CN109706226B

CN109706226B - 一种基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应进行miRNA快速检测的方法

Info

Publication number: CN109706226B
Application number: CN201910179354.XA
Authority: CN
Inventors: 程靓; 王瑞丽; 刘利
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-03-11
Also published as: CN109706226A

Abstract

本发明公开了一种基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应进行miRNA快速检测的方法。本发明所提供的检测miRNA的方法是基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应对目标miRNA进行检测。本发明基于不对称PCR的链延伸反应生成能够形成哑铃环结构的单链后，在LAMP扩增体系中加入生成的单链，引物对和miRNA引发快速扩增反应，从而完成对miRNA的特异且快速的检测。本发明具有如下优点：高特异性；高灵敏度；检测速度快；高通量同时检测多种miRNA。

Description

一种基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应进行miRNA快速检测的方法

技术领域

本发明涉及核酸分子快速检测领域，具体涉及一种基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应进行miRNA快速检测的方法。

背景技术

miRNA是在植物，动物和一些病毒中发现的小的非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)，其在RNA沉默和基因表达的转录后调节中发挥作用。第一个miRNA是在20世纪90年代初发现的。然而，直到21世纪初，miRNA才被认为是一类独特的生物调节剂。miRNA研究揭示了不同细胞类型和组织中表达的miRNA量不同，以及异常的miRNA表达与疾病状态有关。第一种人类疾病被发现与miRNA失调相关的是慢性淋巴细胞白血病。

近年来的研究表明，miRNA具有致癌基因和抑癌基因的作用，在人类癌症的生理病理学中扮演重要的角色。miRNA在癌症病例中的表现形式，可以作为癌症诊断和预后判断的工具，甚至能够预判患者的存活率，已经成为新一代的癌症标记物。此外，miRNA通常较短，在血液中的丰度低，并且同族的miRNA序列高度相似，因而对于特异性检测miRNA难度较大，并且检测所需要的周期较长，因此开发一种能够特异性强并且能够快速检测miRNA是当前所面临的一个难题。

目前miRNA常用的检测方法是qRT-PCR(定量逆转录聚合酶链式反应)，由于miRNA的序列只有20多个碱基左右，一般需要采用颈环状引物与miRNA的末端形成互补序列，然后在逆转录酶作用下生成cDNA，然后对该cDNA进行real-time PCR实验，该两步过程中均需要用到PCR仪器，并且第二步的real-time PCR过程往往需要3-4h，不能满足快速检测的需求。因此开发更加快速而便捷的检测方法是当前所面临的挑战。

针对上述问题，需要开发一种能够快速区分待测miRNA与同族miRNA的相似序列，并且能够实现特异性强，灵敏度高，方便快捷并且能够多通道同时检测的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高特异性，高灵敏度、高通量以及能够快速检测多种miRNA的方法。

本发明设计通过不对称PCR的引物延伸反应生成一个特殊的恰好能形成哑铃环结构的媒介体，该媒介体能够作为环介导等温扩增反应(LAMP)的模板，可缩短扩增所需要的起始模板长度，并且避免两条外引物的使用，简化了LAMP扩增反应，加入两条内引物的引物对和待检测的miRNA就能够触发LAMP反应，在短时间内扩增产生大量具有不同长度的茎环结构DNA和带有许多环的类似花椰莱结构的DNA的混合物，预先在反应体系中加入荧光染料，随着扩增反应的进行，荧光染料嵌插入产物，产生很强的荧光信号，从而建立起高效，快速地检测miRNA的方法，用于miRNA的超灵敏荧光检测。

第一方面，本发明要求保护一种检测miRNA的方法。

本发明所提供的检测miRNA的方法，是基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应对目标miRNA进行检测。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：

(A)设计合成如下a1)-a5)所示的模板及引物：

a1)引物延伸模板，命名为Template-miR；所述Template-miR为自5’端到3’端依次由如下五部分组成的单链DNA：B1c，B2，B1，F1c和F2c，其中B1和F1c之间有连接序列LS。

a2)引物延伸模板的互补链，命名为Template-miR-c；所述Template-miR-c为与所述Template-miR反向互补的单链DNA，自5’端到3’端依次由如下五部分组成：F2，F1，B1c，B2c和B1，其中F1和B1c之间有所述连接序列LS的反向互补序列LSc。

a3)扩增引物1，命名为AP-primer；所述AP-primer为自5’端到3’端依次由如下三部分组成的单链DNA：F1c，目标miRNA的反向互补序列miRc和F2。

a4)扩增引物2，命名为FIP；所述FIP为自5’端到3’端依次由如下两部分组成的单链DNA：F1c和F2。

a5)扩增引物3，命名为BIP；所述BIP为自5’端到3’端依次由如下两部分组成的单链DNA：B1c和B2。

其中，所述B1c与所述B1反向互补；所述F1c与所述F1反向互补；所述B1、所述B2、所述F1、所述F2、所述连接序列LS和所述目标miRNA的序列两两之间既不存在6个以上连续相同的核苷酸也不能互补配对。

(B)将所述Template-miR和所述Template-miR-c退火形成双链，所得双链命名为ds Template-miR。

在本发明中，具体是按照包括如下步骤的方法将所述Template-miR和所述Template-miR-c退火形成双链的：将Template-miR和所述Template-miR-c等摩尔混合，在94℃保温5min，然后缓慢降至室温。

(C)以所述ds Template-miR为模板，以所述AP-primer为引物，进行单引物不对称PCR扩增，将所得单链产物命名为DSLT(double stem-loop template，双链颈环模板)。

进一步地，在所述单引物不对称PCR扩增的反应体系中，所述ds template-miR的用量可为100ng，所述AP-primer的用量可为25pmol。所述单引物不对称PCR扩增的反应程序可为：95℃1分钟；95℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟。

(D)配制如下两组反应体系，分别进行LAMP扩增：

实验组：含有所述DSLT、所述FIP、所述BIP和待测样本；

对照组：与所述实验组的差别仅在于以对照样本替代所述待测样本；所述对照样本中不含有所述目标miRNA。

进一步地，在所述LAMP扩增的反应体系中，所述DSLT的用量可为20ng，所述FIP和所述BIP的用量均可为20pmol。所述LAMP扩增的反应条件可为：55-65℃恒温反应90分钟。

(E)根据步骤(D)的扩增结果按照如下确定所述待测样本中是否含有所述目标miRNA：如果所述实验组出现扩增信号的时间早于所述对照组，则所述待测样本中含有所述目标miRNA；反之，则所述实验组中不含有所述目标miRNA。

其中，所述实验组出现扩增信号的时间早于所述对照组，即认为所测样本中含有目标miRNA。

在本发明的一个实施例中，步骤(D)的所述反应体系中含有荧光染料(如SYBRGreen II)，因此可根据荧光信号确定是否发生扩增反应。

更进一步地，所述AP-primer的长度可为60-70nt；所述Template-miR的长度可为100-120nt；其中，所述F1、所述F2、所述B1和所述B2的长度均可为10-30nt，所述连接序列LS的长度可为20-25nt。

更进一步地，所述F1c与所述F1之间的Tm值需要高于所述目标miRNA与所述目标miRNA的互补序列之间的Tm值。这样能确保能够形成茎环结构，否则影响LAMP扩增的效果。

在本发明的一个实施例中，所述B1的序列如SEQ ID No.1的第36-48位所示；所述B2的序列如SEQ ID No.1的第14-35位所示；所述F1的序列如SEQ ID No.1的第70-87位的反向互补序列所示；所述F2的序列如SEQ ID No.1的第88-110位的反向互补序列所示；所述连接序列LS如SEQ ID No.1的第49-69位所示。

更加具体的，所述Template-miR的序列如SEQ ID No.1所示；所述Template-miR-c的序列如SEQ ID No.1的反向互补序列所示；所述FIP的序列如SEQ ID No.3所示；所述BIP的序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明的一个实施例中，所述AP-primer的序列如SEQ ID No.2所示。其中，SEQID No.2的第1-18位为所述F1c的序列，第19-40位为目标miRNA(具体为miR-34a-5p)的反向互补序列，第41-63位为所述F2的序列。

在本发明的另一个实施例中，所述AP-primer的序列如SEQ ID No.5所示。其中SEQID No.5的第1-18位为所述F1c的序列，第19-41位为目标miRNA(具体为miR-155-5p)的反向互补序列，第42-64位为所述F2序列。

根据所检测的目标miRNA的不同，在实际应用中可将SEQ ID No.2的第19-40位或者SEQ ID No.5的第19-41位替换为所需的目标miRNA的反向互补序列。

在所述方法中，所述待测样本中含有所述目标miRNA或者不含有所述目标miRNA。所述待测样本可为miRNA或者为总RNA。

第二方面，本发明要求保护前文第一方面中所述方法在miRNA的高通量检测中的应用。

第三方面，本发明要求保护一种检测miRNA的试剂盒。

本发明所要求保护的检测miRNA的试剂盒，可含有前文步骤(A)所述的模板及引物。

进一步地，所述试剂盒中还可含有可读性载体；所述可读性载体上记载有前文所述的步骤(B)至步骤(E)。

根据需要，所述试剂盒中还可含有进行不对称PCR和/或LAMP所需的常规试剂，如DNA聚合酶，dNTP，Bst 2.0DNA聚合酶、MgSO₄、SYBR Green II等。

第四方面，本发明要求保护所述试剂盒在检测miRNA中的应用。

第五方面，本发明要求保护所述试剂盒在miRNA的高通量检测中的应用。

本发明基于不对称PCR的链延伸反应生成能够形成哑铃环结构的单链后，在LAMP扩增体系中加入生成的单链，在合适的温度下形成哑铃环结构，在聚合酶作用下引物对和miRNA引发快速扩增反应，从而完成对miRNA的特异且快速的检测。

与现在技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

1、高特异性，该方法能够区分单碱基差异的miRNA，同时能够区分成熟miRNA和miRNA前体分子。

2、高灵敏度，该方法在检测miRNA时，灵敏度能够达到10aM。

3、检测速度快，第一步的产物可以在单次反应后拿到大量的单链模板，因此后续的检测只用进行第二步的LAMP反应，该步反应通常在1.5h能够观察到反应结果，判断出检测的样本中是否含有目标miRNA。

4、高通量同时检测多种miRNA，只用调整AP-primer中miRNA的互补序列，即可通过不对称PCR扩增出含有不同miRNA互补序列的DSLT，采用不同的DSLT检测不同的miRNA，由于可采用real-time PCR仪作为检测仪器，因此可以同时检测96个样本，达到高通量检测的要求。

附图说明

图1为本发明的技术原理图。

图2为本发明方法的灵敏度评价结果。

图3为基于图2结果的线性回归方程。说明了miRNA的浓度和扩增时间T之间存在良好的线性关系。

图4为本发明方法的特异性评价结果。

图5为本发明方法的相对检出率评价结果。

图6为癌细胞系(细胞株BEL-7404)中miR-34a的检测结果。N为阴性对照；P为阳性对照。

图7为采用miR-155对本发明方法进行验证的结果。N表示阴性对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的技术原理图如图1所示。

第一步：不对称PCR引物和引物延伸模板

A、扩增引物1(命名为AP-primer)：AP-primer有三个部分，3’端与需要延伸的模板(Template-miR)的部分序列互补配对，即通过二十几个核苷酸长度与待延长模板(Template-miR)的3’端互补配对，AP-primer是由F1c，miRNAc(miRNA的互补序列)和F2三部分组成，长度在60-70nt之间，如图1。通常，设计的线性可变引物具有四种功能：1、作为不对称PCR的引物；2、引发的扩增反应产物足够长，能够形成哑铃环结构，为LAMP扩增奠定基础；3、包含miRNA的互补片段，因此具有miRNA的识别位点，扩增起点，使扩增反应能循环起来；4.它包含同FIP完全相同的序列。

B、引物延伸模板(命名为Template-miR)：Template-miR由五部分组成，包括F2c，F1c，B1，B2和B1c，F1c和B1之间有连接序列LS，长度在20-25nt，Template-miR的总长度在100-120nt之间，并且3’端与AP-primer的3’端互补配对，这样设计的目的是为了通过不对称PCR技术将Template-miR由100-120nt延长至140-160nt左右，产物是单链DNA，在55-65℃条件下能够形成哑铃环结构，在LAMP扩增反应中充当扩增循环的模板，如图1。模板设计的目的在于：1、不对称PCR的模板；2、包含颈环结构，这样使生成的模板具有哑铃环结构，在LAMP循环扩增中充当起始模板；3、包含与BIP完全相同的序列。

C、引物延伸模板的互补链(命名为Template-miR-c)：与Template-miR互补配对，通过退火实验形成双链，如图1。

第二步：miRNA检测

A、LAMP循环扩增中的内引物FIP，由F2和F1c组成，并且保证F1c与F1的Tm值要高于miRNA与其互补链的Tm值，这样能确保能够形成茎环结构，否则影响LAMP扩增的效果，如图1。

B、LAMP循环扩增中的内引物BIP，由B2和B1c组成，如图1。

首先在图1中(2)的哑铃环结构中，以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板进行DNA合成延伸。此时5’端的环状结构被剥离延伸。因为3’端环状的B2c区段处于单链状态，BIP引物可以与之进行碱基配对，并以BIP的3’末端为起点，一边剥离以B1为起点先合成的DNA链，一边进行DNA合成延伸。接着在图1中(4)结构中，由B1延伸而得到的DNA链被BIP引物延伸而得到的DNA链剥离成单链，因为在3’末端存在互补区段，从而形成环状结构，并在环状结构的F1区段的3’末端开始进行以自身单链为模板的DNA合成图1中(5)的结构。然后这条DNA一边剥离双链部分中BIP引物延伸得到DNA链，一边继续延伸，形成图1中(7)的结构。

通过上述过程，BIP引物延伸而得到DNA链被剥离，成为单链，而其两端分别存在互补的区段B1、B1c与F1c、F1，经由自我碱基配对形成哑铃状结构。可以看出图1中(7)就是(2)的对应结构。

图1中(7)的结构和(2)的结构对应，以F1区段的3’末端为起点，以自身为模板进行DNA合成，另外，FIP引物在单链的F2c区段进行碱基配对，一边剥离F1区段延伸而得到DNA链，以便进行DNA合成延伸。由此经过与图1中(2)至(7)相同的过程，又再生成图1中(2)的结构。同时在图1中(6)的结构中，FIP引物一边对单链的F2c区段进行碱基配对并剥离双链部分，一边进行DNA链的合成。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。

在环介导等温扩增法的基础上，在哑铃状结构的5’末端的环状单链部分(F1区段与F2区段之间)插入具有待检测miRNA的互补序列，命名为miRNAc，就能够作为miRNA的扩增起点，在DNA聚合酶作用下，向哑铃状结构的5’端延伸，在短时间能够实现快速扩增的目的，荧光信号在短时间内达到最大平台。一般来说加入miRNA的扩增反应所需要的时间是不加miRNA的扩增时间的1/3-1/2。

实施例1、miRNA灵敏度的检测

以miRNA-34家族成员中的miR-34a-5p进行相关实验，将合成好的miRNA oligo链配制成1pM，然后进行10倍梯度稀释，对不同浓度的miRNA同时进行扩增检测(具体操作参照实施例2进行)。

检测结果如图2和图3所示。扩增时间早于阴性对照即为阳性结果，从检测结果可以看出检测限能够达到10aM。

实施例2、miRNA特异性的检测

通用方法，本方法设计原理如图1。

选择miRNA-34家族的三个成员以及单碱基变化的一条链(序列如下表1)进行相关实验，针对每一种miRNA合成oligo，同时检测四种miRNA，以验证该方法检测miRNA的特异性。针对miRNA 34家族的四个成员，特异性检测miR-34a-5p的检测体系如表2所示。

表1 miRNA 34家族的四个成员序列

表2 针对miRNA 34家族的四个成员的检测体系

A、不对称PCR延伸模板链

首先将Template-miR和Template-miR-c等摩尔浓度混合，命名为ds template-miR，在94℃下保温五分钟，然后缓慢降至室温，稀释到200ng/μl，备用。

按照表3配制反应体系扩增延长模板链Template-miR

表3 不对称PCR扩增体系

AP-primer(10μM)	2.5μL
		ds template-miR(200ng/μL)	0.5μL
dNTPs(10mM)	1μL
		5×Phusion HF buffer	10μL
Nuclear free water	35.5μL
		Phusion DNA polymerase(2000U/mL)	0.5μL
total	50μL

不对称PCR的反应方法：在95℃下1分钟，然后进行35个循环(95℃，30秒，50℃，30秒和72℃，1分钟)；将反应体系在72℃下进一步温育10分钟以延伸任何不完全的产物。将扩增后的产物用吸附柱纯化(为了进行后续的LAMP扩增，因此需要对该步骤进行纯化得到目的DNA，对于其余的体系均需要除去，以免影响后续LAMP实验)，得到DSLT(单链DNA)，备用。

B、简化的LAMP扩增反应

表4 简化的LAMP扩增反应体系

将反应体系按照表4混合均匀后，置于real-time PCR仪器上，在恒温55-65℃条件下，反应90分钟。

结果如图4所示。结果显示靶序列miR-34a-5p最先发生扩增反应，而单碱基改变的序列miR-34x以及同族序列的扩增时间较晚。单碱基发生改变后，在扩增起始时间上和目标miR-34a相差较大，与阴性对照接近，证明建立的方法特异性良好，能够达到单碱基检测的需求。

进一步，将miR-34a的相对检出率假定为100％，将miR-34b、miR-34c以及miR-34x带入线性方程T＝0.2648-4.039lgC_miR-34a/M，计算出miR-34b、miR-34c以及miR-34x的相对检出率分别为：0.168％，0.006％和0.875％，结果如图5，因此三者的检出率均低于0.1％。证明建立的方法特异性良好，能够达到单碱基检测的需求。

实施例3、癌细胞系中miRNA的检测

应用该技术检测癌细胞系(细胞株BEL-7404)中miR-34a。

1、癌细胞株的培养以及总RNA的提取

将癌细胞株BEL-7404培养后，用trizol方法提取总RNA，作为待测样本。

2、根据检测不同的miRNA设计不同的AP primer(表5)，Template-miR、Template-miR-c、FIP和BIP同实施例2。

表5 针对mi-34a所设计的AP primer

3、癌细胞中miRNA的检测

A、不对称PCR延伸模板链

分别按照表6配制反应体系扩增延长模板链Template-miR。

表6 不对称PCR扩增体系

AP primer-34a	2.5μL
		ds template-miR(200ng/μL)	0.5μL
dNTPs(10mM)	1μL
		5×Phusion HF buffer	10μL
Nuclear free water	35.5μL
		Phusion DNA polymerase(2000U/mL)	0.5μL
total	50μL

不对称PCR的反应方法：在95℃下1分钟，然后进行35个循环(95℃，30秒，50℃，30秒和72℃，1分钟)；将反应体系在72℃下进一步温育10分钟以延伸任何不完全的产物。将扩增后的产物用吸附柱纯化，得到不同的DSLT，备用。

B、简化的LAMP扩增体系

将反应体系按照表7混合均匀后，置于real-time PCR仪器上，在恒温55-65℃条件下，反应90分钟。

表7 简化的LAMP扩增体系

注：阴性对照为表1阴性对照；阳性对照为miR-34a oligo。

4、结果如图6所示

结论：用建立的方法能够检测出实际样本中是否含有miR-34a。

实施例4、方法通用性验证

选择miR-155进行验证。

对于检测miR-155所设计的Forward-miR，命名为AP primer-155(表8)。

表8 AP primer-155

采用上述同实施例1中相同的ds template-miR，不对称PCR扩增得到延长的模板链，不对称PCR扩增体系参考表3，后续简化的LAMP扩增体系参考表4，反应方法参照实施例1。

结果如图7所示。

结论：证明建立的方法通用性良好，只需要改变不对称PCR方法中的AP primer所包含的不同miRNA的靶序列即可满足检测不同miRNA的需求。

<110> 中国科学院化学研究所

<120> 一种基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应进行miRNA快速检测的方法

<130> GNCLN190330

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 110

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

cgacagcaga ggagttgtgt ggaagtgtga gcggatcctc tgctgtcgat gtctggtcta 60

gggattatgg gctcgtcgtg actggccgtg cggggctgcg tcctctccag 110

<210> 3

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ggctcgtcgt gactggccac aaccagctaa gacactgcca ctggagagga cgcagccccg 60

cacggcca 68

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ggctcgtcgt gactggccct ggagaggacg cagccccgca c 41

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

cgacagcaga ggagttgtgt ggaagtgtga gcgga 35

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

ggctcgtcgt gactggccac ccctatcacg attagcatta actggagagg acgcagcccc 60

gcacggcca 69

Claims

1.一种检测miRNA的非疾病诊断性方法，是基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应对目标miRNA进行检测；

所述方法包括如下步骤：

（A）设计合成如下模板及引物：

a1）引物延伸模板，命名为Template-miR；所述Template-miR为自5’端到3’端依次由如下五部分组成的单链DNA：B1c，B2，B1，F1c和F2c，其中B1和F1c之间有连接序列LS；

a2）引物延伸模板的互补链，命名为Template-miR-c；所述Template-miR-c为与所述Template-miR反向互补的单链DNA，自5’端到3’端依次由如下五部分组成：F2，F1，B1c，B2c和B1，其中F1和B1c之间有a1）中所述连接序列LS的反向互补序列LSc；

a3）扩增引物1，命名为AP primer；所述AP primer为自5’端到3’端依次由如下三部分组成的单链DNA：F1c，目标miRNA的反向互补序列和F2；

a4）扩增引物2，命名为FIP；所述FIP为自5’端到3’端依次由如下两部分组成的单链DNA：F1c和F2；

a5）扩增引物3，命名为BIP；所述BIP为自5’端到3’端依次由如下两部分组成的单链DNA：B1c和B2；

其中，所述B1c与所述B1反向互补；所述F1c与所述F1反向互补；所述B1、所述B2、所述F1、所述F2、所述连接序列LS和所述目标miRNA的序列两两之间既不存在6个以上连续相同的核苷酸也不能互补配对；

（B）将所述Template-miR和所述Template-miR-c退火形成双链，所得双链命名为dsTemplate-miR；

（C）以所述ds Template-miR为模板，以所述AP primer为引物，进行单引物不对称PCR扩增，将所得单链产物命名为DSLT；

（D）配制如下两组反应体系，分别进行LAMP扩增：

实验组：含有所述DSLT、所述FIP、所述BIP和待测样本；

对照组：与所述实验组的差别仅在于以对照样本替代所述待测样本；所述对照样本中不含有所述目标miRNA；

（E）根据步骤（D）的扩增结果按照如下确定所述待测样本中是否含有所述目标miRNA：如果所述实验组出现扩增信号的时间早于所述对照组，则所述待测样本中含有所述目标miRNA；反之，则所述实验组中不含有所述目标miRNA；

所述F1c与所述F1之间的Tm值高于所述目标miRNA与所述目标miRNA的互补序列之间的Tm值。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述AP primer的长度为60-70nt；

所述Template-miR的长度为100-120nt；所述F1、所述F2、所述B1和所述B2的长度均为10-30nt；所述连接序列LS的长度为20-25nt。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述B1的序列如SEQ ID No.1的第36-48位所示；所述B2的序列如SEQ ID No.1的第14-35位所示；所述F1的序列如SEQ ID No.1的第70-87位的反向互补序列所示；所述F2的序列如SEQ ID No.1的第88-110位的反向互补序列所示；所述连接序列LS如SEQ ID No.1的第49-69位所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Template-miR的序列如SEQ ID No.1所示；所述Template-miR-c的序列如SEQ ID No.1的反向互补序列所示；所述FIP的序列如SEQ ID No.3所示；所述BIP的序列如SEQ ID No.4所示。

5.权利要求1-4中任一所述的方法在miRNA的高通量检测中的非疾病诊断性应用。

6.一种检测miRNA的试剂盒，含有权利要求1-4任一中的步骤（A）所述的模板及引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有可读性载体；所述可读性载体上记载有权利要求1中的步骤（B）至步骤（E）。

8.权利要求6或7所述的试剂盒在检测miRNA中的非疾病诊断性应用。

9.权利要求6或7所述的试剂盒在miRNA的高通量检测中的非疾病诊断性应用。