CN110484605B - 一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用 - Google Patents
一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种活细胞原位检测microRNA‑34的基因,涉及基因工程技术领域。本发明所述基因基于DNA立体镊子结构快速原位检测microRNA,能够实现在活细胞内的迅速检测,避免了microRNA提取,逆转录以及PCR等一系列的操作。同时针对microRNA针对疾病诊断特异性较差的现状,原位检测能够很好的实现对microRNA表达异常的细胞的检测,从而明确发生疾病的细胞及组织来源,能够极大地增强microRNA检测的临床意义。在本发明实施例中,对梯度稀释待测microRNA‑34进行检测,检测限达到1.499nm,灵敏度高;同时相较于其他序列相似的microRNA,表现出高度特异性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用。
背景技术
MicroRNA作为一类内源性、非编码的RNA分子,其在生命活动的许多过程中起着重要的调节作用,尤其是与包括癌症在内的众多疾病的发生、发展密切相关。MicroRNA异常表达与肿瘤等疾病的密切关系促使其可以作为诊断和预测癌症的生物标志物。然而,由于microRNA本身含量低、易于降解、尺寸小、序列相似以及在肿瘤中广泛的异常表达等特点,使其难以通过简单方法直接检测,因而急需发展高灵敏度、高特异性的原位检测方法。目前常用的microRNA检测方法包括northern blot,实时定量PCR以及原位杂交等,然而这几种方法对microRNA检测过程中均无法兼顾高灵敏度、高特异性及原位检测这三个重要因素,并且其操作过程繁琐,条件要求苛刻,需要有经验的人员进行操作,从而限制了其应用范围。然而,在临床及科研中,单一的microRNA不能发挥诊断作用的重要原因之一就是不能判定其细胞来源,而实时的高灵敏的microRNA原位检测将可以弥补这一缺陷。因此,实现microRNA在活细胞内的原位检测将是推动其在临床领域应用的一大机遇。
近几年来,对microRNA和mRNA的胞内检测逐渐开始崭露头角。前期有研究利用上转发光金纳米粒子修饰的DNA四面体结构实现了对活细胞内的microRNA的定量检测,或是利用石墨烯结合DNA荧光探针实现了对活细胞内microRNA的原位检测。然而,目前核酸分子的胞内检测大多还需辅以各种纳米材料作为载体实现,其细胞毒性,体内代谢效率等问题难以避免。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用,利用生物相容性极高的DNA纳米结构进行胞内检测,有效减少对细胞本身活性的影响,能够实现在活细胞内的迅速检测,避免了microRNA提取,逆转录以及PCR等一系列的操作,能够简单有效的快速实现对microRNA的检测。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种活细胞原位检测microRNA-34的基因,所述基因由P1、P2、P3、P4、P5和P6组装成立体镊子结构,所述立体镊子结构包括5条边和4个面;所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述P5的核苷酸序列如SEQID NO.5所示,所述P6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;
在所述立体镊子结构中,所述P1和P2的结合部分形成固定边1;P1和P3的结合部分连接P1和P5的结合部分形成边2;P2和P3的结合部分连接P2和P5的结合部分形成边3;P2和P4的结合部分连接P2和P6的结合部分形成边4;P1和P4的结合部分连接P1和P6的结合部分形成边5;所述固定边1、边2和边5形成面1,所述固定边1、边3和边4形成面2,所述面1和面2以所述固定边1为轴开合;在所述边2和边3之间包括microRNA的结合部。
优选的,在所述立体镊子结构中,还包括荧光基团和荧光淬灭基团。
优选的,在所述P5和P6的一端分别包含有荧光基团和荧光淬灭基团。
本发明还提供了所述基因的制备方法,包括以下步骤:将P1、P2、P3、P4、P5和P6等体积混合后,于95℃下变性5min,降温后得所述基因。
优选的,所述P1、P2、P3、P4、P5和P6的浓度均为10μM。
本发明还提供了一种活细胞原位检测microRNA-34的试剂盒,包括所述基因或利用所述制备方法制备得到的基因。
本发明还提供了所述试剂盒在活细胞原位检测microRNA-34中的应用。
优选的,在活细胞原位检测时,将所述基因与待测RNA样本于37℃共孵育1h,当荧光被淬灭时,待测RNA样本中不包含有microRNA-34;当表现出荧光时,待测RNA样本中包含有microRNA-34。
本发明提供了一种活细胞原位检测microRNA-34的基因,基于DNA立体镊子结构快速原位检测microRNA,能够实现在活细胞内的迅速检测,避免了microRNA提取,逆转录以及PCR等一系列的操作,能够简单有效的快速实现对microRNA的检测。同时针对microRNA针对疾病诊断特异性较差的现状,原位检测能够很好的实现对microRNA表达异常的细胞的检测,从而明确发生疾病的细胞及组织来源,能够极大地增强microRNA检测的临床意义。在本发明实施例中,对梯度稀释待测microRNA-34进行检测,检测限达到1.499nm,灵敏度高;同时相较于其他序列相似的microRNA,表现出高度特异性。
附图说明
图1为本发明所述基因的立体镊子结构图;
图2为P1和P2所形成的立体DNA镊子的基本形状;
图3为P3、P4、P5和P6与P1和P2的结合关系;
图4为所述基因与microRNA-34结合后的结构图;
图5为不同浓度下的microRNA-34与所述结构的基因结合后的波长图;
图6为荧光强度与microRNA-34浓度的线性分析图;
图7为不同种类的microRNA与所述结构的基因结合后的波长分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种活细胞原位检测microRNA-34的基因,所述基因由P1、P2、P3、P4、P5和P6组装成立体镊子结构,所述立体镊子结构包括5条边和4个面;所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述P5的核苷酸序列如SEQID NO.5所示,所述P6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;
在所述立体镊子结构中,所述P1和P2的结合部分形成固定边1;P1和P3的结合部分连接P1和P5的结合部分形成边2;P2和P3的结合部分连接P2和P5的结合部分形成边3;P2和P4的结合部分连接P2和P6的结合部分形成边4;P1和P4的结合部分连接P1和P6的结合部分形成边5;所述固定边1、边2和边5形成面1,所述固定边1、边3和边4形成面2,所述面1和面2以所述固定边1为轴开合;在所述边2和边3之间包括microRNA的结合部。
在本发明中,所述立体镊子结构中的结合部分是基于碱基互补配对原则结合起来的。本发明所述基因结构如图1所示,P1和P2部分结合构成了立体DNA镊子的基本形状(图2),P3和P4分别与P1和P2结合,稳定立体镊子的结构,P5和P6分别与P1和P2部分结合(图3),P5和P6遗留的部分设计为miRNA-34的互补序列,作为microRNA结合的位点,由于DNA单链是柔性结构,故无法保持四面体的结构,而导致该条棱连接的两个面闭合,形成类似闭合的“扇贝”的结构。而当待测microRNA-34(UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU)存在时,可以与所述microRNA的结合部的单链杂交形成刚性的双链,重新支撑起四面体结构,打开“扇贝”(图4)。
在本发明的所述立体镊子结构中,优选还包括荧光基团和荧光淬灭基团,在所述P5和P6的一端分别都包含有所述荧光基团和荧光淬灭基团。当所述三维DNA镊子为开的状态时,荧光亮;当所述三维DNA镊子为闭合的状态时,荧光暗,因此可通过荧光的亮暗,判断三维DNA镊子的开合状态,从而判断是否与microRNA杂交。
本发明还提供了所述基因的制备方法,包括以下步骤:将P1、P2、P3、P4、P5和P6等体积混合后,于95℃下变性5min,降温后得所述基因。
在本发明中所述P1、P2、P3、P4、P5和P6的浓度优选的均为10μM。本发明对发生所述变性的仪器并没有特殊限定,优选PCR仪。本发明所述降温优选为自然降温至室温(18~25℃)。
本发明还提供了一种活细胞原位检测microRNA-34的试剂盒,包括所述基因或利用所述制备方法制备得到的基因。
本发明还提供了所述试剂盒在活细胞原位检测microRNA-34中的应用。
本发明所述活细胞原位检测优选为非诊断目的。本发明在进行所述活细胞原位检测时,优选将所述基因与待测RNA样本37℃共孵育1h,当不存在microRNA-34时,荧光基团与猝灭基团之间距离较近,荧光被淬灭,当存在microRNA-34时,通过miRNA与P5或P6的结合,荧光基团和淬灭基团之间的距离增大,荧光得以释放出来。因此一条microRNA可以对应一个荧光基团,以此可以根据荧光的强度定量microRNA的数量。
下面结合实施例对本发明提供的活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将立体DNA镊的组装链分别以10μM的浓度等比例混合后95℃变性5min,然后缓慢降温至室温形成三维DNA镊结构。立体DNA镊组装链序列见表1。
表1立体DNA镊的组装链序列
对上述得到的三维DNA镊结构进行灵敏度和特异性检测:
1、分别将microRNA-34梯度稀释为1000nM,500nM,200nM,100nM,50nM,40nM,30nM,20nM,10nM,1nM,直至荧光强度变化与空白对照组无显著性差异时为止,然后分别将稀释后的microRNA-34与上述三维DNA镊结构在37℃下共孵育1h后在荧光显微镜下观察结果。结果如图5所示,确定其检测下限为1.499nM。
对荧光强度与microRNA-34浓度进行线性分析,结果如表2和图6所示:Y=1.041X+202(Y为荧光强度,X为浓度nM)。
表2不同浓度下的荧光强度
2、选取与待测microRNA-34序列类似的microRNA(如microRNA-21,microRNA-27)作为阴性对照,与上述三维DNA镊结构在37℃下共孵育1h后在荧光显微镜下观察结果,验证该立体镊子检测microRNA的特异性,结果如图7所示。
本发明提供了一种活细胞原位检测microRNA-34的基因,能够实现在活细胞内的迅速检测microRNA-34,特异性好,灵敏度高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
<120> 一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcgcacctg agagtccttc taatagggtt tcctggtcaa gcggtgaact agaatgccct 60
ttgggctgtt ccgggtgtgg ctcgtccg 88
<210> 2
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggccgaggac tcctgtcctg gtcaagcggt ttggcgaact ggtcctgcgt ctacttaccg 60
tttccgacga gccacacccg gaacagccc 89
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctcaggtgc gcgtttcggt aagtagacg 29
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggagtcctc ggcctttggg cattctagtt 30
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccctattaga aggacaacca gctaagacac tgccaggacc agttcgcc 48
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgcttgacc aggacaacca gctaagacac tgccaccgct tgaccagg 48
Claims (4)
1.一种用于活细胞原位检测microRNA-34的基因,其特征在于,所述基因由P1、P2、P3、P4、P5和P6组装成立体镊子结构,所述立体镊子结构包括5条边和4个面;所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述P5的核苷酸序列如SEQID NO.5所示,所述P6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;
在所述立体镊子结构中,所述P1和P2的结合部分形成固定边1;P1和P3的结合部分连接P1和P5的结合部分形成边2:P2和P3的结合部分连接P2和P5的结合部分形成边3;P2和P4的结合部分连接P2和P6的结合部分形成边4;P1和P4的结合部分连接P1和P6的结合部分形成边5;所述固定边1、边2和边5形成面1,所述固定边1、边3和边4形成面2,所述面1和面2以所述固定边1为轴开合;在所述边2和边3之间包括microRNA的结合部;
在所述P5和P6的两端均分别包含有所述荧光基团和荧光淬灭基团。
2.权利要求1所述基因的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将P1、P2、P3、P4、P5和P6等体积混合后,于95℃下变性5min,降温后得所述基因。
3.根据权利要求2所述制备方法,其特征在于,所述P1、P2、P3、P4、P5和P6的浓度均为10μM。
4.一种活细胞原位检测microRNA-34的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述基因或利用权利要求2或3所述制备方法制备得到的基因。
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Legal Events
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GR01 | Patent grant | ||
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CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20200728 Termination date: 20210923 |