CN106282371A - 一种利用转录组测序的ssr分子标记鉴定马尾松种质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)DNA提取采用天根DNAsecure Plant Kit试剂盒优化步骤，然后按如下的PCR反应体系和反应程序用引物对马尾松样本进行扩增；(2)基于马尾松转录组测序的序列设计SSR引物，并进行PCR扩增体系优化；(3)最后对PCR产物，采用优化的10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，通过银染法对PCR产物进行检测，根据谱带的有无和大小来判定结果。

Description

一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及基于马尾松转录组测序序列而开发的SSR引物及其应用。基于转录组序列开发的多对SSR标记引物，专用于从DNA水平对马尾松种质进行快速鉴定及亲缘关系分析。
背景技术
马尾松(Pinus massoniana)是我国南方最主要的优质针叶用材树种之一，在我国森林资源发展、林纸一体化、松香林产化工业及森林生态服务功能中具有重要地位，其中，马尾松优良种质的发掘和保护对产业的健康发展至关重要。因此，马尾松种质的准确、高效鉴定和亲缘关系分析，对种质的知识产权保护、开发和利用具有重要现实意义。目前，已有马尾松遗传多样性、遗传连锁图谱构建等方面的相关报道，但由于马尾松基因组及转录组数据的缺乏，造成马尾松生长发育规律解析、分子标记开发和遗传图谱构建等相对滞后。随着分子生物学的发展，，主要有RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等分子标记技术已被用于马尾松种质鉴定、亲缘关系分析和遗传图谱构建，但这些多为显性标记，不能区分纯合体和杂合体，且这些分子标记覆盖马尾松基因组的比例较小，标记密度较低。
简单重复序列(SSR)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于重复次数和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR)，基因组SSR标记的开发操作繁琐，费时费力，费用高，这是限制SSR标记应用的一大瓶颈。与基因组SSR标记相比，表达序列标签来源于基因的转录区，可直接反映基因的表达信息，且标记在种间的通用性更高。
随着高通量测序技术的快速发展和测序成本的降低，利用新一代高通量测序技术对植物全基因组范围内进行测序，产生丰富的转录组数据，其中包含了大量的EST序列。利用转录组序列开发SSR标记既有EST-SSR标记的优点，同时其海量的数据为SSR标记的开发提供了比EST-SSR更全面的信息，提高了遗传多样性和分子标记辅助育种研究的准确性。因此，本发明利用高通量测序技术成功获得马尾松转录组数据，对这些数据进行系统分析，最终找到了适用于马尾松SSR标记分析的引物，这将会对马尾松重要性状基因的定位、分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等起重要推动作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为了克服现有分子标记覆盖马尾松基因组比例低、操作复杂等缺点，本发明旨在提供多态性检出率高、分辨率更好、稳定可靠、简单高效的分子标记鉴定方法。该方法可直接用于马尾松的种质鉴定、亲缘关系分析和遗传图谱的构建，为种质知识产权保护和遗传改良提供更好的评估工具。本发明需要解决的关键技术是马尾松SSR标记引物的获得，以及聚丙烯酰胺变性凝胶的优化。
本发明的技术方案是：一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，包含以下步骤：
(1)DNA提取采用天根DNAsecure Plant Kit试剂盒优化步骤，然后按如下的PCR反应体系和反应程序用引物对马尾松样本进行扩增；
(2)基于马尾松转录组测序的序列设计SSR引物，并进行PCR扩增体系优化；
(3)最后对PCR产物，采用优化的10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，通过银染法对PCR产物进行检测，根据谱带的有无和大小来判定结果。
所述的SSR标记引物为如下的1对或任意几对：
所述的PCR反应体系采用10-20μl反应体系：分别包含10-50ng的模板DNA 1-2μl，正、反向引物各0.3-0.6μl，5-10μl Mix及适量ddH2O。其中Mix含0.1U/μl Taq polymerase、500μM dNTP、20mM Tris-HCl、100mM KCl、3mM MgCl2，以及其它稳定剂和增强剂。
所述的PCR的反应程序为：94℃预变性4min；对94℃反应30s，60-63℃反应45s，72℃反应45s进行40个循环；72℃延伸7min；4℃最终保存。
本发明的有益效果：
本发明方法适用于马尾松种质快速可靠的分子检测和鉴定，具有重要的实用价值，与其它方法相比，本发明具有以下的技术优势：
1、操作简便快速：本发明对样本进行简单处理、PCR扩增和常规的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳后即可判断结果，无需对扩增的产物进行限制性内切酶酶切，整个检测过程可在5个小时内完成；
2、对聚丙烯酰胺变性凝胶的制作已进行优化，并形成一套完整的体系，效果较好：制作过程简单，耗时较短，且能将差异较小的片段(3bp左右)较好的区分开，进一步提高了SSR标记在种质鉴定和知识产权保护上的应用效率；
3、检测结果灵敏度高：对待检样品仅需提供模板10-50ng，即可准确鉴定其所属种质；
4、结果高度准确、可靠、重复性好：本发明已经对不同种质的马尾松DNA样本进行了检测，经过多次重复检测，检测准确率100％，为检测结果提供了高度的可靠性；
5、本发明的SSR引物开发基于马尾松转录组测序结果，引物具有高特异性、专一性：在马尾松SSR分子标记研究领域，前人多采用从其他松属类植物中筛选的引物，或依靠生物信息学手段从松属EST数据库中开发的SSR引物，但效果都不太理想；
6、本发明中开发的SSR引物获得的分子标记，在马尾松基因组中分布均匀、多态性丰富、清晰稳定、分辨率高，可有效用于马尾松的种质鉴定、亲缘关系分析及遗传图谱构建等工作，在知识产权保护和遗传育种上具有重要实际意义；
7、取材方便、经济效益明显：针叶、球花等组织或器官均可为实验材料，苗期、幼林期、成年大树均可取样，不受季节、地点的限制。通过对马尾松苗木纯度的SSR分子鉴定，可避免苗木生产与销售过程中出现的鱼龙混杂现象。
附图说明
图1为SSR引物扩增后1％琼脂糖凝胶电泳初筛检测图；1～4分别表示福建漳平G22家系、H90家系、70-80-5家系；5、6分别表示广西南宁29-1家系、1-2-1家系；M为DNA Marker；
图2为SSR引物扩增后10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳复筛检测图；1～6分别表示都匀林场的黄平49家系、黄平50家系、黄平38家系、福泉4家系、黄平34家系、福泉3家系；M为DNA Marker；
图3为引物对PmS54对来自贵州、福建及广西共72份马尾松种质的10％PAGE变性凝胶电泳检测图；1～24对应表2中贵州都匀林场各家系；25～48对应表2中福建漳平林场各家系；49～72对应表2中广西南宁林场各家系；M为DNA Marker。
具体实施方式
实施例1：以本发明中的SSR引物，鉴定贵州、福建、广西三地共72份马尾松种质，其中以引物对PmS54为例，可区分供试材料。
1.SSR引物的设计及合成
首先对测序得到的序列进行前处理，得到高质量无冗余的EST序列，利用MISA软件在转录数据中搜索SSR位点，搜索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重复次数分别为10、6、5、5、5和5，接着用Primer3.0引物批量设计程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物，并且SSR位点序列长度在18～27bp之间。其中，引物设计的主要参数为：退火温度(Tm)在57～63℃之间，60℃最佳；PCR产物大小为100～300bp；GC含量在40％～60％之间，50％最佳。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。设计合成的PmS54正、反向引物相关信息如表1所示。
表1引物PmS54相关信息
2.基因组DNA的提取及检测
采用贵州、福建、广西三地共72份马尾松种质为供试材料，见表2所示。
采用天根DNAsecure Plant Kit(DP320)试剂盒并作适当修改，提取基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，核酸浓度测定仪检测DNA浓度，将浓度稀释至10～50ng/μL左右，-20℃保存。
表2贵州、福建、广西三地共72份马尾松种质
3.PCR扩增
优化反应体系为(10-20μl)：10～50ng的模板DNA，各0.3-0.6μl正、反向引物(10μM)，5-10μl Mix及适量ddH2O。其中Mix含0.1U/μl Taq polymerase，500μMdNTP，20mMTris-HCl(pH8.3)，100mMKCl，3mM MgCl2，以及其它稳定剂和增强剂。
优化的PCR程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，复性45s，72℃延伸45s，40个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
4.SSR引物初筛
将PCR反应产物在含有GoldViewⅠ的1％琼脂糖凝胶中，以5V/cm的电压电泳适当时间，然后于凝胶分析仪中观察并拍照保存，筛选出条带清晰的引物，如图1所示。
5.SSR引物多态性位点复筛
初筛引物的PCR反应产物，在10％聚丙烯酰胺变性凝胶中，以80V电压预电泳10min左右，然后以150V电压正式电泳2～3h，最后显影、染色、拍照，筛选出条带清晰、具有多态性差异的引物，如图2所示。已优化的10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳的操作过程如下：
1)安装夹心式垂直电泳板
(1)将玻璃板拿到流动水处洗刷干净、晾干，用乙醇或剥离硅烷均匀擦洗玻璃板；
(2)将清洗干净的两块长、短玻璃板晾干后，按要求分别插入到U型硅橡胶框的凹形槽中；
(3)将装好的玻璃电泳板倾斜成45-60℃角，放在灌胶支架上固定好；
(4)用滴管吸取少量的1％琼脂糖溶液，灌入凝胶长玻璃板外侧底部，灌胶液面高度约0.5-1.0cm(封胶面应整齐)，待琼脂糖凝固；
2)制备凝胶板
(1)按表3各组分的用量，从上到下依次加入小烧杯中，混匀；加完尿素后，用双蒸水补足至50ml后进行过滤，过滤结束后同时加入10％APS(过硫酸铵)和TEMED(四甲基二乙胺)，混匀稍微静止等泡沫散去；
表3 10％聚丙烯酰胺变性凝胶组成成分及添加成分的顺序
(2)将混匀的凝胶沿玻璃板凹口快速均匀倒下，至短玻璃板边缘，插入适当的梳子封条；
(3)室温聚合1-2小时后，小心取出梳子封条，用注射器加ddH2O多次冲洗加样孔；
(4)将凝胶板用力均匀地固定在垂直电泳槽里，带凹口背板朝里，面向缓冲液槽；
(5)用1×TBE电解液灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源，调试工作环境为电压80V，预电泳10min左右；
(6)预电泳期间，向PCR产物中加入2.5μl loading buffer(上样缓冲液)，混匀，PCR仪97℃变性10min，4℃保存；
(7)正式电泳点样前，用注射器加1×TBE电解液再次冲洗加样孔，边冲洗边点样，PCR产物上样量为2μl左右，然后打开电源，调试工作环境为电压150V，电泳2.5小时左右；
(8)电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，然后将胶板放入有ddH2O的托盘中冲洗一或两次，银染检测；
3)银染检测
(1)固定(10％冰乙酸)：50ml冰乙酸加ddH2O定容至500ml，混匀，倒入托盘中，摇床轻摇25min左右，约至二甲苯靑褪去，ddH2O漂洗两次(速度快，约5s)；
(2)染色(0.1％AgNO3)：称取0.5g AgNO3用ddH2O定容至500ml，染色时现加入3ml37％的甲醛，混匀，倒入托盘中于摇床上避光震荡约25min，然后ddH2O漂洗2次，时间不超过5s；
(3)显色：称取7.5g NaOH，ddH2O定容至500ml，染色时加入2ml 37％甲醛，混匀，将显色液倒入托盘中于摇床上震荡至满意为止(可分两次加入，第一次加入少许，洗掉黑色银液倒掉，再加入剩余显色液，轻摇至条带满意为止)；
(4)ddH2O漂洗1～2次，尽量不超过5s，立即数码相机拍照记录。
6.供试材料的SSR分析
用复筛出的多态性较好的SSR引物(如PmS54)，对供试材料进行PCR扩增及变性PAGE凝胶电泳、银染，结果如图3。凝胶制备和染色方法见步骤5。
7.数据处理及分析
每种SSR引物重复扩增3次，绝大部分带型可重复，极少数不能重复的谱带统计时忽略不计。采用人工读带的方式，对扩增结果进行统计分析，将谱带按“引物号-片段长度”进行记录，并按有无分别赋值1和0，建立数据库。
指纹图谱构建
不同引物产生的谱带数及多态性存在差异，根据用最少的引物组合鉴别尽量多种质的原则，建立马尾松遗传图谱，且所有供试材料的特异性各不相同，达到种质鉴定的目的。

Claims (4)

1.一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，其特征在于：包含以下步骤：
(1)DNA提取采用天根DNAsecure Plant Kit试剂盒优化步骤，然后按如下的PCR反应体系和反应程序用引物对马尾松样本进行扩增；
(2)基于马尾松转录组测序的序列设计SSR引物，并进行PCR扩增体系优化；
(3)最后对PCR产物，采用优化的10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，通过银染法对PCR产物进行检测，根据谱带的有无和大小来判定结果。
2.根据权利要求1所述的一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，其特征在于：SSR标记引物为如下的1对或任意几对：
3.根据权利要求1所述的一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，其特征在于：PCR反应体系采用10-20μl反应体系：分别包含10-50ng的模板DNA 1-2μl，正、反向引物各0.3-0.6μl，5-10μl Mix及适量ddH2O。其中Mix含0.1U/μl Taq polymerase、500μM dNTP、20mM Tris-HCl、100mM KCl、3mM MgCl2，以及其它稳定剂和增强剂。
4.根据权利要求3所述的一种利用转录组测序的SSR分子标记鉴定马尾松种质的方法，其特征在于：PCR的反应程序为：94℃预变性4min；对94℃反应30s，60-63℃反应45s，72℃反应45s进行40个循环；72℃延伸7min；4℃最终保存。
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