CN111549025A - 链置换引物和细胞转录组文库构建方法 - Google Patents
链置换引物和细胞转录组文库构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111549025A CN111549025A CN202010515520.1A CN202010515520A CN111549025A CN 111549025 A CN111549025 A CN 111549025A CN 202010515520 A CN202010515520 A CN 202010515520A CN 111549025 A CN111549025 A CN 111549025A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rna
- cdna
- cell
- library
- artificial sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种单细胞全转录组文库构建方法，其中本发明单细胞全转录组文库构建方法包括步骤：（A）逆转录细胞RNA，以产生相应于所述细胞RNA的第一链cDNA，其中逆转录RNA所使用的链置换引物的5′末端带有多个dSpacer，且所述链置换引物带有长度为4的随机序列；（B）由所述第一链cDNA产生相应的第二链cDNA，从而产生双链cDNA；（C）通过PCR扩增所述双链cDNA，其中PCR扩增所使用的扩增引物的5′末端带有T7启动子序列和（D）通过T7 RNA聚合酶转录PCR扩增得到的cDNA，本发明单细胞全转录组文库构建方法受转录本本身的含量影响小和能够准确反应样品中RNA的含量而不会受到PCR重复读长的影响，且其流程简单易行，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种链置换引物，其适用于用于逆转录RNA。进一步地，本发明还涉及一种细胞转录组文库构建方法。
背景技术
RNA测序技术是生物医学领域常用的重要技术手段之一。特别是，对单个细胞的全转录组进行测序，可以观察和研究不同细胞内，甚至相同细胞在不同时期，其RNA表达情况和变化规律。RNA测序技术在生物医学诸多分支，如发育生物学、肿瘤学、基因组学等研究中起到重要作用。
近10年来，转录组测序技术方法发展迅速。目前RNA测序已经从大量经过纯化的RNA(10ng以上)发展为直接对单细胞中RNA进行测序和RNA建库。从测序内容上看，RNA测序可以分为信使RNA(mRNA)测序和全转录组测序。mRNA是编码蛋白质的信号RNA分子，这种RNA的特点是具有多聚腺苷酸的尾巴和帽子结构。随着RNA研究的深入，人们发现基因组上存在大量的转录区域，这些可转录区域产生了大量的非编码RNA，发挥重要的功能。随着测序技术的发展和研究的深入，通过全转录组测序的方法鉴定和研究非编码RNA的功能已经成为RNA研究领域的前沿热点。
由于RNA是单链结构，对RNA测序需要得到其序列方向信息。RNA的方向性信息对于非编码RNA的研究非常重要，尤其是在对没有参考序列(新的转录本)的转录本的鉴定时，是必需的。同时根据研究要求，需要对RNA的转录起始位点和3′端的加工情况进行识别，和针对RNA的末端序列进行测序，这种方法称为快速cDNA末端扩增(Rapid Amplication cDNAEend,RACE)。但是常用的随机引物无法保证从RNA的末尾开始启动反转录，因此利用随机引物反转录得到的文库并不能对RNA的末端进行准确的检测。目前常用的smart-seq测序中，利用了dT(15)-VN的设计来优化反转录的起始位置。由于mRNA的末端有几个到几百个的腺苷酸尾巴，在多聚胸腺嘧啶(poly dT)的后面接上非胸腺嘧啶碱基有利于提高反转录从3′端末尾起始的比例，但是由于A-T配对的不稳定，这种方法并不能保证反转录都从3′端开始。
因此，高通量单细胞RNA测序的核心在于单细胞RNA的标记。目前常用方法是在反转录过程中引入标签序列(Barcode)。具体为在cDNA的5′端或者3′端引入单细胞的特异标签序列。这种方法的特点是每个mRNA最后都只能得到一个读取(Read)。目前所有的单细胞RNA测序都需要利用mRNA3′端是多聚腺苷酸化的尾巴，利用多聚胸腺嘧啶引物进行反转录能达到两个目的:一个是可以有效地避免核糖体RNA,转运RNA等非poly A尾巴RNA的影响。同时由于尾巴处的poly A序列和dT随机引物之间的配对对于每种mRNA分子是一样的(polyA尾巴太短除外)，这样反转录对于不同丰度的mRNA的扩增是一致的。值得注意的是poly(dT)引物进行反转录的特异性有限，存在从mRNA的中间处而不是3′端启始反转录的情况。
现有单细胞全转录组测序技术主要是基于smart-seq的全转录组测序和转录组建库技术。例如，TAKARA公司提供的单细胞全转录组测序和转录组建库试剂盒SMART-Seq v4Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing、
Stranded Kit和
smRNA-Seq Kit for
等。第一种试剂盒及相关技术可以少量细胞或pg级RNA为起始，对样品中的polyA RNA进行全长扩增，然后将DNA打断后建库。第二种试剂盒及相关技术可对所有RNA进行扩增和测序。然而，现有试剂盒及相应全转录组测序和RNA建库方法均有相应局限。例如，TAKARA公司提供的第一种试剂盒及其测序方法仅能对有polyA的RNA进行扩增和测序；第二种试剂盒及其测序方法对RNA的标记不便，而且反转录标记无法保证扩增线性，无法对两个细胞内的RNA含量进行直接比较。
发明内容
本发明的主要优势在于提供一种细胞转录组文库构建方法，其中本发明细胞转录组文库构建方法可对单个细胞全转录组进行逆转录、扩增和帮助建立细胞转录组文库。
本发明的另一优势在于提供一种细胞转录组文库构建方法，其中本发明细胞转录组文库构建方法对微量表达RNA和微量样品RNA的扩增更加灵敏。此外，本发明细胞转录组文库构建方法没有胶回收步骤，更易于实现和消耗时间少。
本发明的另一优势在于提供一种细胞转录组文库构建方法，其中本发明细胞转录组文库构建方法直接从RNA扩增，能精确反映体系中的RNA的相对含量，适用于基因的表达分析。
本发明的另一优势在于提供一种全转录组测序方法，其中本发明细胞转录组文库构建方法创造性地将RNase H酶和T7 DNA连接酶转录扩增结合应用于单细胞全转录组测序。
本发明的另一优势在于提供一种全转录组测序方法，其中本发明细胞转录组文库构建方法不需要复杂的实验设备，普通分子生物学实验室即可使用本发明细胞转录组文库构建方法实现高通量的单细胞全转录组测序。
本发明的另一优势在于提供一种用于细胞转录组文库构建的链置换引物，其中本发明用于细胞转录组文库构建的链置换引物可实现高效的RNA5′端锚定序列的添加。
为了实现本发明上述至少一个目的，本发明提供一种细胞转录组文库构建方法，其包括下述步骤：
(A)逆转录细胞RNA，以产生相应于所述细胞RNA的第一链cDNA，其中逆转录RNA所使用的链置换引物的5′末端带有多个dSpacer，且所述链置换引物带有长度为4的随机序列；
(B)由所述第一链cDNA产生相应的第二链cDNA，从而产生双链cDNA；
(C)通过PCR扩增所述双链cDNA，其中PCR扩增所使用的扩增引物的5′末端带有T7启动子序列；和
(D)通过T7 RNA聚合酶转录PCR扩增得到的cDNA。
依本发明的另一方面，本发明进一步提供一种细胞cDNA文库构建方法，其包括下述步骤：
(A)逆转录细胞RNA，以产生相应于所述细胞RNA的第一链cDNA，其中逆转录RNA所使用的链置换引物的5′末端带有多个dSpacer，且所述链置换引物带有长度为4的随机序列；
(B)由所述第一链cDNA产生相应的第二链cDNA，从而产生双链cDNA；和
(C)通过PCR扩增所述双链cDNA，其中PCR扩增所使用的扩增引物的5′末端带有T7启动子序列。
依本发明的另一方面，本发明进一步提供一种链置换引物，其中所述链置换引物的5′末端带有多个dSpacer和长度为4的随机序列。
通过对随后的描述和附图的理解，本发明进一步的目的和优势将得以充分体现。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明，附图和权利要求得以充分体现。
附图说明
图1所示的是现有NEB小RNA源的转录组文库建库流程示意图。
图2所示的是依本发明实施例的细胞全转录组测序流程示意图。
图3A所示的是依本发明实施例的链置换终止序列结构。
图3B所示的是依本发明实施例的细胞全转录组文库产物分析结果。
图3C所示的是依本发明实施例的细胞全转录组文库产物中精确终止和未精确终止的比例和对比结果。
图3D所示的是依本发明实施例的示例性细胞全转录组文库R1的序列结构。
图4所示的是依本发明实施例的细胞全转录组测序时，对梯度RNA检测、读取与RNA的线性回归曲线。
图5A所示的是随机引物反转录和优化的TS-PCR对微量RNA的检测方法流程图。
图5B所示的是随机引物反转录和优化的TS-PCR细胞全转录组文库的相关性分析。
图5C所示的是随机引物反转录和优化的TS-PCR两种方法得到的细胞全转录组文库在基因组上的映射图。
图5D和图5E所示的是随机引物反转录和优化的TS-PCR两种方法在不同的RNA情况下对基因的表达检测的相关性。
图6所示的是KAPA试剂盒和优化的TS-PCR方法建库得到文库的相关性。
图7A所示的是利用TS-PCR进行单细胞总RNA建库的文库片段分布。
图7B所示的是去除核糖体RNA文库和不去除核糖体RNA得到的细胞全转录组文库的IGV映射结果。
图8A所示的是依本发明实施例的单细胞全转录组文库测序数据与人基因组和小鼠基因组的比较结果。
图8B所示的是依本发明实施例的单细胞全转录组文库测序数据的聚类分析结果。
图8C所示的是依本发明实施例的两种不同细胞系合并后，IGV展示细胞特异性的基因的比对结果。
图9所示的是依本发明实施例的细胞全转录组文库构建方法流程图。
图10所示的是依本发明实施例的细胞cDNA文库构建方法流程图。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)技术人员通常理解的相同的含义。例如，术语“RNA”是指单条RNA链和多条RNA链。术语“约”与数值一起使用时旨在包含该数值上下偏差10％数值范围，优选5％，更优选1％。术语“细胞”可以指一个或多个细胞。在一些实施例中，所述细胞是正常细胞，例如不同发育阶段的人类细胞或来自不同器官或组织类型的人类细胞、未分化的人类，干细胞或已被诱导分化的人类干细胞。在一些实施例中，所述细胞是非正常细胞，例如，来自身患疾病的人，或来自人体病理组织。在一些实施例中，所述细胞是细菌。在一些实施例中，所述细胞是真菌。在一些实施例中，所述细胞是原生动物或寄生虫或来自于寄生虫。
本发明提供了一种细胞转录组文库构建方法和用于细胞转录组文库构建的化合物和组合物。相对于现有的细胞转录组文库构建方法，本发明细胞转录组文库构建方法更易于实现，并可对单细胞全转录组进行测序，以帮助建立细胞转录组文库。本发明细胞转录组文库构建方法还可用于微量样品中RNA进行转录组文库构建和测序。进一步地，本发明细胞转录组文库构建方法的随机引物反转录步骤改为衔接子连接之后使用特异性引物进行反转录，优化了微量RNA的测序方法，提高了对表达丰度较低的转录本的检测能力和防止在对微量RNA进行测序时，测序结果产生偏倚。
目前，检测多个样本内RNA含量，往往需要通过向每个样品内均掺入等量突出RNA(Spike in RNA)。对于表达丰度高的RNA，这种操作比较容易。但是，对于微量RNA样本，特别是单细胞含有的微量RNA样本，很难控制掺入RNA的量。掺入RNA量过少，很容易受到干扰，导致定量困难。而利用衔接子连接标记微量RNA样本，然后通过测序的方法能够很容易地对不同的样本中的RNA进行相对定量。
目前，通量较高的单细胞测序都是基于mRNA的3′多腺苷酸结构进行反转录，并在反转录的时候对细胞RNA进行标记。对于短读长的二代测序机器，无法实现全长转录组的覆盖，也无法对非编码RNA进行有效的检测。本发明细胞转录组文库构建方法对测序流程的优化，实现了从细胞裂解到RNA连接标记的单管完成，从而实现对单细胞RNA全转录组的测序和全长覆盖。
目前，现有利用RNase H进行核糖体RNA的去除都是在RNA扩增之前，使用体外扩增RNA的方法是将T7 DNA连接酶启动子序列放在反转录引物上面，这样扩增得到的RNA是真实RNA的反向互补序列。本发明细胞转录组文库构建方法利用优化的链置换引物，精确地实现5′锚定引物的添加和将T7 DNA连接酶启动子反向互补序列添加到cDNA的3′端，这样得到的RNA与自身序列一致。此外，本发明细胞转录组文库构建方法在扩增后再利用RNase H去除核糖体RNA。在实际应用中，我们发现，与现有在RNA扩增之前利用RNase H去除核糖体RNA相比，在扩增后再利用RNase H去除核糖体RNA，有利于减少RNA损失，尤其有助于在细胞转录组文库构建中，有效反转录微量RNA，从而使细胞转录组文库的转录产物更完整。这对检测和比对不同细胞或类似细胞的低表达RNA非常重要，可提高低表达丰度的RNA的检测。低表达RNA有可能在某些细胞中选择性表达，且扮演重要角色。本发明扩增后再利用RNase H去除核糖体RNA有助于减少低表达RNA的损失，对研究细胞基因转录情况具有重要意义。
因此，本发明人优化了转录组测序流程和步骤，解决了现有细胞转录组文库构建和转录组测序方法存在的问题，实现对微量RNA样本或单细胞全转录组进行高通量测序和检测分析。
依本发明的另一个方面，本发明还提供一种用于细胞转录组文库构建的化合物和组合物。在一个实施例，本发明细胞转录组文库构建方法包括：分离细胞样品，优选为单细胞样品；提取细胞全转录组；修复全转录组RNA末端和连接3′端衔接子；使修复后的全转录组RNA和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)；对修复后的全转录组RNA分别逆转录为单链cDNA；用链置换聚合酶合成，以单链cDNA为模版合成相应第二链；进一步对单链cDNA及其第二链进行扩增。本发明还进一步提供一种用于全转录组测序的链置换引物，其中该链置换引物的5′末端带有多个dSpacer。相对于目前报道的链置换引物(TSO)，5′末端带有多个dSpacer的链置换引物可实现精确终止和cDNA3′末端锚定序列的高效添加，尤其是可防止在反转录结束时，末端产生多个链置换引物的情况发生。该链置换引物的5′末端带有的多个dSpacer，能够防止链置换的再一次延伸，从而实现了短片段5′衔接子连接的替换。进一步地，本发明用于全转录组测序的链置换引物添加四个随机引物，以帮助在测序的阅读中去除副产物。本发明用于全转录组测序的链置换引物的5′末端带有的多个dSpacer可取代RNA的5′的连接，且具有明显效果。
在一个具体实施方案中，所有的操作在一个无酶的环境中进行。操作前对超净台进行彻底清洗，用RNA酶去除试剂进行擦拭，实验前利用紫外照射半小时以上。
在一个具体实施方案中，上述RNA样品是待测RNA或包含待测RNA。在优选实施方案中，所述待测RNA是分离纯化的。在一个具体实施方案中，RNA样品中包含的待测RNA可以来自于人体、动物体、植物体或其器官、组织或细胞。在一个具体实施方案中，所述RNA可以是mRNA、tRNA、rRNA、总RNA或者其他来源的RNA。
在一个具体实施方案中，“优化的TS-PCR”是指将RNA溶解于1X PFE buffer(2XPFE buffer,TaKaRa)中,并加入0.5ul DNase I，在42℃条件下去除基因组，然后在85℃反应5-6分钟，优选5分钟30秒，使得RNA断裂。接着75℃10分钟将DNase I失活。加入T4 PNK和PNK buffer,在37℃下反应30分钟-60分钟，优选45分钟，将RNA的3′端磷酸去除，得到3′端羟基的修复好的RNA。在末端修复好的RNA体系中加入预先配置好的衔接子，衔接子的浓度为1uM,每个反应(细胞)中加入0.5ul-1ul衔接子，优选1ul。加入T4 RNA连接酶(NEB,T4 RNAligase truncked KQ)将反应于4℃震荡孵育18小时-24小时，优选24小时。或者连接反应在20℃孵育4小时，4小时2小时。连接之后用pico-RT(序列见附件)和SMARTScribeTM ReverseTranscriptase(cat#639538)反转录酶进行反转录，并添加入Blocked-TSO。反应时间为30-90分钟，优选90分钟。反转录完成之后利用DNA纯化磁珠进行cDNA的纯化。
在一个具体实施方案中，“连接体系合并”是指将各个连接的反应小管子中的RNA及其中的buffer吸取到一个1.5mL离心管中。然后利用1X稀释的RNA纯化磁珠(RNA cleanbeads)将离心管中的RNA进行吸附，在磁力架上去掉连接缓冲液。使用75％酒精将磁珠洗涤两次，待磁珠上酒精挥发后添加适当的无酶水溶解RNA，放置5分钟之后将磁珠置于磁力架上，转移上清并弃磁珠。
在一个具体实施方案中，“随机引物链置换PCR”是指直接将RNA利用pico-RTN6(序列见附件)随机引物和SMARTScribeTM Reverse Transcriptase(cat#639538)反转录酶进行反转录，并添加入Blocked-TSO。反应时间为30-90分钟，优选90分钟。反转录完成之后利用DNA纯化磁珠进行cDNA的纯化。
在一个具体实施方案中，“测序衔接子添加”是指将通过优化的TS-PCR得到的cDNA片段利用Universal Primer(NEB)和index primer(NEB)对cDNA进行扩增12-14个循环后，添加1X DNA纯化磁珠混合均匀，在常温下放置5分钟后在磁力架上去掉扩增buffer。使用75％酒精将磁珠洗涤两次，待磁珠上酒精挥发后添加适当的无酶水溶解RNA，放置5分钟之后将磁珠置于磁力架上，转移上清并弃磁珠。
在一个具体实施方案中，“通过PCR添加T7启动子序列”是指将通过优化的TS-PCR得到的cDNA片段利用T7-pre-universal Primer和index primer(NEB)对cDNA进行扩增12-14个循环后，添加1X DNA纯化磁珠混合均匀，在常温下放置5分钟后在磁力架上去掉扩增buffer。使用75％酒精将磁珠洗涤两次，待磁珠上酒精挥发后添加适当的无酶水溶解RNA，放置5分钟之后将磁珠置于磁力架上，转移上清并弃磁珠。
在一个具体实施方案中，“利用去除核糖体RNA试剂盒进行核糖体RNA的去除”是指利用任何一种商业试剂盒将样品中的核糖体或者其他的已经知道序列的核糖体RNA通过RNase H(NEB)的方法进行去除或者连接有Biotin的寡聚脱氧核糖核酸杂交去除。
在一个具体实施方案中，“洗涤RNA沉淀”是指将醇沉得到的RNA利用75％的酒精洗涤两遍，然后溶解于适当体积的无酶水中。
在一个具体实施方案中，“将单个细胞置于裂解液中”是指在体视镜下或者利用流式细胞分选仪将细胞装进200ul的PCR试管中。优选的方案使用流式细胞分选。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员可以理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应当视为对本发明范围的限制。因此，本文以下实施例仅为了帮助理解本发明和帮助解释本发明技术方案，而不以任何方式限制本发明的范围。
除非明确指出，否则下述实施例不表示具体条件，符合常规条件或推荐条件。
除非特别指明，以下实施例中所用的PCR仪为Veriti 96孔热循环仪，购自AppliedBiosystems公司。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级的试剂，且可从常规渠道商购获得。
实施例1：细胞标记与细胞裂解
本发明公开的方法是从单细胞或者少量细胞开始。首先，通过流式细胞分选或者肉眼在显微镜下操作分离得到单细胞，将单个细胞放在预先配置的裂解液中。由于细胞量少，只需要少量的裂解液就可以将细胞完全裂解。同时由于微量的特点，需要向裂解液中加入DNA探针，RNA酶抑制剂和糖原。裂解液选择Qiagen公司的RLT plus裂解液。糖原的量为0.5ul-1.5ul，优选1ul每个反应(或细胞)，RNA酶抑制剂为1U-3U/ul,优选2U/ul。可选的操作为细胞放在裂解液之后，加入20ul乙醇，并加入5ul蛋白酶溶液(Qiagen公司)。在裂解液中通过蛋白酶消化进一步释放RNA，然后通过醇沉浓缩反应体积。室温下放置裂解10分钟后加入100ul-150ul，优选150ul乙醇,置于-20℃或-80℃醇沉4小时以上。
实施例2：DNA去除和RNA打断
为了尽量减少干扰，在建库之前对细胞基因组DNA进行去除，由于二代测序的特点，对于Illumina测序仪而言，需要将插入RNA的长度控制在300bp以下以便获得尽可能多所有的RNA信息。将上一步得到的RNA沉淀溶解于9ul的1X PFE buffer(2X PFE buffer,TaKaRa)中,并加入0.5ul DNase I，在42℃条件下去除基因组，然后在85℃反应5-6分钟，优选5分钟30秒，使得RNA断裂。接着75℃10分钟将DNase I失活。
实施例3：RNA 3′末端修复和连接
直接往上面的反应体系中加入T4 PNK和PNK buffer,在37℃下反应30分钟-60分钟，优选45分钟，将RNA的3′端磷酸去除，得到3′端羟基的修复好的RNA。在末端修复好的RNA体系中加入预先配置好的衔接子，衔接子的浓度为1uM,每个反应(细胞)中加入0.5ul-1ul衔接子，优选1ul。加入T4 RNA连接酶(NEB,T4 RNA ligase truncked KQ)将反应于4℃震荡孵育18小时-24小时，优选24小时。或者连接反应在20℃孵育4小时，4小时2小时。
实施例4：衔接子序列的准备
1)衔接子序列设计：
本发明衔接子设计预留7个碱基作为标记序列。衔接子序列为:
Phosphate-N[6Tag]AGATCGGAAGAGCACACGTCT。本说明提供了42个衔接子序列的序列，详见附件。
2)衔接子序列处理：
衔接子序列通过Mth RNA Ligase(NEB#M2611A)酶进行5′腺苷酸化反应。按照说明书，oligo的浓度为10uM,反应条件为65℃反应一小时,85℃反应5分钟终止反应。然后置于-20℃留存备用。
实施例5：转录组文库构建
通过上面的细胞RNA标记步骤，将每个细胞的RNA进行标记。然后通过TS-PCR的方法扩增得到文库。
1)、反转录和链置换反应
将每个孔内的RNA集中在一块，通过DNA吸附磁珠Ampure beads(Beckman)将体系中的RNA纯化，溶解于20ul无酶水中。加入反转录体系并添加链置换引物(链置换引物通式为(dSpacer)3CACGACGCTCTTCCGATCT[X1X2X3X4X5X6]NNNNrGrG+G)，其中选择性地，X1、X2、X3、X4、X5、X6分别是C、A、G或T碱基或其修饰物)。本文中使用的示例性引物为：
TSO-1：(dSpacer)3CACGACGCTCTTCCGATCTNNNNrGrG+G(SEQ ID NO:43)
TSO-2:(dSpacer)3CACGACGCTCTTCCGATCT ATCACGNNNNrGrG+G(SEQ ID NO:44)
TSO-3:(dSpacer)3CACGACGCTCTTCCGATCT CGATGTNNNNrGrG+G(SEQ ID NO:45)
这里的反转录酶使用M-MLV反转录酶，如M-MLV Reverse Transcriptase(Promega,cat#M1701)或者SMARTScribeTM Reverse Transcriptase(cat#639538)。该酶具有在合成的cDNA链的3′端加上3个左右的胞嘧啶。反转录使用的反转录引发oligo根据衔接子序列设计，其中本文可能用到3′端衔接子序列如下述表1所示。反转录温度条件为42℃或50℃，反应时间为60分钟到90分钟，优选90分钟。反转录之后，85℃10分钟失活反转录酶并终止反转录反应。
根据本文的3′端衔接子序列
上述衔接子序列的通式为5-phosphate-N[6X1X2X3X4X5X6]AGATCGGAAGAGCACACGTCT-3，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6分别是C、A、G或T碱基或其修饰物，选择性地，N可为A、G、C或T碱基或其修饰物。
2)、cDNA pCR扩增：
将上述得到的cDNA用DNA纯化磁珠(DNA clean beads)进行纯化后PCR,使用Universal primer和T7-pre-universal引物[序列为：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACGACGCTCTTCCGATC-s-T(SEQ ID NO:46)]进行全转录组的扩增。单细胞起始选择14-16个循环就足够，这时候一般得到50ng左右的DNA为宜。
3)、T7扩增：
1ng DNA进行第五步操作。将剩下的绝大多数DNA加入T7反转录反应体系，按照说明书配置，50ul反应体系为宜。
4)、核糖体RNA去除：
将上述转录体系中加入DNase,去除反应体系中的模版DNA,使用RNA纯化磁珠(RNAclean beads)进行纯化，测量RNA浓度，这时RNA的浓度50-100ng/ul(溶解于50ul水中，如果RNA产量过高，可以增加溶解体积)左右为宜。按照说明书操作，使用核糖体去除试剂盒进行操作，去除上一步得到的RNA中的核糖体RNA。纯化RNA之后再一次使用picoRT引物[示例性地，引物序列为AGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:47)]进行反转录得到富集非核糖体RNA来源的cDNA。
5)、衔接子添加：
为了适应Illumina的机器，本发明使用的扩增primer使用NEB的MultiplexOligos for
进行文库的扩增。扩增试剂选择Hot-start Mix(TAKARA)。扩增4个循环即可，得到用于上机测序的两个文库，一个是去除了核糖体的全转录组文库，一个是没有经过核糖体RNA去除的文库。
实施例6：HeLa细胞全转录组测序
利用Trizol法从人HeLa细胞中提取总RNA。根据
mRNAPurificationKit(Ambion,61006)说明，从总RNA中分离纯化mRNA。将RNA溶解为100ng/ul,取10pg RNA进行优化的TS-PCR和PCR进行测序衔接子添加。平行进行的是将Blocked TSO换成normal TSO(序列见附件)。将得到的两个文库在illumina 2500机器进行测序。分析测序得到的R1的结构和测序得到的数据中含有TSO序列的比例，如图3A至图3D所示。可见本发明所述的TSO高度的特异性。在相同的反转录条件下大大减少了副产物，使得TS-PCR技术进行二代测序成为可能。结果如图3A至图3D所示。
实施例7：HeLa细胞全转录组测序
利用Trizol法从人HeLa细胞中提取总RNA。根据
mRNA PurificationKit(Ambion,61006)说明，从总RNA中分离纯化mRNA。将RNA溶解为1ng/ul,取10pg，100pg，1ng，10ng RNA进行优化的TS-PCR并PCR进行测序衔接子添加。在优化的TS-PCR过程中，不同的样本进行不同的衔接子连接，每个梯度进行三个重复。将得到的两个文库在illumina2500机器进行测序。将得到的数据根据衔接子序列进行拆分，然后比对到hg19基因组上并进行reads的统计。结果可见基于优化的TS-PCR方法对微量RNA的检测能力非常强。同时，不同RNA量的样品的数据量呈良好的线形关系。该方法能够对至少10pg的RNA进行含量的精确比较。如图4所示。
实施例8：HeLa细胞全转录组测序
利用Trizol法从人HeLa细胞中提取总RNA。根据
mRNA PurificationKit(Ambion,61006)说明，从总RNA中分离纯化mRNA。将RNA溶解为1ng/ul。取1pg,10pg,100pg，1ng RNA进行随机引物链置换PCR，然后PCR进行测序衔接子的添加。平行地，对1pg和10pg RNA进行优化的TS-PCR和进行PCR测序衔接子添加。将得到的六个文库在illumina2500机器进行测序。将测序得到的数据比对到hg19基因组上面，用IGV对mappinng的情况进行展示，并统计不同量的RNA建库检测的重复性。可见利用随机引物链置换PCR的时候，对于低表达的基因的检测随着RNA量的减少，对其进行的检测就越不准。而基于随机引物反转录和链置换反应是目前报道的微量RNA的建库方法。相比之下，基于优化的TS-PCR方法在1pg和10pg的量的情况下依然保持良好的线性。所以基于优化的TS-PCR方法在微量RNA建库中具有显著优势。以上所述见图5A至图5E。
实施例:9：HeLa细胞全转录组测序
利用Trizol法从人HeLa细胞中提取总RNA。根据
mRNA PurificationKit(Ambion,61006)说明，从总RNA中分离纯化mRNA。将RNA溶解为1ng/ul。取10ng RNA进行优化的TS-PCR和进行PCR衔接子添加建库，重复三次，平行地使用KAPA转录组试剂盒进行建库。将得到的四个文库在illumina 2500机器进行测序。将测序得到的数据比对到hg19基因组上面。用Stringtie和Ballgown软件对基因表达进行分析。可见用优化的TS-PCR方法和试剂盒的方法检测到的RNA的表达相关性良好。可见基于优化的TS-PCR方法能够准确反映RNA样品中基因的表达。如图6所示
实施例10：单细胞全转录组测序
取一个细胞置于20ul RLT裂解液中(Qiagen),置于200ul PCR管中。添加3ul蛋白酶并置于常温下消化5分钟，添加150ul乙醇，20ul醋酸钠，和2ul糖原进行醇沉，置于-80度4小时以上。将细胞裂解液置于4度预冷的恒温高速离心机中高速离心30分钟，然后吸去乙醇，用75％乙醇将离心得到的沉淀洗涤2遍，然后置于超净台中干燥。溶解于20ul无酶水中。然后通过优化的TS-PCR得到具有5′端和3′端锚定序列的cDNA。同时操作10个左右的细胞，在进行衔接子连接的时候添加不同的衔接子。将10个细胞得到的cDNA进行合并。然后通过PCR添加T7启动子序列形成带有T7启动子的准文库。然后利用T7 RNA聚合酶对文库进行转录。在转录的产物中利用DNA酶将模版DNA去除。利用1X的适当稀释的RNA纯化磁珠对转录的RNA进行纯化。测量RNA的浓度，将RNA稀释到50ng/ul左右。利用去除核糖体RNA试剂盒进行核糖体RNA的去除。对剩下的RNA利用picoRT oligo(见附件)进行反转录并使用1X DNA纯化beads进行纯化。将纯化的cDNA使用Universal primer(NEB)和with-universal引物进行扩增4个循环得到最终文库。文库的结果如图7A和图7B所示。
实施例11：高通量细胞全转录组测序
随机取小鼠胚胎，小鼠成骨干细胞系MC3T3,人类细胞系HCC9810,LO2,RBE共5种细胞系各若干，共约70个细胞装入20ul细胞裂解液,每20ul细胞裂解液的成分为0.2ul糖原,0.2ul Protease K,0.2ul SDS(10％)和19.4ul RIPA裂解液。在56℃反应30分钟，70℃反应15分钟。然后添加100ul乙醇进行醇沉。从-80取出细胞裂解液离心并洗涤RNA沉淀。将不同的细胞进行随机分组，在不同的组中在随机分成几排，每排中的细胞12个到24个不等。在进行优化的TS-PCR操作过程中，将每排中的细胞选择不同的衔接子进行连接，然后将连接体系合并之后，在添加反转录的时候每排添加一种带标签的Blocked TSO(序列见附件)。然后按照组将优化的TS-PCR得到的cDNA进行合并。通过PCR添加T7启动子序列过程中每一组选择一种互不相同的index primer(NEB)。然后将得到的带有T7启动子序列的准文库进行合并。然后利用T7 RNA聚合酶对文库进行转录。在转录的产物中利用DNA酶将模版DNA去除。利用1X的适当稀释的RNA纯化磁珠对转录的RNA进行纯化。测量RNA的浓度，将RNA稀释到50ng/ul左右。利用去除核糖体RNA试剂盒进行核糖体RNA的去除。对剩下的RNA利用picoRT oligo(见附件)进行反转录并使用1X DNA纯化beads进行纯化。将纯化的cDNA使用Universalprimer(NEB)和with-universal引物进行扩增4个循环得到最终文库。将得到的文库在illumina 2500机器进行测序。将测序得到的数据分别比对到hg19基因和mm10基因组上面。根据文库的标签序列将数据进行拆分得到每个单细胞的数据。去除掉少于10000条reads细胞数据。根据不同的mapping比例对细胞进行归类和不同的细胞的各个基因的reads count进行统计和聚类分析。发现基于本发明的单细胞测序方法能够高效地捕获单个细胞中的RNA信息。实现了高通量单细胞层面的全转录组建库分析技术。结果图8A至图8C所示。
本领域技术人员会明白附图中所示的和以上所描述的本发明实施例仅是对本发明的示例而不是限制。
由此可以看到本发明目的可被充分有效完成。用于解释本发明功能和结构原理的该实施例已被充分说明和描述，且本发明不受基于这些实施例原理基础上的改变的限制。因此，本发明包括涵盖在附属权利要求书要求范围和精神之内的所有修改。
序列表
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 链置换引物和细胞转录组文库构建方法
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 49
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
natcacgaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 50
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ncgatgtaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
nttaggcaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ntgaccaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
nacagtgaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ngccaataga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 56
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ncagatcaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
nacttgaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 58
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ngatcagaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 59
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ntagcttaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
nggctacaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 61
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ncttgtaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 62
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
nagtcaaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
nagttccaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 64
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
natgtcaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 65
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
nccgtccaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ngtagagaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 67
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ngtccgcaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 68
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ngtgaaaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ngtggccaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 70
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
ngtttcgaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 71
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ncgtacgaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ngagtggaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 73
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
nactgataga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 74
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
natgagcaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 75
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
nattcctaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ncaaaagaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ncaactaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 82
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ncaccggaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 83
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
ncacgataga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 84
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ncactcaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 85
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ntaaggcaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 86
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
ncgtactaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 87
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
naggcagaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 88
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
ntcctgaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 89
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
nggactcaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
ntaggcaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 92
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
nctctctaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 94
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ncagagaaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 95
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
ngctacgaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 96
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
ncgaggcaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 97
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
naagaggaga tcggaagagc acacgtct 28
<210> 98
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
cacgacgctc ttccgatctn nnnggg 26
<210> 99
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
cacgacgctc ttccgatcta tcacgnnnng gg 32
<210> 100
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
cacgacgctc ttccgatctc gatgtnnnng gg 32
<210> 101
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
taatacgact cactataggg agacacgacg ctcttccgat c 41
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
agacgtgtgc tcttccgatc t 21
Claims (10)
1.一种细胞转录组文库构建方法，其特征在于，包括下述步骤：
（A）逆转录细胞RNA，以产生相应于所述细胞RNA的第一链cDNA，其中逆转录RNA所使用的链置换引物的5′末端带有多个dSpacer，且所述链置换引物带有长度为4的随机序列；
（B）由所述第一链cDNA 产生相应的第二链cDNA，从而产生双链cDNA；
（C）通过PCR扩增所述双链cDNA，其中PCR扩增所使用的扩增引物的5′末端带有T7启动子序列；和
（D）通过T7 RNA聚合酶转录PCR扩增得到的cDNA。
2.根据权利要求1所述的细胞RNA文库构建方法，其特征在于，进一步包括下述步骤：
（E）转录结束后，去除T7 RNA聚合酶转录反应体系中的模版DNA和核糖体RNA，其中该步骤（E）位于该步骤（D）之后。
3.根据权利要求2所述的细胞转录组文库构建方法，其特征在于，进一步包括下述步骤：
（M）去除所述细胞RNA的3′末端的磷酸基团，并在所述细胞RNA的3′末端添加腺苷酸化DNA寡聚脱氧核糖核苷酸衔接子，其中该步骤（M）位于该步骤（A）之前。
4.根据权利要求3所述的细胞转录组文库构建方法，其特征在于，进一步包括下述步骤：
（L）裂解细胞，并提取细胞裂解产物中的总 RNA和片段化所述总 RNA，以得到细胞RNA，其中该步骤（L）位于该步骤（M）之前。
5.根据权利要求1所述的细胞转录组文库构建方法，其特征在于，进一步包括下述步骤：
（F）对转录cDNA得到的RNA测序。
6.根据权利要求1所述的细胞转录组文库构建方法，其特征在于，进一步包括下述步骤：
（G）对去除核糖体RNA后的RNA测序。
7.根据权利要求4所述的细胞转录组文库构建方法，其特征在于，当裂解所述细胞时，向裂解液中加入DNA探针。
8.一种细胞cDNA文库构建方法，其特征在于，包括下述步骤：
（A）逆转录细胞RNA，以产生相应于所述细胞RNA的第一链cDNA，其中逆转录RNA所使用的链置换引物的5′末端带有多个dSpacer，且所述链置换引物带有长度为4的随机序列；
（B）由所述第一链cDNA 产生相应的第二链cDNA，从而产生双链cDNA；和
（C）通过PCR扩增所述双链cDNA，其中PCR扩增所使用的扩增引物的5′末端带有T7启动子序列。
9.根据权利要求1所述的细胞cDNA文库构建方法，其特征在于，进一步包括下述步骤：
（M）去除所述细胞RNA的3′末端的磷酸基团，并在所述RNA的3′末端添加腺苷酸化DNA寡聚脱氧核糖核苷酸衔接子，其中该步骤（M）位于该步骤（A）之前。
10.一种链置换引物，其特征在于，所述链置换引物的5′末端带有多个dSpacer和长度为4的随机序列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010515520.1A CN111549025B (zh) | 2020-06-08 | 2020-06-08 | 链置换引物和细胞转录组文库构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010515520.1A CN111549025B (zh) | 2020-06-08 | 2020-06-08 | 链置换引物和细胞转录组文库构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111549025A true CN111549025A (zh) | 2020-08-18 |
| CN111549025B CN111549025B (zh) | 2021-09-14 |
Family
ID=72001272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010515520.1A Active CN111549025B (zh) | 2020-06-08 | 2020-06-08 | 链置换引物和细胞转录组文库构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111549025B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113106150A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-07-13 | 浙江大学 | 一种超高通量单细胞测序方法 |
| CN113373140A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-09-10 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种自单细胞或微量RNA生成并扩增cDNA的方法和试剂盒 |
| CN114807305A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-07-29 | 首都医科大学附属北京口腔医院 | 一种构建原核生物单细胞rna测序文库的方法 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107893100A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-04-10 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 一种单细胞mRNA逆转录与扩增的方法 |
| CN108103055A (zh) * | 2018-01-09 | 2018-06-01 | 上海亿康医学检验所有限公司 | 一种单细胞rna逆转录与文库构建的方法 |
| US20190010489A1 (en) * | 2015-09-15 | 2019-01-10 | Takara Bio Usa, Inc. | Methods for preparing a next generation sequencing (ngs) library from a ribonucleic acid (rna) sample and compositions for practicing the same |
| CN109312331A (zh) * | 2016-04-01 | 2019-02-05 | 贝勒医学院 | 全转录组扩增的方法 |
| US20190119671A1 (en) * | 2016-04-20 | 2019-04-25 | Qiagen Gmbh | Method for generating a stranded rna library |
| CN110157785A (zh) * | 2018-02-13 | 2019-08-23 | 浙江大学 | 一种单细胞rna测序文库构建方法 |
| CN110951827A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-04-03 | 广州表观生物科技有限公司 | 一种转录组测序文库快速构建方法及其应用 |
| CN111148849A (zh) * | 2017-05-26 | 2020-05-12 | 阿布维托有限责任公司 | 高通量多核苷酸文库测序和转录组分析 |
| CN111247248A (zh) * | 2018-06-04 | 2020-06-05 | 伊鲁米纳公司 | 高通量单细胞转录组文库及制备和使用方法 |
| CN111363795A (zh) * | 2018-12-26 | 2020-07-03 | 清华大学 | 一种单细胞全基因组测序的方法 |
-
2020
- 2020-06-08 CN CN202010515520.1A patent/CN111549025B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20190010489A1 (en) * | 2015-09-15 | 2019-01-10 | Takara Bio Usa, Inc. | Methods for preparing a next generation sequencing (ngs) library from a ribonucleic acid (rna) sample and compositions for practicing the same |
| CN109312331A (zh) * | 2016-04-01 | 2019-02-05 | 贝勒医学院 | 全转录组扩增的方法 |
| US20190119671A1 (en) * | 2016-04-20 | 2019-04-25 | Qiagen Gmbh | Method for generating a stranded rna library |
| CN111148849A (zh) * | 2017-05-26 | 2020-05-12 | 阿布维托有限责任公司 | 高通量多核苷酸文库测序和转录组分析 |
| CN107893100A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-04-10 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 一种单细胞mRNA逆转录与扩增的方法 |
| CN108103055A (zh) * | 2018-01-09 | 2018-06-01 | 上海亿康医学检验所有限公司 | 一种单细胞rna逆转录与文库构建的方法 |
| CN110157785A (zh) * | 2018-02-13 | 2019-08-23 | 浙江大学 | 一种单细胞rna测序文库构建方法 |
| CN111247248A (zh) * | 2018-06-04 | 2020-06-05 | 伊鲁米纳公司 | 高通量单细胞转录组文库及制备和使用方法 |
| CN111363795A (zh) * | 2018-12-26 | 2020-07-03 | 清华大学 | 一种单细胞全基因组测序的方法 |
| CN110951827A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-04-03 | 广州表观生物科技有限公司 | 一种转录组测序文库快速构建方法及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HASHIMSHONY T等: "CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq", 《GENOME BIOL》 * |
| SEQYUAN: "单细胞smart-seq2建库原理", 《简书》 * |
| SHENG K等: "《 Single Cell Methods》", 27 April 2019 * |
| SIMONE PICELLI等: "Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2", 《NATURE PROTOCOLS 》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113106150A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-07-13 | 浙江大学 | 一种超高通量单细胞测序方法 |
| CN113373140A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-09-10 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种自单细胞或微量RNA生成并扩增cDNA的方法和试剂盒 |
| CN114807305A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-07-29 | 首都医科大学附属北京口腔医院 | 一种构建原核生物单细胞rna测序文库的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111549025B (zh) | 2021-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111549025B (zh) | 链置换引物和细胞转录组文库构建方法 | |
| EP3036359B1 (en) | Next-generation sequencing libraries | |
| US8999677B1 (en) | Method for differentiation of polynucleotide strands | |
| CN113166797A (zh) | 基于核酸酶的rna耗尽 | |
| US11761037B1 (en) | Probe and method of enriching target region applicable to high-throughput sequencing using the same | |
| CN111808854B (zh) | 带有分子条码的平衡接头及快速构建转录组文库的方法 | |
| CN107893260B (zh) | 高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒 | |
| US20210214783A1 (en) | Method for constructing sequencing library, obtained sequencing library and sequencing method | |
| CN105986324A (zh) | 环状小rna文库构建方法及其应用 | |
| CN112680797B (zh) | 一种去除高丰度rna的测序文库及其构建方法 | |
| CN112359093B (zh) | 血液中游离miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒 | |
| CN112410331A (zh) | 带分子标签和样本标签的接头及其单链建库方法 | |
| CN114507711B (zh) | 一种单细胞转录组测序方法及其应用 | |
| CN111118126B (zh) | 一种基于高通量测序的mRNA检测方法 | |
| CN112680796A (zh) | 一种靶标基因富集建库方法 | |
| CN111518870A (zh) | 一种去除核糖体rna的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体rna的方法 | |
| CN116287124A (zh) | 单链接头预连接方法、高通量测序文库的建库方法及试剂盒 | |
| US20240301466A1 (en) | Efficient duplex sequencing using high fidelity next generation sequencing reads | |
| CN112080555A (zh) | Dna甲基化检测试剂盒及检测方法 | |
| WO2020259303A1 (zh) | 一种快速构建rna 3'端基因表达文库的方法 | |
| CN116065240A (zh) | 一种高通量构建rna测序文库的方法及试剂盒 | |
| CN111534513A (zh) | 一种去除核糖体rna的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体rna的方法 | |
| CN111534512A (zh) | 一种去除核糖体rna的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体rna的方法 | |
| CN116042770B (zh) | 尿液中miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒 | |
| EP3798319A1 (en) | An improved diagnostic and/or sequencing method and kit |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |