量的野生假俭草资源。由于其广泛的地理分布造就了假俭草种质资源丰富的遗传多样性，形成了不同的资源种类，使得不同的假俭草种质资源在环境适应性、抗逆性、绿期等特性上差异明显。
简单重复序列(SSR)是由几个碱基组成的基因序列串联重复而成的DNA序列。根据来源不同可以分为基因组SSR(G-SSR)和植物表达序列标签SSR(EST-SSR)两种，其中EST-SSR是以PCR技术为关键，直接从转录组序列中筛选SSR。因此，EST-SSR具有数量多、开发简单，多态性高和稳定性好的优点，且其多态性可能与基因表达功能直接相关，具有更高的通用性和转化率。随着转录组测序技术的发展与测序成本的降低，也为利用转录组数据开发EST-SSR分子标记提供了便利。
目前，假俭草分子标记数量不足是阻碍其遗传多样性研究的重要因素，且基于假俭草转录组序列开发的EST-SSR引物在假俭草人工绘制种质鉴别示意图构建中的应用尚未见报道。因此，有必要开发一种足量、稳定、高效的EST-SSR分子标记引物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种EST-SSR分子标记引物组及其应用，本发明提供的一种EST-SSR分子标记引物组可应用于假俭草种质资源鉴定、遗传谱系分析、遗传图谱构建、种质资源保护和辅助育种等领域。
为实现上述目的，本发明通过下述技术方案来实现：
一种用于鉴定假俭草种质资源间遗传距离的EST-SSR分子标记引物组，所述EST-SSR分子标记引物组包括扩增SSR1～SSR26所示的分子标记的引物对：
SSR1的引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
SSR2的引物对如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
SSR3的引物对如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
SSR4的引物对如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
SSR5的引物对如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；
SSR6的引物对如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
SSR7的引物对如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；
SSR8的引物对如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；
SSR9的引物对如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示；
SSR10的引物对如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示；
SSR11的引物对如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示；
SSR12的引物对如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示；
SSR13的引物对如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示；
SSR14的引物对如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示；
SSR15的引物对如SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示；
SSR16的引物对如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示；
SSR17的引物对如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示；
SSR18的引物对如SEQ ID No.35和SEQ ID No.36所示；
SSR19的引物对如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示；
SSR20的引物对如SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示；
SSR21的引物对如SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示；
SSR22的引物对如SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示；
SSR23的引物对如SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示；
SSR24的引物对如SEQ ID No.47和SEQ ID No.48所示；
SSR25的引物对如SEQ ID No.49和SEQ ID No.50所示；
SSR26的引物对如SEQ ID No.51和SEQ ID No.52所示。
本发明还提供了一种鉴定假俭草种质资源间遗传距离的试剂盒，包括EST-SSR分子标记引物组和检测试剂。
本发明还提供了一种鉴定假俭草种质资源间遗传距离的的方法，包括如下步骤：
(1)分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；
(2)使用所述EST-SSR分子标记引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)将所述PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得扩增条带，将所述扩增条带在EXCEL 2016中进行统计，并在软件GenAlex 6.51b2中进行遗传距离、主坐标的相关分析，获得统计及分析的数据；
(4)将所述统计及分析的数据通过FREETREE软件进行聚类图构建，获得假俭草种质资源的聚类分析图，即可获得假俭草种质资源间遗传距离的鉴定结果。
优选的，步骤(1)所述基因组DNA的浓度为18～22ng/ml。
优选的，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：3～5μL20ng/ml模板DNA，上下游引物各0.4～0.6μL，0.4～0.6μL DNA Taq聚合酶，8～12μL 2X Reaction Mix，4～5μL ddH2O。
优选的，步骤(2)所述PCR的扩增条件为：92～97℃预变性1～3min；92～97℃变性25～35s，40～50℃复性25～35s，70～75℃延伸50～70s，变性、复性和延伸共运行28～32个循环；循环结束，最后延伸1～3min。
优选的，步骤(3)所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为6～10％。
本发明还提供了一种EST-SSR分子标记引物组在假俭草遗传谱系分析或遗传图谱构建中的应用。
本发明还提供了一种EST-SSR分子标记引物组在假俭草种质资源的保护或辅助育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的EST-SSR分子标记引物组具有重复性好，谱带清晰，多态性高等的特点；本发明提供的基于假俭草转录组序列开发的EST-SSR分子标记引物组可应用于假俭草种质资源鉴定、遗传谱系分析、遗传图谱构建、种质资源保护和辅助育种等领域。
附图说明
图1为将SSR1～SSR26的引物对应用于29个假俭草种质资源的聚类分析图；
图2为SRR1～SSR3在29个假俭草种质资源的扩增位点图；
图3为SRR4～SSR6在29个假俭草种质资源的扩增位点图；
图4为SRR7～SSR9在29个假俭草种质资源的扩增位点图；
图5为SRR10～SSR12在29个假俭草种质资源的扩增位点图；
图6为SRR13～SSR15在29个假俭草种质资源的扩增位点图；
图7为SRR16～SSR18在29个假俭草种质资源的扩增位点图；
图8为SRR19～SSR21在29个假俭草种质资源的扩增位点图；
图9为SRR22～SSR24在29个假俭草种质资源的扩增位点图；
图10为SRR25～SSR26在29个假俭草种质资源的扩增位点图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于鉴定假俭草种质资源间遗传距离的EST-SSR分子标记引物组，所述EST-SSR分子标记引物组包括扩增SSR1～SSR26所示的分子标记的引物对：
SSR1的引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
SSR2的引物对如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
SSR3的引物对如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
SSR4的引物对如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
SSR5的引物对如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；
SSR6的引物对如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
SSR7的引物对如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；
SSR8的引物对如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；
SSR9的引物对如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示；
SSR10的引物对如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示；
SSR11的引物对如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示；SSR12的引物对如SEQ IDNo.23和SEQ ID No.24所示；SSR13的引物对如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示；SSR14的引物对如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示；SSR15的引物对如SEQ ID No.29和SEQ IDNo.30所示；SSR16的引物对如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示；SSR17的引物对如SEQ IDNo.33和SEQ ID No.34所示；SSR18的引物对如SEQ ID No.35和SEQ ID No.36所示；SSR19的引物对如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示；SSR20的引物对如SEQ ID No.39和SEQ IDNo.40所示；SSR21的引物对如SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示；SSR22的引物对如SEQ IDNo.43和SEQ ID No.44所示；SSR23的引物对如SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示；SSR24的引物对如SEQ ID No.47和SEQ ID No.48所示；SSR25的引物对如SEQ ID No.49和SEQ IDNo.50所示；SSR26的引物对如SEQ ID No.51和SEQ ID No.52所示。
在本发明中，所述SSR1～SSR26的引物对的引物序列如表1所示：
表1SSR1～SSR26的引物对的引物序列
注：F为正向引物，R为反向引物。
本发明还提供了一种鉴定假俭草种质资源间遗传距离的试剂盒，包括EST-SSR分子标记引物组和检测试剂。
本发明还提供了一种鉴定假俭草种质资源间遗传距离的方法，包括如下步骤：
(1)分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；
(2)使用所述EST-SSR分子标记引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)将所述PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得扩增条带，将所述扩增条带在EXCEL 2016中进行统计，并在软件GenAlex 6.51b2中进行遗传距离、主坐标的相关分析，获得统计及分析的数据；
(4)将所述统计及分析的数据通过FREETREE软件进行聚类图构建，获得假俭草种质资源的聚类分析图，即可获得假俭草种质资源间遗传距离的鉴定结果。
在本发明中，步骤(1)所述基因组DNA的浓度优选为18～22ng/ml，进一步优选为19～21ng/ml，更优选为20ng/ml。
在本发明中，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系优选为以20μL计，包括：3～5μL20ng/ml模板DNA，上下游引物各0.4～0.6μL，0.4～0.6μL DNA Taq聚合酶，8～12μL 2XReaction Mix，4～5μL ddH2O；进一步优选为包括4μL20ng/ml模板DNA，上下游引物各0.5μL，0.5μL DNATaq聚合酶，10μL 2XReaction Mix，4.5μL ddH2O。
在本发明中，步骤(2)所述PCR的扩增条件优选为：92～97℃预变性1～3min；92～97℃变性25～35s，40～50℃复性25～35s，70～75℃延伸50～70s，变性、复性和延伸共运行28～32个循环；循环结束，最后延伸1～3min；进一步优选为95℃预变性2min；95℃变性30s，45℃复性30s，73℃延伸60s，变性、复性和延伸共运行30个循环；循环结束，最后延伸2min。
在本发明中，步骤(3)所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度优选为6～10％，进一步优选为7～9％，更优选为8％。
在本发明中，步骤(3)所述扩增条带在EXCEL 2016中进行统计的具体方法为：根据某一引物扩增的假俭草的指纹图谱电泳图，统计相同分子量片段处的特征性谱带的有无及相同的电泳迁移率处的特征性谱带的有无，再将具有相同扩增谱带的种质资源分为一组，无此谱带的分为一组；继续加入引物，并依据相同的统计方法依次逐步再进行分类，直至所有参试材料品种均清晰的区分开。
本发明还提供了一种EST-SSR分子标记引物组在假俭草遗传谱系分析或遗传图谱构建中的应用。
本发明还提供了一种EST-SSR分子标记引物组在假俭草种质资源的保护或辅助育种中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：一种EST-SSR分子标记引物组的开发，包括如下步骤：
(1)通过转录组测序获得假俭草样本的转录组数据库，具体为：假俭草全长转录组数据来源于对假俭草品种“武陵假俭草”采用第三代PacBio测序平台(单分子实时测序技术)进行转录组学研究，对假俭草幼叶进行建库测序，并采用二代测序纠正错误，从而获得高质量转录组数据库；
(2)利用MISA软件对步骤(1)所述数据库进行SSR位点搜索。搜索标准为：单核苷酸最少重复10次；二核苷酸至少重复6次；三、四、五、六核苷酸最少重复次数5次；所述重复为碱基重复的次数。
(3)利用Primer 3.0软件设计SSR引物，每条SSR产生2组引物，生成候选引物；
(4)随机挑选数据库中的6份假俭草资源，利用CTAB法提取假俭草基因组DNA，分别采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计对DNA的品质和浓度进行检测，使用步骤(3)中的候选引物进行PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳初步筛选出含有目标条带的引物；所述目标条带的特点为条带清晰且分子量与设计长度相符；
(5)使用步骤(4)中初筛的PCR引物进行PCR扩增，扩增后利用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，筛选出能扩增出步骤(3)中的目标序列的引物，即得到用于鉴定假俭草种质资源的EST-SSR分子标记的引物组，所述EST-SSR分子标记的引物组有26对，具体的引物序列如表1所示。
其中，所述PCR扩增体系以20μL计，包括以下组分：4μL 20ng/mL模板DNA、上下游引物各0.5μL、0.5μLDNATaq聚合酶，10μL2X Reaction Mix，4.5μLdd H2O。PCR扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，45℃复性30s，72℃延伸60s，变性、复性和延伸共运行30个循环；循环结束，最后延伸2min。
实施例2：一种鉴定假俭草种质资源间遗传距离的方法
(1)分别提取表2中的假俭草品种的基因组DNA，调整浓度至20ng/ml。
表2假俭草材料
(2)以基因组DNA为模板，利用SSR1～SSR26的引物对进行扩增，获得PCR产物。
所述PCR扩增的反应体系以20μL计，其中包括：4μL 20ng/mL模板DNA、上下游引物各0.5μL、0.5μL DNATaq聚合酶，10μL 2X Reaction Mix，4.5μL dd H2O。所述PCR扩增的反应条件为95℃预变性2min，95℃变性30s，45℃复性30s，72℃延伸60s，变性、复性和延伸共运行30个循环，循环结束，最后延伸2min。
(3)将所述PCR产物通过8％聚丙烯酰胺垂直板电泳显示扩增条带，扩增条带在EXCEL 2016进行统计，并在软件GenAlex 6.51b2中进行遗传距离、主坐标等相关分析，获得统计及分析的数据；
所述SRR1～SSR26在29个假俭草种质资源的扩增位点图如图2-图10所示。
所述扩增条带在EXCEL 2016中进行统计的具体方法为：根据某一引物扩增的假俭草的指纹图谱电泳图，统计相同分子量片段处的特征性谱带的有无及相同的电泳迁移率处的特征性谱带的有无，再将具有相同扩增谱带的种质资源分为一组，无此谱带的分为一组；继续加入引物，并依据相同的统计方法依次逐步再进行分类，直至所有参试材料品种均清晰的区分开。
所述SSR1～SSR26的引物对对29份假俭草材料的扩增情况如表3所示。
表3SSR1～SSR26的引物对对29份假俭草材料的扩增情况
注：PIC，polymorphic information content，多态性指数；TNB，the totalnumberofbands，总条带数；NPB，the numberofpolymorphic bands，多态性条带；PPB，thepercentage ofpolymorphic bands，多态性条带百分比；MI，markerIndex，标记指数；Rp，resolvingpower，分辨力；I，Shannon diversity index，香农多样性指数；H，heterozygosity，杂合性。
由表3可知，基于假俭草转录组数据开发的26对标记引物，鉴定为可靠的多态性条带为102条，每个引物对的多态性条带(NPB)数量从1个(SSR20)变为7个(SSR6)，平均条带数为3.92，每个引物对扩增的条带总数(TNB)从1个(SSR20)到7个(SSR6)不等，平均条带数为3.96。各引物多态性条带百分比(PPB)从75.00％(SSR9)变为100％(SSR1、SSR2等)，平均为99.03％。
此外，还计算了PIC(范围从0.212到0.525)、MI(范围从0.5到3.401)、I(范围从0.21到0.61)、H(范围从0.11到0.40)和Rp(范围从0.52到4.00)以评估引物的多态性及其对材料的分辨率。结果表明，基于假俭草转录组开发的EST-SSR多态性较好，分辨率高。
(4)获得的条带数据通过FREETREE软件进行聚类图构建，获得29个假俭草品种的聚类分析图，所述聚类分析图如图1所示；并使用FigTree V1.4.3软件测定聚类分析图的稳定性。
具体为，基于DICE系数，使用FREETREE软件进一步使用二进制矩阵计算种质对之间的遗传相似性(GS)。然后，使用带算术的未加权对组方法(UPGMA)，通过Fig TreeV 1.4.3软件使用引导值(1,000次替换)测试树状图的稳定性。
由图1可知，在0.6858处可以将29个品种划分为4个进化枝，分别为1、2、3、4。四个群中，聚类差异较大。其中，进化枝1中种质全部来自于秀水河滩。进化枝2中，包括福州森林公园、杭州和眉山种质。进化枝3中包括武陵假俭草和来自江苏的材料。进化枝4中包括来自四川和广东的材料。
通过FigTree V1.4.3软件的测定可知，基于假俭草转录组开发的EST-SSR稳定性较强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于鉴定假俭草种质资源间遗传距离的EST-SSR分子标记引物组，其特征在于，所述EST-SSR分子标记引物组包括扩增SSR1～SSR26所示的分子标记的引物对：
SSR1的引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
SSR2的引物对如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
SSR3的引物对如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
SSR4的引物对如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
SSR5的引物对如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；
SSR6的引物对如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
SSR7的引物对如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；
SSR8的引物对如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；
SSR9的引物对如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示；
SSR10的引物对如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示；
SSR11的引物对如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示；
SSR12的引物对如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示；
SSR13的引物对如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示；
SSR14的引物对如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示；
SSR15的引物对如SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示；
SSR16的引物对如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示；
SSR17的引物对如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示；
SSR18的引物对如SEQ ID No.35和SEQ ID No.36所示；
SSR19的引物对如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示；
SSR20的引物对如SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示；
SSR21的引物对如SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示；
SSR22的引物对如SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示；
SSR23的引物对如SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示；
SSR24的引物对如SEQ ID No.47和SEQ ID No.48所示；
SSR25的引物对如SEQ ID No.49和SEQ ID No.50所示；
SSR26的引物对如SEQ ID No.51和SEQ ID No.52所示。
2.一种鉴定假俭草种质资源间遗传距离的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的EST-SSR分子标记引物组和检测试剂。
3.一种鉴定假俭草种质资源间遗传距离的的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；
(2)使用权利要求1所述EST-SSR分子标记引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)将所述PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得扩增条带，将所述扩增条带在EXCEL2016中进行统计，并在软件GenAlex6.51b2中进行遗传距离、主坐标的相关分析，获得统计及分析的数据；
(4)将所述统计及分析的数据通过FREETREE软件进行聚类图构建，获得假俭草种质资源的聚类分析图，即可获得假俭草种质资源间遗传距离的鉴定结果。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述基因组DNA的浓度为18～22ng/ml。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：3～5μL20ng/ml模板DNA，上下游引物各0.4～0.6μL，0.4～0.6μLDNATaq聚合酶，8～12μL2XReactionMix，4～5μLddH2O。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR的扩增条件为：92～97℃预变性1～3min；92～97℃变性25～35s，40～50℃复性25～35s，70～75℃延伸50～70s，变性、复性和延伸共运行28～32个循环；循环结束，最后延伸1～3min。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为6～10％。
8.一种权利要求1所述EST-SSR分子标记引物组在假俭草遗传谱系分析或遗传图谱构建中的应用。
9.一种权利要求1所述EST-SSR分子标记引物组在假俭草种质资源的保护或辅助育种中的应用。
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