CN109161586B - 一种对rna分子进行绝对定量的高通量测序方法 - Google Patents
一种对rna分子进行绝对定量的高通量测序方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法：RNA样品脱磷酸化；再通过T4 RNA连接酶，连接脱磷酸化的RNA与DNA接头1，捕捉95%以上的RNA；之后用去甲基化酶减少RNA修饰；再去除多余的接头1；然后以上述RNA为模板逆转录得到cDNA；再降解RNA模板；通过T4 DNA连接酶连接cDNA与发卡结构的DNA接头2，连接98%以上cDNA；再去除多余的接头2；最后进行PCR引物扩增并测序。本发明通过特殊设计DNA接头，克服了现有RNA测序技术中连接效率偏好性导致的无法精确定量，以及无法捕捉含有修饰位点的RNA分子的缺陷，实现了能够实现对不同来源的RNA样品中所有RNA分子进行绝对定量。本发明的方法简便，可用于临床分子诊断、分子生物学研究、细菌抗药性、癌症发生及预防等领域。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与生物医药领域，涉及一种用于对RNA分子进行绝对定量的方法，具体涉及一种测定样品中RNA分子拷贝数的高通量测序方法。
背景技术
随着分子生物技术的发展，现代生物学和生物医学研究已经进入到“组学”的研究阶段，即通过捕捉细胞内数以千万计的分子动态信息，研究细胞内全局代谢网络和运行机制，如功能基因组学，蛋白组学，代谢组学等。其中，作为遗传信息的传递者，RNA分子在细胞内的其他诸多功能也逐渐被揭示，如调控基因表达、生物催化、调控蛋白翻译效率、细胞抗药性等。
随着新一代测序技术（NGS，高通量测序）的发展，RNA高通量测序成为RNA组学研究领域的重要手段，即同时监测细胞内所有RNA分子的动态过程，进而揭示细胞内RNA分子的代谢网络及其作用机理。然而，目前的常规RNA测序技术不能用于RNA分子的绝对定量分析，有两个原因：首先，研究表明，用于RNA测序的连接酶对RNA的序列具有偏好性，不同3’端序列的RNA分子的连接效率差异103倍以上，这种差异在后期测序过程中会被放大到106倍，因此目前的RNA测序技术只能用于不同样品间的相对比较，无法实现绝对定量；第二，目前的RNA测序技术，是基于将两个DNA接头分别连接到RNA分子的两端后，进行逆转录。而当RNA分子上具有修饰位点时，逆转录酶就会在修饰位点脱落，进而导致该类分子无法完成后续的PCR扩增，结果就导致测序时该类RNA分子丢失。基于此，其他几种改良的RNA定量技术被开发出来，包括：1. 利用DNA探针进行对RNA分子进行杂交，包括凝胶分离后的分子杂交以及芯片杂交两种。而基于探针杂交的技术，由于杂交效率对不同结构、不同序列的RNA分子差异较大，只能对RNA分子进行定性或者半定量，并且无法实现高通量检测，目前该方法已基本被弃用；2. 通过将RNA分子的3’端加入DNA接头或者polyA后，进行逆转录得到cDNA，最后PCR扩增cDNA后进行高通量测序。然而目前有研究证明，类似于传统测序技术，加入DNA接头或者polyA的反应，对不同RNA分子的3’端序列具有序列偏性，只能捕捉部分RNA分子，所以仍然无法实现对不同RNA分子的绝对定量。
目前越来越多的研究表明，细胞内存在大量的含有表观遗传修饰的RNA分子，如tRNA、具有调控功能的tRNA分子片段、含有表观遗传修饰的mRNA、小RNA等，这些分子在基因表达，抗药性，癌症发生，细胞代谢等过程具有重要的调控功能。现在广泛使用的RNA测序技术，无法对该类RNA分子进行绝对定量分析。因此，开发RNA分子绝对定量技术，尤其对含有修饰的RNA分子，将极大推动RNA组学方面的研究和临床应用。
发明内容
针对现有技术中无法对修饰RNA测序定量，以及连接效率偏好性导致的无法精确定量的问题，本发明提供了一种精确定量细胞内RNA分子的方法，通过设计特殊的DNA接头，第一次实现了捕捉并绝对定量样品中所有RNA分子，不但能够实现对不同来源的RNA样品进行绝对定量，还能够实现对含有修饰位点的RNA分子的定量。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法，包括以下步骤：
（1）RNA样品脱磷酸化；
（2）通过T4 RNA连接酶连接步骤（1）获得的RNA与特殊设计的DNA接头1，连接效率大于95%；
（3）利用去甲基化酶减少RNA修饰；
（4）去除多余的DNA接头1；
（5）以步骤（4）中的RNA为模板逆转录得到cDNA；
（6）降解RNA模板；
（7）通过T4 DNA连接酶连接步骤（6）获得的cDNA与特殊设计的DNA接头2，连接效率大于98%；
（8）去除多余的DNA接头2；
（9）利用NGS测序进行标准PCR引物扩增并测序；
所述DNA接头1的序列如SEQ No. 1所示，其3’端碱基为双脱氧核苷酸；DNA接头2的序列如SEQ No. 2所示，其5’端磷硫酰化修饰，其3’端修饰丙烷；逆转录的引物序列如SEQNo. 3所示，5’端含有6个磷硫酰化修饰。
优选地，步骤（2）中RNA样品中还包括不同系列浓度的内参RNA；进一步地，所述内参RNA的序列随机，长度为20-80nt；更优选为60-80nt。
优选地，步骤（3）中的去甲基酶为AlkB酶。
优选地，步骤（4）和步骤（8）中采用酶解法去除多余的DNA接头1 或DNA接头2；优选为核酸酶RecJ。
优选地，步骤（3）与步骤（4）顺序可换。
优选地，步骤（6）中降解方式可以为RNA酶解或碱性水解。
优选地，步骤（7）中，发卡结构的DNA接头2通过热变性后缓慢降温获得。
优选地，步骤（9）中所述NGS测序为Illunima测序。
本发明的原理如下：
现有技术中对RNA的定量检测，对于常规无修饰RNA，会首先添加5’和3’连接接头，通过逆转录获得cDNA，通过后续的扩增和测序列步骤，通过检测获得的reads数量得到RNA的量；但是如果RNA被修饰，逆转录过程则中断于修饰位点，不能获得完整的cDNA，因此无法定量RNA；而且5’和3’接头的连接效率差异较大，造成许多即使未修饰的RNA也不能获得cDNA，最终无法实现绝对定量。本发明中通过去修饰酶的作用获得完整的cDNA。本发明中特殊设计的DNA接头1序列，末端采用双脱氧核苷酸可以防止接头自连，提高与RNA的连接效率，实现了捕捉样品中大于95%的RNA分子；同时，连接反应后多余的接头可以用生物化学方法轻易去除。由于接头2连接的是cDNA，本发明中特殊设计的接头2具有发卡结构，一方面可以提高T4 DNA连接酶的结合率，实现连接效率大于98%，另一方面可以防止自连，而且连接反应后多余的接头可以用生物化学方法轻易去除。同时，本发明通过连接接头1后，先进行逆转录，再连接接头2的方式，提高了5’和3’连接序列的结合效率，避免了RNA修饰对逆转录cDNA的阻断效应，实现了大于95%的RNA分子能够被定量测序，最终通过加入内参RNA获得标准曲线，通过标准曲线对RNA分子的拷贝数进行绝对定量。
本发明具有以下优点：
本发明提供的精确定量细胞内RNA分子的方法，通过特殊的接头序列与结构的设计，实现了捕捉并定量样品中所有RNA分子，不但能够实现对不同来源的RNA样品进行绝对定量，还能够实现对含有修饰位点的RNA分子的定量。本发明的方法简便，解决了无法对修饰RNA测序定量，以及连接效率偏好性导致的无法精确定量的问题，可用于临床分子诊断、分子生物学研究、细菌抗药性、癌症发生及预防等诸多领域。
附图说明
图1是传统测序技术无法定量含有修饰RNA分子的原理示意图；
图2是本发明精确定量RNA方法原理示意图；
图3是接头1（Linker 1）序列及其连接RNA后的bioanalyzer检测结果；
图4是接头2（Linker 2））序列及其连接cDNA的bioanalyzer检测结果；
图5是定量不同浓度的内参RNA分子所得线性关系；
图6是定量结核杆菌在潜伏期中的tRNA分子的拷贝数变化。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 Linker1高效连接tRNA样品
1. RNA样品制备
单克隆酵母菌接种于5mL YPD培养基，30℃过夜培养，收集1mL菌体，用Purelinkesmall RNA isolation 试剂盒 (Invitrogen, 美国）提取RNA样品，试剂盒操作按说明书进行。
2. RNA样品去磷酸化
50ng RNA样品中加入1μL rSAP (NEB, 美国），1μL NEB cutsmart缓冲液，补水到10μL，37℃反应15min后，65℃ 10min终止反应。
3. DNA Linker1连接
10μL去磷酸化的RNA样品中加入22μL的混合液（含100 pmol Linker1，10mmolATP，30单位T4 RNA连接酶1(NEB, 美国），2μL缓冲液，15μL PEG8000）。16℃反应过夜后，用Zymo Oligo Clean & Concentrator kit纯化反应液，样品洗脱在19μL水中。bioanalyzer检测连接结果，如图3所示，>95%的RNA分子被成功连接。
实施例2 Linker 2连接cDNA样品
1. DNA样品制备
Linker 2样品通过化学合成（IDT, 美国），序列如图4所示。cDNA样品化学合成长度为60nt的DNA样品（IDT, 美国），序列为随机序列，以模拟不同来源的cDNA样品。
2. Linker 2发夹结构形成
溶解10μg Linker 2于10μL水中，95℃变性3min，之后以0.1℃每秒钟的速度降温至4℃，即形成图4中的发夹结构。
3. 连接反应
20μL的反应体系中含有：50ng的cDNA样品中，加入1μg（20倍）或2.5μg（50倍）的Linker 2，2μL T4 DNA连接酶(NEB, 美国），2μL缓冲液，10μL PEG8000，22℃反应12小时后，用Zymo Oligo Clean & Concentrator kit纯化反应液，样品洗脱在19μL水中。bioanalyzer检测连接结果，如图4所示，2.5μg Linker 2可连接>98%的cDNA样品。
实施例3 精确定量结核杆菌潜伏期中的tRNA分子变化
1. RNA样品制备
将结核杆菌BCG单克隆菌体接种于100mL 7H9培养基（Middlebrook）中，37℃摇床培养36小时，收集菌体，悬浮于100mL PBS缓冲液。取出10mL悬浮液，离心收集菌体，提取RNA样品，该样品为潜伏期第0天（S0)的样品。剩余悬浮液继续37℃滚筒培养，培养至第4，10，20天分别取出10mL菌体，提取RNA样品，即为潜伏期第4（S4)，10(S10)，20（S20）天的样品。二十天后，收集所有菌体，并用7H9培养基继续培养6天后，收集菌体，提取RNA样品，为恢复期第6天（R6)样品。每个样品3个重复，每个样品中加入不同浓度的长度为60nt的RNA内参（序列见SEQ No. 4）。RNA样品提取均采用Purelinke small RNA isolation 试剂盒(Invitrogen,美国），试剂盒操作按说明书进行。
2. RNA样品去磷酸化
50ng RNA样品中加入1μL rSAP (NEB, 美国），1μL NEB cutsmart缓冲液，补水到10μL，37℃反应15min后，65℃ 10min终止反应。
3. Linker1连接
10μL去磷酸化的RNA样品中加入22μL的混合液（含100 pmol Linker1，10mmolATP，30单位T4 RNA连接酶1(NEB, 美国），2μL缓冲液，15μLPEG8000）。16℃反应过夜后，用Zymo Oligo Clean & Concentrator kit纯化反应液，样品洗脱在19μL水中。
4. AlkB去除RNA修饰
步骤3中所得的tRNA产物中加入50μL新鲜配制的反应液：2×优化AlkB缓冲合剂（150mM 2-酮戊二酸，4mM抗坏血酸，150mM (NH4)2Fe(SO4)2，100g/mLBSA，100 mM HEPES（pH8）），AlkB酶2 mL（Arraystar），1μL核糖核酸酶抑制剂（NEB）和水。反应在室温下孵育2小时后，加入100μL酚-氯仿（pH值5.2）萃取除去AlkB蛋白。上清液用Zymo Oligo Clean &Concentrator kit纯化反应液，样品洗脱在19μL水中。
5. 消除未连接的Linker1
向第4步所得产物中加入2μL NEB cutsmart缓冲液，1μL 5’ deadenylase（NEB），30℃反应1小时后，再加入2μL RecJ（NEB）继续37℃孵化30min，使用Dyex Kit纯（QIAGEN）反应产物。
6. 逆转录反应
向步骤5所得产物中加入2 pmol逆转录引物，70℃温育3min后，立即置于冰上。利用Clontech primescriptase kit (Clonthech)进行逆转录反应，操作按照试剂盒说明书进行。
7. 消除RNA模版
向步骤6中所得反应产物中介入1μL浓度为5mol的氢氧化钠，90℃反应5min，水解RNA。降至室温后，加入1μL浓度为5mol的盐酸，用于中和氢氧化钠。中和反应后的产物，用Zymo Oligo Clean & Concentrator kit纯化反应液，样品洗脱在19μL水中，冷冻干燥浓缩至5μL。
8. cDNA连接反应
向步骤7所得产物中，加入1μg的Linker 2，2μLT4 DNA连接酶(NEB, 美国）2μL缓冲液，10μL PEG8000，22℃反应12小时后，用Zymo Oligo Clean & Concentrator kit纯化反应液，样品洗脱在19μL水中。
9. 消除未连接的Linker 2
向第8步所得产物中加入2μL NEB cutsmart缓冲液，1μL 5’deadenylase（NEB），30℃反应1小时后，再加入2μL RecJ（NEB）继续37℃孵化30min，使用Dyex Kit（QIAGEN）纯化反应产物。
10. PCR扩增及Illunima文库构建
取20μL步骤9中的纯化产物，加入1μL的Clontech AMPseq DNA聚合酶（Clontech）以及25μL的缓冲液，2μL dNTPs (10 mM)以及Illunima引物各2μL，95℃变性1min，之后按以下PCR程序18个循环：95℃30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1min。反应完成后的PCR产物利用QIAGEN胶回收试剂盒回收大于200bp的DNA片段，用于Illunima。
11. Illunima测序数据分析
将测序所得的数据，对60nt的RNA内参以及结核杆菌的tRNA序列（图6）进行匹配。对可以匹配的测序reads数进行计数，即为该RNA样品的数量。
结核杆菌tRNA序列参见：
http://gtrnadb.ucsc.edu/GtRNAdb2/genomes/bacteria/Myco_bovi_BCG_ATCC_35743_63839/。
序列表
<110> 曲阜师范大学
<120> 定量RNA分子的高通量测序方法
<130> 20180325
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker 1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
nncactcggg caccaggac 19
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker 2
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(28)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
tgaagagcct agtcgctgtt cannnnnnct gcccatagag c 41
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT primer
<400> 3
gtccttggtg cccgagtg 18
<210> 4
<211> 60
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reference gene
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> n is a, c, g, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(60)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 4
nnagcuagcu agcuagcuag cuagcuagcu agcuagcuag cuagcuagcu agcuagcunn 60
Claims (8)
1.一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）RNA样品脱磷酸化；
（2）通过T4 RNA连接酶连接步骤（1）获得的RNA与特殊设计的DNA接头1；
（3）利用去甲基化酶减少RNA修饰；
（4）去除多余的DNA接头1；
（5）以步骤（4）中的RNA为模板逆转录得到cDNA；
（6）降解RNA模板；
（7）通过T4 DNA连接酶连接步骤（6）获得的cDNA与特殊设计的DNA接头2；
（8）去除多余的DNA接头2；
（9）利用NGS测序进行标准PCR引物扩增并测序；
所述DNA接头1的序列如SEQ No. 1所示，其3’端碱基为双脱氧核苷酸；DNA接头2的序列如SEQ No. 2所示，其5’端磷硫酰化修饰，其3’端修饰丙烷；逆转录的引物序列如SEQ No. 3所示，5’端含有6个磷硫酰化修饰；
步骤（2）中，RNA样品中还包括不同系列浓度的内参RNA；
步骤（7）中，DNA接头2为发卡结构，通过热变性后缓慢降温获得；
所述步骤（1）中，RNA为tRNA。
2.根据权利要求1所述的高通量测序方法，其特征在于，所述内参RNA的序列随机，长度为20-80nt。
3.根据权利要求1所述的高通量测序方法，其特征在于，所述内参RNA的长度为60-80nt。
4.根据权利要求1所述的高通量测序方法，其特征在于，步骤（3）中的去甲基酶为AlkB酶。
5.根据权利要求1所述的高通量测序方法，其特征在于，步骤（4）和步骤（8）中采用酶解法去除多余的DNA接头1或DNA接头2。
6.根据权利要求5所述的高通量测序方法，其特征在于，酶为核酸酶RecJ。
7.根据权利要求1所述的高通量测序方法，其特征在于，步骤（6）中降解方式为RNA酶解或碱性水解。
8.根据权利要求1所述的高通量测序方法，其特征在于，步骤（9）中所述NGS测序为Illunima测序。
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