CN112111591B - 白皮松est-ssr引物及其在群体遗传多样性分析中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了白皮松EST‑SSR引物及其在群体遗传多样性分析中的应用。本发明利用白皮松转录组数据设计开发了特异的EST‑SSR标记从中筛选合成了96对引物并对其进行了相关验证，最终筛选出差异较为稳定、多态性良好的11对EST‑SSR特异性引物。本发明进一步公开了所述的EST‑SSR特异性引物在白皮松群体遗传多样性分析、多态性分析以及构建遗传图谱等方面的应用。本发明所提供的EST‑SSR引物可为白皮松群体的进化研究、种质资源保护等提供重要的借鉴价值，对于白皮松良种繁育也具有指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及EST-SSR引物，尤其涉及白皮松EST-SSR特异性引物，本发明进一步涉及所述白皮松EST-SSR特异性引物在群体遗传多样性分析等方面的应用，属于白皮松EST-SSR特异性引物及其应用领域。
背景技术
近年来，随着分子生物学的不断发展，多种分子标记技术被开发且广泛应用于生物学研究，如随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单重复序列(SSRs)、起始密码子多态性(SCoT)和单核苷酸多态性(SNPs)等。其中，简单重复序列标记技术(SSR)是针对基因组DNA中简单重复序列区域所设计的分子标记技术。基因组DNA中重复序列包括两种类型：分散型和串联型，其中SSR标记主要针对的是串联重复序列中的微卫星DNA，因此又被称为微卫星DNA标记。由于基因组DNA在复制过程中的滑动和修复机制造成微卫星DNA在全基因组水平上重复次数的差异，从而使得SSR标记在植物群体中具有较高的多态性，同时微卫星DNA两端序列又具有较高的保守性，因此通过设计合适的引物即可快速进行SSR分子标记多态性的检测(Li Y-C,Korol AB,Fahima T,Beiles A,Nevo E:Microsatellites:genomicdistribution,putative functions and mutational mechanisms:a review.Molecularecology 2002,11(12):2453-2465)。由于其敏感性高、丰富度高、特异性高、重复度高和共显性等优点，SSR分子标记在遗传多样性、群体遗传结构、分子辅助育种QTL图谱以及进化研究中均发挥着重要的作用(Bhandawat A,Sharma V,Singh P,Seth R,Nag A,Kaur J,Sharma RK:Discovery and Utilization of EST-SSR Marker Resource for GeneticDiversity and Population Structure Analyses of a Subtropical Bamboo,Dendrocalamus hamiltonii.biochemical genetics 2019,57(5):652-672.)。然而，大多数物种常常因缺乏相应的基因组数据而限制了SSR分子标记在植物研究中的应用。近年来，随着转录组测序技术的兴起，多个物种功能基因组区域序列被揭示。通过针对这些植物基因组编码区域的微卫星序列，研究者们开发了特异的SSR分子标记，即EST-SSRs，并在多个物种研究中得到了实践。
由于基因组编码区序列保守度较非编码区域高，因此EST-SSR分子标记相比于SSR标记具有更高的重复性和稳定性，其在物种内甚至物种间都具有更高的传递性(Müller M,Gailing O:Characterization of 20new EST-SSR markers for northern red oak(Quercus rubra L.)and their transferability to Fagus sylvatica L.and six oakspecies of section Lobatae and Quercus.annals of forest research 2018,61(2):211-222.)。EST-SSR标记在植物育种中具有着极其重要的价值，其不仅可用于进行植物种质资源遗传多样性的分析，对于植物优良基因型和优良品种的鉴定和保护也具有极其重要的价值，尤其在一些农作物和经济作物育种中，相关的EST-SSR标记均发挥了重要作用。EST-SSR标记也常被用于构建植物的遗传图谱，因其覆盖面广、重复性高，由其所构建的遗传图谱更为精准和全面。
EST-SSR标记在植物功能基因与性状的连锁分析研究中也发挥着作用，因其位于植物基因组的编码区，开发的标记往往与功能基因相连锁，常被用于进行植物特定性状的连锁分析。除此之外，ESR-SSR标记还可被用于进行植物群体遗传多样性的分析(Ellis JR,Burke JM:EST-SSRs as a resource for population genetic analyses.Heredity2007,99(2):125-132)。植物遗传多样性的高低决定了其适应环境以及维持生态系统稳定性的能力。植物的遗传多样性受多种因素影响，包括植物的繁育系统、遗传漂变、自然选择、基因突变和基因流等，同时还受着环境变化和人为干扰的影响。群体遗传学研究不仅可用于评价植物天然群体结构的稳定性，有利于植物保护学家们开展有针对的保护策略，其对于研究植物不同地理分布的遗传多样性差异也具有极其重要的价值，为培育学家们建立种子园和种子区划具有重要的指导意义(Torokeldiev N,Ziehe M,Gailing O,Finkeldey R:Genetic diversity and structure of natural Juglans regia L.populations in thesouthern Kyrgyz Republic revealed by nuclear SSR and EST-SSR markers.treegenetics&genomes 2019,15(1):1-12.)。
白皮松为松科(Pinaceae)松属(Pinus)白皮松组(Sect.Parrya)植物，是东亚唯一的三针松，是中国特有的乡土树种(彭重华,薄楠林:白皮松研究进展.中国农学通报2007(11):174-178.)。因其适生范围广、抗逆性强，白皮松在中国北方和西部地区的园林绿化和生态工程造林中占有着重要地位。此外，白皮松既抗臭氧又抗SO2和烟尘，在工厂和城市绿化中也具有潜在的应用价值。白皮松木材纹理均匀又耐腐蚀，常被用做家具制造和建筑用材；其松脂含量高，具有多种芳香化学成分；其松子和花粉具有食用和药用价值，因此白皮松又是未来林业发展中的潜在经济树种。然而，不同于其他乡土树种，白皮松受人为破坏程度大，现有分布呈块状或零星分布，天然种质资源相对较少。因此，对其开展相应的种质资源评价和群落遗传结构研究，可为未来白皮松育种、培育和保护提供重要的指导意义。
白皮松作为中国重要的乡土栽培树种，前人针对其群体已开展了多种不同水平的遗传多样性研究。李斌等人利用白皮松种实的长、宽、高等性状指标对白皮松天然群体进行了多样性分析，结果表明白皮松的表型遗传变异主要发生于群体内(李斌,顾万春,卢宝明:白皮松天然群体种实性状表型多样性研究.生物多样性2002(02):181-188.)。然而王小平等人却发现白皮松同一种源内个体间的遗传变异较少，群体间差异较大(王小平,刘晶岚,王九龄,刘春江:白皮松种子及球果形态特征的地理变异.北京林业大学学报1998(03):28-34.)。相似的结论在同工酶标记(生化标记)中也得到了证实，白皮松10个天然群体在群体间遗传分化较大，而群体内亲缘关系则较近(李斌,顾万春:白皮松保育遗传学——天然群体遗传多样性评价与保护策略.林业科学2005(01):57-64.)。因此，针对白皮松的遗传多样性保护策略应以选择多个遗传距离较远的天然群体进行随机抽样、异地保存为主，而群体遗传多样性的研究则有助于选择较为适宜的天然群体。分子标记以其稳定性和简易性在白皮松遗传多样分析中也得到了初步研究。然而由于白皮松风媒异交和种质资源遭到严重破坏的影响下，获得的白皮松特异的多态性分子标记较少，远不能满足后续白皮松研究的需要。
发明内容
本发明目的之一是提供白皮松特异的多态性分子标记；
本发明目的之二是将所筛选出的特异的多态性分子标记应用于白皮松的群体遗传多样性分析、遗传分化分析或构建遗传图谱等方面。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了用于白皮松群体遗传多样性分析的EST-SSR特异性引物，由以下8对引物组成：(1)由核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物组成的引物对BPS-SSR-1；(2)由核苷酸序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物组成的引物对BPS-SSR-9；(3)由核苷酸序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物组成的引物对BPS-SSR-14；(4)由核苷酸序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物组成的引物对BPS-SSR-52；(5)由核苷酸序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物组成的引物对BPS-SSR-62；(6)由核苷酸序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物组成的引物对BPS-SSR-83；(7)由核苷酸序列为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物组成的引物对BPS-SSR-96；(8)由核苷酸序列为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的引物组成的引物对BPS-SSR-50。
本发明进一步的提供了用于白皮松群体遗传多样性分析的EST-SSR特异性引物，由以下11对引物组成：(1)由核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物组成的引物对BPS-SSR-1；(2)由核苷酸序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物组成的引物对BPS-SSR-9；(3)由核苷酸序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物组成的引物对BPS-SSR-14；(4)由核苷酸序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物组成的引物对BPS-SSR-52；(5)由核苷酸序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物组成的引物对BPS-SSR-62；(6)由核苷酸序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物组成的引物对BPS-SSR-83；(7)由核苷酸序列为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物组成的引物对BPS-SSR-96；(8)由核苷酸序列为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的引物组成的引物对BPS-SSR-50；(9)由核苷酸序列为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的引物组成的引物对BPS-SSR-16；(10)由核苷酸序列为SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的引物组成的引物对BPS-SSR-82；(11)由核苷酸序列为SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的引物组成的引物对BPS-SSR-93。
本发明所提供的上述的EST-SSR特异性引物能够应用于白皮松群体遗传多样性分析或遗传分化分析，包括：(1)提取待测白皮松样品基因组DNA；(2)采用所述EST-SSR特异性引物进行PCR扩增；(3)将步骤(2)的扩增产物经电泳分离并统计结果；(4)利用步骤(3)的统计结果进行遗传多样性分析。其中，所述遗传多样性分析方法包括：采用GeneAlex6.5软件对白皮松群体进行遗传多样性分析
本发明的的另一方面提供了白皮松EST-SSR特异性引物，选自以下11对引物中的任何一种或一种以上的组合：(1)由核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物组成的引物对BPS-SSR-1；(2)由核苷酸序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物组成的引物对BPS-SSR-9；(3)由核苷酸序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物组成的引物对BPS-SSR-14；(4)由核苷酸序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物组成的引物对BPS-SSR-52；(5)由核苷酸序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物组成的引物对BPS-SSR-62；(6)由核苷酸序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物组成的引物对BPS-SSR-83；(7)由核苷酸序列为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物组成的引物对BPS-SSR-96；(8)由核苷酸序列为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的引物组成的引物对BPS-SSR-50；(9)由核苷酸序列为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的引物组成的引物对BPS-SSR-16；(10)由核苷酸序列为SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的引物组成的引物对BPS-SSR-82；(11)由核苷酸序列为SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的引物组成的引物对BPS-SSR-93。
更优选的，所述的白皮松EST-SSR特异性引物选自由核苷酸序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物组成的引物对BPS-SSR-9、由核苷酸序列为SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示的引物组成的引物对BPS-SSR-14或由核苷酸序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物组成的引物对BPS-SSR-52中的任何一种或多种。
本发明所提供的白皮松EST-SSR特异性引物能够用于白皮松的多态性分析，包括：(1)提取待测白皮松样品基因组DNA；(2)采用所述EST-SSR特异性引物进行PCR扩增；(3)将步骤(2)的扩增产物经电泳分离并统计结果；(4)采用软件GeneMarker进行分析，对每对引物在所有白皮松样本中等位基因位点进行统计；统计结果采用GeneAlex 6.5进行分析，对所有多态性基因位点的观察杂合度和预期杂合度进行分析，采用软件Cervus 3.0对所有多态性位点的多态性信息含量进行检验。
本发明所提供的上述白皮松EST-SSR特异性引物进一步应用于构建白皮松遗传图谱。
更进一步的，本发明提供了一种用于白皮松遗传多样分析或多态性分析的试剂盒，包括缓冲液，dNTP，Taq DNA聚合酶和SSR引物，其中，所述SSR引物是上述的白皮松EST-SSR特异性引物。
本发明整体技术方案详述
本发明通过利用白皮松转录组数据为白皮松设计开发了特异的EST-SSR标记，从中筛选合成了96对引物并对其进行了相关验证。
通过对白皮松单样本进行的预实验，在所设计的96对引物中，共有55对引物扩增出明确条带。根据预实验的结果，从中选取了条带较为清晰的SSR引物25对，并对其前引物进行了再设计，添加了相应的M13引物序列，并与荧光修饰(FAM、HEX、TAMRA、ROX)引物相结合，对其进行了毛细管电泳检测。根据毛细管电泳检测结果发现，其中，11对引物在毛细管电泳检测中表现出多态性，其余14对引物均为单态性；这11对表现出多态性的引物分别为BPS-SSR-1(由核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物组成)、BPS-SSR-9(由核苷酸序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物组成)、BPS-SSR-14(由核苷酸序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物组成)、BPS-SSR-52(由核苷酸序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物组成)、BPS-SSR-62(由核苷酸序列为SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10所示的引物组成)、BPS-SSR-83(由核苷酸序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物组成)、BPS-SSR-96(由核苷酸序列为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物组成)、BPS-SSR-50(由核苷酸序列为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的引物组成)、BPS-SSR-16(由核苷酸序列为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的引物组成)、BPS-SSR-82(由核苷酸序列为SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的引物组成)、BPS-SSR-93(由核苷酸序列为SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的引物组成)。
在11对具有多态性的引物中，白皮松样本中观察杂合度变化范围为0.000～0.478，期望杂合度变化范围为0.033～0.525，多态性信息含量变化范围为0.032～0.484，等位基因位点个数变化范围为2～5，其中引物对BPS-SSR-9、BPS-SSR-14、BPS-SSR-52这三对引物变异丰富度较好，对白皮松样本开展分子标记研究较为适宜。
基于毛细管电泳的数据，本发明以具备多态性变异的微卫星位点对白皮松三个地区的群体进行相关分析。从三个群体中各随机选取了20个样本进行标记分析，其中引物BPS-SSR-16、BPS-SSR-82以及BPS-SSR-93在60个样本中无效等位基因数量较多，为排除过多的误差影响，仅选取了剩余的8对引物(BPS-SSR-1、BPS-SSR-9、BPS-SSR-14、BPS-SSR-52、BPS-SSR-62、BPS-SSR-83、BPS-SSR-96和BPS-SSR-50)对群体进行了相关分析。分析结果显示，三个地区样本群体中，山西群体遗传变异程度较大，山东群体遗传变异程度较小。其中在位点BPS-SSR-1、BPS-SSR-62、BPS-SSR-83和BPS-SSR-96中，三个群体的等位基因分布模式相似，均含有主要的等位基因位点；在位点BPS-SSR-9中，北京地区样本等位基因分布模式与其他两个地区差异较大；在位点BPS-SSR-14、BPS-SSR-50、BPS-SSR-52中三个地区样本等位基因分布模式差异变化较大，具有较高的应用价值。
本发明通过白皮松转录组数据自主设计了SSR相关引物并对其进行了部分验证，为白皮松树种研究提供了特异的多态性的SSR标记。这些标记可为后续白皮松群体的进化研究和种质资源保护提供重要的借鉴价值；此外基于样本个体特异的表型特征，可结合相应的转录组数据注释，为白皮松优良表型构建关联的特异SSR标记，为白皮松良种繁育提供重要的指导意义。
本发明所涉及到术语及定义
基因杂合度包括期望杂合度和观测杂合度，期望杂合度是由种群内占据优势等位基因的基因型频率决定的，是用公式计算出来的理想状态，该数值能够间接地反映出种群内遗传结构变化程度的水平。在一个种群内，稀有基因的基因型频率是非常低的，致使它基本对期望杂合度不产生影响。因此，期望杂合度的改变基本不受样本量大小的影响，它也是衡量群体遗传多样性水平的优良指标(Nei,1975)。
多态信息含量(PIC)表示一个后代所获得某个等位标记来自于它的父代或母代的同一个等位标记的可能性。该理论是由Bostein于1980年提出用来衡量群体基因片段多态性的指标。随着等位基因频率、等位基因的改变而改变。它可用来衡量微卫星DNA特异性位点变异程度的高低(Bostein et al.,1980)。理想的多态性位点应具有较大的多态信息含量，较低的遗传相似性和较高的特异性。多态信息含量与其对应的可利用程度及使用频率有关：某一群体内多态信息含量越高，则表明杂合子在该位点所占的比率就越高、其所包含的遗传信息就相应越多。
聚类分析是指根据种内或种间的相互作用关系，将各个种群之间的关系用分支图的方式将其表示出来，采用分组的形式，将个体或种群总结归纳为不同的具有相互关系的若干组，分组之后，组内的个体或种群遗传距离最为接近，遗传关系尽量相似，而组间的个体或种群尽量具有差异，以此来达到其客观的分类的目的，也就是所说的系统发育树。系统发育树分为两种，一种为有根树，另一种为无根树。有根树和无根树的本质区别为有无外群。有根树是将外群作为树根，反映分类单元间的进化关系；而无根树没有外群的介入，仅将所分析的个体或种群根据遗传距离等归纳到一起。无根树加进外群即为有根树。
附图说明
图1白皮松不同类型的EST-SSR重复序列的分布频率。
图2白皮松96对EST-SSR引物预实验扩增情况。
图3 8个微卫星位点在三个样本群体中的等位基因分布模式；Na,等位基因数量；Na Freq.>＝5％,基因分布频率大于等于5％的等位基因数量；Ne，有效等位基因数量；I，香浓相关指数；No.Private Alleles，单个群体中特有的等位基因数量。
图4白皮松群体遗传起源的主成分分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1白皮松EST-SSR特异性引物的筛选及其在群体遗传多样性分析中的应用
1实验材料
本发明中所采集的实验材料均来源于北京市温泉苗圃栽培的白皮松种质资源圃，材料采集均采用了当年生枝条的幼嫩叶片，具体材料来源信息见表1。
表1实验材料及来源
2实验方法
2.1基因组DNA的提取
针对材料的来源与生理特性，实地采取当年生白皮松叶片，加入干燥硅胶颗粒，保存于冰盒中带回，存于-70℃待用。取白皮松新鲜叶片约100mg，加入液氮充分研磨后，采取改良的CTAB提取法对白皮松样本进行了DNA提取。
2.2 SSR-PCR扩增
2.2.1引物设计
以本发明人课题组获得的白皮松转录组数据为依据，对白皮松转录表达序列进行微卫星位点的筛选和前后引物的设计。根据引物的稳定性、渗透性、产物的大小以及前后引物的Tm值差异进行了初步筛选，获得并合成了96对引物，引物具体情况见表2。由于本试验设计引物的来源为转录组数据，故本发明中所用SSR标记分属于EST-SSR标记。
表2白皮松EST-SSR引物
2.2.2引物筛选
对于所合成的96对引物，由于并没有相关实验证明其全部具有较好的多态性以及反应的相关条件，为减轻实验负担，在实验最初阶段采取使用单个白皮松样本DNA进行了相关预实验。
2.2.3 SSR-PCR反应体系及程序
一个合适的SSR-PCR反应体系对于良好的实验结果的获得是必不可少的。根据实验室已有的实验基础，本试验采取的PCR反应体系为20ul反应体系，具体反应体系见表3。
表3 SSR-PCR反应体系
SSR-PCR反应程序采取Touch-down PCR，设置为两部分，第一部分以合适的退火温度56℃为基准，每个循环递减0.5℃，设置9个循环；第二部分以退火温度52℃为基准，设置25个循环，延伸时间均设置为30s，反应完成后，于琼脂糖凝胶电泳中进行初步检测。
2.3毛细管电泳
2.3.1设计引物
从筛选好的引物中选择差异性稳定、多态性好的SSR引物，重新合成新的引物，在所有前引物的5‘端添加M13引物的序列：TGTAAAACGACGGCCAGT；
2.3.2PCR反应体系与程序
PCR反应程序不变，以新合成的前后引物和带有荧光修饰序列的MI3引物进行PCR反应扩增，PCR反应体系如下表4所示。
表4 SSR-PCR反应体系(加入荧光蛋白)
2.3.3检测及数据分析
PCR反应完成后，先进行琼脂糖凝胶电泳检测，条带确认无误后，再进行毛细管电泳检测，获得峰图后进行统计与列表。
2.4 SSR数据分析
毛细管电泳结果采用软件GeneMarker进行分析，对每对引物在所有白皮松样本中等位基因位点进行统计。统计结果采用GeneAlex 6.5进行分析，对所有多态性基因位点的观察杂合度(Ho)和预期杂合度(He)进行分析，采用软件Cervus 3.0对所有多态性位点的多态性信息含量(PIC)进行检验，对SSR引物进行评价；采用GeneAlex 6.5对白皮松群体进行分析。
3试验结果
3.1白皮松EST-SSR位点的分布特征
基于白皮松转录组测序的结果，从中共筛选获得了8073个SSR位点，其中三碱基重复位点在其中占据了较大比例(39.6％)。在三碱基重复位点中，多数(73.06％)SSR位点呈现四次重复。随着重复次数的增加，分布的重复碱基频率逐渐降低。与之类似，其他类型的重复碱基均呈现出类似的现象(图1)。
3.2白皮松EST-SSR引物的筛选
通过对白皮松单样本进行的预实验，在所设计的96对引物中，共有55对引物扩增出明确条带(图2)，在总引物中占据了57.3％的比例，因此可认定本发明所设计引物在白皮松群体具有一定的适用性。
根据预实验的结果，从中选取了条带较为清晰的SSR引物25对(表5)，并对其前引物进行了再设计，添加了相应的M13引物序列，并与荧光修饰(FAM、HEX、TAMRA、ROX)引物相结合，对其进行了毛细管电泳检测。
根据毛细管电泳检测结果发现，其中，11对引物在毛细管电泳检测中表现出多态性，其余14对引物均为单态性；这11对表现出多态性的引物分别为BPS-SSR-1(由SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的引物组成)、BPS-SSR-9(由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物组成)、BPS-SSR-14(由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物组成)、BPS-SSR-52(由SEQID No.7和SEQ ID No.8所示的引物组成)、BPS-SSR-62(由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物组成)、BPS-SSR-83(由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物组成)、BPS-SSR-96(由SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物组成)、BPS-SSR-50(由SEQ ID No.15和SEQID No.16所示的引物组成)、BPS-SSR-16(由SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的引物组成)、BPS-SSR-82(由SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的引物组成)、BPS-SSR-93(由SEQID No.21和SEQ ID No.22所示的引物组成)。
在11对具有多态性的引物中，白皮松样本中观察杂合度变化范围为0.000～0.478，期望杂合度变化范围为0.033～0.525，多态性信息含量变化范围为0.032～0.484，等位基因位点个数变化范围为2～5，其中引物对BPS-SSR-9、BPS-SSR-14、BPS-SSR-52这三对引物变异丰富度较好，对白皮松样本开展分子标记研究较为适宜。
表5白皮松中25个微卫星位点的特征
3.3白皮松三个地区群体中EST-SSR位点的分布特征
基于毛细管电泳的数据，本试验以具备多态性变异的微卫星位点对白皮松三个地区的群体进行相关分析。从三个群体中各随机选取了20个样本进行标记分析，其中引物BPS-SSR-16、BPS-SSR-82以及BPS-SSR-93在60个样本中无效等位基因数量较多，为排除过多的误差影响，仅选取了剩余的8对引物(BPS-SSR-1、BPS-SSR-9、BPS-SSR-14、BPS-SSR-52、BPS-SSR-62、BPS-SSR-83、BPS-SSR-96和BPS-SSR-50)对群体进行了相关分析，所获得的8个微卫星位点在三个样本群体中的分布情况具体如图3所示。
分析结果显示，三个地区样本群体中，山西群体遗传变异程度较大，山东群体遗传变异程度较小。其中在位点BPS-SSR-1、BPS-SSR-62、BPS-SSR-83和BPS-SSR-96中，三个群体的等位基因分布模式相似，均含有主要的等位基因位点；在位点BPS-SSR-9中，北京地区样本等位基因分布模式与其他两个地区差异较大；在位点BPS-SSR-14、BPS-SSR-50、BPS-SSR-52中三个地区样本等位基因分布模式差异变化较大，具有较高的应用价值；主成分分析的结果如图4所示，相比于山东和北京群体，山西群体的遗传多样性较为丰富。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京林业大学
<120> 白皮松EST-SSR引物及其在群体遗传多样性分析中的应用
<130> BJ-1006-200415A
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Claims (7)
1.用于白皮松群体遗传多样性分析的EST-SSR特异性引物，其特征在于，由以下8对引物对组成：(1)由核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物组成的引物对BPS-SSR-1；(2)由核苷酸序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物组成的引物对BPS-SSR-9；(3)由核苷酸序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物组成的引物对BPS-SSR-14；(4)由核苷酸序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物组成的引物对BPS-SSR-52；(5)由核苷酸序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物组成的引物对BPS-SSR-62；(6)由核苷酸序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物组成的引物对BPS-SSR-83；(7)由核苷酸序列为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物组成的引物对BPS-SSR-96；(8)由核苷酸序列为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的引物组成的引物对BPS-SSR-50。
2.权利要求1所述的EST-SSR特异性引物在白皮松群体遗传多样性分析或遗传分化分析中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：(1)提取待测白皮松样品基因组DNA；(2)采用所述EST-SSR特异性引物进行PCR扩增；(3)将步骤(2)的扩增产物经毛细管电泳分离并统计结果；(4)利用步骤(3)的统计结果进行遗传多样性分析；所述遗传多样性分析方法包括：采用GeneAlex 6.5软件对白皮松群体进行遗传多样性分析。
4.权利要求1所述的EST-SSR特异性引物在构建白皮松遗传图谱中的应用。
5.权利要求1所述的白皮松EST-SSR特异性引物在白皮松多态性分析中的应用。
6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：(1)提取待测白皮松样品基因组DNA；(2)采用所述EST-SSR特异性引物进行PCR扩增；(3)将步骤(2)的扩增产物经毛细管电泳分离并统计结果；(4)采用软件GeneMarker进行分析，对每对引物在所有白皮松样本中等位基因位点进行统计；统计结果采用GeneAlex 6.5进行分析，对所有多态性基因位点的观察杂合度和预期杂合度进行分析，采用软件Cervus 3.0对所有多态性位点的多态性信息含量进行检验。
7.一种用于白皮松群体遗传多样分析或多态性分析的试剂盒，包括缓冲液，dNTP，TaqDNA聚合酶和SSR引物，其特征在于，所述SSR引物是权利要求1所述的EST-SSR特异性引物。
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