CN105238781A - 基于转录组序列开发的李ssr标记引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子标记技术开发及应用领域，具体提供基于转录组序列开发李SSR标记引物对及其在李种质资源研究中的应用。所述引物对是基于转录组序列开发得到的，在转录组测序的基础上，对大量序列信息进行批量处理，进行SSR位点搜索和SSR引物设计，可以大批量开发SSR标记，大大提高了开发的效率，克服了传统方式开发SSR标记，步骤复杂、工作量大、开发成本高的问题。最终进行SSR引物筛选与多样性分析，验证了SSR引物的有效性。本发明为李SSR标记引物的开发及利用SSR分子标记进行李种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术开发及应用领域，具体涉及基于转录组序列开发的李SSR标记引物对及SSR引物开发的方法。
背景技术
李是蔷薇科李属植物，广泛分布于世界各国，也是我国重要的传统果树之一。李果实富含类胡萝卜素、维生素和花色苷等生物活性物质，具有预防多种疾病的功效，深受消费者喜爱。我国李种质资源极其丰富，李品种数量繁多，命名不科学，同名异物或同物异名的现象十分严重，严重阻碍了李种质资源的开发利用。因此，通过系统的研究，完善品种资源分类，对李种质资源的收集、保存和利用具有十分重要的意义。
分子标记技术是鉴定果树种质资源的有效途径，并且已成功地应用于李种质资源研究。SSR标记具有共显性、数量丰富、多态性高、重复性好、易检测、操作简单等优点，已被广泛用于包括李在内的多种的果树品种鉴定、遗传多样性分析，遗传图谱构建和亲缘关系研究等领域。李缺乏基因组信息，采用传统方式进行SSR标记的开发，步骤复杂、工作量大、开发成本高，限制了SSR标记技术在李种质资源研究中的应用。EST-SSR来源于转录区域，可直接反映相关基因的多样性，具有良好的通用性。近年来，高通量测序技术的快速发展使果树EST-SSR的开发得到了广泛的应用。本研究以芙蓉李转录组数据为基础，开发SSR引物，为利用SSR分子标记进行李种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等奠定基础。
发明内容
本发明的目的是针对目前缺乏李SSR标记引物的不足，提供基于转录组序列开发的李SSR标记引物及应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：基于转录组序列开发的李SSR标记引物对，其特征在于：在检测过程中使用一对或多对引物，所述引物共40对引物，分别为：
第一对引物，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:31和SEQIDNO:32所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:33和SEQIDNO:34所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:35和SEQIDNO:36所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:41和SEQIDNO:42所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:43和SEQIDNO:44所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:45和SEQIDNO:46所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:47和SEQIDNO:48所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:49和SEQIDNO:50所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:51和SEQIDNO:52所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:53和SEQIDNO:54所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:55和SEQIDNO:56所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:57和SEQIDNO:58所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:59和SEQIDNO:60所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:61和SEQIDNO:62所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:63和SEQIDNO:64所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:65和SEQIDNO:66所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:67和SEQIDNO:68所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:69和SEQIDNO:70所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:71和SEQIDNO:72所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:73和SEQIDNO:74所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:75和SEQIDNO:76所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:77和SEQIDNO:78所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:79和SEQIDNO:80所示；
进一步的所述的引物对通过以下步骤得到：
1）构建转录组文库:提取李植物组织总RNA，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA。随后，加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断；以mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，利用AMPureXPbeads纯化cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择；最后通过PCR富集得到cDNA文库。
2）对上述转录组文库进行测序，采用Trinity法对其进行序列组装，得到转录组序列，取每条基因中最长的转录本作为Unigene，并对Unigene序列进行生物信息学分析；
3）采用MISA软件对李转录组中长度大于1kb的Unigene进行单碱基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和混合SSR位点搜索。
4）采用Primer3软件进行SSR引物设计，引物序列长度18-27bp，预计扩增产物长度100-280bp，GC含量40%-60%，退火温度57-63℃，上、下游引物的退火温度值相差不大于2℃。
5）SSR引物筛选与多样性分析
提取李种质资源材料DNA，进行设计引物有效性的PCR鉴定，筛选SSR引物，若有与预计扩增产物长度相近的扩增产物，该引物即为有效引物。采用筛选出的有效引物进行李种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等。
PCR反应体系为20μL，：2×DreamtaqgreenPCRmastermix(Thermoscientific)10μL，上、下游引物各0.8μL(浓度为10μmol/L)，基因组DNA30ng，水7.4μL。PCR反应程序为：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离，并用EB染色。
本发明的优点在于：本发明提供的基于李转录组序列的李SSR标记开发技术，与现有技术相比，获得的转录组序列，极大地增加了用于引物开发的原始数据；本发明采用生物信息学途径进行李SSR标记引物的开发，可以大批量开发SSR标记，大大提高了开发的效率，克服了传统方式开发SSR标记，步骤复杂、工作量大、开发成本高的问题。提供的SSR标记引物是稳定存在的新标记，可直接用于李种质资源的研究，解决了李SSR引物少问题，为利用SSR分子标记进行李种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等奠定基础。
附图说明
图1引物19、21、28和33在8个李品种中的多态性图谱。1：油柰；2：花柰；3：黑宝石；4：威克逊；5：秋姬李；6：槜李；7：芙蓉李；8：三华李；M：marker。
具体实施方式
实施例1
基于转录组测序开发的李SSR引物对，是通过李转录组测序、SSR位点鉴别及SSR引物设计、DNA提取、SSR引物筛选和遗传多样性分析等过程得到的。
本发明中，通过基于转录组序列开发的李SSR引物对的具体方法是：
1）转录组数据的获得
采用EZNAPlantRNAKit(OmegaBio-tek)进行芙蓉李果实总RNA的提取。采用Qubit2.0Fluorometer(Invitrogen,LifeTechnologies,CA,USA)测定RNA的浓度，Agilent2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)评价RNA的质量。将来自于3棵不同树同一阶段果实样品的RNA等量混合后，用于测序文库构建。
采用EZNAPlantRNAKit(OmegaBio-tek)提取芙蓉李果实总RNA，采用Nanodrop、Qubit2.0、Aglient2100方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整性。采用Illumina’sTruSeqRNASamplePreparationKit进行转录组文库构建。用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA。随后，加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断；以mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，利用AMPureXPbeads纯化cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择；最后通过PCR富集得到cDNA文库。
使用IlluminaHiSeq2500高通量测序平台对cDNA文库进行测序，获得的RawData。随后，对RawData进行数据过滤，去除其中的接头序列及低质量Reads获得高质量的CleanData。获得高质量的测序数据之后，采用Trinity法对其进行序列组装。
2）SSR位点鉴别及SSR引物设计
采用MISA软件（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）对芙蓉李转录组中长度大于1kb的Unigene进行单碱基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和混合SSR位点搜索。利用软件Primer3进行引物设计，每条含有SSR位点的Unigene序列产生3条引物。引物序列长度18-27bp，预计扩增产物长度100-280bp，GC含量40%-60%，退火温度57-63℃，上、下游引物的退火温度值相差不大于2℃。尽量避免出现发卡结构、二聚体、错配和引物二聚体等引物二级结构。
3）SSR引物筛选与多样性分析
植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，北京）进行三月李叶片DNA提取。取5μLDNA溶液用1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA纯度检测，电泳缓冲液为1×TAEBuffer，电泳20min后，凝胶用核酸染料进行染色，并用凝胶成像系统仪进行凝胶图像采集。最后将各材料的DNA浓度稀释至30ng/μL备用。PCR反应体系为20μL，：2×DreamtaqgreenPCRmastermix(Thermoscientific)10μL，上、下游引物各0.8μL(浓度为10μmol/L)，基因组DNA30ng，水7.4μL。PCR反应程序为：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离，并用EB染色。
应用上述方法是用芙蓉李果实作为材料进行高通量测序，共组装得到52093条Unigene，其中长度大于1kb的Unigene有13944条（序列总长约为30285.91kb）。采用MISA软件对这些序列进行SSR搜索，共有5434条Unigene含有SSR位点，含有两个或两个以上SSR位点的Unigene有1584条（29.14%）。共检测到7601个SSR位点，SSR发生频率（检出SSR个数与总Unigene数目之比）为54.51%，平均每3.98kb含有1个SSR，其中复合SSR有549个（7.22%）。如表1所示，有单核苷酸至六核苷酸6种重复类型的SSR存在。其中单核苷酸重复出现频率最高，占总SSR的42.19%，其次为二和三核苷酸重复，分别占总SSR的37.72%和18.48%；四、五和六核苷酸重复出现频率均较低，分别为总SSR的1.22%、0.28%和0.11%。
芙蓉李转录组SSR重复单元的重复次数分布在5-24次之间，其中5-9次重复的SSR共有5027个，占总数的66.14%；其次为10-20次重复的SSR，共有2307个，占总数的30.35%。20次重复以上的SSR仅267个，占总数的3.51%。芙蓉李转录组SSR的长度长度分布从10-48bp不等，其中小于12bp的SSR有1814个（23.87%），12-19bp的SSR有4603个（60.56%），大于19bp的SSR有1184个（15.58%）。
表1芙蓉李转录组SSR不同基序长度和重复次数的数量分布
从芙蓉李转录组SSR核苷酸基序类型来看，7601个SSR位点共包含136种重复单元，一、二、三、四、五、六核苷酸重复各有27、24、40、26、19和8种。从分布频率来看（表2），出现最多的基元是A/T（3152个，41.47%），其次是AG/CT（2398个，31.55%）。在单核苷酸重复基元中，以A/T为主，占单核苷酸重复总数的98.29%。在二核苷酸重复基元中，以AG/CT为主，占二核苷酸重复总数的83.64%，其次分别为AT/AT和AC/GT，分别占二核苷酸重复总数的10.46%和5.79%。在三核苷酸重复基元中，以AAG/CTT为主，占三核苷酸重复总数的30.68%，其次为AGC/CTG、AGG/CCT、ATC/ATG和ACC/GGT，分别占三核苷酸重复总数的14.95%、13.88%、13.17%和10.25%。在四核苷酸重复基元中，以AAAG/CTTT出现频率最高，占四核苷酸重复总数的20.43%，其次为AAAT/ATTT和AAAC/GTTT，分别占四核苷酸重复总数的18.28%和10.75%。各类五和六核苷酸重复出现频率均较低。
表2芙蓉李转录组SSR基序类型分布
根据5434条含有SSR位点的Unigene序列进行引物设计，同获得4235对候选引物，从中随机挑选40对SSR引物（包括二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸3种重复基元的SSR位点，表3）进行引物有效性验证。以2份李种质资源材料的基因组DNA为模板对这些引物进行PCR扩增和筛选。结果表明，40对引物均能够扩增出与预期产物片段大小相符特异条带，有效扩增率为100%。
表3芙蓉李SSR引物信息
利用验证的40对SSR引物对8份李种质资源进行扩增、多态性评价。结果表明，17对（42.5%）引物在8个李品种中呈现出多态性（表3），如引物19、21、28和33（图1）。17对引物共检测到55个条带，其中多态性条带32个，每对引物平均产生1.88个多态性片段。每对引物产生1-4个不等的多态性片段。
本研究结果表明采用李转录组数据进行SSR标记开发是一种十分有效的途径。芙蓉李转录组SSR标记对于李种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种、遗传图谱构建以及功能基因的挖掘等都具有重要的价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCELISTING
<110>福建省农业科学院果树研究所
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>80
tgaattggagacatgcagaca21
Claims (4)
1.基于转录组序列开发的李SSR标记引物对，其特征在于：在检测过程中使用一对或多对引物，所述引物共40对引物，分别为：
第一对引物，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:31和SEQIDNO:32所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:33和SEQIDNO:34所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:35和SEQIDNO:36所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:41和SEQIDNO:42所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:43和SEQIDNO:44所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:45和SEQIDNO:46所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:47和SEQIDNO:48所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:49和SEQIDNO:50所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:51和SEQIDNO:52所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:53和SEQIDNO:54所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:55和SEQIDNO:56所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:57和SEQIDNO:58所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:59和SEQIDNO:60所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:61和SEQIDNO:62所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:63和SEQIDNO:64所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:65和SEQIDNO:66所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:67和SEQIDNO:68所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:69和SEQIDNO:70所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:71和SEQIDNO:72所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:73和SEQIDNO:74所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:75和SEQIDNO:76所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:77和SEQIDNO:78所示；
第一对引物，其序列如SEQIDNO:79和SEQIDNO:80所示。
2.根据权利要求1所述的基于转录组序列开发的李SSR标记引物对的筛选方法，其特征在于：所述的引物对通过以下步骤得到：
1）构建转录组文库:提取李植物组织总RNA，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA;随后，加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断；以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，利用AMPureXPbeads纯化cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择；最后通过PCR富集得到cDNA文库；
2）对上述转录组文库进行测序，采用Trinity法对其进行序列组装，得到转录组序列，取每条基因中最长的转录本作为Unigene，并对Unigene序列进行生物信息学分析；
3）采用MISA软件对李转录组中长度大于1kb的Unigene进行单碱基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和混合SSR位点搜索；
4）采用Primer3软件进行SSR引物设计，引物序列长度18-27bp，预计扩增产物长度100-280bp，GC含量40%-60%，退火温度57-63℃，上、下游引物的退火温度值相差不大于2℃；
5）SSR引物筛选与多样性分析
提取李种质资源材料DNA，进行设计引物有效性的PCR鉴定，筛选SSR引物，若有与预计扩增产物长度相近的扩增产物，该引物即为有效引物；采用筛选出的有效引物进行李种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究。
3.根据权利要求2所述的一种基于转录组序列开发李SSR标记引物的方法，其特征在于：步骤5）中PCR反应体系为20μL，：2×DreamtaqgreenPCRmastermix10μL，上、下游引物各0.8μL、浓度为10μmol/L，基因组DNA30ng，水7.4μL；PCR反应程序为：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离，并用EB染色。
4.如权利要求1所述的李SSR引物对在李种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究上的应用。
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