CN113637669B - 一种光热-基因联合治疗癌症的DNA-AuNPs结构单体、系统、方法及其应用 - Google Patents

一种光热-基因联合治疗癌症的DNA-AuNPs结构单体、系统、方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种光热‑基因联合治疗癌症的DNA‑AuNPs结构单体、系统、方法及其应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。其中，所述DNA‑AuNPs结构单体至少包括三个发夹结构DNA，一个连接链DNA和金纳米颗粒；其中，所述金纳米颗粒表面连接有发夹结构H1、发夹结构H3和连接链LD；发夹结构H2与所述连接链LD具有互补杂交的区域，形成H2‑LD。本发明基于DNA自组装技术，通过合理设计miR‑21响应的DNA‑AuNPs结构单体，实现光热‑基因联合治疗癌症(如宫颈癌)，增强治疗效果，在生物传感、生物医学和肿瘤治疗等研究领域具有广泛的应用前景。

Description

一种光热-基因联合治疗癌症的DNA-AuNPs结构单体、系统、方 法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种光热-基因联合 治疗癌症的DNA-AuNPs结构单体、系统、方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不 必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所 公知的现有技术。
DNA具有可编程性和良好的生物相容性，在构造纳米结构、分子机器、仿 生器件等方面表现出巨大的潜力。DNA纳米技术主要可分为两大类：结构DNA 纳米技术和动态DNA纳米技术。结构DNA纳米技术通常采用自下而上的组装 方式，构建二维或三维结构，并可通过DNA纳米尺度的可寻址性自组装得到宏 观材料。动态DNA纳米技术则强调非平衡动力学条件下的自组装，通过调节 DNA碱基的数量和序列精确控制核酸分子的自组装过程。
宫颈癌是一种常见的女性生殖道恶性肿瘤，发病率在女性恶性肿瘤中居第二 位。已成为严重威胁妇女生命的重大疾病之一。传统治疗宫颈癌的方法主要有手 术、化疗、放射治疗等，这些方法虽然可以在一定程度上抑制肿瘤的生长，但通 常创伤性大，副作用严重。近年来，基因治疗、光学治疗等方法已广泛应用于癌 症治疗，与传统治疗方法相比，具有靶向性高、副作用小等优点，但也存在一定 的局限性，如：体外合成siRNA生物稳定性差、易在递送过程中降解等。
发明人发现，目前没有将AuNPs光热治疗和细胞内原位生成siRNA基因治 疗同时应用于宫颈癌联合治疗的相关工作报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种光热-基因联合治疗癌症的 DNA-AuNPs结构单体、系统、方法及其应用。本发明基于DNA自组装技术， 通过合理设计miR-21响应的DNA-AuNPs结构单体，实现光热-基因联合治疗癌 症(如宫颈癌)，增强治疗效果，在生物传感、生物医学和肿瘤治疗等研究领域 具有广泛的应用前景。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种DNA-AuNPs结构单体，所述DNA-AuNPs 结构单体其至少包括三个发夹结构DNA，一个连接链DNA(Linker DNA，LD) 和金纳米颗粒(AuNPs)；其中，所述金纳米颗粒表面连接有发夹DNA(H1、 H3)和连接链LD；H2与所述连接链LD具有互补杂交的区域，形成发夹结构 H2-LD。
所述发夹结构H1具有与miR-21结合的粘性末端，并且与miR-21结合后即 打开发夹结构H1；
打开后的发夹结构H1裸露的单链部分能够与发夹结构H2互补结合，并打 开发夹结构H2；
打开后的发夹结构H2裸露的单链部分能够与发夹结构H3互补结合，进而 将miR-21取代下来。
其中，所述金纳米颗粒与发夹结构DNA和连接链DNA的连接方式具体可 以为Au-S键连接。
具体的，
所述发夹结构H1具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
所述发夹结构H2具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述发夹结构H3具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
所述连接链LD具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明的第二个方面，提供一种支化DNA功能组装体，所述支化DNA功 能组装体通过向上述DNA-AuNPs结构单体施加miR-21后自组装获得。
所述miR-21具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
所述支化DNA功能组装体还含有特异性识别目的基因VEGF的siRNA，所 述siRNA是发夹结构H2和发夹结构H3在自组装过程中原位生成。
本发明的第三个方面，提供一种系统，所述系统包含如下(1)或(2)：
(1)上述DNA-AuNPs结构单体和光照装置；
(2)上述支化DNA功能组装体和光照装置。
其中，所述光照装置发射光源为近红外光源，具体的，所述光源波长为660 nm，金纳米颗粒经近红外光源辐照后，实现光能向热能的转换，从而使得肿瘤 局部温度升高至50℃左右，从而利用光热效应杀死肿瘤细胞。
本发明的第四个方面，提供上述DNA-AuNPs结构单体、支化DNA功能组 装体和/或系统在如下任意一种或多种中的应用：
(a)生物传感和/或制备生物传感器；
(b)抑制细胞生长和/或杀死细胞；
(c)肿瘤治疗和/或制备肿瘤治疗产品；
(d)肿瘤治疗评估和/或制备肿瘤治疗评估产品。
本发明的第五个方面，提供一种抑制肿瘤细胞生长和/或杀死肿瘤细胞的方 法，所述方法包括向肿瘤细胞施加上述DNA-AuNPs结构单体和/或系统。
本发明的第六个方面，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括：向受试者 施加上述DNA-AuNPs结构单体和/或系统。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案利用动态DNA自组装技术构建DNA纳米机器，由肿瘤细胞 内过表达的miR-21引发纳米金聚集，同时原位生成siRNA，特异性抑制VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达，实现癌症(如宫颈癌)的光热-基因联合治疗，弥 补单一治疗的局限性，极大提高肿瘤的治疗效果，在临床领域具有潜在的应用价 值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明 的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例中光热-基因联合治疗宫颈癌的实验原理图。
图2是本发明实施例中聚丙烯酰胺凝胶电泳表征miR-21引发的发夹组装过 程。泳道1-4分别为H1、H2、H3、H2-LD，泳道5为I+H1，泳道6为 I+H1+H2-LD+H3，泳道7为H1+H2-LD+H3。
图3是本发明实施例中紫外-可见吸收光谱表征图。
图4是本发明实施例中透射电镜表征图。
图5是本发明实施例中实时荧光图谱，加入不同浓度miR-21后DNA-AuNPS 随时间的荧光变化。
图6是本发明实施例中CCK8实验结果。误差棒表示±SD(n＝3),***表示 P＜0.001。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。 除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普 通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限 制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出， 否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使 用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件 和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常 按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有 完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和 条件，或按照制造厂商所建议的条件。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并 不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件， 或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明， 均可通过商业途径购买得到。
如前所述，近年来，基因治疗、光学治疗等方法已广泛应用于癌症治疗，与 传统治疗方法相比，具有靶向性高、副作用小等优点，但也存在一定的局限性， 如：体外合成siRNA生物稳定性差、易在递送过程中降解等。
有鉴于此，本发明基于DNA自组装技术，设计三种DNA发夹结构(H1、 H2和H3)。H1和H3通过修饰巯基(-SH)连接到纳米金(AuNPs)表面，H2 通过巯基修饰的连接链DNA(LD)互补杂交连接到AuNPs表面，从而制得 DNA-AuNPs结构单体。该DNA-AuNPs通过内吞方式进入人宫颈癌细胞(HeLa 细胞)，细胞内过表达的microRNA-21(miR-21或I)作为引发剂和催化剂，引 发DNA-AuNPs发生自组装反应，最终生成支化DNA功能组装体，导致AuNPs 聚集，在特定近红外光源(660nm)照射下，实现光能向热能的转换，使肿瘤细 胞局部温度升至50℃左右，从而利用光热效应杀死肿瘤细胞。此外，H2和H3 在组装过程中原位生成siRNA，能够特异性抑制血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA和VEGF蛋白的表达，从而抑制细胞生 长，实现对宫颈癌的基因治疗。该方法通过HeLa细胞内过表达的miR-21原位 生成siRNA，克服了体外合成siRNA存在的生物稳定性差、易降解等问题。
因此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种DNA-AuNPs结构单体， 所述DNA-AuNPs结构单体其至少包括三个发夹结构DNA，一个连接链DNA和 金纳米颗粒(AuNPs)；其中，所述金纳米颗粒表面连接有发夹结构H1、发夹结 构H3和连接链LD；发夹结构H2与所述连接链LD具有互补杂交的区域，形成 发夹结构H2-LD。
所述发夹结构H1具有与miR-21结合的粘性末端，并且与miR-21结合后即 打开发夹结构；
打开后的发夹结构H1裸露的单链部分能够与发夹结构H2互补结合，并打 开发夹结构H2；
打开后的发夹结构H2裸露的单链部分能够与发夹结构H3互补结合，进而 将miR-21取代下来。
其中，所述金纳米颗粒与发夹结构DNA和连接链DNA的连接方式具体可 以为Au-S键连接。
本发明的又一具体实施方式中，
所述发夹结构H1具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
所述发夹结构H2具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述发夹结构H3具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
所述连接链LD具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明的又一具体实施方式中，为方便实时监控反应动力学过程，所述发夹 结构DNA(如发夹结构H3)可修饰有荧光基团。
本发明的又一具体实施方式中，所述发夹结构H3近3’端或3’端修饰有 荧光基团。本发明对荧光基团不做具体限定，所述荧光基团包括但不限于FAM、 ROX和VIC。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种支化DNA功能组装体，所述支化 DNA功能组装体通过向上述DNA-AuNPs结构单体施加miR-21后自组装获得。
所述miR-21具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
本发明的又一具体实施方式中，所述支化DNA功能组装体还含有特异性识 别目的基因VEGF的siRNA，所述siRNA是在发夹结构H2和发夹结构H3在 自组装过程中原位生成。
本发明的又一具体实施方式中，所述siRNA包含如SEQ ID NO.6-7所示的 核苷酸序列，其能够特异性抑制制血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA和VEGF蛋白的表达，从而抑制细胞生长。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种系统，所述系统包含如下(1)或 (2)：
(1)上述DNA-AuNPs结构单体和光照装置；
(2)上述支化DNA功能组装体和光照装置。
其中，所述光照装置发射光源为近红外光源，具体的，所述光源波长为660 nm，金纳米颗粒经近红外光源辐照后，实现光能向热能的转换，从而使得肿瘤 局部温度升高至50℃左右，从而利用光热效应杀死肿瘤细胞。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述DNA-AuNPs结构单体、支化DNA 功能组装体和/或系统在如下任意一种或多种中的应用：
(a)生物传感和/或制备生物传感器；
(b)抑制细胞生长和/或杀死细胞；
(c)肿瘤治疗和/或制备肿瘤治疗产品；
(d)肿瘤治疗评估和/或制备肿瘤治疗评估产品。
其中，所述(b)中，所述细胞为可以肿瘤细胞。miR-21在众多肿瘤细胞、 组织中过表达，如宫颈癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、脑胶质瘤、 肺癌和前列腺癌等，且临床试验证明miR-21的表达水平与肿瘤的临床分期，转 移、预后存在密切关系，因此其已成为癌症基因治疗的重要靶点。
而本申请则是通过合理设计miR-21响应的DNA-AuNPs组装单体，因此可 靶向肿瘤细胞，由肿瘤细胞内过表达的miR-21引发纳米金聚集，同时原位生成 siRNA，特异性抑制VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达，实现癌症的光热-基因 联合治疗。
因此，所述(c)和(d)中，所述肿瘤包括但不限于宫颈癌、乳腺癌、胃癌、 结直肠癌、肝癌、胰腺癌、脑胶质瘤、肺癌和前列腺癌。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种抑制肿瘤细胞生长和/或杀死肿瘤 细胞的方法，所述方法包括向肿瘤细胞施加上述DNA-AuNPs结构单体和/或系 统。
具体的，所述方法包括：向肿瘤细胞施加上述DNA-AuNPs结构单体，并施 加近红外光源(如660nm)照射。
所述肿瘤细胞包括但不限于宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌 细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、脑胶质瘤细胞、肺癌细胞和前列腺癌细胞。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括： 向受试者施加上述DNA-AuNPs结构单体和/或系统。
具体的，所述方法包括：向受试者施加上述DNA-AuNPs结构单体，并施加 近红外光源(如660nm)照射。
所述肿瘤包括但不限于宫颈癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、 脑胶质瘤、肺癌和前列腺癌。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应 理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用核 苷酸序列见下表1。
表1所用到的核酸序列
Figure BDA0003227487640000071
Figure BDA0003227487640000081
实施例
实验原理：
本发明实验原理如图1所示，该体系由三种DNA发夹结构(H1、H2和H3)、 连接链DNA(LD)和AuNPs组成。其中，H1、H3和LD通过Au-S键连接到 AuNPs表面；随后，H2与LD互补杂交，得到DNA-AuNPs单体结构。制备 DNA-AuNPs通过内吞作用进入HeLa细胞内，HeLa细胞中高表达的miR-21作 为引发链与H1的粘性末端结合，进而打开H1的发夹结构；H1裸露的单链部分与相邻DNA-AuNPs结构中的H2互补杂交，进而打开H2的发夹结构。同理， 打开的H2与另一个DNA-AuNPs单体结构中的H3互补结合，进而将miR-21取 代下来，使其作为催化剂，引发新一轮的组装反应。经过一系列催化发夹组装后， 最终生成包含多个三叉DNA结构的功能组装体。在组装过程中，AuNPs发生聚 集，在近红外光源(660nm)照射下，将光能转换成热能，使细胞局部温度升高 至50℃左右，利用光热效应杀死肿瘤细胞，从而实现光热治疗。此外，H2和 H3在组装过程中原位生成siRNA，特异性识别目的基因VEGF，从而抑制VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达，进而抑制肿瘤细胞生长，实现基因治疗。因此， 本发明提出了一种基于DNA动态自组装的纳米机器，实现原位合成siRNA，提 高了siRNA的稳定性，通过将基因治疗与光热治疗相结合，实现了宫颈癌的联 合治疗。
实验部分：
1、DNA发夹结构预处理
将DNA干粉分别离心(11000r/min，5min)，加入相应体积的超纯水配成 浓度为10- 4mol/L的DNA母液。使用前，采用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA-2Na，12.5mM MgCl2，pH8.0)将DNA母液稀释至所需浓度，并进行退 火处理，以形成稳定的发夹结构。退火后的DNA溶液放置于4℃备用。退火条 件：95℃持续10min，温度逐渐降至25℃稳定4h。
2、纳米金(AuNPs)的制备
将40mg氯金酸(HAuCL4)溶于100mL超纯水中，将溶液转移至250mL 三口烧瓶中进行磁力搅拌和油浴加热。当溶液沸腾时，快速加入柠檬酸三钠溶液 (10mL水中溶解114mg柠檬酸三钠)，继续加热回流40分钟，得到酒红色溶 液。然后将溶液自然冷却至室温，转移至干净的玻璃容器中，避光放置于4℃保 存备用，AuNPs浓度为15nM。
3、DNA-AuNPs结构单体的合成
用TE缓冲液将发夹DNA(H1、H2、H3)母液稀释为50μM，进行退火处 理。将等量的H2与LD在37℃下孵育2h，使H2与LD互补杂交形成稳定的 杂交体H2-LD。将等量的H1、H2-LD、H3与TCEP(10mM)混匀(nDNA:nTCEP＝1:100)，室温孵育1.5h。向微量离心管中加入AuNPs和TCEP处理过的DNA 混合液(nAuNPs:nDNA＝1:200)，混匀后静置16h，然后加入浓度为3M的NaCl 溶液，使NaCl的终浓度为0.3M，静置24h后离心洗涤2次(11000r/min，10min)。
4、支化DNA功能组装体的制备
取适量DNA-AuNPs单体，向其加入不同浓度的miR-21，37℃反应4h。
5、聚丙烯酰胺凝胶电泳
向烧杯中依次加入2.7mL 30％丙烯酰胺凝胶溶液、6.2mL超纯水，1mL 10× TAE缓冲液，90μL 10％过硫酸铵(APS)和10μL N’N’N’N’-四甲基乙二胺 (TEMED)，混匀后灌入到制胶板中，室温下静置30min后，将凝胶转移到电 泳槽。然后，取10μL样品与2μL 10×Loading buffer混合，将混合物加入到泳 道中，在170V电压下运行5min，110V运行40min。用4S Red Plus核酸染色 剂避光染色30min后显影。
6、荧光动力学研究
向DNA-AuNPs中分别加入等量不同浓度的miR-21，采用实时荧光监测组 装过程的动力学。
7、细胞培养
HeLa细胞生长于DMEM(含10％FBS)培养基中，置于37℃培养箱(含 有5％CO2)中培养。当细胞密度长至培养皿底部面积的90％左右时，进行传代 处理。细胞使用前均用细胞计数板计数。
8、Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验
将HeLa细胞接种在96孔板(5×103个/孔，100μL/孔)中，共6组，每 组6个复孔，培养24h后，分别加入PBS、AuNPs、Lipo3000、Lipo-siRNA、 Lipo-H1/H2/H3、DNA-AuNPs，其中siRNA的终浓度为200nM。放置培养箱中 孵育48h，用660nm激光照射5min。移除培养液后，用PBS洗2次，随后向 每孔加入100μL无血清培养基(含10％CCK8试剂)孵育0.5h，用酶标仪测定 450nm处的吸光度值。
实验结果
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对发夹H1、H2-LD、H3的组装过程进行表征。结 果如图2所示，泳道1-3分别为H1、H2和H3；泳道4为H2-LD杂交体；泳道 5为向H1溶液中加入引发链miR-21后的反应产物，与泳道1相比，泳道5生成 分子量较大的条带，证明miR-21成功与H1杂交，生成I-H1杂交体；泳道6为 向H1、H2-LD、H3体系中加入引发链miR-21后的反应产物，可明显观察到大 分子量的新条带；泳道7为H1、H2-LD和H3的混合物，在没有引发链miR-21存在时，泳道7中条带的位置和泳道1-3条带的位置基本一致，并没有新条带的 生成，证明miR-21作为引发链能够特异性引发发夹组装反应。
利用紫外-可见吸收光谱表征DNA-AuNPs的制备及其组装过程。如图3所 示，AuNPs在520nm处出现特征吸收峰；DNA-AuNPS在260nm(DNA特征吸 收峰)和520nm(AuNPs特征吸收峰)处有吸收峰，证明发夹DNA通过Au-S 共价键连接到AuNPs表面，成功制备得到DNA-AuNPs单体；加入引发链miR-21 后，紫外-可见吸收峰红移，在650nm出现明显的吸收峰，表明miR-21成功引 发DNA-AuNPs组装，导致AuNPs聚集。进一步采用TEM进行表征，结果表明， AuNPs的平均粒径约为14nm(图4a)，连接发夹DNA后粒径均匀，分散性良 好(图4b)；加入引发链miR-21后，AuNPs发生明显聚集(图4c)，证明了miR-21 成功引发DNA-AuNPs的组装反应。
采用实时荧光监测该组装反应的动力学过程。在H3的3'端修饰荧光基团 (FAM)，将三种DNA发夹连接到AuNPs上，由于荧光基团距离AuNPs较近， 因此荧光被AuNPs猝灭。miR-21引发DNA-AuNPs组装后，H3的发夹结构被打 开，增加了荧光基团和AuNPs之间的距离，荧光恢复。实验结果如图5所示， 在没有引发链miR-21时，荧光强度随时间无变化。加入引发链miR-21后，荧 光强度随时间延长逐渐增大，并且随引发链浓度增大，反应速率显著提高，证明 引发链浓度增大能够引发更多的组装反应，生成大量的DNA功能组装体。
进一步采用CCK-8分析法研究DNA-AuNPs对HeLa细胞的影响。向6组 HeLa细胞中分别加入PBS、AuNPs、Lipo3000、Lipo-siRNA、Lipo-H1/H2/H3、 DNA-AuNPs，孵育48h后进行激光照射(660nm)，测试细胞存活率。结果如 图6所示，当细胞用AuNPs处理时，细胞存活率为96.22％，证明AuNPs具有 良好的生物相容性，对细胞基本没有毒性；与直接转染siRNA相比(Lipo-siRNA 组，79.88％)，原位生成siRNA(Lipo-H1/H2/H3组)可降低细胞存活率至66.38％； 采用DNA-AuNPs处理HeLa后，细胞存活率仅为28.78％，表明将光热治疗与基 因治疗联合，可极大提高对肿瘤细胞的杀伤作用，降低肿瘤细胞的存活率。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本 发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员 来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分 技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同 替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛大学附属医院
<120> 一种光热-基因联合治疗癌症的DNA-AuNPs结构单体、系统、方法及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> H1
<400> 1
atcagactga tgttgacagg accgcgacga tctcatctca acatcagtct gataagcta 59
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> H2
<400> 2
gatctcatca gggtactcct agcttgatga gatcgtcgcg gtcctgtcaa cat 53
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> H3
<400> 3
agggtactcc tagcttatca gactgatgtt gaaagctagg aguacccuga ugagauc 57
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> LD
<400> 4
caggaccgcg ac 12
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> miR-21
<400> 5
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> VEGF-siRNA sense
<400> 6
ggaguacccu gaugagauc 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> VEGF-siRNA antisense
<400> 7
gaucucauca ggguacucc 19

Claims (6)

1.一种DNA-AuNPs结构单体，其特征在于，所述DNA-AuNPs结构单体由三个发夹结构DNA，一个连接链DNA和金纳米颗粒组成；其中，所述金纳米颗粒表面连接有发夹结构H1、发夹结构H3和连接链LD；发夹结构H2与所述连接链LD具有互补杂交的区域，形成发夹结构H2-LD；
所述发夹结构H1为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
所述发夹结构H2为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述发夹结构H3为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述连接链LD为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述发夹结构H3修饰有荧光基团；
所述发夹结构H3近 3’ 端或 3’ 端修饰有荧光基团；所述荧光基团选自FAM、ROX 和VIC。
2.如权利要求1所述的DNA-AuNPs结构单体，其特征在于，所述发夹结构H1具有与miR-21结合的粘性末端，并且与miR-21结合后即打开发夹结构；
打开后的发夹结构H1裸露的单链部分能够与发夹结构H2互补结合，并打开发夹结构H2；
打开后的发夹结构H2裸露的单链部分能够与发夹结构H3互补结合，进而将miR-21取代下来；
所述金纳米颗粒与发夹结构DNA和连接链DNA的连接方式具体为Au-S键连接。
3.一种支化DNA功能组装体，其特征在于，所述支化DNA功能组装体通过向权利要求1-2任一项所述DNA-AuNPs结构单体施加miR-21后自组装获得；
所述miR-21为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
所述支化DNA功能组装体还含有特异性识别目的基因VEGF 的siRNA，所述siRNA是在发夹结构H2和发夹结构H3在自组装过程中原位生成；
所述siRNA为SEQ ID NO.6-7所示的核苷酸序列。
4.一种系统，其特征在于，所述系统包含如下（1）或（2）：
（1）权利要求1-2任一项所述DNA-AuNPs结构单体和光照装置；
（2）权利要求3所述支化DNA功能组装体和光照装置。
5.如权利要求4所述系统，其特征在于，所述光照装置发射光源为近红外光源，所述光源波长为660 nm。
6.权利要求1-2任一项所述DNA-AuNPs结构单体、权利要求3所述支化DNA功能组装体和/或权利要求4或5所述系统在如下任意一种或多种中的应用：
（a）制备生物传感器；
（b）制备肿瘤治疗产品；
（c）制备肿瘤治疗评估产品；
所述肿瘤为宫颈癌。
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