CN110257479A - 一种快速构建rna 3’端基因表达文库的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法，包括：使用带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物对mRNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；使用带有第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；其中，所述第一接头与第二接头的序列不完全相同。本发明提供的该方法可有效实现针对真核生物mRNA 3’端的转录组文库构建。

Description

一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法。

背景技术

随着后基因组时代的来临，基因表达与转录组学研究作为一种强有力的工具，在现今的生命科学研究中占有日益重要的地位。它可以帮助人们深入了解基因结构，揭示特定条件下的基因表达情况，以及生物体应对外界环境变化的调控机制。不同于DNA水平的研究，针对mRNA的表达文库构建与检测可以更加准确、直接地反映生物个体、组织乃至单细胞水平的表达差异；作为蛋白质组学的上游研究范畴，基因表达检测在现今的基础研究与精准医疗、药物研发等领域发挥着日益重要的作用。

早期的基因表达检测，其方法主要是依据在细胞或生物体中观察到的生物化学或特定表型的变化来判断特定基因是否表达；之后随着生物化学技术的不断发展，针对特定表达产物和蛋白分子的检测方法也被应用于定性或半定量地检测基因表达，如WesternBlot技术。另一方面，分子生物学的迅猛发展，为表达检测提供了强有力的工具，最具代表性和里程碑式意义的技术当首推RT-PCR与RT-qPCR技术，研究人员可以利用该技术构建表达文库，更加灵敏、准确地定量检测特定基因的表达水平。但这些技术的共同局限，是在同一时间只能获得有限的数据量，面对日益增加的高通量、大样本检测需求则力有未逮。

基因芯片(又称微阵列)技术的兴起，使得高通量表达检测成为可能。该技术通过将大量探针分子以高密度固定于特定支持物(芯片)上后与标记的样品分子进行杂交，再通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。该技术可一次性对样品大量序列进行检测和分析，满足高通量基因表达检测需求。但是，受制于在样品制备、探针合成与固定、分子标记、数据读取与分析等各环节的技术制约，该方法在当前应用中也存在诸多不足，如成本高昂、检测灵敏度较低、重复性差等等。

二代测序技术的蓬勃发展，特别是RNA测序技术的进步，迅速推进了转录组学研究的广泛应用。目前RNA测序技术已可以在定性与定量层面上对mRNA进行有效研究，帮助人们了解细胞应答机制，推进了一系列生命科学研究乃至医学、药学相关研究与分子诊断试剂开发。

由于基因表达检测往往更多关注的是特定基因的表达水平，或者说是特定mRNA分子的绝对数量与相对数量，而非其全长精确序列，因此RNA建库在基因表达检测领域的应用，可通过仅对mRNA的3’端区域进行建库，获得一定长度的、可确定其与其它分子差异的特异性信息即可实现。基于上述原理，目前已有多种成熟的技术方案，如MARS-seq等。

但这些方案的一点共性，都是通过mRNA分子的3’端poly(A)结构对其进行反转录，进而转化为双链cDNA，再进行传统的DNA文库构建。此方法需要经历末端修复与磷酸化、加A、连接接头、文库放大以及多步纯化等一系列繁琐的操作，这些操作对于较大起始量的RNA样本尚可接受，但对于以单细胞RNA建库为代表的极低模板量mRNA建库，特别是对于某些表达水平极低的mRNA来说，其分子数目很少甚至是单拷贝级别，则十分容易导致信息的丢失。

值得注意的是，目前针对DNA的NGS文库构建，已有成熟的基于转座酶复合物的方法，如Epicentre公司的第二代DNA测序试剂盒系列产品(TRANSPOSON END COMPOSITIONSAND METHODS FOR MODIFYING NUCLEIC ACIDS.United States Patent ApplicationPub.No.US 20110287435 A1.)，以及国内学者对以上建库方法做出的改进(中国发明专利：201710013203.8；发明名称：一种环状转座子复合物及其应用)。该方法较之传统的DNA文库构建方案，步骤更加简单，易于操作，大幅缩短了建库操作时间；但此方法在RNA建库方向上尚无成熟应用的先例。

作为一种相对新颖的DNA建库技术，转座酶复合物的两个特点包括：1、随机在DNA片段两端引入第一或第二接头，对单个片段而言，两端的序列可能相同也可能不同；2、DNA模板的分子末端无法被转座酶引入接头。这两点对于以基因组为模板的DNA建库而言不是问题，但对于RNA建库而言，无法对mRNA分子3’区域进行有方向性的双端不同接头连接。

如能解决此问题，则可将简单、快速、高效的转座酶建库技术与转录组建库技术相结合，开发出强有力的RNA 3’端基因表达文库构建与测序技术，对转录组学、RNA测序领域研究具有重大深远的实际意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法，该方法可有效实现针对真核生物mRNA 3’端的转录组文库构建。

本发明的第二个目的在于提供一种可快速的基因表达的测序方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法，所述方法包括以下步骤：

使用带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物对mRNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；

以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；

使用携带第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；

其中，所述第一接头与第二接头的序列不相同。

此外，优选的方案是，所述方法还包括以下步骤：

以根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物对双链cDNA片段进行扩增，得到RNA 3’端基因表达文库。

此外，优选的方案是，根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物还包括建库和测序所需的Index序列。

此外，优选的方案是，所述第一接头和第二接头中带有建库和测序所需的Index序列。

此外，优选的方案是，所述转座酶复合物包含转座酶和插入DNA；所述转座酶为Tn5转座酶或MuA转座酶。

此外，优选的方案是，所述转座酶复合物中，携带第二接头的插入DNA为两条一样的DNA分子，或携带第二接头的插入DNA为一条两端带有相同第二接头的DNA分子。

此外，优选的方案是，带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物，其5’端为带有第一接头序列的Oligo(dT)引物，其3’末端为含T碱基的核苷酸。

此外，优选的方案是，带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物，其5’端为带有第一接头序列的Oligo(dT)引物，其3’末端为带有与紧邻mRNA poly(A)区域发生退火的含锚定碱基的核苷酸。

根据本发明的第二个目的，本发明提供一种基因表达的测序方法，所述方法包括以下步骤：

使用带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物对RNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；

以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；

使用带有第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；

利用带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段进行测序工作；

其中，所述第一接头和第二接头中带有建库和测序所需的Index序列；所述第一接头与第二接头的序列不相同。

根据本发明的第二个目的，本发明还提供另一种基因表达的测序方法，所述方法包括以下步骤：

使用带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物对RNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；

以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；

使用带有第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；

以根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物对双链cDNA片段进行扩增，得到RNA 3’端基因表达文库；

将RNA 3’端基因表达文库进行测序工作；

其中，根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物还包括建库和测序所需的Index序列；所述第一接头与第二接头的序列不相同。

本发明的有益效果如下：

传统的转录组文库构建因操作繁琐、步骤过多而容易导致信息丢失，而且针对低模板量mRNA(如单细胞RNA)的表达文库构建困难。本发明提供的该方法拟将DNA NGS文库构建领域已较为成熟的基于转座酶复合物的建库技术与针对低模板量mRNA的表达检测需求相结合，实现简单、快速、高效的RNA 3’端基因表达文库构建。

本发明技术路线明确，利用带有第一接头的Oligo(dT)引物对RNA样本进行反转录后，合成第二链cDNA，并使用带有第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，因此通过反转录与转座步骤分别成功添加第一接头和第二接头，生成双端带有不同接头的mRNA 3’端区域的双链cDNA，可直接进行或增加一步文库扩增后进行下游测序。本方法建库效率高，且方法简单易行，省时省力，尤其适用于低起始量RNA模板，特别是单细胞RNA的表达文库构建，有效避免因步骤繁多导致的信息丢失问题，对转录组学、RNA测序领域研究具有重大而深远的意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明的原理示意图。

图2示出实施例1、2中转座产物纯化后的电泳检测结果图。其中，M是指100bp的DNA分子标记物，1号泳道中为实施例1扩增产物，2号泳道中为实施例2扩增产物。

图3示出实施例1中分选后文库经安捷伦高灵敏DNA芯片电泳图。

图4示出实施例2中分选后文库经安捷伦高灵敏DNA芯片电泳图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明提供了一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的新方法，所述方法包括以下步骤：

(1)使用带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物对mRNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；

(2)以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；

(3)使用携带第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；

其中，所述第一接头与第二接头的序列不相同，以保证源自mRNA模板3’端区域的双链cDNA两端带有不同的接头序列。

本发明的术语“第一接头”和“第二接头”中接头序列是指向他所接合的核酸片段提供寻址手段的非靶核酸组分的DNA序列。

本发明的mRNA样本是指真核生物的3’端含有polyA序列的mRNA样本。该mRNA样本可通过常规的RNA提取、纯化和富集等步骤获得，这些步骤均属于现有技术中的成熟技术，本发明对此不做进一步限制。

本发明的具体技术流程为：首先通过带有第一接头的Oligo(dT)引物进行RNA样本的反转录，获得带有第一接头的第一链cDNA，然后通过消化mRNA模板、合成第二链cDNA即可获得带有第一接头的双链cDNA；然后利用带有第二接头序列的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头；此时，除了源自mRNA模板3’端区域的双链cDNA两端带有不同的第一接头与第二接头序列外，其余片段的两端均带有相同的第二接头序列，因此仅有mRNA模板3’端区域可进行下游的测序工作，而其余区域则不会被利用。综上，本发明可有效实现针对mRNA 3’端的转录组文库构建与测序工作。通过本发明提供的方法得到的转录组文库，可用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因高通量测序平台。

本发明得到的带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段可直接进行下游测序工作，或者使用根据第一接头和第二接头序列所设计的PCR引物进行文库扩增，实现对目标区域的富集与放大，然后再进行下游的测序工作。

在本发明优选的实施方式中，当需要对文库进行扩增时，所述方法还包括以下步骤：以根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物对双链cDNA片段进行扩增，得到RNA 3’端基因表达文库。当原始的RNA样本量很低时，该步扩增可以有效扩大双链cDNA片段的量，实现对目标区域的富集和信号放大。进一步优选地，该步骤中根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物还包括建库和测序所需的Index序列。本领域技术人员可以理解的是，在本发明可以实现的实施方式中，根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物还可以包括其它任意所需的序列，例如进行高通量单细胞测序时，通过多步PCR引入分子标签与细胞标签，并通过二者数量的相乘实现高通量。通过文库扩增PCR步骤引入其它任意所需序列，以便实现下游的测序工作。

在本发明优选的实施方式中，当直接进行下游测序工作时，所述第一接头和第二接头中直接带有建库和测序所需的Index序列或其它测序所需的任意序列，以便实现下游的测序工作。

在本发明优选的实施方式中，步骤(3)所述转座酶复合物包含转座酶和插入DNA，所述转座酶可以是Tn5，也可以是MuA或是其它可以行使转座功能的转座酶。进一步优选地，转座酶复合物中，携带第二接头的插入片段可以是两条一样的DNA分子；或者携带第二接头的插入片段也可以是一条两端带有相同第二接头序列的DNA分子，此时形成的是环状转座子复合物(参见专利申请《一种环状转座子复合物及其应用》，申请号201710013203.8)。

在本发明优选的实施方式中，本发明合成第一链cDNA时使用的反转录引物为5’端带有第一接头序列的Oligo(dT)引物；其3’末端为带有与紧邻mRNA poly(A)区域发生退火的锚定碱基的核苷酸，该引物可与真核生物总RNA样本中所有mRNA组分结合启动反转录。

在本发明的另一种优选的实施方式中，本发明合成第一链cDNA时使用的反转录引物为5’端带有第一接头序列的Oligo(dT)引物；其3’末端为含T碱基的核苷酸。

传统基因表达文库构建方法，通常首先需要进行mRNA的捕获或核糖体RNA去除，然后进行反转录，继而进行较繁琐的传统建库流程(包括片段化、末端修复与加A、接头连接、文库扩增等步骤，以及多步产物分选与纯化)。此方法步骤繁琐，耗时费力，且操作污染几率较大，需要RNA样品起始量较高，对于少量RNA模板，特别是单细胞RNA建库，往往效果并不理想。

本发明使用反转录—合成双链cDNA—体外转座的技术路线，通过反转录与转座两步骤，将mRNA模板3’端区域成功构建为两端带有不同接头序列的文库，可直接进行或增加一步文库扩增后进行下游测序。此方法步骤较少，操作简单灵活，特别适用于低起始量RNA建库，如单细胞RNA建库与测序。

基于上述本发明提供的构建RNA 3’端基因表达文库的方法，本发明还提供了两种基因表达的测序方法。

其中，第一种测序方法包括以下步骤：

使用带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物对RNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；

以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；

使用带有第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；

利用带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段进行测序工作；

其中，所述第一接头和第二接头中带有建库和测序所需的Index序列；所述第一接头与第二接头的序列不相同。

第二种测序方法包括以下步骤：

使用带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物对RNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；

以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；

使用带有第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；

以根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物对双链cDNA片段进行扩增，得到RNA 3’端基因表达文库；

将RNA 3’端基因表达文库进行测序工作；

其中，根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物还包括建库和测序所需的Index序列；所述第一接头与第二接头的序列不相同。

实施例1转座法后通过PCR的方式进入双端测序接头

1.mRNA的富集

对真核生物的mRNA进行富集，具体步骤为常规mRNA富集步骤，例如可以使用mRNA纯化试剂盒(北京全式金生物，目录号：EC801)，此处步骤略。

2.第一链cDNA的合成

第一链cDNA的合成，例如使用第一链cDNA转录合成试剂盒(北京全式金生物，目录号：AT301)进行该操作：

1>依照以下体系加入各组分：

Oligo(T)-VN1为带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物，序列为：GACGTGTGCTCTTCCGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAVN(如SEQ ID NO.1所示)，其中V代表G/A/C三种碱基中的任意一种，N代表G/A/C/T四种碱基中的任意一种。

2>轻轻混匀；42℃孵育30分钟；

3>85℃加热5秒失活RT/RI转录酶。

3.mRNA的消化

1>在上述体系中加入1μl RNA酶混合物，对残留的mRNA于37℃消化15分钟，得到带有第一接头的第一链cDNA溶液；

4.第二链合成

在上述体系中，直接进行第二链的合成，例如使用全式金公司的第一链cDNA转录合成试剂盒(北京全式金生物，目录号：AT302)进行该步操作。

1>依照以下体系加入各组分：

2>轻轻混匀；16℃孵育60分钟，得到带有第一接头的双链cDNA溶液；

5.转座法第二接头的插入

在上述体系中，使用含有相同短接头(使用Oligo A与Oligo B退火制备而成)的Tn5转座复合物Tn5-S直接对双链cDNA进行接头的插入，其中，Oligo A的序列为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(如SEQ ID NO.2所示)；

Oligo B的序列为：CTGTCTCTTATACACATCT(如SEQ ID NO.3所示)。插入的步骤为：

1>依照以下体系加入各组分：

注意：转座酶Tn5在室温下也可缓慢反应，因此反应混合液需在冰上加入，并于吹打混匀后立即进行孵育反应。

2>移液枪吹吸混匀，管壁上如有液体可点甩离心，并立即进行下步反应。

3>将样品置于PCR仪中，55℃孵育5分钟(盖子温度70℃)。

4>立即置于冰中，并立即向反应管中加入20μl 4×Tn5 Digestion Mix*，移液枪吹吸混匀，PCR仪中55℃孵育5分钟(盖子温度70℃)，立即置于冰中。

6.转座产物纯化

进行产物纯化，具体操作略。例如本实施例中使用MagicPureTM Size SelectionDNA Beads(北京全式金生物，目录号：EC401)进行纯化。纯化结束后对纯化产物进行电泳检测，检测结果如图2，可见，转座产物纯化后主要分布于300～500bp范围内，片段化效果良好。

7.3’末端产物的扩增

1>依照以下体系加入各组分：

其中，上游引物Primer-F的序列为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index-i5]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；其中，[index-i5]插入在上游引物Primer-F原始序列CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(如SEQ ID NO.4所示)中间，具体插入位置如上游引物Primer-F的序列所示。

下游引物Primer-R的序列为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[index-i7]TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG。其中，[index-i7]插入在下游引物Primer-R原始序列AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(如SEQ ID NO.5所示)中间，具体插入位置如下游引物Primer-R的序列所示。

2>移液枪吹吸混匀，管壁上如有液体可点甩离心。

3>PCR仪中进行以下扩增程序

*此步不可省略。转座反应产物并非完整的双链DNA，72℃孵育3分钟用于生成成熟的PCR模板。

8.扩增产物的分选：

进行产物片段分选，例如，本实施例中使用MagicPureTM Size Selection DNABeads(北京全式金生物，目录号：EC401)。为防止引物及大片段残留，建议进行两次片段分选，分选具体操作略。分选结束后，对分选产物使用安捷伦2100高灵敏DNA芯片检测，检测结果如图3，可见，扩增产物分选后主要分布于300～500bp范围内，大小分布与峰型均正常。

实施例2转座法后直接测序

1.mRNA的富集

同实施例1中步骤1

2.第一链cDNA的合成

进行第一链cDNA的合成。例如，本实施例中使用第一链cDNA转录合成试剂盒(北京全式金生物，目录号：AT301)进行该操作：

1>依照以下体系加入各组分：

Oligo(T)-VN2为带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物2，其序列为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index-i5]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAVN。

其中，[index-i5]起区分各样本数据的作用，每个样本都有不同的index，在测序的时候会通过index的不同将样本的数据区分开；[index-i5]插接在带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物原始序列2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAVN(如SEQ ID NO.6所示)的中间，具体插入位置如带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物2的序列所示。

其中，序列末端的V代表G/A/C三种碱基中的任意一种，N代表G/A/C/T四种碱基中的任意一种。

2>轻轻混匀；42℃孵育30分钟；

3>85℃加热5秒失活RT/RI转录酶。

3.mRNA的消化

同实施例1中步骤3

4.第二链合成

同实施例1中步骤4

5.转座法第二接头的插入

在上述体系中，使用含有相同长接头(使用Oligo C与Oligo B退火制备而成)的Tn5转座复合物Tn5-L直接对双链cDNA进行接头的插入；其中，Oligo C的序列为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index-i7]GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG；[index-i7]插入在Oligo C原始序列CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(如SEQ ID NO.7所示)中，具体插入位置如Oligo C的序列所示。

插入的步骤为：

1>依照以下体系加入各组分：

注意：转座酶Tn5在室温下也可缓慢反应，因此反应混合液需在冰上加入，并于吹打混匀后立即进行孵育反应。

2>移液枪吹吸混匀，管壁上如有液体可点甩离心，并立即进行下步反应。

3>将样品置于PCR仪中，55℃孵育5分钟(盖子温度70℃)。

4>立即置于冰中，并立即向反应管中加入15μl 5×Tn5 Repair Mix，移液枪吹吸混匀，PCR仪中65℃孵育5分钟(盖子温度99℃)，立即置于冰中。

6.转座产物纯化

同实施例1中步骤6。对纯化产物进行电泳检测，如图2所示。

7.转座产物的分选：

进行产物片段分选。例如本实施例中使用的是MagicPureTM Size Selection DNABeads(北京全式金生物，目录号：EC401)。为防止引物及大片段残留，建议进行两次片段分选，分选具体操作略。分选结束后，对分选产物使用安捷伦2100高灵敏DNA芯片检测，检测结果如图4所示，可见，扩增产物分选后主要分布于300～500bp范围内，大小分布与峰型均正常。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 北京全式金生物技术有限公司

<120> 一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法

<130> JLC19I0007E

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacgtgtgct cttccgatct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaavn 46

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgtctctta tacacatct 19

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct 58

<210> 5

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60

ag 62

<210> 6

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aavn 84

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgga gatgtgtata agagacag 58

Claims (10)

1.一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

使用带有第一接头的Oligo dT反转录引物对mRNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；

以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；

使用携带第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；

其中，所述第一接头与第二接头的序列不相同。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

以根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物对双链cDNA片段进行扩增，得到RNA 3’端基因表达文库。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物还包括建库和测序所需的Index序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一接头和第二接头中带有建库和测序所需的Index序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转座酶复合物包含转座酶和插入DNA；所述转座酶为Tn5转座酶或MuA转座酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转座酶复合物中，携带第二接头的插入DNA为两条一样的DNA分子，或携带第二接头的插入DNA为一条两端带有相同第二接头的DNA分子。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，带有第一接头的Oligo dT反转录引物，其5’端为带有第一接头序列的Oligo dT引物，其3’末端为含T碱基的核苷酸。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，带有第一接头的Oligo dT反转录引物，其5’端为带有第一接头序列的Oligo dT引物，其3’末端为带有与紧邻mRNA polyA区域发生退火的含锚定碱基的核苷酸。

9.一种基因表达的测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

使用带有第一接头的Oligo dT反转录引物对RNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；

以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；

使用带有第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；

利用带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段进行测序工作；

其中，所述第一接头和第二接头中带有建库和测序所需的Index序列；所述第一接头与第二接头的序列不相同。

10.一种基因表达的测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

使用带有第一接头的Oligo dT反转录引物对RNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；

以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；

使用带有第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；

以根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物对双链cDNA片段进行扩增，得到RNA3’端基因表达文库；

将RNA3’端基因表达文库进行测序工作；

其中，根据第一接头序列和第二接头序列设计的PCR引物还包括建库和测序所需的Index序列；所述第一接头与第二接头的序列不相同。