CN114317800B - 基于侧柏转录组序列开发的est-ssr标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于侧柏转录组序列开发的EST‑SSR标记引物及其应用。所述EST‑SSR标记引物是基于侧柏转录组测序数据获取SSR序列并设计引物，通过琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳筛选三重筛选法获得的扩增稳定、高效多态的微卫星标记引物。本发明利用侧柏不同品种、无性系验证了开发的EST‑SSR标记引物在遗传多样性分析、亲缘关系鉴定方面的有效性，该EST‑SSR标记引物可应用于侧柏属植物遗传多样性分析、亲缘关系与品种鉴定、分子标记辅助选择育种，以及植物新品种保护等研究领域。
Description
技术领域
本发明属于植物分子标记技术领域，具体涉及基于侧柏转录组序列开发的EST-SSR标记引物及其应用。
背景技术
侧柏(Platycladus orientalis(L.)Franco)为柏科侧柏属常绿乔木，属于单属种针叶植物。侧柏在我国有最广的自然分布范围，是重要的生态抗逆树种，具有较高的生态、经济与社会利用价值。侧柏耐旱耐瘠薄、抗逆性强，适应范围广，是我国造林绿化的重要树种；侧柏木质细密、耐腐力强，可作建筑、农具等用材；侧柏生命力强，具有较长的寿命，是我国主要的古树资源、文化树种；侧柏叶具有抗菌、抗氧化、促进毛发生长、止血等药理学作用；侧柏挥发性次生代谢物丰富，是重要的香料成分。在侧柏育种领域，上世纪80年代，侧柏种源试验在全国展开，但不同分布区、不同科研单位间的品种(无性系、优株)命名不同，严重影响了侧柏种质资源的创新利用、新品种保护及良种推广应用。
相比其他植物，我国侧柏新品种选育与分子鉴定工作进展较慢。目前植物新品种DUS测试仅局限于植物学表型鉴定，而侧柏优良品种(无性系)无性繁殖后代在苗期形态特征差异较小，表型鉴定很难精确区分，这也为侧柏植物新品种保护构成了严峻挑战。
微卫星(Simple Sequence Repeats，SSR)分子标记是一种稳定、精确、高效的分子标记技术，被广泛应用于植物遗传评价尤其是遗传多样性分析与亲缘关系鉴定领域。其中，基于表达序列标签的微卫星(EST-SSR)标记相较于传统微卫星标记具有开发效率高、多态性高、重复性好、成本低等优点，在樱桃、皂荚、马尾松、杨树等多种植物遗传多样性研究与亲缘关系鉴定中得以应用。目前，侧柏微卫星分子标记较少，针对侧柏开发的高效多态的EST-SSR引物标记更少。为了更好地开展侧柏及其栽培变种遗传多样性分析，实现侧柏种质资源分子鉴定，进而更好地服务于侧柏植物新品种保护与良种推广应用，急需开发更多高效、稳定、多态的特异性微卫星分子标记引物。
发明内容
为了解决针对侧柏高效、多态、稳定的微卫星分子标记不足的技术问题，本发明基于侧柏转录组序列开发了一套EST-SSR引物，该套EST-SSR引物具有扩增稳定、重复性能好、高效多态的优点，可有效实现侧柏属植物品种的鉴定、遗传多样性分析和亲缘关系鉴定。
第一，本发明保护成套EST-SSR引物。
本发明保护的成套EST-SSR引物包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10和引物对11；
所述引物对1(记作编号为PoE9的EST-SSR标记引物)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2(记作编号为PoE64的EST-SSR标记引物)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3(记作编号为PoE74的EST-SSR标记引物)由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4(记作编号为PoE84的EST-SSR标记引物)由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5(记作编号为PoE85的EST-SSR标记引物)由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6(记作编号为PoE89的EST-SSR标记引物)由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7(记作编号为PoE97的EST-SSR标记引物)由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对8(记作编号为PoE105的EST-SSR标记引物)由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对9(记作编号为PoE133的EST-SSR标记引物)由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；
所述引物对10(记作编号为PoE139的EST-SSR标记引物)由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；
所述引物对11(记作编号为PoE166的EST-SSR标记引物)由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成。
其中，所述编号为PoE9的EST-SSR标记引物的重复序列为(AT)6，所述编号为PoE64的EST-SSR标记引物的重复序列为(CT)8，所述编号为PoE74的EST-SSR标记引物的重复序列为(CA)8，所述编号为PoE84的EST-SSR标记引物的重复序列为(AT)9，所述编号为PoE85的EST-SSR标记引物的重复序列为(CTG)5，所述编号为PoE89的EST-SSR标记引物的重复序列为(TC)18，所述编号为PoE97的EST-SSR标记引物的重复序列为(GTTT)5，所述编号为PoE105的EST-SSR标记引物的重复序列为(TTG)7，所述编号为PoE133的EST-SSR标记引物的重复序列为(ATAC)6，所述编号为PoE139的EST-SSR标记引物的重复序列为(TA)20，所述编号为PoE166的EST-SSR标记引物的重复序列为(AG)7。
上述成套EST-SSR引物中的每个引物对均采用降落式PCR进行扩增，每个引物对的退火温度为55-65℃，引物长度均为20bp，PCR产物大小为110-258bp。
进一步的，所述成套EST-SSR引物由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10和引物对11组成。
更进一步的，所述成套EST-SSR引物的每个引物对中的一条引物(如正向引物)进行荧光标记。在本发明中，所述荧光标记具体为6-FAM荧光基团。
第二，本发明保护上述成套EST-SSR引物的新用途。
本发明保护上述成套EST-SSR引物在如下m1)-m10)中任一种中的应用：
m1)侧柏鉴定和/或分类；
m2)侧柏遗传多样性分析和/或遗传结构分析；
m3)侧柏亲缘关系分析与鉴定；
m4)侧柏分子标记辅助育种；
m5)侧柏种质资源保护与利用；
m6)制备侧柏鉴定和/或分类的产品；
m7)制备侧柏遗传多样性分析和/或遗传结构分析的产品；
m8)制备侧柏亲缘关系分析与鉴定的产品；
m9)制备侧柏分子标记辅助育种的产品；
m10)制备侧柏种质资源保护与利用的产品。
第三，本发明保护含有上述成套EST-SSR引物的PCR试剂、以及含有上述成套EST-SSR引物的试剂盒或含有所述PCR试剂的试剂盒。
上述PCR试剂或试剂盒中，所述PCR试剂由PCR试剂1至PCR试剂11组成；每个PCR试剂中含有一种引物对，所述引物对中的引物在其所在PCR试剂中为等摩尔混合。
上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述成套EST-SSR引物中的各条引物分别单独包装的步骤。
第四，本发明保护上述PCR试剂或试剂盒的新用途。
本发明保护上述PCR试剂或试剂盒在如下n1)-n5)中任一种中的应用：
n1)侧柏鉴定和/或分类；
n2)侧柏遗传多样性分析和/或遗传结构分析；
n3)侧柏亲缘关系分析与鉴定；
n4)侧柏分子标记辅助育种；
n5)侧柏种质资源保护与利用。
第五，本发明保护一种利用上述成套EST-SSR引物进行侧柏遗传多样性分析或亲缘关系鉴定的方法。
本发明保护的利用上述成套EST-SSR引物进行侧柏遗传多样性分析或亲缘关系鉴定的方法包括以下步骤：
(x1)采用上述成套EST-SSR引物对侧柏的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(x2)利用毛细管凝胶电泳对步骤(x1)获取的PCR扩增产物进行检测与分析，获取扩增谱带数据并统计引物扩增位点信息；
(x3)根据步骤(x2)获取的数据信息进行遗传多样性分析或亲缘关系鉴定。
进一步的，所述PCR扩增为降落式PCR扩增，所述降落式PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，10个循坏；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s，27个循坏；72℃延伸10min。
所述降落式PCR扩增反应体系为20μL，包括ddH2O 14.8μL，dNTP 0.4μL，Buffer2μL，正向引物0.3μL(20μM)，反向引物0.3μL(20μM)，DNA模板2μL，Taq酶0.2μL。
更进一步的，所述遗传多样性分析的参数包括等位基因数、有效等位基因数、香农信息指数、期望杂合度、观察杂合度和多态性信息含量。
在本发明中，所述遗传多样性分析和亲缘关系分析的方法包括如下步骤：利用GeneMarker软件中的Fragment(plant)片段分析软件对毛细管电泳的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小；然后分别利用Convert软件进行数据转换，利用Popgene1.32软件获取遗传参数并进行遗传多样性分析；再用iTOL构建供试侧柏材料亲缘关系系统进化树，根据不同个体分开的程度，判断供试侧柏材料亲缘关系的远近。
第五，本发明保护上述成套EST-SSR引物的开发与筛选方法。
本发明保护的上述成套EST-SSR引物的开发与筛选方法包括如下步骤：
(y1)SSR位点的筛选
根据侧柏转录组测序数据搜索SSR位点，搜索标准设定为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸重复单元数目分别不少于10、6、5、5、5、5；
(y2)EST-SSR引物的设计
对含有步骤(y1)筛选的SSR位点的序列(Unigene序列)设计引物，SSR位点序列长度为17-28bp；引物设计的参数如下：退火温度为50-65℃；PCR产物大小为100-500bp，GC含量为40-60％；
(y3)EST-SSR引物的筛选
采用三重检测法对步骤(y2)设计的EST-SSR引物进行筛选，所述三重检测法为琼脂糖凝胶电泳检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和毛细管电泳检测；
所述琼脂糖凝胶电泳检测为利用琼脂糖凝胶电泳检测形态差异极大的侧柏样品的PCR扩增产物，初选具有目的基因的引物；
所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为在初选基础上，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所述PCR扩增产物，复选含有清晰目的条带且具有多态性的引物；
所述毛细管电泳检测为在初选、复选的基础上，利用测序仪对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳检测，最终筛选出多态性丰富、峰型明确、扩增稳定的多态性引物。
进一步的，所述形态差异极大的侧柏样品为蝶叶侧柏、青龙山1号、乌拉山1号、洒金001号。
更进一步的，利用2.0％琼脂糖凝胶进行所述琼脂糖凝胶电泳检测。利用6.0％聚丙烯酰胺凝胶进行所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
上述任一所述应用或方法中，所述侧柏不仅包括侧柏属的各种侧柏品种、种质资源、无性系、家系、优系、优株，还包括其变种、栽培变种，以及它们的无性繁育(如扦插繁殖、嫁接繁殖)后代。
本发明基于侧柏转录组测序数据获取SSR序列并设计引物，通过三重筛选法(琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳)筛选获得了一套EST-SSR标记引物，共由11对引物组成，并利用侧柏不同品种(无性系)验证了本发明开发的成套EST-SSR标记引物在遗传多样性分析、亲缘关系鉴定方面的有效性。通过实验证明：本发明开发的成套EST-SSR标记引物具有丰富的多态性，且扩增稳定、重复性好的特点，有效丰富了侧柏属微卫星分子标记引物数量。利用本发明开发的成套EST-SSR标记引物能够进行侧柏属植物亲缘关系鉴定、遗传多样性分析，为侧柏属植物新品种保护、良种繁育与推广应用等提供了重要的分子技术支撑。
附图说明
图1为利用本发明所述的成套EST-SSR标记引物对2个侧柏品种及其无性繁殖后代个体、3个待测未知侧柏无性系基因组扩增结果的亲缘关系聚类图。其中，20-1代表LYq-1；20-10代表LYq-10；20-11代表LYq-11；20-12代表LYq-12；20-13代表LYq-13；20-14代表LYq-14；20-15代表LYq-15；20-16代表LYq-16；20-19代表LYj-1；20-2代表LYq-2；20-20代表LYj-2；20-3代表LYq-3；20-4代表LYq-4；20-5代表LYq-5；20-6代表LYq-6；20-7代表LYq-7；20-8代表LYq-8；20-9代表LYq-9；20-F2代表立叶侧柏；20-17代表ploc-3；20-21代表ploc-1；20-22代表ploc-2；20-18代表DYq-1；20-F1代表蝶叶侧柏。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的侧柏品种(无性系)均来源于北京市农林科学院林业果树研究所侧柏种质资源圃，具体如下：
青龙山1号-青龙山13号(简写为QLS-1#～QLS-13#，平台资源号1111C0003115000885～1111C0003115000897)、青龙山17-1号(简写为QLS-17-1#)、青龙山17-7号(简写为QLS-17-7#)：在北京市平谷区青龙山实生侧柏林中，经实生选优获得优良无性系；
177号、1733号、1746号、1747号、1763号、1771号、1773号-1777号(简写为JX-177#～JX1777#)：在郏县国家侧柏良种基地中，经实生选优获得优良无性系；
林果1号、立叶侧柏、林果2号：在北京市海淀区自然分布的侧柏林中，经实生选优获得优良无性系；
锥峰山1号(简写为ZFS-1#)、锥峰山4号(简写为ZFS-4#)：在北京市密云区锥峰山林场天然侧柏林中，经实生选优获得优良无性系；
蝶叶侧柏：经过北京市林木良种审定委员会审定的侧柏良种(简写为DY，良种编号：京-S-SV-PO-001-2006)(平台资源号1111C0003115000707)；
乌拉山1号(简写为WLS-1#)：在内蒙古乌拉山林场实生侧柏林中，经实生选优获得优良无性系；
法海寺1号-法海寺3号(又名京海柏1号～3号，简写为FHS-1#～FHS-3#)(平台资源号1111C0003115000897～1111C0003115000899)：在北京市石景山区法海寺实生侧柏林中，经实生选优获得优良无性系；
1001号-1096号(44个)、1870号、1875号、2004号、洒金001号：在栽培变种洒金柏实生后代中，经实生选优获得优良无性系；
侧西优1号-4号、侧西优6号-9号、侧西优11号、侧西垂1号-侧西垂2号：在北京市西山国家森林公园实生侧柏林中，经实生选优获得优良无性系。
实施例1、侧柏EST-SSR引物组的开发与筛选方法
1、引物开发与设计方法
根据侧柏转录组测序数据，运用MISA(Microsatellite)软件搜索SSR位点，搜索标准设定为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸，各个核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5、5。然后采用Primer 3.0引物批量设计程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物，SSR位点序列长度为17-28bp。引物设计的主要参数如下：退火温度(Tm)在50-65℃之间；PCR产物大小为100-500bp，GC含量为40-60％。
2、多态引物检测方法
1.1供试材料
供试材料为叶形、叶色、冠形等形态特征差异极大的4个侧柏品种或无性系(蝶叶侧柏、青龙山1号、乌拉山1号、洒金001号)的叶片样品，来源于北京市农林科学院林业果树研究所侧柏种质资源圃。
1.2DNA提取与检测
采用改良CTAB法提取侧柏叶片基因组DNA。提取产物取2-3μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测纯度。
1.3PCR扩增
根据所述步骤1的引物设计结果，随机选择与合成180对引物进行多态性引物筛选。
引物筛选所用PCR反应体系为20μL，包括ddH2O 14.8μL，dNTP 0.4μL，Buffer2μL，正向引物0.3μL，反向引物0.3μL，DNA模板2μL，Taq酶0.2μL。
引物筛选所用降落式PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，10个循坏；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s，27个循坏；72℃延伸10min。
1.4三重检测法筛选多态性EST-SSR引物
所述三重检测法，即琼脂糖凝胶电泳检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测、毛细管电泳检测。
所述琼脂糖凝胶电泳检测即利用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测4个形态差异极大的侧柏样品的PCR扩增产物，初选具有目的基因的引物。
所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测即在初选基础上，利用6.0％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测4个形态差异极大的侧柏样品的PCR扩增产物，复选含有清晰目的条带且具有多态性的引物。
所述毛细管电泳检测是在初选、复选的基础上，利用3730XL测序仪对4个形态差异极大的侧柏样品的PCR扩增产物进行毛细管电泳检测，最终筛选出多态性丰富、峰型明确、扩增稳定的高效多态性引物。
3、多态性引物
本发明根据所述步骤1、2的引物开发与筛选方法，最终获得了一组基于侧柏转录组序列的多态性微卫星分子标记引物，包括PoE9、PoE64、PoE74、PoE84、PoE85、PoE89、PoE97、PoE105、PoE133、PoE139、PoE166共11对引物。
所述引物PoE9的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-CAAAAGGGAAGGAAGCCTCT-3’(序列1)；
反向引物序列：5’-AAGTTCCATGTGCTCCTTGC-3’(序列2)。
所述引物PoE64的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-CCAGAAGATGTGGGGAAAGA-3’(序列3)；
反向引物序列：5’-GCTTGTTTTCAGCCCAAGTC-3’(序列4)。
所述引物PoE74的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-CGACATTCTGAAATTCGGGT-3’(序列5)；
反向引物序列：5’-AGGATGCGGGAATTTTCTTT-3’(序列6)。
所述引物PoE84的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-AAACATTTCCTGCAAATCCG-3’(序列7)；
反向引物序列：5’-GGACCCCAAAAAGTTCCATC-3’(序列8)。
所述引物PoE85的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-ATGCTTCATCAACTGACCCC-3’(序列9)；
反向引物序列：5’-GGTTTTCCCCTACAGCAACA-3’(序列10)。
所述引物PoE89的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-AATACTGACGCGGCTTCAAC-3’(序列11)；
反向引物序列：5’-CGCCATGGTTGTTGACTTTA-3’(序列12)。
所述引物PoE97的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-GCTGCTTGGTTCAGATGACA-3’(序列13)；
反向引物序列：5’-TAGTAACGCCGATACCCTGG-3’(序列14)。
所述引物PoE105的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-ATTTGATTGCTTCCACCAGC-3’(序列15)；
反向引物序列：5’-GATCCACTGGACCCATGTTT-3’(序列16)。
所述引物PoE133的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-GCCTGATGACCTGAACTGCT-3’(序列17)；
反向引物序列：5’-CCAAGTTCCAGCCAACAGAT-3’(序列18)。
所述引物PoE139的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-CCACTGAAGCTGAATCACCA-3’(序列19)；
反向引物序列：5’-AGAAAGAAGGATTGGTCGGC-3’(序列20)。
所述引物PoE166的核苷酸序列为：
正向引物序列：5’-GTTGTTCCCAATGCATTCAA-3’(序列21)；
反向引物序列：5’-GGAATAATGAATTGCAGCCC-3’(序列22)。
所述编号为PoE9的EST-SSR标记引物的重复序列为(AT)6，所述编号为PoE64的EST-SSR标记引物的重复序列为(CT)8，所述编号为PoE74的EST-SSR标记引物的重复序列为(CA)8，所述编号为PoE84的EST-SSR标记引物的重复序列为(AT)9，所述编号为PoE85的EST-SSR标记引物的重复序列为(CTG)5，所述编号为PoE89的EST-SSR标记引物的重复序列为(TC)18，所述编号为PoE97的EST-SSR标记引物的重复序列为(GTTT)5，所述编号为PoE105的EST-SSR标记引物的重复序列为(TTG)7，所述编号为PoE133的EST-SSR标记引物的重复序列为(ATAC)6，所述编号为PoE139的EST-SSR标记引物的重复序列为(TA)20，所述编号为PoE166的EST-SSR标记引物的重复序列为(AG)7。
实施例2、一种利用实施例1提供的多态性EST-SSR标记引物分析侧柏种质资源遗传多样性的方法
利用实施例1筛选出的编号为PoE9、PoE64、PoE74、PoE84、PoE85、PoE89、PoE97、PoE105、PoE133、PoE139、PoE166的EST-SSR标记引物，采用荧光引物毛细管电泳法扩增94份侧柏种质材料的EST-SSR分子标记，94份侧柏种质材料包括侧柏品种(无性系)及其栽培变种垂枝侧柏、洒金柏，具体编号及名称如表1所示。
表1中的94份侧柏种质材料均来源并保存于北京市农林科学院林业果树研究所侧柏种质资源圃。利用毛细管电泳检测荧光PCR产物大小，利用Popgene 32统计分析供试材料的遗传多样性。具体步骤如下：
表1、94份侧柏种质相关信息
1、DNA提取与检测
采用改良CTAB法提取94份侧柏叶片的基因组DNA。提取产物取2-3μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。
2、荧光引物合成
在本发明开发的11对侧柏多态性EST-SSR标记引物的正向引物序列5’端采用6-FAM荧光基团进行修饰，合成11对荧光EST-SSR引物。
3、微卫星荧光引物PCR扩增
采用降落式PCR进行扩增。
微卫星荧光引物PCR扩增反应体系为20μL，包括ddH2O 14.8μL，dNTP 0.4μL，Buffer(Takara，货号为4030)2μL，正向引物0.3μL(20μM)，反向引物0.3μL(20μM)，DNA模板2μL，Taq酶0.2μL。每对侧柏多态性EST-SSR标记引物对应一个反应体系。
微卫星荧光引物PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，10个循坏；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s，27个循坏；72℃延伸10min。
4、毛细管电泳检测
将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。然后利用ABI 3730XL全自动DNA测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。
5、遗传多样性分析
统计11对EST-SSR引物对94份侧柏材料扩增获得的片段大小，通过Convert 1.31进行格式转换，利用Popgene 32(Yeh et al.，1999)统计分析等位基因数(Observednumber of alleles，Na)、有效等位基因数(effective number of alleles per loci，Ne)、香农信息指数(Shannon's Information index，I)、期望杂合度(expectedheterozygosity，He)、观察杂合度(observed heterozygosity，Ho)、多态性信息含量(PIC)等遗传参数。结果如表2和表3所示。
表2为所述11对EST-SSR引物对94份侧柏扩增的等位基因频率
表3为所述11对EST-SSR引物对94份侧柏扩增的遗传多样性
/>
根据表2和表3分析结果可知，11对EST-SSR引物对94份侧柏叶片基因组DNA的PCR扩增结果中，PoE84扩增得到的谱带最多，包括15种长度，等位基因频率变化范围为0.0053-0.1968；其次为PoE139和PoE89，分别包括13种、12种谱带长度，等位基因频率变化范围分别为0.0053-0.3404、0.0106-0.2394。扩增谱带最少的为PoE85、PoE105、PoE166，仅有2种谱带长度。在遗传多样性分析方面，毛细管电泳检测到的等位基因数为2-15个，每个位点平均有等位基因约7个。有效等位基因变化范围为1.1003-7.7850，平均3.0569；香农信息指数变化范围为0.1922-2.2687，平均值为1.1003。多态性变化范围为0.0912-0.8715，多态性信息含量变化范围为0.0871-0.8585。以上遗传分析均表明供试94份侧柏具有高水平的遗传多样性。根据多态性信息含量(PIC)，得到本发明所述引物对的优先排列顺序，即PoE84＞PoE89＞PoE139＞PoE9＞PoE74＞PoE133＞PoE64＞PoE105＞PoE97＞PoE166＞PoE85。
实施例3、一种利用实施例1提供的多态性EST-SSR标记引物鉴定侧柏种质资源亲缘关系的方法
利用实施例1筛选出的编号为PoE9、PoE64、PoE74、PoE84、PoE85、PoE89、PoE97、PoE105、PoE133、PoE139、PoE166的EST-SSR标记引物，采用荧光引物毛细管电泳法扩增已知侧柏品种‘立叶侧柏’、‘蝶叶侧柏’及其无性繁殖的后代个体，以及3个待测侧柏无性系的EST-SSR分子标记。上述材料均来源于北京市农林科学院林业果树研究所侧柏种质资源圃。利用毛细管电泳检测荧光PCR产物大小，利用Popgene32统计分析遗传多样性，利用Ntsys2.10构建亲缘关系聚类图。具体步骤如下：
1、DNA提取与检测
采用改良CTAB法提取侧柏新品种‘立叶侧柏’及其扦插繁殖的16个个体(LYq-1～LYq-16)、嫁接繁殖的2个个体(LYj-1～LYj-2)，‘蝶叶侧柏’及其扦插繁殖个体(DYq-1)，以及3个待测侧柏无性系(ploc-1～ploc-3)叶片的基因组DNA。提取产物取2-3μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。
2、荧光引物合成
在本发明开发的11对侧柏多态性EST-SSR标记引物的正向引物序列5’端采用6-FAM荧光基团进行修饰，合成11对荧光EST-SSR引物。
3、微卫星荧光引物PCR扩增
采用降落式PCR进行扩增。
微卫星荧光引物PCR扩增反应体系为20μL，包括ddH2O 14.8μL，dNTP 0.4μL，Buffer 2μL，正向引物0.3μL(20μM)，反向引物0.3μL(20μM)，DNA模板2μL，Taq酶0.2μL。每对侧柏多态性EST-SSR标记引物对应一个反应体系。
微卫星荧光引物PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸50s，10个循坏；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s，27个循坏；72℃延伸10min。
4、毛细管荧光电泳检测
将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。然后利用ABI 3730XL全自动DNA测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。
5、亲缘关系分析
通过Convert 1.31进行格式转换，利用Popgene 1.32统计分析遗传一致度和遗传距离，采用UPGMA法进行亲缘关系聚类分析，构建系统发育树。
根据本发明所述11对EST-SSR引物对24份侧柏个体的亲缘关系聚类结果可知(图1)，DYq-1号与‘蝶叶侧柏’保持一致，LYq-1～LYq-16、LYj-1、LYj-2与‘立叶侧柏’保持一致，遗传距离为0，证实‘蝶叶侧柏’和DYq-1号为同一个或为其无性繁殖后代、‘立叶侧柏’和LYq-1～LYq-16、LYj-1、LYj-2为同一个体或为其无性繁殖后代。而待测侧柏无性系ploc-1、ploc-2、ploc-3没有与‘蝶叶侧柏’、‘立叶侧柏’聚在一起，说明这三个无性系与‘蝶叶侧柏’、‘立叶侧柏’亲缘关系较远；相较于ploc-3、ploc-1和ploc-2相对亲缘关系较近。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 基于侧柏转录组序列开发的EST-SSR标记引物及其应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caaaagggaa ggaagcctct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aagttccatg tgctccttgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccagaagatg tggggaaaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcttgttttc agcccaagtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cgacattctg aaattcgggt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aggatgcggg aattttcttt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aaacatttcc tgcaaatccg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ggaccccaaa aagttccatc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atgcttcatc aactgacccc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ggttttcccc tacagcaaca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
aatactgacg cggcttcaac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cgccatggtt gttgacttta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gctgcttggt tcagatgaca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tagtaacgcc gataccctgg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
atttgattgc ttccaccagc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gatccactgg acccatgttt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gcctgatgac ctgaactgct 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ccaagttcca gccaacagat 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ccactgaagc tgaatcacca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
agaaagaagg attggtcggc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gttgttccca atgcattcaa 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
ggaataatga attgcagccc 20
Claims (9)
1.成套EST-SSR引物，其包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10和引物对11；
所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对8由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对9由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；
所述引物对10由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；
所述引物对11由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成。
2.根据权利要求1所述的成套EST-SSR引物，其特征在于：所述成套EST-SSR引物由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10和引物对11组成。
3.根据权利要求1或2所述的成套EST-SSR引物，其特征在于：每个引物对中的一条引物进行荧光标记。
4.权利要求1-3任一所述的成套EST-SSR引物在如下m1）-m10）中任一种中的应用：
m1）侧柏鉴定和/或分类；
m2）侧柏遗传多样性分析和/或遗传结构分析；
m3）侧柏亲缘关系分析与鉴定；
m4）侧柏分子标记辅助育种；
m5）侧柏种质资源保护与利用；
m6）制备侧柏鉴定和/或分类的产品；
m7）制备侧柏遗传多样性分析和/或遗传结构分析的产品；
m8）制备侧柏亲缘关系分析与鉴定的产品；
m9）制备侧柏分子标记辅助育种的产品；
m10）制备侧柏种质资源保护与利用的产品。
5.含有权利要求1-3任一所述成套EST-SSR引物的PCR试剂。
6.含有权利要求1-3任一所述成套EST-SSR引物的试剂盒或含有权利要求5所述PCR试剂的试剂盒。
7.权利要求5所述PCR试剂或权利要求6所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1-3任一所述成套EST-SSR引物中的各条引物分别单独包装的步骤。
8.权利要求5所述的PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在如下n1）-n5）中任一种中的应用：
n1）侧柏鉴定和/或分类；
n2）侧柏遗传多样性分析和/或遗传结构分析；
n3）侧柏亲缘关系分析与鉴定；
n4）侧柏分子标记辅助育种；
n5）侧柏种质资源保护与利用。
9.一种利用权利要求1-3任一所述的成套EST-SSR引物进行侧柏遗传多样性分析或亲缘关系鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（x1）采用权利要求1-3任一所述的成套EST-SSR引物对侧柏的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（x2）利用毛细管凝胶电泳对步骤（x2）获取的PCR扩增产物进行检测与分析，获取扩增谱带数据并统计引物扩增位点信息；
（x3）根据步骤（x2）获取的数据信息进行遗传多样性分析或亲缘关系鉴定。
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