CN104561276A - 一种利用irap分子标记对马尾松种质鉴定的方法 - Google Patents

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范付华
丁贵杰
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Abstract

本发明公开了一种利用IRAP分子标记对马尾松种质鉴定的方法，其特征在于：包含以下步骤：（1）采用天根DNA？secure？Plant？Kit试剂盒优化步骤后，提取基因组DNA；（2）根据马尾松LTR反转录转座子的序列设计系列IRAP引物，并进行PCR扩增体系优化；（3）通过琼脂糖凝胶电泳代替聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，将谱带按“引物号-片段长度”为指纹进行记录，并按有无分别赋值1和0，建立数据库。

Description

一种利用IRAP分子标记对马尾松种质鉴定的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及基于马尾松基因组开发的IRAP标记及其应用。基于马尾松LTR反转录转座子序列，开发的8条IRAP标记引物，能从DNA水平对马尾松进行种质鉴定及亲缘关系分析。
背景技术
马尾松（Pinus massoniana）以速生、丰产、适应能力强、分布广、全树综合利用率高、用途广泛等优良特性，而成为我国南方最主要优质针叶用材树种之一，在我国森林资源发展、林纸一体化、松香林产化工业及森林生态服务功能中具有重要地位，其中，马尾松优良种质的发掘和保护对产业的健康发展至关重要。因此，马尾松种质的准确、高效鉴定和亲缘关系分析，对种质的知识产权保护、开发和利用具有重要现实意义。
随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术被广泛用于马尾松种质鉴定和亲缘关系分析。与其它遗传标记（形态学标记、生物化学标记、细胞学标记）相比，分子标记的优越性有：大多数为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异丰富，分子标记数量极多；不同发育阶段、不同组织的DNA都可用于标记分析；不受环境因子的影响；检测手段简单、迅速。现有的DNA标记技术有数十种，但覆盖马尾松基因组的比例较小，标记密度较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为了克服现有分子标记覆盖马尾松基因组比例低、操作复杂等缺点，本发明旨在提供多态性检出率高、分辨率更好、稳定可靠、简单高效的分子标记。本发明提供的IRAP引物及方法，可以使IRAP标记直接用于马尾松的种质鉴定和亲缘关系分析，具有高效性和实用性。
本发明的技术方案是：一种利用IRAP分子标记对马尾松种质鉴定的方法，包含以下步骤：
（1）采用天根DNA secure Plant Kit试剂盒优化步骤后，提取基因组DNA；
（2）根据马尾松LTR反转录转座子的序列设计系列IRAP引物，并进行PCR扩增体系优化；
（3）通过琼脂糖凝胶电泳代替聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，将谱带按“引物号-片段长度”为指纹进行记录，并按有无分别赋值1和0，建立数据库。
IRAP标记引物：为以下中的1条或任意几条：
R-3     GCCCTGAACAAGAAGACACTG；
R-16    AGCGGTATGTGCGTGGACTA；
R-17    AGACCTCAAAGAATCGCTACCC；
P-3     AGGGTAAGAAAGAACTGGTATG；
P-16    AGGGTATGAGGTGAAAGGGAAGG；
SAR1    CAACTCATACGCAACCTGTCCAATCCTG；
SAF2    GTGGAGCCTGATTATCTTCTAT；
PPT2    ACCAGGGAGAAATTGAGAATCT。
步骤（2）中10 μl的反应体系中：10-50 ng的模板DNA、0.3-0.5 μl浓度为10μM的引物、ddH2O和5 μl Mix。
Mix包含0.1 U/μl Taq polymerase，500μM dNTP，20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，以及稳定剂和增强剂。
本发明的有益效果：本发明通过马尾松反转录转座子LTR、PPT及RT序列设计引物，经过简单的PCR和电泳检测，可以检测其它分子标记无法鉴定的马尾松种质，具有操作简单、重复性好、效率高等优点。本发明中开发的8条IRAP引物扩增获得的分子标记，在马尾松基因组中分布均匀、多态性丰富、清晰稳定、分辨率高，可有效用于马尾松种质的DNA指纹图谱构建及知识产权保护等工作，具有重要实际意义；在本发明中，优化的PCR体系更适合马尾松IRAP标记的扩增，而且采用琼脂糖凝胶电泳代替聚丙烯凝胶电泳，极大地节省了时间和成本，进一步提高了IRAP标记在马尾松种质鉴定和知识产权保护上的应用效率。
附图说明
图1为IRAP引物扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；
图2为IRAP引物扩增后琼脂糖凝胶电泳检测图；
图3为引物SAR1对60个马尾松家系的电泳检测图。
具体实施方式
实施例：以本发明中的IRAP引物鉴定60份马尾松种质，其中P-16、SAR1、PPT2单条引物即可区分所有60份供试材料。
1、IRAP引物设计
以申请人获得的带有3’-LTR末端的马尾松反转录转座子LTR序列和部分RT序列为模板，设计合成特异的IRAP正、反向引物（表1）。
2、马尾松材料及基因组DNA的提取
60份马尾松种质见表2。
采用天根DNAsecure Plant Kit（DP320）试剂盒并作适当修改，提取基因组DNA：1）取新鲜马尾松针叶100 mg，加入液氮充分碾磨。加入450 μl缓冲液LP1和6 μl RNase A (10 mg/ml)，旋涡振荡2 min，室温放置15 min。2）加入150 μl缓冲液LP2，充分混匀，旋涡振荡2 min。3）12,000 rpm(~13,400×g)离心5 min，将上清移至新的离心管中。4）加入1.5倍体积的缓冲液LP3(使用前先加入无水乙醇)，立即充分振荡混匀25 sec，此时可能会出现絮状沉淀。5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000 rpm (~13,400×g )离心30 sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。6）向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW (使用前先加入无水乙醇)，12,000 rpm (~13,400×g )离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7）重复操作步骤6）。8）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。9）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl洗脱缓冲液TE，室温放置3-7 min，12,000 rpm(~13,400×g )离心2 min，将溶液收集到离心管中备用。
3、PCR扩增
反应体系为（10 μl）：10~50 ng的模板DNA，0.3-0.5 μl引物（10 μM），5 μl Mix及适量ddH2O。其中，Mix含0.1 U/μl Taq polymerase，500 μM dNTP，20 mM Tris-HCl（pH8.3），100 mM KCl，3 mM MgCl2，以及其它稳定剂和增强剂。PCR反应程序为94℃预变性4 min；94℃变性45 s，最适退火温度复性45 s（表1），72℃延伸1 min，35-40个循环；最后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR反应产物，在含有GoldViewⅠ的1.5%琼脂糖凝胶中，以5 V/cm的电压电泳50 min，然后于凝胶分析仪中观察并拍照保存。
4、数据处理及分析
每种IRAP引物重复扩增2次，绝大部分带型可重复，极少量不能重复的谱带统计时忽略不计。将谱带按“引物号-片段长度”为指纹进行记录，并按有无分别赋值1和0，建立数据库。
5、指纹图谱构建     不同引物产生的谱带数及多态性存在差异，根据用最少的引物组合鉴别尽量多种质的原则，建立马尾松DNA指纹图谱，且所有供试种的特异性指纹各不相同，达到种质鉴定的目的。

Claims (4)

1.一种利用IRAP分子标记对马尾松种质鉴定的方法，其特征在于：包含以下步骤：
（1）采用天根DNA secure Plant Kit试剂盒优化步骤后，提取基因组DNA；
（2）根据马尾松LTR反转录转座子的序列设计系列IRAP引物，并进行PCR扩增体系优化；
（3）通过琼脂糖凝胶电泳代替聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，将谱带按“引物号-片段长度”为指纹进行记录，并按有无分别赋值1和0，建立数据库。
2.根据权利要求1所述的一种利用IRAP分子标记对马尾松种质鉴定的方法，其特征在于：IRAP标记引物：为以下中的1条或任意几条：
R-3    GCCCTGAACAAGAAGACACTG；
R-16       AGCGGTATGTGCGTGGACTA；
R-17       AGACCTCAAAGAATCGCTACCC；
P-3    AGGGTAAGAAAGAACTGGTATG；
P-16       AGGGTATGAGGTGAAAGGGAAGG；
SAR1       CAACTCATACGCAACCTGTCCAATCCTG；
SAF2       GTGGAGCCTGATTATCTTCTAT；
PPT2       ACCAGGGAGAAATTGAGAATCT。
3.根据权利要求1所述的一种利用IRAP分子标记对马尾松种质鉴定的方法，其特征在于：步骤（2）中10 l的反应体系中：10-50 ng的模板DNA、0.3-0.5 l浓度为10M的引物、ddH2O和5 l Mix。
4.根据权利要求3所述的一种利用IRAP分子标记对马尾松种质鉴定的方法，其特征在于：Mix包含0.1 U/μl Taq polymerase，500μM dNTP，20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，以及稳定剂和增强剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282371A (zh) * 2016-09-21 2017-01-04 贵州大学 一种利用转录组测序的ssr分子标记鉴定马尾松种质的方法

Non-Patent Citations (1)

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