CN108103055A - 一种单细胞rna逆转录与文库构建的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于转录组分析领域，涉及到一种快速进行单细胞RNA逆转录与文库构建的方法。本发明能在5‑6小时内,由1‑2000个细胞或10pg‑20ng经提取的真核生物总RNA为起始，扩增出20‑500ng高质量全长双链cDNA，并获得符合下游分析要求的高质量cDNA文库。此发明有效避免了cDNA合成过程中的3’偏好性和基因组DNA的污染，表达定量分子标签可辅助基因表达量计算，同时在完整扩增RNA序列信息的同时该表达定量分子标签还可保留链来源信息。本发明可获得95％以上的逆转录与扩增建库成功率，cDNA文库可无缝衔接Illumina主流测序平台，下机数据(5M Reads)可检测到90％以上的基因表达，基因表达一致性超过90％，扩增无明显偏倚，且需要的样本投入量更少。

Description

一种单细胞RNA逆转录与文库构建的方法

技术领域

本发明属于转录组分析领域，涉及到一种快速的单细胞RNA逆转录与文库构建方法。

背景技术

转录组是指某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下，细胞内所有转录的mRNA产物的集合，包含了时间和空间的限定，是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带。

转录组分析包括但不限于：编码基因的分析、翻译蛋白的预测、外显子内含子的剪切拼接、转录本的结构分析功能分析，mRNA二级结构，基因的差异表达等等。目前成熟可靠的转录组分析手段包括RT-qPCR分析基因表达量、芯片杂交平台分析分析某些已知基因的转录活动、或者高通量测序技术等。

其中应用高通量测序技术(下一代测序技术，NGS)进行转录组测序(RNA-seq)是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。相对于传统的RT-qPCR平台或芯片杂交平台，NGS技术应用于转录组分析无需预先针对已知的序列设计探针或引物，即可在转录本水平和基因水平对整体转录活动进行检测，并且具有定量更准确，检测通量更高，检测范围更广等优点。此外，在分析转录本结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确的识别可变剪切位点以及可能的点突变，提供最全面的转录组信息。

准确深入地分析转录组，有助于全面理解细胞基因表达和调控网络的作用。相同组织细胞的基因型几乎一致，但细胞亚群的表达往往不同；不同组织的细胞各自拥有独特的转录组。研究这些转录组的细微差异能够从不同的生理学功能和表型角度阐释基因调控网络。一般转录组实验通常需要成千上万甚至上百万个细胞。但早期胚胎细胞和干细胞等只能收集到微量细胞，这就要求实验中利用尽可能少的细胞，最好是在单细胞水平进行转录组分析。最新研究表明，相似细胞的基因表达具有异质性，这种异质性是由不同的衍生基因组、细胞循环和微环境等决定的。常规方法得到的是大量细胞基因表达信息的共性，难以显示彼此的异质性。对单细胞转录组的分析，不仅能研究基因表达的异质性，也能研究表达的随机性，进一步揭示与发育、疾病等相关的一系列重要信息。因此在单细胞水平进行转录组分析具有重要的科学意义也是现实的迫切需要。

理论上以NGS技术进行RNA-seq能在单细胞水平上进行，并且根据不同深度的分析，最终能获得整体水平全部基因的表达信息。此方法具有如下优点：a.分辨率高，起始样品量为单个细胞；b.灵敏度高；c.数字化信号，可以直接检测单个碱基差异、基因家族中相似基因以及可变剪接造成的不同表达；d.检测范围广，不仅能检测基因，还能检测RNA拼接体；e.重现性好。此方法最重要的环节是单细胞mRNA表达分析，即通过获得研究对象mRNA(转录本，基因组转录区域)的信息，鉴定转录发生位点，可变剪切等，其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。单细胞mRNA表达分析的重要前提是单细胞中痕量的mRNA(6-10pg)或pg级别的mRNA被高效且均一的逆转录和扩增。

实践中，单细胞mRNA测序从样本制备到数据处理，从单细胞的分离和处理到扩增时灵敏度和偏向性都存在很多技术问题。自2009年汤富酬等人在"mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell".Nat Methods.6(5):377–82.首次报道单细胞RNA测序技术以来，许多新颖的技术被开发出来，可以更快速、更低成本地提供更多信息。与本专利相关的重要的单细胞RNA测序技术有：

Smart-Seq

Smart-Seq(Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript)是一项具里程碑意义的技术，在2012年由美国和瑞典的科学家共同开发。作为一种单细胞测序方案，它在转录本的序列覆盖度上有所改善。基因组的完整覆盖实现了选择性转录本异构体和SNV的检测。

在这种方案中，人们裂解细胞，并将RNA与包含oligo(dT)的引物杂交。然后添加几个无模板的C核苷酸，生成第一条链。这种poly(C)垂悬只添加到全长转录本上。然后将寡核苷酸引物与poly(C)突出杂交，合成第二条链。全长cDNA经过PCR扩增，以获得纳克级的DNA。PCR产物纯化后可用于测序(图1)。

优点：

1.不需要知道mRNA的序列。

2.使用低至50pg的起始材料。

3.转录本的覆盖度改善。

4.高水平的可定位序列。

缺点：

1.并非链特异的。

2.转录本长度偏向性，对超过4Kb的序列不能高效转录。

3.高丰度转录本被优先扩增。

4.纯化步骤可能导致材料损失。

Smart-Seq2

Smart-Seq2一年后发表在《Nature Methods》(2013,10(11):1096)上，对最初的Smart-Seq方案做了一些改进。新方案使用锁核酸(LNA)、更高浓度的MgCl2以及甜菜碱。它不再需要纯化步骤，可大大提高产量。

在这个方案中，人们在包含游离dNTP和带有通用5’锚定序列的oligo(dT)寡核苷酸的缓冲液中裂解单细胞。之后开展逆转录，这个反应也在cDNA的3’端添加2-5个无模板的C核苷酸。然后加入模板转换寡核苷酸(TSO)，它携带了两个核糖鸟苷和一个修饰鸟苷，在3’端产生LNA，作为最后一个碱基。在第一链反应后，利用有限的循环扩增cDNA。然后通过Tagmentation，利用扩增出的cDNA快速有效地构建测序文库。

优点：

1.使用低至50pg的起始材料。

2.不需要知道mRNA的序列。

3.不再需要纯化步骤。

4.转录本的覆盖度改善。

5.高水平的可定位序列。

缺点：

1.并非链特异。

2.扩增效率不高。

本领域需要更高效更特异的单细胞扩增技术。

发明内容

本发明在SMART-seq2基础上做出根本性改变，可实现高效且均一的转录本扩增的同时完成文库构建。

具体技术为：

单细胞(或极微量细胞)经热裂解后释放总RNA，特殊设计的逆转录接头ILMN_MM_30dT和MM_6N引物(6N即NNNNNN，其为6碱基随机引物，用于和RNA随机贴合)和在裂解环境中与RNA的Poly(A)尾或其他区段特异性互补配对，逆转录酶的作用下对其中mRNA进行逆转录并获得cDNA第一链。(图3)。

而后以模板转换(Template-switching)技术在所获得的cDNA的3’端无模板地添加2-5个(通常为3个)C核苷酸。体系中特殊设计的模板转换寡核苷酸ILMN_KK_6N3G(3’端携带1-4个核糖鸟苷和1个LNA鸟苷，LNA鸟苷作为最后一个碱基，此模板转换寡核苷酸的5’端以疏水特性封闭基团例如NH₂-C6做封闭处理)在cDNA的3’端添加一段接头序列，特殊的反应保护剂可极大增强逆转录酶的模板转换活性，并在逆转录酶的以DNA为模板的聚合活性引导下，进行cDNA二链生成(图4)。

在第二链生成反应后，利用有限的循环以Illumina通用引物和Index引物扩增cDNA。简并碱基M和K的作用是限制接头添加的方向(图5)。

在一个方面，本发明提供一种单细胞mRNA逆转录同时构建cDNA文库的方法，包括：

1)裂解单细胞或极微量细胞获得总RNA

2)使用逆转录接头或MM_6N引物在逆转录酶的作用下对mRNA进行逆转录获得cDNA第一链；

其中所述逆转录接头为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+poly(dT)+VN，5’端以SpacerC18修饰，其中V＝A或C或G；N＝A或C或G或T；

所述MM_6N引物为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+NNNNNN(SEQ ID No.1)，5’端以Spacer C18修饰，其中NNNNNN为6碱基随机引物，用于和RNA随机贴合；

3)在获得的cDNA第一链的3’端不依赖模板添加2-5个C核苷酸；

4)使用步骤3)获得的cDNA为模板，使用模板转换寡核苷酸在逆转录酶的以DNA为模板的聚合活性下进行cDNA二链生成；

所述模板转换寡核苷酸为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTKK+1-4个核糖鸟苷+一个LNA鸟苷，并在5’端以AMO修饰；

5)在第二链生成后，利用有限的循环以通用引物和Index引物进行扩增获得cDNA,

其中所述通用引物为：

5’NH2-C6-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTMM(SEQ ID No.2)

所述Index引物为：

5’NH2-C6-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTKK，其中NNNNNN为Index，N为任意碱基(SEQ ID No.3)。

在一个实施方案中，所述逆转录酶选自Invitrogen^TM公司SuperScript^TMIIReverse Transcriptase、或Invitrogen^TM公司SuperScript^TMIII ReverseTranscriptase、Thermo Scientific^TM公司Maxima H Minus Reverse Transcriptase、RevertAid H Minus Reverse Transcriptase。

在另一个实施方案中，所述poly(dT)包含30个T碱基。

在一个实施方案中，所述逆转录接头为SEQ ID No.4。

在另一个实施方案中，所述1-4个核糖鸟苷为2个核糖鸟苷。

在另一个实施方案中，所述模板转换寡核苷酸在GCTCTTCCGATCTKK序列与核糖鸟苷之间还包括表达定量分子标签(barcode)，所述表达定量分子标签为4-10个任意碱基。

在另一个实施方案中，所述表达定量分子标签为6个任意碱基。

在一个实施方案中，所述模板转换寡核苷酸为SEQ ID No.5。

表达定量分子标签作用有两点：

1)以6个N碱基为例，其随意组合产生4096种变式，以4096种变式标记同一基因的转录本，配合打断构建文库方式，即可得到该基因的表达量绝对定量值。

2)标签只能特异性的加在cDNA二链，配合生物信息数据分析，可以获得转录方向。

本发明另一方面提供一种对细胞内转录本绝对定量的方法，包括：

对根据权利要求5所述的方法建立的cDNA文库测序后，找出包含GCTCTTCCGATCTKK序列+所述表达定量分子标签+GGG加部分转录本序列的Reads，通过部分转录本序列，将其特异性的比对到基因上，然后分析所述表达定量分子标签的变式个数，如某一种变式出现多次，那么认为该情况来自于PCR扩增中的Duplication，计数为1，去重后的变式个数，即为表达量绝对定量值。

有益效果：

本发明能在5-6小时内,由1-2000个细胞或10pg-20ng经提取的真核生物总RNA为起始，在逆转录酶的作用下对其中mRNA(或其他类型RNA)进行逆转录并获得cDNA第一链，而后以Template-switching专利技术在cDNA的3’端添加一段接头序列(带有表达定量分子标签)并进行cDNA二链生成，而后以接头区段为引物锚定位点进行指数扩增的同时在cDNA两端加上Illumina文库接头，以获得符合下游分析要求的高质量cDNA文库。此发明有效避免了cDNA合成过程中的3’偏好性和基因组DNA的污染，表达定量分子标签可辅助基因表达量计算，同时在完整扩增RNA序列信息的同时该表达定量分子标签还可保留链来源信息。一般情况下，一个反应视投入量可以扩增出20-500ng高质量全长双链cDNA。本发明可获得95％以上的逆转录与扩增建库成功率，cDNA文库可无缝衔接Illumina主流测序平台，下机数据(5M Reads)可检测到90％以上的基因表达，基因表达一致性超过90％，扩增无明显偏倚，且需要的样本投入量更少。

附图说明

图1是Smart-Seq1方法示意图。

图2是Smart-Seq2方法示意图。

图3是利用本发明逆转录接头在逆转录酶的作用下对mRNA进行逆转录并获得cDNA第一链的示意图。

图4是利用本发明的模板转换寡核苷酸获得cDNA第二链的示意图。

图5是利用本发明的引物扩增cDNA的示意图。

图6是用琼脂糖凝胶电泳检测制备DNA文库中的片段长度分布范围的结果。L：DNALadder；S：使用200ng cDNA构建文库，磁珠进行选择回收后结果。

图7是用Agilent 2100Bioanalyzer检测制备DNA文库中的片段长度分布范围的结果。

图8是小鼠脑细胞构建文库并测序，Reads比对外显子、内含子、基因间隔区域的分布统计饼图。Total Tags是序列切割(spliced)一次计数成2个标签(tags)切割2次计数3个标签，所以Total Tags>＝Total Reads。CDS_Exons是基因区域的编码区域。5'UTR Exons是基因区域的5端UTR区域。3'UTR Exons是基因区域的3端UTR区域。Introns是内含子区域。

TSS_up_1kb是转录起始位置上游1Kb内。TSS_up_5kb是转录起始位置上游1Kb到5Kb内。TSS_up_10kb是转录起始位置上游5Kb到10Kb内。TES_down_1kb是转录终止位置下游1Kb内。TES_down_5kb是转录终止位置下游1Kb到5Kb内。TES_down_10kb是转录终止位置下游5Kb到10Kb内。

图9是小鼠脑细胞构建文库并测序，剪切位点注释情况的统计饼状图。

图10是小鼠脑细胞构建文库并测序得到的转录本覆盖均一性分布图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1获取单细胞(或微量细胞)总RNA

1.细胞稀释：将小鼠脑细胞用1x PBS缓冲液(以下PBS均指1×PBS缓冲液)稀释，离心、重悬，处理为细胞悬液，密度为～20个细胞/μL；

a.组织处理方法：将组织在液氮中磨碎，每20-30mg组织加约600μL PBS，12,000rpm(～13,400×g)离心1分钟，得到细胞沉淀，弃上清并吸取细胞沉淀，用1x PBS稀释处理成细胞悬液；

b.单层培养细胞处理方法：以P1000移液器将贴壁细胞轻轻吹下，12,000rpm(～13,400×g)离心1分钟，得到细胞沉淀，弃上清并吸取细胞沉淀，以1x PBS稀释处理成细胞悬液；

c.细胞悬液处理方法：12,000rpm(～13,400×g)离心1分钟，得到细胞沉淀，弃上清并吸取细胞沉淀，用1xPBS稀释处理成细胞悬液；

注意：尽量除尽细胞培养基，细胞培养基可能抑制细胞裂解并影响RNA质量；尽量使细胞充分悬浮并计数，计数不准确可能影响单细胞分离。

2.将单细胞加入含有4μL Cell Lysis Buffer的PCR管中；

注意：含有单细胞样本的PBS溶液体积不得超过1μL，严格的体积控制有助于逆转录反应的顺利进行。

3.将13.3*NμL的RT Buffer置于PCR管中(N为反应的数量)；

4.在预热的PCR仪中孵育样本和RT Buffer(RT Buffer中千万不可加逆转录酶)，条件如下：

温度	时间
		72℃	3min
立即置于0℃	>2min

实施例2逆转录获得双链全长cDNA

1.吸取1.7*NμL的RT Enzyme Mix加入到上一步的RT Buffer中，手动混匀，离心；

2.在每份细胞裂解产物中，加入15μL RT Buffer与RT Enzyme Mix的混合物，瞬时离心后立即置于冰上，在预热的PCR仪上孵育样本，条件如下：

实施例3扩增

将29.25μL PCR Mix加入逆转录产物中(此时溶液体积为49.25μL)，每管反应中分别加入0.75μL Index引物，混匀离心后，在PCR仪中扩增，反应条件如下：

实施例4文库检测

步骤一：纯化

1)将扩增产物转移至离心管中，取0.8×(40uL)Ampure XP磁珠或CMpure磁珠，与扩增产物混匀后置于磁力架上静置10min；

2)待磁珠全部吸附到管壁上(约5min)，弃上清后用新配制的80％乙醇清洗磁珠两次，弃上清；

3)室温静置5min，待磁珠干燥后(请注意不要过分干燥致使磁珠开裂，以免影响回收效率)，根据下游需要以17.5uL TE buffer、EB buffer或去核酸水重悬磁珠；

4)室温静置5min后将离心管置于磁力架上，吸取15uL上清，此上清双链cDNA文库。

步骤二：文库质量检测

1文库浓度

为了得到高质量的测序结果，需要对cDNA文库进行精确定量，首先推荐使用Realtime PCR方法对DNA文库进行绝对定量。此外，还可使用荧光染料法，如Qubit法或荧光染料Picogreen法，此处请勿使用基于吸光度测量的定量方法。最终可使用以下近似公式换算DNA文库的摩尔浓度。

2文库长度分布

制备好的DNA文库可用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100Bioanalyzer检测DNA文库中的片段长度分布范围。结果见图6和图7。

实施例5测序上机(数据量为5M reads)

使用HiSeq 2500测序仪对文库进行测序，单端测序，读长为141，机打检测结果统计见

下表1：

表1

请结合有益效果对上表进行讨论。

模板起始量低：10个细胞或100pg Total RNA即可作为起始模板，进行高效扩增；

扩增灵敏度高：使用优化的反应体系，大幅度增加了基因的检出量；

产物完整性好：通过PolyT引物扩增全长mRNA，同时通过6N引物扩增其他类型RNA，可获得全转录组信息，避免了5'和3'偏好性；

操作成功率大：cDNA扩增产物即为二代测序文库，该方法大大减少了RNA样品的处理步骤，从而最大限度避免了样品损失的风险，提高了操作成功率；

实施例6表达绝对定量

测序数据下机后，得到原始的TASTQC文件，经过基因组比对操作去除无效数据，找出包含GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGACATNNNNNNGGG加部分转录本序列的Reads，通过部分转录本序列，将其特异性地比对到基因上，然后分析6N的变式个数，如6N的某一种变式出现多次，那么认为该情况来自于PCR扩增中的Duplication，计数为1，去重后的变式个数，即为表达量绝对定量值。

实施例7 500pg小鼠脑细胞构建文库的结果

取500pg小鼠脑细胞构建文库，采用上述相同的步骤，使用HiSeq 2500测序仪对文库进行测序，单端测序，读长为141。Reads比对外显子、内含子、基因间隔区域做分布统计饼图(图8)。详细说明：计算比对参考基因组的Reads在不同基因成分内的覆盖情况(例如CDSexon，5'UTR exon，3'UTR exon，Intron)，Reads比对分布评估统计每个区域比对到的唯一reads的数目，即如果同一reads比对到同一区域，但该区域可能被同时注释为外显子和内含子(两个不同的转录本元件)，则按一定的优先顺序只记录一次该Reads在优先基因组区域内的比对数量，区域计数的优先次序按CDS Exons>UTR Exons>Introns排序。例如，如果一个Reads比对到一个属于CDS Exon和Intron区域，该Reads将被标注为属于CDS Exons。结果说明该方法测序得到的外显子占比高，得到的cDNA完整性好。

剪切位点根据注释情况做统计饼状图如图9所示。详细说明：可变性剪切位点注释评估分析过程是依据各样本比对参考基因组与已知基因模型注释信息，比较已知剪切位点(splice junction)获得当前转录组内的新剪切位点数目与比例。每个探测到的剪切位点可被划分为3个独立类型，(1)已注释的：全部属于已知基因模型注释内的剪切位点，即包括剪切位点的5端剪切位点和3端剪切位点，其比例为37.27％。(2)全新的：全部属于新的剪切位点，剪切位点两端均不属于已知基因模型中被注释的部分，其比例为51.62％。(3)部分新的：某部分(5'SS or 3'SS)属于已知基因模型注释内的剪切位点，另外部分(3'SS或5'SS)属于新的剪切位点的情形，其比例为11.11％。结果说明本方法得到的新可变剪切较多，对于可变剪切方向的转录组研究具有重大意义。

转录本覆盖均一性分布图如图10所示，横坐标代表转录本长度归一化后100nt的位置，纵坐标代表覆盖在每个子区域位置上的reads数目，详细说明:转录本覆盖匀一性分布评估用于检测转录本内测序reads是否均一并且是否存在5'/3'偏差，评估方法是：分析过程中将所有已知转录本归一化为长度100nt长度范围的区域并计算覆盖在每个子区域位置上的reads数目。最终提供描述基因体5'/3'方向的reads覆盖度分布图。结果显示该方法不存在5’/3’偏差，RNA序列测序实验质量很好，可用于后续的进一步数据分析。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 上海亿康医学检验所有限公司

<120> 一种单细胞RNA逆转录与文库构建的方法

<141> 2018-01-09

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)

<223> 5‘端被C18基团封闭

<220>

<221> misc_feature

Claims (9)

1.一种单细胞mRNA逆转录同时构建cDNA文库的方法，包括：

1)裂解单细胞或极微量细胞获得总RNA

2)使用逆转录接头或MM_6N引物在逆转录酶的作用下对mRNA进行逆转录获得cDNA第一链；

其中所述逆转录接头为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+poly(dT)+VN，5’端以Spacer C18修饰，其中V＝A或C或G；N＝A或C或G或T；

所述MM_6N引物为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTMM+NNNNNN，其中NNNNNN为6碱基随机引物，用于和RNA随机贴合(SEQ ID No.1)。

3)在获得的cDNA第一链的3’端不依赖模板添加2-5个C核苷酸；

4)使用步骤3)获得的cDNA为模板，使用模板转换寡核苷酸在逆转录酶的以DNA为模板的聚合活性下进行cDNA模板转换；

所述模板转换寡核苷酸为(5’到3’)GCTCTTCCGATCTKK+1-4个核糖鸟苷+一个LNA鸟苷，并在5’端以AMO修饰；

5)在第二链生成后，利用有限的循环以通用引物和Index引物进行扩增获得cDNA,

其中所述通用引物为：

5’NH2-C6-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTMM(SEQID No.2)

所述Index引物为：

5’NH2-C6-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTKK，其中NNNNNN为Index，N为任意碱基(SEQ ID No.3)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述逆转录酶选自Invitrogen^TM公司SuperScript^TMII Reverse Transcriptase、或Invitrogen^TM公司SuperScript^TM III ReverseTranscriptase、Thermo Scientific^TM公司Maxima H Minus Reverse Transcriptase、RevertAid H Minus Reverse Transcriptase。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述poly(dT)包含30个T碱基。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述逆转录接头为SEQ ID No.4。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述1-4个核糖鸟苷为2个核糖鸟苷。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸在GCTCTTCCGATCTKK序列与核糖鸟苷之间还包括表达定量分子标签，所述表达定量分子标签为4-10个任意碱基。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述表达定量分子标签为6个任意碱基。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸为SEQ ID No.5。

9.一种对细胞内转录本绝对定量的方法，包括：

对根据权利要求5所述的方法建立的cDNA文库测序后，找出包含GCTCTTCCGATCTKK序列+所述表达定量分子标签+GGG加部分转录本序列的Reads，通过部分转录本序列，将其特异性的比对到基因上，然后分析所述表达定量分子标签的变式个数，如某一种变式出现多次，那么认为该情况来自于PCR扩增中的Duplication，计数为1，去重后的变式个数，即为表达量绝对定量值。