CN102876660A - 扩增靶核酸的方法和测定样品中的靶核酸的相对量的方法 - Google Patents

扩增靶核酸的方法和测定样品中的靶核酸的相对量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102876660A
CN102876660A CN2012102406576A CN201210240657A CN102876660A CN 102876660 A CN102876660 A CN 102876660A CN 2012102406576 A CN2012102406576 A CN 2012102406576A CN 201210240657 A CN201210240657 A CN 201210240657A CN 102876660 A CN102876660 A CN 102876660A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
target nucleic
sequence
primer
mirna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012102406576A
Other languages
English (en)
Inventor
洪性宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Samsung Electronics Co Ltd
Original Assignee
Samsung Electronics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020120049776A external-priority patent/KR101922126B1/ko
Application filed by Samsung Electronics Co Ltd filed Critical Samsung Electronics Co Ltd
Publication of CN102876660A publication Critical patent/CN102876660A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

以降低的扩增偏倚扩增靶核酸的方法和测定样品中的靶核酸的相对量的方法。所述扩增靶核酸的方法包括：提供包含多种类型的靶核酸的样品；连接至少两种类型的所述靶核酸；和扩增连接产物。

Description

扩增靶核酸的方法和测定样品中的靶核酸的相对量的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求在韩国知识产权局于2011年7月11日提交的韩国专利申请No.10-2011-0068556和2012年5月10日提交的韩国专利申请No.10-2012-0049776的权益，它们的公开内容全部通过参考引入本文。
技术领域
本公开内容涉及扩增靶核酸的方法和测定样品中的靶核酸的相对量的方法。
背景技术
核酸扩增指靶核酸序列或其互补序列的拷贝数增加。核酸扩增是本领域中公知的。核酸扩增包括在扩增过程期间需要多个循环的方法或在单一温度下实施的方法。循环技术以需要热循环的方法例示。需要热循环的方法包括聚合酶链式反应(PCR)，其是本领域中公知的。PCR包括通过热变性将双链DNA变性成单链DNA，将引物与单链DNA退火；和由所述引物合成互补链。
等温扩增是在单一温度下实施的或者其中扩增过程的主要方面在单一温度下实施的扩增。在PCR过程中，加热反应产物以分开两条链，使得另一引物可结合到模板。相反地，等温技术依赖于链置换聚合酶(strand displacingpolymerase)，以分开双链的两条链并再复制模板。等温技术可以分成依赖于引物置换以引发反复的模板复制的方法和依赖于单一引物分子的连续再使用或新合成的方法。依赖于引物置换的方法包括解旋酶依赖性扩增(HDA)、外切核酸酶依赖性扩增、重组酶聚合酶扩增(RPA)、和环介导的扩增(LAMP)。依赖于单一引物分子的连续再使用或新合成的方法包括链置换扩增(SDA)或基于核酸的扩增(NASBA和TMA)。
扩增偏倚(amplification bias)可以在扩增短的靶核酸时根据靶核酸的类型而产生。扩增偏倚可根据靶核酸拷贝数或碱基序列、例如AT含量或GC含量而变化。例如，在包含多种微RNA(miRNA)的样品中，即在包含miRNA文库的样品中扩增各miRNA时，扩增偏倚可根据miRNA的序列和miRNA的拷贝数而变化。通常，miRNA具有范围为约18至25nt且平均约21至24nt的长度，而且具有超过1000种类型的序列。
因此，仍需要开发在没有扩增偏倚的情况下或以降低的扩增偏倚扩增在包含多种靶核酸诸如miRNA文库的样品中的靶核酸的方法。
发明内容
提供以降低的扩增偏倚扩增靶核酸的方法。
提供测定样品中的靶核酸的相对量的方法。
附图说明
通过结合附图考虑的实施方案的以下描述，这些和/或其它方面将变得明晰和更容易理解，其中：
图1A和1B显示扩增产物的电泳结果。
具体实施方式
现在将详细地介绍实施方案，其例子在附图中说明，其中相同的附图标记始终是指相同的元件。在这点上，本实施方案可以具有不同形式，并且不应解释为限于本文中所阐述的描述。因而，下文仅通过参考附图描述实施方案以解释本说明书的各方面。诸如“…至少一种(个)”的表述在要素列表之前或之后时修饰整个要素列表，而不是修饰该列表的单独要素。
根据本发明的实施方案，提供扩增靶核酸的方法，该方法包括：提供包含多种类型的靶核酸的样品；连接至少两种类型的所述靶核酸；并扩增连接产物。
所述方法包括提供包含多种类型的靶核酸的样品。样品可以是包含靶核酸的任何样品。例如，样品可以包括包含靶核酸的生物样品或化学样品。源自活生物体的生物样品可以从活生物体直接分离，或者分离并进一步加工(例如通过使用纯化和扩增)。例如，经分离的活生物体包括选自下组的至少一种：血液、尿、唾液、淋巴、组织和细胞。另外，经进一步加工的样品可以是任何样品，包括血清、由活生物体分离的核酸、或扩增的核酸。化学样品可以包括化学合成的靶核酸。样品可以包括RNA或DNA。样品可以包括miRNA。术语“miRNA”可以是真核细胞中存在的短RNA。miRNA在细胞生理学中具有重要的功能，并且可以充当在基因表达的翻译后的控制物(controller)。可以通过使用TRizol/TRI试剂的方法分离miRNA。也可以通过使用已知的分离试剂盒例如mirVana分离试剂盒(Ambion)和RNeasy试剂盒(Qiagen)分离miRNA。
靶核酸可以具有约200nt或更小的长度。例如，靶核酸长度的范围可在约15至约200nt、约15至约170nt、约15至约150nt、约15至约120nt、约15至约100nt、约15至约80nt、约15至约75nt、约15至约70nt、约18至约200nt、约18至约170nt、约18至约150nt、约18至约120nt、约18至约100nt、约18至约80nt、约18至约75nt、约18至约70nt、约18至约50nt、约18至约30nt、约18至约27nt、约8至约25nt、约18至约25nt、或约21至约25nt的范围内。例如，靶核酸可以具有与前miRNA或miRNA的长度对应的长度。靶核酸可以是DNA或RNA。RNA可以选自下组：tRNA、rRNA、mRNA和miRNA。DNA可以是基因组DNA片段或由RNA制备的cDNA。
在本文中使用的术语“多种类型的靶核酸”表示一个样品中含有具有不同一级序列的至少两种核酸分子。例如，一个样品中可以含有具有不同序列的至少两种miRNA分子。术语“至少两”包括至少三、至少四、至少五、至少n[n为6以上的任意整数]的界限，以及靶核酸的类型的任意具体数目为2或更大的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、m[m为16以上的任意整数]，其全部在此附上。
所述方法包括连接至少两种类型的靶核酸。可以通过使用本领域中已知的任何方法来实施连接。例如，可以在RNA连接酶和DNA连接酶的至少一种存在的情况下实施所述连接。用于在RNA连接酶和DNA连接酶的至少一种存在的情况下连接靶核酸的条件是本领域中公知的。例如，用于连接的条件可以包括包含如下的溶液：具有磷酸化的5’-P-末端的核酸、具有3’-羟基末端的核酸、和ATP。例如，RNA连接酶包括T4RNA连接酶1或2。DNA连接酶包括T4DNA连接酶。可以在适于连接的缓冲液中进行反应。反应温度可以在约35℃至约40℃的范围中，例如约37℃。
通过引入在靶核酸间的接头序列来实施连接。所述连接可通过如下实施：将具有3’-末端的一个靶核酸与具有5’-末端的另一个靶核酸连接，3’-末端特异性接头序列结合到所述3’-末端，5’-末端特异性接头序列结合到所述5’-末端。术语“接头序列”指用于与靶核酸的3’-末端或5’-末端连接的核酸序列。接头序列可以是DNA或RNA。接头序列可以是单链序列或双链序列。接头序列可以具有在约20%至约80%，例如约30%至约80%、约40%至约80%、约50%至约80%、约60%至约80%、约70%至约80%、约60%至约70%、约30%至约70%、约30%至约60%、约30%至约50%、约30%至约40%、约40%至约50%，或约40%至约70%范围内的GC含量。接头序列可以具有在约3nt至约100nt范围内的长度。接头序列的长度可在约3nt至约70nt、约3nt至约50nt、约3nt至约30nt、约3nt至约20nt、约3nt至约10nt、约3nt至约7nt、约4nt至约20nt、约4nt至约10nt、或约4nt至约7nt的范围内。
术语“对3’-末端或5’-末端特异性的接头序列”表示不同的接头序列分别结合到3’-末端和5’-末端。可以通过选择性封闭或活化靶核酸和接头序列的5’-末端和3’-末端的反应性来进行连接。例如，5’-末端接头序列可通过如下仅连接到靶核酸如miRNA或其cDNA的5’-末端：将靶核酸的5’-末端磷酸化，封闭靶核酸的3’-末端(例如，通过将3’-末端-OH基团转化成磷酰基基团)，并在DNA或RNA连接酶存在的情况下与具有3’-末端-OH基团的5’-末端接头序列(A5)反应。在这点上，可以将5’-末端接头序列的5’-末端选择性地磷酸化。3’-末端接头序列(A3)可通过如下仅连接到连接产物的3’-末端：在DNA或RNA连接酶存在的情况下将连接产物与具有磷酸化的5’-末端的3’-末端接头序列反应。在这点上，可以将3’-末端接头序列的3’-末端选择性地磷酸化。可以将对靶核酸的3’-末端和5’-末端特异性的接头序列顺序地引入靶核酸的5’-末端和3’-末端，顺序地引入靶核酸的3’-末端和5’-末端，或者同时引入靶核酸的5’-末端和3’-末端。5’-末端特异性接头序列和3’-末端特异性接头序列可以具有相同的核苷酸序列或不同的核苷酸序列。
将接头序列同时引入5’-末端和3’-末端的例子如下。在DNA或RNA连接酶存在的情况下，将具有磷酸化的5’-末端和3’-末端OH基团的靶核酸、具有非磷酸化的5’-末端和3’-末端OH基团的5’-末端接头序列、和具有磷酸化的5’-末端和封闭的3’-末端的3’-末端接头序列反应，使得可以将分别对靶核酸的5’-末端和3’-末端特异性的接头序列键合到靶核酸的5’-末端和3’-末端。
如上所述，可以将在其5’-末端和3’-末端中的至少之一处具有特异性接头序列的靶核酸彼此连接。
所述方法包括将引物序列或引物结合序列与靶核酸的连接产物的3’-末端和5’-末端的至少一个连接。可以与接头序列与靶核酸间的连接相同的方式将引物序列或引物结合序列与连接产物的3’-末端或5’-末端连接。可以将引物序列和引物结合序列的至少一个与3’-末端和5’-末端之一特异性连接。术语“引物结合序列”包括与引物互补的序列。但是，所述方法可不包括将引物序列或引物结合序列连接到靶核酸的连接产物的3’-末端或5’-末端的至少之一。在这种情况下，接头序列可用作引物序列或引物结合序列。例如，当连接产物包括仅在靶核酸的连接产物的3’-末端或5’-末端的至少之一处的接头时，所述方法可不包括将引物序列或引物结合序列连接到靶核酸的连接产物的3’-末端或5’-末端的至少之一。此外，接头序列的至少一部分也可用作引物序列。
术语“引物序列”指起到核酸聚合起点作用的核酸序列。引物序列可以结合到靶核酸且具有3’-OH基团。引物序列可以是DNA或RNA。引物序列可以是单链。引物序列可以具有在约20%至约80%，例如约30%至约80%、约40%至约80%、约50%至约80%、约60%至约80%、约70%至约80%、约60%至约70%、约30%至约70%、约30%至约60%、约30%至约50%、约30%至约40%、约40%至约50%、或约40%至约70%范围内的GC含量。引物序列可以具有在约10nt至约100nt范围内的长度。例如，引物序列的长度可在约10nt至约70nt、约10nt至约50nt、约10nt至约30nt、约10nt至约20nt、约15nt至约100nt、约15nt至约70nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、或约15nt至约30nt的范围内。
所述引物序列或引物结合序列可预连接到接头序列。两个或更多个(两种或更多种)靶核酸可包括将两个或更多个不同的靶核酸与一个或多个预连接的、端基封闭的3’-引物-接头序列、或者一个或多个预连接的、端基封闭的5’-引物-接头序列组合。
如从前述描述中明晰的，接头和引物序列可以多种不同的方式添加到靶核酸。例如，接头序列(例如端基封闭的接头序列)可连接到两个或更多个靶核酸的3’-末端，和靶核酸随后彼此连接(如果需要，采用从接头除去端基封闭的步骤)以提供具有以下结构的连接产物：(靶)-A3-[(靶)-A3]n-(靶)-A3，其中A3是3’接头序列，(靶)是靶核酸序列，和n是代表在连接产物中靶核酸序列的数目的整数。n可在1000、例如2-1000、2-800、2-600、2-500、2-300、2-200或2-100的范围内。当然，可使用连接至靶的5’末端的5’接头序列进行相同的过程，在该情况下连接产物将具有以下结构：A5-(靶)-[A5-(靶)]n-A5-(靶)，其中A5是5’接头序列。如需要，引物或引物结合序列可添加到连接产物的3’和/或5’末端，提供具有以下结构的连接产物：
P5-(靶)-A3-[(靶)-A3]n-(靶)-A3；
P5-(靶)-A3-[(靶)-A3]n-(靶)-A3-P3；
(靶)-A3-[(靶)-A3]n-(靶)-A3-P3；
P5-A5-(靶)-[A5-(靶)]n-A5-(靶)；
P5-A5-(靶)-[A5-(靶)]n-A5-(靶)-P3；或
A5-(靶)-[A5-(靶)]n-A5-(靶)-P3；
其中P5和P3分别是5’和3’引物或引物结合序列，且A5、A3、(靶)和n各自如上定义。
或者，接头序列可添加到靶核酸序列的3’和5’末端两者，和靶核酸随后连接以提供具有以下结构的连接产物：当然，可使用连接至靶的5’末端的5’接头序列进行相同的过程，在该情况下连接产物将具有以下结构：A5-(靶)-A3-[A5-(靶)-A3]n-A5-(靶)-A3，其中A5、A3、(靶)和n各自如上定义。引物或引物结合序列可添加到3’和/或5’末端以提供具有以下结构的连接产物：
P5-A5-(靶)-A3-[A5-(靶)-A3]n-A5-(靶)-A3；
A5-(靶)-A3-[A5-(靶)-A3]n-A5-(靶)-A3-P3；或
P5-A5-(靶)-A3-[A5-(靶)-A3]n-A5-(靶)-A3-P3；
其中P5、P3、A5、A3、(靶)和n如上定义。
接头和引物或引物结合序列向靶核酸的连接、以及包括接头和/或引物或引物结合序列的靶核酸的连接可以任何合适的顺序进行，如需要，使用端基封闭(保护)基团，以得到具有所需结构的连接产物，如本文中涉及的任何连接产物。合适的方案说明在以下提供的实施例中。
在具体实施方式中，不使用插入(intervening)引物序列。代替地，靶核酸序列彼此连接，和在靶核酸彼此连接之前、同时或之后，引物(或引物结合序列)或接头-引物(或接头-引物结合序列)添加到3’和/或5’末端。作为进一步说明，端基封闭的接头-引物序列可添加到靶核酸的混合物，和所述混合物连接以提供具有以下结构的变化长度的核酸：(靶)-(靶)n-(靶)-A3-P3，其中A3是接头序列，P3是端基封闭的引物或引物结合序列，和靶是靶序列，及n如上定义。接头-引物或接头-引物结合序列然后可添加到连接产物的5’末端以提供具有以下结构的产物：P5-A5-(靶)-(靶)n-(靶)-A3-P3。当然，通过在第一步中使用5’接头-端基封闭的引物代替3’接头-引物来首先添加P5-A5基团可进行相同的过程。作为进一步说明，当端基封闭的接头-引物序列如5’-羟基5’端基封闭的P5-A5而不是5’-磷酰基和3’-羟基P5-A5和/或2’,3’-双脱氧3’端基封闭的A3-P3以如上所述类似的方式使用时，接头-引物序列可仅添加到5’、3’或5’和3’末端两者。
所述方法包括扩增连接产物。术语“扩增”指靶核酸及其互补序列的拷贝数增加。可以通过使用本领域中已知的任何方法来实施扩增。核酸的扩增包括在扩增过程期间需要多个循环的方法或在单一温度下实施的方法。循环技术以需要热循环的方法例示。需要热循环的方法包括聚合酶链式反应(PCR)，其是本领域中公知的。PCR包括通过热变性将双链DNA变性成单链DNA，将引物与单链DNA退火；并由所述引物合成互补链。等温扩增是在单一温度下实施的或者其中扩增过程的主要方面在单一温度下实施的扩增。在PCR过程中，加热反应产物以分开两条链，使得另一引物可以结合到模板。相反地，等温技术依赖于链置换聚合酶，以分开双链的两条链并再复制模板。等温技术可以分成依赖于引物置换以引发反复的模板复制的方法和依赖于单一引物分子的连续再使用或新合成的方法。依赖于引物置换的方法包括解旋酶依赖性扩增(HDA)、外切核酸酶依赖性扩增、重组酶聚合酶扩增(RPA)、和环介导的扩增(LAMP)。依赖于单一引物分子的连续再使用或新合成的方法包括链置换扩增(SDA)或基于核酸的扩增(NASBA和TMA)。
可以通过将所述连接产物扩增为一个扩增产物来实施所述扩增。即，可选择引物使得一个扩增产物包括在一个连接产物中含有的所有靶核酸。例如，在PCR中，正向引物可以与最上游的靶核酸的5’-末端区或其上游区互补，而反向引物可以与最下游的靶核酸的3’-末端区或其下游区互补。可以通过使用与所述引物序列互补的序列和与所述引物结合序列互补的序列的至少一个作为引物来实施所述扩增。连接产物可具有约4000nt或更小的长度。例如，连接产物的长度可在约15-约4000nt、约15-约3500nt、约15-约3000nt、约15-约3000nt、约15-约2500nt、约15-约2000nt、约15-约1500nt、约15-约1000nt、约15-约800nt、约15-约600nt、约15-约400nt、约15-约200nt、约18-约4000nt、约18-约3500nt、约18-约3000nt、约18-约3000nt、约18-约2500nt、约18-约2000nt、约18-约1500nt、约18-约1000nt、约18-约800nt、约18-约600nt、约18-约400nt、约18-约200nt、约21-约4000nt、约21-约2000nt、或约21-约1000nt的范围内。
引物可以没有与靶核酸互补的序列，如miRNA或其cDNA。在PCR中，因为正向引物与最上游的靶核酸的5’-末端的上游区互补，所以正向引物没有靶核酸序列或与靶核酸互补的序列，且因为反向引物与最下游的靶核酸的3’-末端的下游区互补，所以反向引物没有靶核酸序列或与靶核酸互补的序列。
所述方法可以进一步包括：如果所述靶核酸是RNA，则通过逆转录所述靶核酸产生与所述靶核酸互补的DNA(cDNA)。可以在所述连接之前或之后实施所述逆转录。本领域中已知，使用逆转录酶使用RNA链，逆转录产生DNA互补链。
所述方法可以进一步包括在所述逆转录前将接头序列与所述靶核酸的3’-末端和5’-末端的至少一个连接。可以将所述接头序列与靶核酸的3’-末端和5’-末端的至少一个特异性连接。
所述方法可以进一步包括在所述逆转录后将接头序列与靶核酸的cDNA的3’-末端和5’-末端的至少一个连接。可以将接头序列与靶核酸的3’-末端和5’-末端的至少一个特异性连接。连接接头序列是如上所述的。
根据本发明的另一实施方案，提供测定样品中的靶核酸的相对量的方法，该方法包括：根据上述方法扩增样品中含有的靶核酸；由扩增产物测量所述靶核酸的量；并通过使用测量的量测定所述样品中的所述靶核酸的相对量。
所述方法包括根据上述方法扩增样品中含有的靶核酸。
所述方法包括由扩增产物测量靶核酸的量。可以通过本领域中已知的任何方法测量靶核酸的量。可以通过使用实时扩增测量靶核酸的量。实时扩增包括使用荧光染料和荧光淬灭剂的TaqmanTM方法、以及使用结合到双链DNA的荧光材料的方法。根据TaqmanTM方法，可以基于在扩增期间通过使用TaqmanTM探针检测的荧光材料的量实时测量靶核酸的量，所述TaqmanTM探针具有与荧光报告材料结合的5’-末端和与荧光淬灭剂结合的3’-末端，而且包含对各靶核酸特异性的序列。在扩增期间，因为通过具有5’->3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶使引物延伸并且合成新链，所以通过5’->3’外切核酸酶活性切割与模板退火的探针。因为探针被切割，所以荧光染料得到释放。因而，从其分离荧光淬灭剂，并且荧光升高。在这点上，荧光报告材料可以根据靶核酸而变化。使用TaqmanTM探针的实时扩增是本领域中公知的，并且可以使用任何已知的方法。除了实时扩增以外，可使用对应单独的靶核酸的特异性探针的杂交方法量化或检测单独的靶核酸，和在这种情况下，探针可固定在微阵列中。可通过如下量化或检测单独的靶核酸：扩增单独的靶核酸和通过使用特异性探针检测其。例如，检测可通过使用电泳或其它检测方法(例如光或电信号检测方法)进行。量化或检测的量可用于计算单独的靶核酸的相对量。
在使用结合到双链DNA的荧光材料的方法中，DNA结合荧光材料在PCR期间结合到所有双链DNA。在PCR期间，DNA产物的增加提高荧光强度。在每个循环测量强度，使得可以定量DNA的浓度。DNA结合荧光材料可以是SYBR Green I。也可以通过使用扩增产物的杂交或电泳来测定靶核酸的量。
所述方法包括通过使用靶核酸的测量的量测定样品中的靶核酸的相对量。可以通过相对于预定值例如阈值将靶核酸的量标准化，或者将靶核酸的量与标准值比较来实施所述测定靶核酸的相对量。
可以使用测定的靶核酸的相对量来确定靶核酸与各种生理状况例如疾病间的关系。
根据在包含多种靶核酸的样品中根据实施方案的扩增靶核酸的方法，可以降低的扩增偏倚扩增靶核酸。如此，可由扩增产物的量更精确地测定样品中的靶核酸的概况(剖析图，profile)。
根据本发明的另一实施方案的测定样品中的靶核酸的相对量的方法，可以有效测定样品中的靶核酸的相对量。
参考以下实施例进一步详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明的目的，而并不意图限制本发明的范围。
实施例1：以降低的扩增偏倚扩增靶核酸
1.制备第一连接产物，其中接头序列和引物序列连接到单独miRNA的cDNA
选择具有不同GC含量的15种类型的miRNA作为待扩增的靶核酸。合成具有与接头序列和引物序列顺序结合的3’-末端和5’-末端的单链DNA(其是各miRNA的cDNA)(第一连接产物)以模拟具有与顺序结合到接头序列和引物序列的3’-末端和5’-末端的连接产物。
详细地，将3’-末端接头序列(A3)与各miRNA的cDNA的3’-末端连接，将5’-末端接头序列(A5)与cDNA的5’-末端连接，将3’引物序列(P3)与A3连接，并将5’引物序列(P5)与A5连接，导致合成第一连接产物(Bioneer Corporation,KOREA)。合成的第一连接产物具有P5-A5-miRNA的cDNA-A3-P3的一般结构。在这点上，P5和P3是引物结合位点。P5-A5和A3-P3具有如下的序列。
P5-A5:5’-TGAGTTCTACGGTACCTCTAAGC-3’(SEQ ID NO：16)
A3-P3:5’-AGGCATAAGCTGTTAGCTCAGAAT-3’(SEQ ID NO：17)
作为扩增引物，使用P5-A5序列的正向引物(SEQ ID NO：16)和具有5’-ATTCTGAGCTAACAGCTTATGCCT-3’(SEQ ID NO：18)的与A3-P3序列互补的反向引物。
因为接头序列和引物序列具有在20%至80%范围内的GC含量，所以连接产物也具有接近20%至80%的GC含量。
下表1中显示15种miRNA的序列。
表1
  编号   名称  SEQ ID NO：   GC含量(%)   Tm(℃)   长度(nt)
  1   hsa-mir-95   1   36.4   60   22
  2   hsa-mir-7   2   34.8   62   23
  3   hsa-mir-1   3   27.3   56   22
  4   hsa-mir-9   4   34.8   62   23
  5   hsa-mir-16   5   45.5   64   22
  6   hsa-mir-17   6   47.8   68   23
  7   hsa-mir-25   7   50   66   22
  8   hsa-mir-31   8   52.4   64   21
  9   hsa-mir-1203   9   71.4   72   21
  10   hsa-mir-1307   10   72.7   76   22
  11   hsa-mir-3141   11   73.7   66   19
  12   hsa-mir-1915   12   90   76   20
  13   hsa-mir-2861   13   89.5   72   19
  14   hsa-mir-3196   14   88.9   68   18
  15   hsa-mir-3665   15   83.3   66   18
2.制备第二连接产物，其中接头序列和引物序列连接到单独miRNA的cDNA
经由接头序列连接选自与SEQ ID NO：1至15互补的cDNA的4种cDNA，并且将引物序列与连接产物的两端连接以合成第二连接产物。第二连接产物具有如下的结构。
P5-A5-cDNA1-A3-A5-cDNA2-A3-A5-cDNA3-A3-A5-cDNA4-A3-P3
这里，A3、A5、P3和P5是如上定义的，而cDNA1、cDNA2、cDNA3和cDNA4指与SEQ ID NO：1至15互补的cDNA之一。
合成包含与靶miRNA互补的4种cDNA的第二连接产物(BioneerCorporation,KOREA)。制备8种类型的第二连接产物，且cDNA1至4如下。
表2
3.靶核酸的扩增
使用如上所述制备的第一连接产物和第二连接产物作为模板通过PCR扩增靶核酸。使用具有SEQ ID NO：16序列的寡核苷酸作为正向引物，并使用具有SEQ ID NO：18序列的寡核苷酸作为反向引物。实施定量实时PCR(qRT-PCR)，并使用SYBR GREENI实时鉴定扩增产物。
使用Roche LC480在95℃以10分钟将qRT-PCR实施40个循环，(在95℃15秒/在55℃1分钟)，且斜率(ramping rate)是3.3℃/秒。用于扩增第一连接产物的PCR混合物包括0.5nM的各模板cDNA、500nM的各正向和反向引物、和SYBR GREEN master mix(Universal RT,Exiqon,#203450)。SYBR GREENmaster mix是包含DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、和SYBR GREENI的混合物。
用于扩增第二连接产物的PCR混合物包含0.5nM的各模板cDNA、500nM的各正向和反向引物、和SYBR GREEN master mix(Universal RT,Exiqon,#203450)。SYBR GREEN master mix是包含DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、和SYBR GREENI的混合物。
通过测量阈值循环(Ct)值来测定扩增的miRNA。
4.扩增结果
下表3中以对于平均Ct值的方差值(CV%)显示第一连接产物的扩增结果。
表3
Figure BDA00001875071000121
如表3中所示，Ct值根据靶核酸的GC含量而变化。虽然具有在20至80%范围内的GC含量的11种类型的miRNA具有20.73的平均Ct值和5.83%的方差值，但是具有大于80%的GC含量的4种类型的miRNA(hsa-mir-1915,2861,3195和3196)在相同实验条件下具有23.37的平均Ct值和16.03%的方差值。这表明方差值随GC含量增加而增加。即，扩增偏倚根据靶核酸序列即GC含量而存在。
下表4中显示第二连接产物的扩增结果。
表4
  编号   GC含量(%)   Ct(循环)
  1   58.1   20.23
  2   49.4   18.40
  3   51.8   20.67
  4   49.1   21.57
  5   52.1   19.08
  6   48.4   20.56
  7   53.2   21.25
  8   58   21.81
在扩增第二连接产物时，miRNA具有20.44的平均Ct值和5.83%的方差值，这表明与具有在20至80%范围内的GC含量的第一连接产物的那些的相似性。这表明由包括GC含量差异的碱基序列差异产生的各miRNA的扩增偏倚在扩增第二连接产物时可被抵消。
实施例2：miRNA的连接和扩增
选择具有不同GC含量的8种类型的miRNA作为待扩增的靶核酸。下表5中列出所选择的8种类型的miRNA。
表5
  miRNA的名称  SEQ ID NO：   GC含量   Tm   长度
  1   hsa-mir-95   1   36.4   60   22
  2   hsa-mir-1307   10   72.7   76   22
  3   hsa-mir-1203   9   71.4   71.4   21
  4   hsa-mir-4271   19   63.2   62.0   19
  5   hsa-mir-1915   12   90   76   20
  6   hsa-mir-3141   11   73.7   66   19
  7   hsa-mir-2861   13   89.5   72   19
  8   hsa-mir-3665   15   83.3   66   18
  平均值   72.48
  标准偏差   17.28
在表5中，miRNA是合成的miRNA(Bioneer Corporation,KOREA)，其具有约1pmole/ul的浓度及磷酸化的5’-末端和3’-OH末端并在-20℃贮存。将接头序列和/或引物序列与miRNA连接，并扩增连接产物。在连接和扩增中的序列如下。
P5-A5:5’-CGGUGAGGUCUUUGGUUCAUCGAUCG-3’(SEQ ID NO：20)
A3-P3:5’-CGAUCGUGUCCUCAAGGCUACCACCU-3’(SEQ ID NO：21)
逆转录引物：5’-ATCGCGAGAATTCCA-3’(SEQ ID NO：22)
PCR的正向引物：5’-CGGTGAGGTCTTTGGTTCAT-3’(SEQ ID NO：23)
PCR的反向引物：5’-AGGTGGTAGCCTTGAGGACA-3’(SEQ ID NO：24)
P5-A5、A3-P3、逆转录引物和PCR引物购自Bioneer Corporation(KOREA)。
(1)A3-P3序列与3’-末端的连接
将表5中所列的8种类型的miRNA混合，使得各miRNA的浓度是1pmole/ul，并且将1ul混合物与1ul A3-P3(160fmole/ul)混合。然后，将混合物添加至反应缓冲液，所述反应缓冲液包含10单位的T4RNA连接酶(NEB,补充有1mM ATP的1xT4RNA连接酶反应缓冲液)，并且在37℃实施RNA连接2小时。
在这点上，维持A3-P3与总miRNA的恒定质量比，使得以5’方向随机连接约4个miRNA，其中A3-P3与3’-末端连接(相对于总miRNA的1/6接头)。如上所述制备的第一连接产物可以是miRNA-miRNA-A3-P3、miRNA-miRNA-miRNA-A3-P3、miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-A3-P3、miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-A3-P3、miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-A3-P3等。用3’-双脱氧胞苷(3’-ddC)封闭A3-P3的3’-末端。
(2)P5-A5与5’末端的连接
将1ul具有10pmole/ul浓度的P5-A5添加至上述操作(1)中制备的反应混合物，并将P5-A5序列在与上述操作(1)相同的反应条件中与其5’-末端连接。结果，制备序列P5-A5-miRNA-miRNA-A3-P3、P5-A5-miRNA-miRNA-miRNA-A3-P3、P5-A5-miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-A3-P3、P5-A5-miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-A3-P3、P5-A5-miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-miRNA-A3-P3等(下文称为第一连接产物)。
另外，作为对照组，以与操作(1)和(2)相同的方式将-A3-P3和P5-A5-分别与8种类型的miRNA各自的3’-末端和5’-末端连接以获得P5-A5-miRNA-A3-P3.
(3)逆转录
使用SEQ ID NO：22的逆转录引物来实施在上述操作(2)中获得的实验组的第一连接产物和对照组的连接产物的逆转录。
通过依照TaqManTM MicroRNA Reverse Transcription Kit(MultiScribeTMReverse Transcriptase，50U/ul,Applied Bioscience;4366596)的方案将1ul(1pmole/ul)实验和对照组的各样品温育在16℃30分钟、在42℃30分钟、及在85℃5分钟来实施逆转录。结果，获得cDNA产物。
(4)扩增和结果
使用在上述操作(3)中获得的cDNA产物作为模板并分别使用900nMSEQ ID NO：23和24序列作为正向引物和反向引物来实施定量实时PCR(qRT-PCR)。通过使用Applied Biosystems TaqmanTM Universal PCR Master MixII，No UNG(零件号:#4440043)试剂盒和250nM Taqman探针(由AppliedBiosystems定制)来实施qRT-PCR。在包括如下的条件下进行qRT-PCR：在95℃变性10分钟一次，以及45次的在95℃变性10秒、在60℃退火并聚合10秒。通过使用BioAnalyzer2100(Agilent)通过电泳来分析扩增产物。
图1A和1B显示扩增产物的电泳结果。图1A是电泳照片，而图1B是图1A的电泳图。在图1B中，a显示实验组，b显示对照组，而3、4和5分别显示1个miRNA的连接产物(约74bp)、2个miRNA的连接产物(约94bp)和5个miRNA的连接产物(约154bp)。如图1B中所示，与对照组相比，在实验组中副产物的产生降低，因为没有过度使用-A3-P3。在图1A中，M表示分子大小标记物，道1表示实验组(连接产物)和道2表示对照组(没有连接反应)。在图1B中，x轴表示Labchip运行时间(秒)和y轴为荧光强度(任意单位)。
如此，如图1B中所示，确定在实验组中制备包含平均4至5个miRNA的第一连接产物。在实施例2中，在其中可连接4至5个miRNA的条件中实施实验。
因为-A3-P3或P5-A5-的长度是26nt，且miRNA的长度在18至22nt的范围内，所以-A3-P3或P5-A5-和1个miRNA的连接产物具有约70至约74nt的长度，-A3-P3或P5-A5-和2个miRNA的连接产物具有约88至约96nt的长度，-A3-P3或P5-A5-和3个miRNA的连接产物具有约106至约118nt的长度，-A3-P3或P5-A5-和4个miRNA的连接产物具有约124至约140nt的长度，而-A3-P3或P5-A5-和5个miRNA的连接产物具有约142至约162nt的长度。
因为连接随机发生，所以可以获得如上所述的具有不同长度的各种连接产物。然而，大小分布取决于-A3-P3的初始量。例如，因为在连接中涉及miRNA和-A3-P3两者，所以如果miRNA总量与-A3-P3量的比是1:1，则预期发生连接使得连接产物中的比是1:1。当-A3-P3的量是总miRNA量的1/6时，1个-A3-P3可与随机选择的5至6个miRNA的连接产物连接。另外，因为-A3-P3的3’-末端被双脱氧胞苷(3’-ddC)封闭，所以-A3-P3的3’-末端不能用于连接，使得终止3’-末端的反应。因此，当所有-A3-P3参与连接时，连接终止，因为不再存在用于与5’-末端P基团连接的3’-末端OH基团。然而，这不限于特定的机制。
表6显示使用△Ct值的实验组和对照组的qRT-PCR的结果。
表6
  编号   miRNA的名称   对照组(△Ct)   实验组(△Ct)
  1   hsa-mir-95   2.912   0.995
  2   hsa-mir-1203   -1.218   0.245
  3   hsa-mir-1307   1.812   0.695
  4   hsa-mir-1915   -0.198   -0.035
  5   hsa-mir-2861   -2.128   -0.765
  6   hsa-mir-3141   1.422   -0.205
  7   hsa-mir-3665   -1.998   -0.945
  8   hsa-mir-4271   -0.608   0.015
  △Ct的最大值-最小值   5.04   1.94
使用装置来测量各实验组(8组)的Ct值，并且通过从8个实验组的平均Ct值减去各miRNA的Ct值来计算△Ct。因此，通过从对照组的平均Ct值减去各Ct值来计算对照组的△Ct，并且通过从实验组的平均Ct值减去各Ct值来计算实验组的△Ct，其中显示相对于平均值的偏差。△Ct的最大值-最小值是对照组和实验组中具有最高△Ct值的miRNA与具有最低△Ct值的miRNA间的差异。在理论上，如果△Ct的最大值-最小值是0，则miRNA扩增的效率是相同的，而如果△Ct的最大值-最小值之差是3.3，则扩增miRNA的量的差异是约10倍。
如表6中所示，即使使用相同量的miRNA，对照组的△Ct的最大值-最小值是5.04。这表明各miRNA的表达量变化32.9倍。另一方面，实验组的△Ct的最大值-最小值是1.94。这表明各miRNA的表达量变化3.8倍。即，实验组的扩增变化(偏倚)降低至对照组的扩增变化(偏倚)的1/10。
根据这些结果，可以通过连接多个miRNA，然后扩增连接产物来降低扩增偏倚。
应当理解，本文中所描述的示例性实施方案应当仅在描述意义上考虑而不是用于限制的目的。典型地应认为各实施方案内的特征或方面的描述可用于其它实施方案中的其它类似特征或方面。
Figure IDA00001875071500011
Figure IDA00001875071500021
Figure IDA00001875071500031

Claims (19)

1.扩增靶核酸的方法，该方法包括：
提供包含多种类型的靶核酸的样品；
连接至少两种类型的所述靶核酸；和
扩增连接产物。
2.权利要求1的方法，其中所述样品包括RNA或DNA。
3.权利要求1的方法，其中在RNA连接酶和DNA连接酶的至少一种存在的情况下实施所述连接。
4.权利要求1的方法，其中所述连接下通过如下实施：引入在所述靶核酸间的接头序列、在靶核酸的5’-末端的接头序列、在靶核酸的3’-末端的接头序列、或其组合。
5.权利要求1的方法，其中通过将具有3’-末端的一个靶核酸与具有5’-末端的另一个靶核酸连接来实施所述连接，3’-末端特异性接头序列结合到所述3’-末端，5’-末端特异性接头序列结合到所述5’-末端。
6.权利要求1的方法，其中将引物序列或引物结合序列与所述连接产物的3’-末端和5’-末端的至少一个连接。
7.权利要求6的方法，其中将所述引物序列和所述引物结合序列的至少一个与所述3’-末端或所述5’-末端特异性连接。
8.权利要求1的方法，其中所述靶核酸具有200nt或更小的长度。
9.权利要求1的方法，其中所述靶核酸具有在20至70nt范围内的长度。
10.权利要求1的方法，其中通过将所述连接产物扩增为一个扩增产物来实施所述扩增。
11.权利要求6的方法，其中通过使用与所述引物序列互补的序列和与所述引物结合序列互补的序列的至少一个作为引物来实施所述扩增。
12.权利要求1的方法，进一步包括：如果所述靶核酸是RNA，则通过逆转录所述靶核酸产生与所述靶核酸互补的DNA(cDNA)。
13.权利要求12的方法，其中在所述连接之前或之后实施所述逆转录。
14.权利要求12的方法，进一步包括在所述逆转录前将接头序列与所述靶核酸的3’-末端和5’-末端的至少一个连接。
15.权利要求14的方法，其中将所述接头序列与所述3’-末端和所述5’-末端的至少一个特异性连接。
16.权利要求12的方法，进一步包括在所述逆转录后将接头序列与所述cDNA的3’-末端和5’-末端的至少一个连接。
17.权利要求16的方法，其中将所述接头序列与所述3’-末端和所述5’-末端的至少一个特异性连接。
18.权利要求1的方法，其中通过PCR来实施所述扩增，且将正向和反向引物与不是所述靶核酸的核酸区特异性退火。
19.测定样品中的靶核酸的相对量的方法，该方法包括：
根据权利要求1-18任一项的方法扩增样品中含有的靶核酸；
由扩增产物测量所述靶核酸的量；和
通过使用测量的量来测定所述样品中的所述靶核酸的相对量。
CN2012102406576A 2011-07-11 2012-07-11 扩增靶核酸的方法和测定样品中的靶核酸的相对量的方法 Pending CN102876660A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2011-0068556 2011-07-11
KR20110068556 2011-07-11
KR1020120049776A KR101922126B1 (ko) 2011-07-11 2012-05-10 바이어스가 감소된 표적 핵산을 증폭하는 방법 및 시료 중 표적 핵산의 상대적인 양을 결정하는 방법
KR10-2012-0049776 2012-05-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102876660A true CN102876660A (zh) 2013-01-16

Family

ID=46466344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012102406576A Pending CN102876660A (zh) 2011-07-11 2012-07-11 扩增靶核酸的方法和测定样品中的靶核酸的相对量的方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8945844B2 (zh)
EP (1) EP2546361B1 (zh)
CN (1) CN102876660A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161586A (zh) * 2018-09-29 2019-01-08 曲阜师范大学 一种对rna分子进行绝对定量的高通量测序方法

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
ES2620431T3 (es) 2008-08-04 2017-06-28 Natera, Inc. Métodos para la determinación de alelos y de ploidía
EP2854056A3 (en) 2009-09-30 2015-06-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
EP2854058A3 (en) 2010-05-18 2015-10-28 Natera, Inc. Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10179937B2 (en) 2014-04-21 2019-01-15 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
ES2770342T3 (es) 2010-12-22 2020-07-01 Natera Inc Procedimientos para pruebas prenatales no invasivas de paternidad
CN103608818B (zh) 2011-02-09 2017-12-08 纳特拉公司 非侵入性产前倍性识别装置
US20140051585A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Natera, Inc. Methods and compositions for reducing genetic library contamination
US9499870B2 (en) 2013-09-27 2016-11-22 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
WO2016183106A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
WO2016205416A1 (en) * 2015-06-15 2016-12-22 uBiome, Inc. Method and system for sequencing in characterization of antibody binding behavior
US20190085406A1 (en) 2016-04-14 2019-03-21 Guardant Health, Inc. Methods for early detection of cancer
US11384382B2 (en) 2016-04-14 2022-07-12 Guardant Health, Inc. Methods of attaching adapters to sample nucleic acids
WO2018067517A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
US10894976B2 (en) 2017-02-21 2021-01-19 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006111784A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Parco Tecnologico Padano Srl Method for enlarging the range of applicability of multiple displacement amplification of linear dna
US20100297630A1 (en) * 2007-07-11 2010-11-25 Pathofinder B.V. Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6495318B2 (en) * 1996-06-17 2002-12-17 Vectorobjects, Llc Method and kits for preparing multicomponent nucleic acid constructs
US7575863B2 (en) 2004-05-28 2009-08-18 Applied Biosystems, Llc Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
CN101952461B (zh) 2008-01-14 2017-12-05 应用生物系统有限公司 用于检测核糖核酸的组合物、方法和试剂盒
US20100062494A1 (en) 2008-08-08 2010-03-11 President And Fellows Of Harvard College Enzymatic oligonucleotide pre-adenylation
US8962253B2 (en) * 2009-04-13 2015-02-24 Somagenics Inc. Methods and compositions for detection of small RNAs

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006111784A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Parco Tecnologico Padano Srl Method for enlarging the range of applicability of multiple displacement amplification of linear dna
US20100297630A1 (en) * 2007-07-11 2010-11-25 Pathofinder B.V. Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL KLEVEBRING ET AL.: "Genome-wide profiling of Populus small RNAs", 《BMC GENOMICS》 *
LOUISE CHAPPELL ET AL.: "Isolation and cloning of small RNAs from virus-infected plants", 《CURRENT PROTOCOLS IN MICROBIOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161586A (zh) * 2018-09-29 2019-01-08 曲阜师范大学 一种对rna分子进行绝对定量的高通量测序方法
CN109161586B (zh) * 2018-09-29 2019-07-09 曲阜师范大学 一种对rna分子进行绝对定量的高通量测序方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2546361B1 (en) 2015-06-03
US8945844B2 (en) 2015-02-03
EP2546361A1 (en) 2013-01-16
US20130017549A1 (en) 2013-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102876660A (zh) 扩增靶核酸的方法和测定样品中的靶核酸的相对量的方法
US11964997B2 (en) Methods of library construction for polynucleotide sequencing
US20210002633A1 (en) Methods for Adding Adapters to Nucleic Acids and Compositions for Practicing the Same
US11124828B2 (en) Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same
US8314220B2 (en) Methods compositions, and kits for detection of microRNA
EP3485037B1 (en) Asymmetric templates and asymmetric method of nucleic acid sequencing
SG173506A1 (en) Method for quantification of small rna species
KR102648647B1 (ko) 짧은 호모폴리머릭 반복서열의 개선된 검출법
US20160177376A1 (en) Detection method of micro-rna with high specificity
JP2022160661A (ja) 単一分子配列決定のための一本鎖環状ｄｎａ鋳型の作成
US11834657B2 (en) Methods for sample preparation
Wu et al. Real-time PCR quantification of plant miRNAs using universal ProbeLibrary technology
CN102725421B (zh) 改良的核酸定量法
CN114606298A (zh) 一种检测样品中一种或多种核酸分子扩增产物长度的方法
KR101922126B1 (ko) 바이어스가 감소된 표적 핵산을 증폭하는 방법 및 시료 중 표적 핵산의 상대적인 양을 결정하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20130116