CN109913546B - 一种检测miRNA的荧光生物探针及检测方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测miRNA的荧光生物探针和检测miRNA的荧光生物传感器及其用途和miRNA的检测方法，利用上述的探针检测miRNA时，具有步骤简单、免标记，反应在等温均相溶液中进行，避免了繁琐的分离过程和耗时的热循环的问题，同时巧妙地结合了催化发夹组装技术和λ外切酶(λ‑Exo)辅助信号扩增技术，同时结合了DNA银纳米簇(DNA‑AgNCs)，实现了生物靶标的高灵敏检测，检测限可低至0.89fM，同时可以区分出miRNA家族成员间的单碱基差异，具有较高的特异性，克服现有技术中的miRNA检测方法不能同时兼顾快速、简单和低成本，同时具有高检测灵敏度和高特异性的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测miRNA的荧光生物探针和检测miRNA的荧光生物传感器及其用途和miRNA的检测方法。
背景技术
microRNAs(miRNAs)是一类短单链非编码RNA，其大小通常为20-25个核苷酸。研究表明，miRNAs高度参与调控多种细胞途径和细胞过程，包括细胞的增殖、分化、衰老和凋亡。同时越来越多的证据表明，miRNAs的异常表达与大部分的人类恶性肿瘤相关，比如肺癌、胃癌、乳腺癌和肝癌等。因此，miRNAs被认为是疾病早期诊断、预后和治疗的潜在生物标志物。miRNAs的快速、准确和高特异性的检测将有助于疾病早期诊断、预后和治疗。然而，由于miRNAs具有体积小、丰度低和家族成员间序列相似度高等特点，使得miRNAs的检测面临较大的挑战。
对于miRNAs的检测，传统方法包括Northern印迹和定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)，是测定miRNAs的金标准。然而，上述的方法存在灵敏度低，特异性差，耗时长和操作复杂等缺陷，大大限制了它们的生物学和医学的应用。因此，新的检测方法一直在持续地开发中，以期实现miRNA的快速、简单和低成本检测，同时具有高检测灵敏度和高特异性。
由于荧光传感器检测具有较低的检测限、灵敏度和特异性，因此，常采用经典的分子信标对生物分子检测。经典的分子信标(MB)设计需要选择合适的荧光染料和淬灭剂，以最大限度地改变荧光发射。然而，荧光染料/猝灭剂与分子信标的结合不仅提高了实验成本，而且大大增加了实验设计的复杂性。为了解决这个问题，DNA银纳米簇(DNA-AgNCs)作为一类新的生物标记引起了人们极大的兴趣。DNA-AgNCs由少量的银原子组成(2-30个原子)，其物理尺寸接近电子的费米波长，具有许多优异的荧光性质，包括良好的量子产率和光稳定性，可调的荧光发射和优异的生物相容性。这些优势使得DNA-AgNCs在核酸检测，蛋白质分析和细胞成像等研究领域得到了广泛的应用。因此，目前，将DNA-AgNCs应用于miRNA的技术也越来越多。
如中国专利文献CN1088663354A中公开的一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器、制备及其应用，通过加入目标物miRNA，与互补miRNA部分碱基互补配对的发夹DNAHP1被打开和目标物结合，形成目标物与发夹DNA H1的杂交链，在加入与发夹DNA HP1碱基互补配对更多的发夹DNA HP2以后，目标物miRNA的加入可引发这个催化发夹自组装放大系统，利用以DNA为模板形成的银纳米簇的电致化学发光信号检测目标物，其最低检测限可低至1am。然而在上述方法中，需要使用玻碳电极，在检测过程中包括对电极修饰金纳米粒子、对电极修饰单链DNAS1、对电极修饰6-巯基-1-己醇、对电极修饰HP1-HP2等步骤，步骤过多，操作复杂，效率低，且检测过程中需要的材料、设备、试剂等较多，成本较高。
发明内容
因此，本发明要解决的第一个技术问题在于克服现有技术中的miRNA检测方法不能同时兼顾快速、简单和低成本，同时具有高检测灵敏度和高特异性的问题，从而提供一种快速、简单、低成本、高检测灵敏度和特异性的用于检测miRNA的荧光生物探针。
本发明要解决的第二个技术问题在于克服现有技术中的miRNA检测方法不能同时兼顾快速、简单和低成本，同时具有高检测灵敏度和高特异性的问题，从而提供一种快速、简单、低成本、高检测灵敏度和特异性的检测miRNA的荧光生物传感器。
本发明要解决的第三个技术问题在于克服现有技术中的miRNA检测方法不能同时兼顾快速、简单和低成本，同时具有高检测灵敏度和高特异性的问题，从而提供一种快速、简单、低成本、高检测灵敏度和特异性的miRNA的检测方法。
为此，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测miRNA的荧光生物探针，包括第一发夹、第二发夹和第三发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区；
所述第一发夹包括：结构域(I)，可与目标miRNA互补杂交；结构域(II)，与所述结构域(I)部分互补杂交形成发夹结构；
所述第二发夹包括：结构域(I’)，可与第一发夹的结构域(I)部分互补杂交；结构域(II’)，与所述结构域(I’)一端相连，可与第一发夹的结构域(II)部分互补杂交；结构域(III’)，与所述结构域(I’)另一端相连，可与结构域(II’)部分互补杂交形成发夹结构；
所述第三发夹包括：结构域(V)，可与第一发夹的结构域(I)部分互补杂交；结构域(III)，与所述结构域(V)一端相连，可与第二发夹的结构域(III’)互补杂交；报告序列(IV)，与所述结构域(V)另一端相连，与所述结构域(III)部分互补杂交形成发夹结构。
在所述的检测miRNA的荧光生物探针中，所述第三发夹的结构域(III)的未与所述结构域(V)相连的另一端修饰有磷酸基团。
在所述的检测miRNA的荧光生物探针中，所述报告序列(IV)的序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供了一种检测miRNA的荧光生物传感器，包括所述的检测miRNA的荧光生物探针。
在所述的检测miRNA的荧光生物传感器中，包括A反应体系和B反应体系；所述A反应体系包括：待测miRNA、含有权利要求1-3任一项所述的检测miRNA的荧光生物探针的探针溶液、第一反应缓冲液、RNase抑制剂和/或核酸外切酶；所述B反应体系包括：含有Ag离子的第二缓冲液和/或NaBH4溶液。
在所述的检测miRNA的生物传感器中，在所述探针溶液中，所述第一发夹、第二发夹和第三发夹的摩尔比为1:1:(1-3)。
在所述的检测miRNA的生物传感器中，Ag离子和第三发夹的摩尔比为(5-7):1。
在所述的检测miRNA的生物传感器中，Ag离子与NaBH4的摩尔比为1:(1-2)。
在所述的检测miRNA的生物传感器中，所述核酸外切酶为λ-Exo。
在所述的检测miRNA的生物传感器中，所述A反应体系，以50μL为计，包括：
所述待测miRNA，4-6μL；
探针溶液，13-17μL
所述第一缓冲液，18-22μL；
所述RNase抑制剂，5-15U，4-6μL；
所述核酸外切酶，15-25U，4-6μL；
ddH2O补足至50μL。
优选的，所述B反应体系，以50μL为计，包括：
含有Ag离子的第二缓冲液，38-42μL；
NaBH4溶液，8-12μL；
ddH2O补足至50μL。
优选的，在所述的检测miRNA的生物传感器中，所述A反应体系，以50μL为计，包括：
所述待测miRNA，5μL；
探针溶液，15μL
所述第一缓冲液，20μL；
所述RNase抑制剂，10U，5μL；
所述核酸外切酶，20U，5μL；
ddH2O补足至50μL。
优选的，所述B反应体系，以50μL为计，包括：
含有Ag离子的第二缓冲液，40μL；
NaBH4溶液，10μL；
ddH2O补足至50μL。
优选的，所述第一缓冲液为含浓度为15-25mM的Tris-HNO3,浓度为45-55mM的KNO3,浓度为5-15mM的Mg(NO3)2,以及浓度为0.5-1.5mM的DTT(二硫苏糖醇),pH 7.8-8.0。
进一步优选的，所述第一缓冲液为含浓度为20mM的Tris-HNO3,浓度为50mM的KNO3,浓度为10mM的Mg(NO3)2,以及浓度为1mM的DTT(二硫苏糖醇)，pH 7.9。
本发明提供了所述的检测miRNA的荧光生物探针或所述的检测miRNA的荧光生物传感器在检测miRNA中的用途。优选的，所述miRNA为let-7a。
本发明提供了一种检测miRNA的方法，包括利用所述的检测miRNA的荧光生物探针和/或所述的检测miRNA的荧光生物传感器进行检测。
在所述的方法中，包括如下步骤：
S1、分别将所述的检测miRNA的荧光生物探针、RNase抑制剂和核酸外切酶加入至反应缓冲液中，然后向其中加入待测溶液，进行孵育，获得第一反应液；
S2、向所述第一反应液中加入含有Ag离子的缓冲液，室温离心，收集上清液，然后加入NaBH4溶液，避光孵育，获得第二反应液，将所得第二反应液进行化学发光检测。
在所述的方法中，在所述S1步骤中，孵育时间为90-150min，孵育温度为35-40℃；优选的，孵育时间为120min，孵育温度为37℃。
在所述的方法中，在所述S2步骤中，孵育时间为70-120min，孵育温度为3-6℃；优选的，孵育时间为90min，孵育温度为4℃。
在所述的方法中，在所述S1步骤中，离心速率为11000-13000rpm，离心时间为4-6min；优选的，离心速率为12000rpm，离心时间为5min。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种检测miRNA的荧光生物探针，包括第一发夹、第二发夹和第三发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区；所述第一发夹包括：结构域(I)，可与目标miRNA互补杂交；结构域(II)，与所述结构域(I)部分互补杂交形成发夹结构；所述第二发夹包括：结构域(I’)，可与第一发夹的结构域(I)部分互补杂交；结构域(II’)，与所述结构域(I’)一端相连，可与第一发夹的结构域(II)部分互补杂交；结构域(III’)，与所述结构域(I’)另一端相连，可与结构域(II’)部分互补杂交形成发夹结构；所述第三发夹包括：结构域(V)，可与第一发夹的结构域(I)部分互补杂交；结构域(III)，与所述结构域(V)一端相连，可与第二发夹的结构域(III’)互补杂交；报告序列(IV)，与所述结构域(V)另一端相连，与所述结构域(III)部分互补杂交形成发夹结构；上述探针结合λ-Exo辅助信号扩增，不需要昂贵的荧光标记和复杂的探针固定，如使用电极吸附探针，测定简单、免标记且成本低廉，又由于探针经过第一轮循环扩增反应和第二轮循环扩增反应获得的高扩增效率，保证了生物靶标的高灵敏检测，同时可以区分出miRNA家族成员间的单碱基差异，具有较高的特异性。
2.本发明提供的一种检测miRNA的荧光生物传感器，包括A反应体系和B反应体系；所述A反应体系包括：待测miRNA、含有检测miRNA的荧光生物探针的探针溶液、第一反应缓冲液、RNase抑制剂和/或核酸外切酶；所述B反应体系包括：含有Ag离子的第二缓冲液和/或NaBH4溶液；利用上述检测miRNA的荧光生物传感器检测miRNA时，具有步骤简单、免标记，反应在等温均相溶液中进行，避免了繁琐的分离过程和耗时的热循环，同时巧妙地结合了催化发夹组装技术和λ外切酶(λ-Exo)辅助信号扩增技术，同时结合了DNA银纳米簇(DNA-AgNCs)，实现了生物靶标的高灵敏检测，检测限低至0.89fM，同时可以区分出miRNA家族成员间的单碱基差异，具有较高的特异性。
3.本发明提供的一种检测miRNA的荧光生物传感器，在所述探针溶液中，所述第一发夹、第二发夹和第三发夹的摩尔比为1:1:(1-3)；进一步的，所述第一发夹、第二发夹和第三发夹的摩尔比为1:1:2，在所述摩尔比例下的发夹反应体系中检测时，发现信噪比(4.0)显著高于摩尔比为1:1:1的信噪比(3.5)和摩尔比为1:1:3的信噪比(2.75)。
4.本发明提供的一种检测miRNA的方法，包括如下步骤：S1、分别将检测miRNA的荧光生物探针、RNase抑制剂和核酸外切酶加入至反应缓冲液中，然后向其中加入待测溶液，进行孵育，获得第一反应液；S2、向所述第一反应液中加入含有Ag离子的缓冲液，室温离心，收集上清液，然后加入NaBH4溶液，避光孵育，获得第二反应液，将所得第二反应液进行化学发光检测；采用上述方法检测miRNA时，具有步骤简单、免标记，反应在等温均相溶液中进行，避免了繁琐的分离过程和耗时的热循环，同时巧妙地结合了催化发夹组装技术和λ外切酶(λ-Exo)辅助信号扩增技术，同时结合了DNA银纳米簇(DNA-AgNCs)，实现了生物靶标的高灵敏检测，检测限低至0.89fM，同时可以区分出miRNA家族成员间的单碱基差异，具有较高的特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中的探针检测miRNA的原理图；
图2是本发明实验例1中实施例8、对比例1-3的方法检测待测let-7amiRNA溶液的荧光信号图；
图3是本发明实验例2中HP1和HP2的浓度的考察实验中F/F0值柱状图；
图4是本发明实验例2中HP3的浓度的考察实验中F/F0值柱状图；
图5是本发明实验例3中不同λ-Exo浓度下的荧光强度结果图；
图6是本发明实验例4中不同孵育时间的荧光强度结果图；
图7是本发明实验例5中miRNA的荧光生物传感器对miRNA的检测特异性结果图；
图8是本发明实验例6中miRNA的荧光生物传感器对miRNA的检测灵敏度结果图。
具体实施方式
下述实施例中涉及的材料和试剂均为市售产品，具体如下：
使用的PAGE纯DNA寡核苷酸由生工生物工程股份有限公司(上海，中国)合成。
HPLC纯let-7a，let-7b，let-7c，let-7d和let-7i miRNA来自南京金斯瑞生物科技有限公司(江苏，中国)。表1列出了上述的寡核苷酸的序列。用DEPC水稀释miRNA至适当的浓度。DNA寡核苷酸(本发明的检测miRNA的荧光生物探针)用20mM Tris-HNO3缓冲液(20mMNaNO3,10mM NH4NO3,2mM Mg(NO3)2,pH 7.4@25℃)稀释，得到100μM的储备溶液。实验前，每个DNA寡核苷酸均加热至95℃保持5分钟，然后缓慢冷却至室温。
二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理水和核糖核酸酶(RNase)抑制剂购自生工生物工程股份有限公司(上海，中国)。
λ核酸外切酶购自纽英伦生物技术有限公司(北京，中国)。
硝酸银(AgNO3)和硼氢化钠(NaBH4)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(上海，中国)。
其他化学品来自国药集团化学试剂有限公司(上海，中国)，未经纯化即使用。
表1.本发明中使用的DNA序列
实施例1检测miRNA的荧光生物探针的设计
本实施例的检测miRNA的荧光生物探针，包括第一发夹、第二发夹和第三发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区；
所述第一发夹包括：结构域(I)，可与目标miRNA互补杂交；结构域(II)，与所述结构域(I)部分互补杂交形成发夹结构；
所述第二发夹包括：结构域(I’)，可与第一发夹的结构域(I)部分互补杂交；结构域(II’)，与所述结构域(I’)一端相连，可与第一发夹的结构域(II)部分互补杂交；结构域(III’)，与所述结构域(I’)另一端相连，可与结构域(II’)部分互补杂交形成发夹结构；
所述第三发夹包括：结构域(V)，可与第一发夹的结构域(I)部分互补杂交；结构域(III)，与所述结构域(V)一端相连，可与第二发夹的结构域(III’)互补杂交；报告序列(IV)，与所述结构域(V)另一端相连，与所述结构域(III)部分互补杂交形成发夹结构。
进一步的，所述第三发夹的结构域(III)的未与所述结构域(V)相连的另一端修饰有磷酸基团。
进一步的，所述报告序列(IV)的序列如SEQ ID NO：1所示。
待测miRNA选择let-7a的寡核苷酸序列，因此所述的检测miRNA的荧光生物探针的具体序列如下表2，其中第一发夹为HP1，第二发夹为HP2，第三发夹为HP3，发夹HP1、HP2和HP3的序列可以分别如序列SEQ ID NO：2-4所示。
表2.所述检测miRNA的荧光生物探针的核苷酸序列
上述探针检测miRNA的原理如图1所示，为：
第一轮循环扩增反应(图1中的循环I)：
(1)随着待测miRNA的加入，第一发夹HP1的结构域(I)(对应于图1中HP1上标记的1、2、3区域)与靶标待测miRNA(触发源)(对应于图1中miRNA上的1*、2*、3*区域)杂交，触发催化发夹组装反应，形成部分杂交的靶标-HP1双链体，使得发夹HP1中的结构域(II)(对应于图1中HP1上标记的4、3*、2*区域)被释放出来；
(2)第一发夹HP1被释放出来的结构域(II)(对应于图1中HP1上标记的4、3*区域)与第二发夹HP2的结构域(II’)(对应于图1中HP2上标记的4*、3区域)部分互补杂交结合，由于HP1-HP2双链体比靶标-HP1双链体更稳定，进一步的，HP1的结构域(I)(对应于图1中HP1上标记的2、3区域)和HP2的结构域(I’)(对应于图1中HP2上标记的2*、3*区域)部分互补杂交结合，释放出HP1的结构域(I)中未互补杂交的区域(对应于图1中HP1上标记的1区域)和HP2的结构域(III’)(对应于图1中HP2上标记的4区域)，同时替换并释放出靶标miRNA；
(3)被释放出的靶标miRNA与另一个新的HP1结合，触发新一轮的第一轮循环扩增反应。
第二轮循环扩增反应(图1中的循环II)：
(4)第一循环扩增反应获得的HP1-HP2双链体释放的HP1的结构域(I)中未互补杂交的区域(对应于图1中HP1上标记的1区域)和HP2的结构域(III’)(对应于图1中HP2上标记的4区域)分别与第三发夹HP3的结构域(V)(对应于图1中HP3上标记的1*区域)和结构域(III)(对应于图1中HP3上标记的4*区域)杂交结合形成稳定的Y形结构HP2-HP1-HP3，Y形结构的形成使得磷酸化修饰的HP3的一端变为钝性末端；
(5)Y形结构HP2-HP1-HP3中的HP3上的钝性末端被λ-Exo识别并催化剪切释放出HP1-HP2双链体和单链的报告序列(IV)。释放出的HP1-HP2双链体可以和另一个发夹HP3杂交形成Y形结构，Y形结构中HP3上的钝性末端，可以进一步被λ-Exo识别并切割以循环利用HP1-HP2双链体，产生大量的单链报告序列(IV)，这些报告序列(IV)作为支架在NaBH4与AgNO3反应过程中形成荧光银纳米簇，产生荧光响应值。因此，催化发夹组装和λ-Exo辅助信号扩增的结合可实现miRNA的高灵敏度检测。
实施例2检测miRNA的荧光生物传感器
本实施例提供了一种检测miRNA的荧光生物传感器，包括A反应体系和B反应体系；
所述A反应体系，以50μL为计，包括：
待测miRNA，4μL；
探针溶液，含发夹HP1、发夹HP2和发夹HP3的摩尔比为1:1:1，发夹HP1的浓度为50nM(nmol/L)，17μL；
所述第一缓冲液，含浓度为15mM的Tris-HNO3,浓度为55mM的KNO3,浓度为5mM的Mg(NO3)2,以及浓度为1.5mM的DTT(二硫苏糖醇),pH 7.8，18μL；
所述RNase抑制剂，15U，6μL；
所述核酸外切酶λ-Exo，15U，4μL；
ddH2O补足。
所述B反应体系，以50μL为计，包括：
含有Ag离子的第二缓冲液，为含AgNO3的柠檬酸钠溶液，其中AgNO3与所述A反应体系中的发夹HP3的摩尔比为5:1，pH 7.1，38μL；
NaBH4溶液，NaBH4与AgNO3的摩尔比为1:1，12μL；
ddH2O补足。
实施例3检测miRNA的荧光生物传感器
本实施例提供了一种检测miRNA的荧光生物传感器，包括A反应体系和B反应体系；
所述A反应体系，以50μL为计，包括：
待测miRNA，6μL；
探针溶液，含发夹HP1、发夹HP2和发夹HP3的摩尔比为1:1:3，发夹HP1的浓度为50nM(M为mol/L)，13μL；
所述第一缓冲液，含浓度为25mM的Tris-HNO3,浓度为45mM的KNO3,浓度为15mM的Mg(NO3)2,以及浓度为0.5mM的DTT(二硫苏糖醇),pH 8.0，22μL；
所述RNase抑制剂，5U，4μL；
所述核酸外切酶λ-Exo，25U，6μL；
去离子水补足。
所述B反应体系，以50μL为计，包括：
含有Ag离子的第二缓冲液，为含AgNO3的柠檬酸钠溶液，其中AgNO3与所述A反应体系中的发夹HP3的摩尔比为7:1，pH 6.9，42μL；
NaBH4溶液，NaBH4与AgNO3的摩尔比为1:1，8μL；
ddH2O补足。
实施例4检测miRNA的荧光生物传感器
本实施例提供了一种检测miRNA的荧光生物传感器，包括A反应体系和B反应体系；
所述A反应体系，以50μL为计，包括：
待测miRNA，5μL；
探针溶液，含发夹HP1、发夹HP2和发夹HP3的摩尔比为1:1:2，发夹HP1的浓度为50nM(nmol/L)，15μL；
所述第一缓冲液，含浓度为20mM的Tris-HNO3,浓度为50mM的KNO3,浓度为10mM的Mg(NO3)2,以及浓度为1mM的DTT(二硫苏糖醇),pH 7.9，20μL；
所述RNase抑制剂，10U，5μL；
所述核酸外切酶λ-Exo，20U，5μL；
ddH2O补足。
所述B反应体系，以50μL为计，包括：
含有Ag离子的第二缓冲液，为含AgNO3的柠檬酸钠溶液，其中AgNO3与所述A反应体系中的发夹HP3的摩尔比为6:1，40μL；
NaBH4溶液，NaBH4与AgNO3的摩尔比为1:1，10μL；
ddH2O补足。
实施例5检测miRNA的方法
本实施例提供了一种检测miRNA的方法，利用实施例1中的探针和实施例2中的检测miRNA的荧光生物传感器，对待测let-7a miRNA溶液进行检测，包括如下步骤：
(1)将所述A反应体系中的探针溶液、所述第一缓冲液、所述RNase抑制剂和所述核酸外切酶混合，向其中加入待测let-7a miRNA溶液，ddH2O补足，于35℃孵育150分钟，孵育结束后，将所得第一反应液4℃储存备用；
(2)向步骤(1)中获得的第一反应液中加入所述B反应体系中的含有Ag离子的第二缓冲液，在室温条件下以11000rpm离心4分钟，收集上清液，然后加入所述B反应体系中的NaBH4溶液，避光下3℃孵育70分钟，获得第二反应液，将所得第二反应液进行化学发光检测，使用带黑色384孔微量滴定板(Greiner Bio-one,Frickenhausen,德国)的SpectraMaxM5e多功能酶标仪(Molecular Devices,CA,USA)进行荧光测量。荧光发射光谱的激发波长为535nm，收集570nm到690nm的波谱，步长2nm。
实施例6检测miRNA的方法
本实施例提供了一种检测miRNA的方法，利用实施例1中的探针和实施例3中的检测miRNA的荧光生物传感器，对待测let-7a miRNA溶液进行检测，包括如下步骤：
(1)将所述A反应体系中的探针溶液、所述第一缓冲液、所述RNase抑制剂和所述核酸外切酶混合，向其中加入待测let-7a miRNA溶液，ddH2O补足，于40℃孵育90分钟，孵育结束后，将所得第一反应液4℃储存备用；
(2)向步骤(1)中获得的第一反应液中加入所述B反应体系中的含有Ag离子的第二缓冲液，在室温条件下以13000rpm离心6分钟，收集上清液，然后加入所述B反应体系中的NaBH4溶液，避光下6℃孵育120分钟，获得第二反应液，将所得第二反应液进行化学发光检测，使用带黑色384孔微量滴定板(Greiner Bio-one,Frickenhausen,德国)的SpectraMaxM5e多功能酶标仪(Molecular Devices,CA,USA)进行荧光测量。荧光发射光谱的激发波长为535nm，收集570nm到690nm的波谱，步长2nm。
实施例7检测miRNA的方法
本实施例提供了一种检测miRNA的方法，利用实施例1中的探针和实施例4中的检测miRNA的荧光生物传感器，对待测let-7a miRNA溶液进行检测，包括如下步骤：
(1)将所述A反应体系中的探针溶液、所述第一缓冲液、所述RNase抑制剂和所述核酸外切酶混合，向其中加入待测let-7a miRNA溶液，ddH2O补足，于37℃孵育120分钟，孵育结束后，将所得第一反应液4℃储存备用；
(2)向步骤(1)中获得的第一反应液中加入所述B反应体系中的含有Ag离子的第二缓冲液，在室温条件下以12000rpm离心5分钟，收集上清液，然后加入所述B反应体系中的NaBH4溶液，避光下4℃孵育90分钟，获得第二反应液，将所得第二反应液进行化学发光检测，使用带黑色384孔微量滴定板(Greiner Bio-one,Frickenhausen,德国)的SpectraMaxM5e多功能酶标仪(Molecular Devices,CA,USA)进行荧光测量。荧光发射光谱的激发波长为535nm，收集570nm到690nm的波谱，步长2nm。
实施例8
本实施例与实施例7基本相同，区别仅在于，在步骤(1)中，HP1、HP2和HP3的摩尔比为1:1:1。
对比例1
本实施例与实施例8基本相同，区别仅在于，在步骤(1)中未加入待测let-7amiRNA溶液和核酸外切酶λ-Exo。
对比例2
本实施例与实施例8基本相同，区别仅在于，在步骤(1)中未加入待测let-7amiRNA溶液。
对比例3
本实施例与实施例8基本相同，区别仅在于，在步骤(1)中未加入核酸外切酶λ-Exo。
实验例1
本效果例考察了分别采用实施例8、对比例1-3的方法检测待测let-7amiRNA溶液，记录荧光信号，结果如图2所示，在图中，a曲线-对比例2，b曲线-对比例3，c曲线-对比例4，d曲线-实施例8，通过比较可知，虽然发夹HP1/HP2/HP3含有互补序列，但孵育后它们的混合物没有显示明显的荧光强度(曲线a)，表明在三个发夹探针之间没有发生杂交。类似地，在HP1/HP2/HP3和λ-Exo的混合物中也没有观察到明显的变化(曲线b)。当将靶标miRNA(T)加入到含有HP1/HP2/HP3的溶液中时，荧光信号显著增加(曲线c)。这种增加主要是由于靶标miRNA与发夹HP1的杂交引起的，发夹HP1打开后引发了发夹HP2和HP3的组装，发夹HP3的打开导致了报告序列的暴露，使其能够作为荧光AgNCs的合成支架，引起荧光强度的增加。在实施例8中，将λ-Exo添加到HP1/HP2/HP3和靶标miRNA的混合物中后，可以检测到更明显的荧光信号增强(曲线d)。这是因为λ-Exo可以切割Y形结构HP2-HP1-HP3以循环利用HP1-HP2双链体不断进行循环II反应，从而释放出更多的报告序列并进一步增强荧光强度。这些实验结果表明，催化发夹组装结合λ-Exo辅助信号放大可以显著放大荧光信号进行miRNA的检测。
实验例2
本实验例考察了发夹HP1、HP2和HP3的浓度对于荧光强度的影响
(1)HP1和HP2的浓度的考察
按照实施例7中相同的方法进行miRNA的检测，区别仅在于，所述HP1和HP2的浓度均依次选择为25nM、50nM、75nM、100nM和125nM，发夹HP3的浓度为50nM。
反应结束后，检测结果如图3所示，50nM组的F/F0值(其中F和F0对应存在和不存在let-7a miRNA时的荧光强度)高于其他组，具有更好的信噪比(S/N)。因此，HP1和HP2的浓度均为50nM最优。
(2)HP3的浓度的考察
按照实施例7中相同的方法进行miRNA的检测，区别仅在于，所述HP3的浓度依次选择为50nM、75nM、100nM、125nM和150nM，HP1和HP2的浓度均为50nM。
反应结束后，检测结果如图4所示，探针HP3浓度为50nM到150nM时F/F0比值的变化。从图中可以看出，F/F0值随着HP3浓度从50nM到100nM的增加而增加，但超过100nM的浓度后逐渐降低。因此，HP3的浓度为100nM时最优。
实验例3
本实验例考察了λ-Exo浓度对于荧光强度的影响
按照实施例7中相同的方法进行miRNA的检测，区别仅在于，λ-Exo的浓度依次选择5U、10U、15U、20U和25U。
反应结束后，检测结果如图5所示，从图中可以看出荧光强度随着λ-Exo从5U到20U的增加而逐渐增加，然后达到平台期。综合考虑酶的消耗量和酶切效率，因此，选择20U的λ-Exo为最优。
实验例4
本实验例考察了孵育时间对于荧光强度的影响
按照实施例7中相同的方法进行miRNA的检测，区别仅在于，在步骤(1)中，孵育时间依次选择30min、60min、90min、120min、150min和180min。
反应结束后，检测结果如图6所示，扩增反应时间从30分钟增加到120分钟，荧光强度迅速增加，在120分钟后趋于平稳，这可能是由于扩增反应的终止所致。因此，扩增反应时间确定为120分钟。
实验例5
本实验例考察了miRNA的荧光生物传感器对miRNA的检测特异性
按照实施例7中相同的方法对不同的相同浓度的靶标miRNA进行检测。
反应结束后，检测结果如图7所示let-7b(两个碱基错配)，let-7c(单个碱基错配)和let-7d(两个碱基错配)的荧光强度仅为let-7a miRNA(完全匹配)荧光强度的29.37％，37.78％和28.19％。let-7i(四个碱基错配)显示与空白溶液几乎相同的荧光响应。上述结果清晰地表明，本发明的miRNA的荧光生物传感器能够高特异性的区分完全互补的靶标miRNA，具有单核苷酸多态性(SNP)分析的巨大潜力。
实验例6
本实验例考察了miRNA的荧光生物传感器对miRNA的检测灵敏度
按照实施例7中相同的方法对一系列不同浓度的靶标let-7a miRNA(浓度依次为0,1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM,1nM和10nM)进行了检测。
反应结束后，检测结果如图8A所示(图中曲线a-i依次对应(a)0,(b)1fM,(c)10fM,(d)100fM,(e)1pM,(f)10pM,(g)100pM,(h)1nM和(i)10nM)，荧光强度随着靶标let-7amiRNA浓度的增加而增加。这与实验理论相一致，即加入到反应液中的miRNA浓度越高，就会发生越多的循环扩增反应并释放出越多的单链报告序列。释放出的报告序列充当合成AgNCs的支架，从而引起荧光强度的逐渐增加。图8B表示荧光强度和let-7a miRNA浓度之间的指数关系。此外，在对数图上(图8B中的插图)，荧光强度与miRNA浓度(1fM至10nM)的对数存在良好的线性相关性。线性回归方程为F＝1355.67+153.10log10C(其中F是荧光强度，C是let-7a miRNA浓度)，相关系数R2＝0.9978。在信噪比为3σ(其中σ是空白样品的标准偏差，n＝3)时估算的检测限(LOD)为0.89fM。
利用本发明的miRNA的荧光生物传感器的检测结果与现有技术相比，表3对本发明的生物传感器与基于催化发夹组装扩增策略构建的其他miRNA生物传感器的灵敏度进行了比较。表4对本发明中构建的生物传感器与一些先前用于检测miRNA的荧光，电化学和比色生物传感器的性能进行了比较。结果表明，本发明构建的miRNA的荧光生物传感器具有检测限低的特点。
表3.基于催化发夹组装扩增策略构建的不同生物传感器的比较
表4.不同信号扩增策略检测miRNA的生物传感器的比较
上述表3-4中涉及的参考文献如下表5：
表5涉及的参考文献
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省原子医学研究所
<120> 一种检测miRNA的荧光生物探针及检测方法和用途
<130> WXHA201800158
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cccacccacc cgcccaa 17
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成（HP1）
<400> 2
aactatacaa cctactacct caccgcccaa ttaatgaggt agtaggtt 48
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成（HP2）
<400> 3
tacctcatta attgggcggt gaggtagtag gttccgccca attaa 45
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成（HP3）
<400> 4
ttaattgggc gggtatagtt cccacccacc cgcccaa 37
Claims (21)
1.一种检测miRNA的荧光生物探针组合，其特征在于，包括第一发夹、第二发夹和第三发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区；
所述第一发夹包括：结构域（I），可与目标miRNA互补杂交；结构域（II），与所述结构域（I）部分互补杂交形成发夹结构;结构域（I）包括1区域、2区域、3区域，结构域（II）包括4区域、3*区域、2*区域；3区域与3*区域互补杂交，2区域与2*区域互补杂交形成茎干区；
所述第二发夹包括：结构域（I’），可与第一发夹的结构域（I）部分互补杂交；结构域（II’），与所述结构域（I’）一端相连，可与第一发夹的结构域（II）部分互补杂交；结构域（III’），与所述结构域（I’）另一端相连，可与结构域（II’）部分互补杂交形成发夹结构；结构域（I’）包括2*区域、3*区域，分别可与结构域（I）的2区域、3区域互补杂交；结构域（II’）包括4*区域、3区域，分别可与结构域（II）中的4区域、3*区域互补杂交；结构域（III’）包括4区域，可与结构域（II’）中的4*区域互补杂交；
所述第三发夹包括：结构域（V），可与第一发夹的结构域（I）部分互补杂交；结构域（III），与所述结构域（V）一端相连，可与第二发夹的结构域（III’）互补杂交；报告序列（IV），与所述结构域（V）另一端相连，与所述结构域（III）部分互补杂交形成发夹结构；结构域（V）包括1*区域，可与结构域（I）中的1区域互补杂交；结构域（III）包括4*区域，可与结构域（III’）中的4区域互补杂交；报告序列（IV）包括5区域，可与结构域（III）的4*区域部分互补杂交。
2.根据权利要求1所述的检测miRNA的荧光生物探针组合，其特征在于，所述第三发夹的结构域（III）的未与所述结构域（V）相连的另一端修饰有磷酸基团。
3.根据权利要求1或2所述的检测miRNA的荧光生物探针组合，其特征在于，所述报告序列（IV）的序列如SEQ ID NO：1所示。
4.一种检测miRNA的荧光生物传感器，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的检测miRNA的荧光生物探针组合。
5.根据权利要求4所述的检测miRNA的荧光生物传感器，其特征在于，包括A反应体系和B反应体系；所述A反应体系包括：待测miRNA、含有权利要求1-3任一项所述的检测miRNA的荧光生物探针的探针溶液、第一反应缓冲液、RNase抑制剂和核酸外切酶；所述B反应体系包括：含有Ag离子的第二缓冲液和NaBH4溶液。
6.根据权利要求5所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，在所述探针溶液中，所述第一发夹、第二发夹和第三发夹的摩尔比为1:1:（1-3）。
7.根据权利要求5或6所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，Ag离子和第三发夹的摩尔比为（5-7）:1。
8.根据权利要求5或6所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，Ag离子与NaBH4的摩尔比为1:（1-2）。
9.根据权利要求5或6所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，所述核酸外切酶为λ-Exo。
10.根据权利要求5或6所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，所述A反应体系，以50μL为计，包括：
所述待测miRNA，4-6μL；
探针溶液，13-17μL；
所述第一反应缓冲液，18-22μL；
所述RNase抑制剂，5-15U，4-6μL；
所述核酸外切酶，15-25 U，4-6μL；
ddH2O补足至50μL。
11.根据权利要求5或6所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，所述B反应体系，以50μL为计，包括：
含有Ag离子的第二缓冲液，38-42μL；
NaBH4溶液，8-12μL；
ddH2O补足至50μL。
12.权利要求1-3任一项所述的检测miRNA的荧光生物探针组合或权利要求4-10任一项所述的检测miRNA的荧光生物传感器在非疾病诊断或治疗的检测miRNA中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述miRNA为let-7a。
14.一种非疾病诊断或治疗的检测miRNA的方法，其特征在于，包括利用权利要求1-3任一项所述的检测miRNA的荧光生物探针组合和/或权利要求4-11任一项所述的检测miRNA的荧光生物传感器进行检测。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、分别将所述的检测miRNA的荧光生物探针、RNase抑制剂和核酸外切酶加入至反应缓冲液中，然后向其中加入待测溶液，进行孵育，获得第一反应液；
S2、向所述第一反应液中加入含有Ag离子的缓冲液，室温离心，收集上清液，然后加入NaBH4溶液，避光孵育，获得第二反应液，将所得第二反应液进行化学发光检测。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在所述S1步骤中，孵育时间为90-150min，孵育温度为35-40℃。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述孵育时间为120min，孵育温度为37℃。
18.根据权利要求15-17任一项所述的方法，其特征在于，在所述S2步骤中，孵育时间为70-120min，孵育温度为3-6℃。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述孵育时间为90min，孵育温度为4℃。
20.根据权利要求15- 17任一项所述的方法，其特征在于，在所述S1步骤中，离心速率为11000-13000rpm，离心时间为4-6min。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述离心速率为12000rpm，离心时间为5min。
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