CN108486104B - 基于dna-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针及应用 - Google Patents
基于dna-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108486104B CN108486104B CN201810332674.XA CN201810332674A CN108486104B CN 108486104 B CN108486104 B CN 108486104B CN 201810332674 A CN201810332674 A CN 201810332674A CN 108486104 B CN108486104 B CN 108486104B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- dsdna
- fluorescent probe
- cancer cells
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 44
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 41
- 239000004332 silver Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims description 10
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 101100444898 Mus musculus Egr1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 44
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- WNAHIZMDSQCWRP-UHFFFAOYSA-N dodecane-1-thiol Chemical compound CCCCCCCCCCCCS WNAHIZMDSQCWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 4
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(I) nitrate Inorganic materials [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 claims 6
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 claims 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 8
- -1 sulfhydryl compound Chemical class 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- BISQARIGQVGOKL-UHFFFAOYSA-N O1CCCC1.C(CCCCCCCCCCC)S Chemical compound O1CCCC1.C(CCCCCCCCCCC)S BISQARIGQVGOKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 101150099493 STAT3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000013228 adenopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QZPSXPBJTPJTSZ-UHFFFAOYSA-N aqua regia Chemical compound Cl.O[N+]([O-])=O QZPSXPBJTPJTSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012984 biological imaging Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004993 emission spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004630 mental health Effects 0.000 description 1
- 108091029118 miR-548c stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000000637 radiosensitizating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于双链DNA‑银纳米簇(dsDNA‑AgNCs)检测并治疗乳腺癌细胞的靶向荧光探针，该荧光探针形状结构为囊泡结构，该囊泡能够特异性识别并进入到癌细胞内，与乳腺癌细胞内的早期生长反应基因(Early growth response gene‑1,Egr‑1)互补配对并剪切掉Egr‑1，阻止癌细胞的表达，同时释放出荧光基团，从而达到对癌细胞的成像及治疗作用。该荧光探针制作简单、成本低廉、使用方便，可用于乳腺癌细胞的快速检测及成像，在医学上具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感技术领域，具体地说，涉及一种基于DNA-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针及应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织下属的国际癌症研究所(IARC)发布的2012年全球癌症报告(Globocan 2012)数据显示：全球每年新发乳腺癌病例约167.1万，每年约52.2万死于乳腺癌[Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Globalcancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65(2):87-108.]。乳腺癌变通常发生在乳房腺上皮组织,影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。从发展趋势来看，20世纪以来乳腺癌的发病率在全世界各国均是上升趋势[De Santis，Ma J，Bryan L，et al.Breast cancer statistics，2013[J].CA Cancer J Clin，2014，64(1):52-62.]。乳腺癌为激素依赖性肿瘤，内源性激素在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用。MCF-7乳腺癌细胞(Michigan Cancer Foundation-7)，是Herbert Soule and co-workers在1973年在密歇根癌症基金会(Michigan Cancer Foundation)建立的，MCF-7细胞保留了多个分化了的乳腺上皮的特性，包括能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成圆形复合物，因此抑制了MCF-7细胞的生长，从而控制乳腺癌。近年来，针对乳腺癌患病年龄呈现年轻化趋势，因此，寻找新的方法用来预防、检测和治疗乳腺癌是不可或缺的。
目前，检测和治疗乳腺癌的方法有很多，也有很多专家学者进行了对乳腺癌多方面的研究，传统的治疗方法是以手术为主，放疗、化疗、内分泌治疗相结合的综合治疗模式。新兴的治疗方法有：基因转染技术[侯冷晨，孔祥杰，李佳，等.miR-548c-5p对乳腺癌细胞MCF-7的影响.同济大学报(医学版).2013，34(4):20.]、RNAi干扰技术[赵树鹏，朱培，齐凤杰.siRNA抑制STAT3基因对人乳腺癌细胞的影响.广东医学.2010，31(12):1520.]、siRNA靶向抑制MCF-7乳腺癌细胞VEGF的表达技术[王海燕，葛银林.应用siRNA技术探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的VEGF对树突状细胞的影响.中国生物化学与分子生物学报.2009，25(4):358.]，蛋白因子抑制技术[梅玫，任玉，周旋，等.反义miR-221/222上调p27kip1对MCF-7乳腺癌细胞系的放射增敏作用.中华乳腺病杂志.2009，3(6):622-632.]，阻断DNA聚合酶θ表达[李学孝，吴爱国，胡斌，等.DNA聚合酶θ表达对MCF-7乳腺癌细胞系体外增殖和早期凋亡的影响.中华乳腺病杂志.2011，5(5):564-575.]，阻断CXCR4启动子表达[李晓霞，王宝利，姚智.CXCR4启动子的克隆及在MCF-7乳腺癌细胞中的特异转录活性.中国现代医学杂志.2009，19(7):992.]等方法。然而新兴的治疗方法有的需要昂贵的精密仪器、复杂的样品制备流程和熟练的操作人员，有的还停留在科研实验上，在很大程度上限制了其应用。传统的方法往往会给病人带来很大的痛苦[Chari R V,Miller M L,Widdison WC.Angew.Chem.Int.Edit.,2014,53(15):3796-3827]，如对药物的抗药性及过敏反应的发生，放疗仪器治疗方法无论在身体上还是精神上都给病人带来了极大的痛苦。作为非常便携的荧光探针是七十年代发展起来的一类新型的生物传感器，与传统方法相比，由于其具有成本低、操作简单且易小型化等优点，受到了许多研究学者的青睐。而且，DNA-银纳米簇(DNA-silver nanocluster)是近年来新兴的一种生物分析细胞成像技术，在结构和性能上具有荧光的特性，逐渐成为生物成像研究领域的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种制作简单、成本低廉、使用方便、灵敏度高的基于DNA-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针及应用。
本发明的构思如下：本发明提供的荧光探针主要包括两个部分，一部分是aptamerDNA，另一部分是RNA cleaving DNAzyme 1，RNA cleaving DNAzyme 1的5′端标记有荧光基团FAM。aptamer DNA和RNA cleaving DNAzyme 1有一部分是互补配对的，并且这部分是富含胞嘧啶的结构，这种结构有利于银纳米簇的生长。由于银纳米簇与巯基化合物有较好的结合作用，本发明利用一端亲水另一端亲油的十二烷基硫醇与银纳米簇结合，从而形成一个类似囊泡的结构。该囊泡能够特异性识别并进入癌细胞，与癌细胞中的Egr-1基因互补配对并剪切掉Egr-1，同时释放出荧光基团，从而达到对癌细胞的成像及治疗作用。
为了实现本发明目的，本发明基于DNA-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针，所述荧光探针按如下方法制备：
1)合成单链DNA1，DNA1的核酸序列如下：
5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGGAGGAGTTGGGGGAGCACATT-3’(SEQ ID NO:1)
DNA1的设计特征在于其由两个部分组成，分别有不同的功能。第一个部分是适配体部分，其功能是防止链内互补和特异性识别乳腺癌细胞，第二部分是银簇链，其作用是用于和DNA2链进行杂交，形成双链DNA银纳米簇；其中，GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG是aptamer DNA序列，其作用是特异性识别乳腺癌细胞；
2)合成单链DNA2，DNA2的核酸序列如下：
5’FAM-CCGCGGCCAGGCTAGCTACAACGACCTGGACGATAATGTGCTCCCC CAACTCCTC-3’(SEQID NO:2)
DNA2的设计特征在于其由两个部分组成，分别有不同的功能，第一部分是颈环部分，其是乳腺癌细胞MCF-7的酶链，它能够识别剪切掉癌细胞中的Egr-1，阻止癌细胞的表达；第二个部分是银簇链，用于和DNA1进行杂交互补配对，形成双链DNA-银纳米簇；其中，CCGCGGCCAGGCTAGCTACAACGACCTGGACGAT是Egr-1的酶链，其作用是在特定的条件下识别并剪切Egr-1；
上述单链DNA1中GAGGAGTTGGGGGAGCACATT与单链DNA2中AATGTGCTCCCCCAACTCCTC为反向互补配对的序列，其作用是用来合成银纳米簇；
3)合成dsDNA：将单链DNA1与单链DNA2杂交得到dsDNA；
4)合成dsDNA-AgNCs：以dsDNA为模板，加入AgNO3溶液和NaBH4溶液，反应得到dsDNA-AgNCs；
5)合成DNA-银纳米簇：将上述dsDNA-AgNCs与十二烷基硫醇混合，自组装成囊泡结构的DNA-银纳米簇，即为可用于检测癌细胞的靶向荧光探针。
本发明所述的癌细胞为乳腺癌细胞。
本发明提供的基于DNA-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针，其制备过程及靶向作用癌细胞的原理如图1所示。该荧光探针形状结构为囊泡结构，该囊泡结构由三个部分组成，一部分是含有核酸适配体的单链DNA链aptamer DNA(DNA1)(1)，另一部分是含有核酶RNA cleaving DNAzyme 1的单链DNA链(DNA2)(2)，第三部分是结合了烷基硫醇化合物的纳米银簇。DNA1的5’端无标记，DNA2的5’端标记有荧光基团(FAM)。DNA1和DNA2有一部分是互补配对的，并且配对这部分是富含胞嘧啶的结构，这种结构有利于银纳米簇的生长，因此能形成dsDNA-AgNCs(3)，而且可以猝灭DNA2 5’端的荧光基团。由于银纳米簇与巯基化合物(4)有较好的结合作用，本发明利用了一端亲水一端亲油的烷基硫醇化合物与银纳米簇1:1结合(5)，亲水部分相互聚集自组装形成囊泡结构(6)。该囊泡能够特异性识别并进入到癌细胞内(7)，与乳腺癌细胞内的早期生长反应基因(Early growth response gene-1,简写成Egr-1)互补配对并剪切断Egr-1，阻止癌细胞基团的表达，同时释放FAM的荧光，从而达到对癌细胞的成像及治疗作用(8)。
本发明的荧光探针可按如下方法制备：
S1、dsDNA溶液的制备：用磷酸盐缓冲液分别溶解单链DNA1和单链DNA2，配制成100μM的单链DNA1溶液和100μM的单链DNA2溶液，然后取10μL 100μM DNA1溶液和10μL 100μMDNA2溶液混合，暗处杂交反应1h，得到50μM dsDNA溶液；
S2、dsDNA-AgNCs溶液的制备：将4μL 50μM dsDNA溶液与93.6μL磷酸盐缓冲液混合，然后加入1.2μL 1000μM AgNO3溶液，室温下避光孵育15min，然后迅速加入1.2μL 1000μM NaBH4溶液，搅拌混合后，于暗处室温反应60min，得到dsDNA-AgNCs溶液；
S3、DNA-银纳米簇的制备：将上述dsDNA-AgNCs溶液于4℃，10，000rpm离心40分钟，弃掉上层溶液，向余下的20μL dsDNA-AgNCs溶液中加入0.2mM十二烷基硫醇的四氢呋喃溶液500μL，搅拌过夜；
所得混合液经2次离心，以除去磷酸盐和过量的十二烷基硫醇化合物，再用500μL磷酸盐缓冲液分散，自组装得到囊泡结构的DNA-银纳米簇；离心的条件为4℃，14,000rpm离心40分钟。
本发明中，磷酸盐缓冲液的配方为20mmol/L Na2HPO4+20mmol/L NaH2PO4+1.0mmol/L Mg(CH3COO)2，pH 7.0。
本发明中配制溶液所用水均为灭菌超纯水(电阻率18.25MΩ·cm)，所用的移液枪枪头均经过高温灭菌处理。
本发明还提供所述荧光探针的以下任一种应用：
1)制备癌细胞显像剂、诊断试剂及治疗药物中的应用；
2)制备Egr-1基因抑制分子中的应用。
本发明还提供由所述荧光探针制备的Egr-1基因抑制分子。
本发明进一步提供一种用于检测和治疗乳腺癌MCF-7的方法，包括银离子浓度的控制，PBS缓冲液的配制，十二烷基硫醇浓度的控制，仪器设备参数的设置以及所述荧光探针的设计和制备。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过合成DNA-银纳米簇，并修饰上一端亲水另一端亲油的十二烷基硫醇，从而形成囊泡结构作为荧光探针。该囊泡能够特异性识别并进入癌细胞，与癌细胞中的Egr-1互补配对并剪切掉Egr-1，阻止癌细胞的表达，同时释放出荧光基团，从而达到对癌细胞的成像及治疗作用。该荧光探针制作简单、成本低廉、使用方便，可用于癌细胞的快速检测及成像，在医学上具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明荧光探针的制备过程及靶向作用癌细胞的原理。其中，(1)DNA1(含aptamer)；(2)DNA2(含RNA cleaving DNAzyme 1)；(3)dsDNA-AgNCs；(4)dsDNA-AgNCs和烷基硫醇化合物反应；(5)组成囊泡结构的单体；(6)囊泡；(7)囊泡特异性识别癌细胞表面的膜蛋白；(8)囊泡与癌细胞中的Egr-1互补配对并切断Egr-1，阻止癌细胞基因的表达，同时释放出荧光基团。
图2为本发明实施例2中DNA-银纳米簇囊泡动态光散射图。
图3为本发明实施例2中DNA-银纳米簇囊泡检测正常乳腺细胞(上)和MCF-7细胞(下)内Egr-1mRNA得到的共聚焦扫描显微镜图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1基于DNA-银纳米簇检测乳腺癌细胞的靶向荧光探针的制备方法
1、设计可特异识别乳腺癌细胞表面抗原的aptamer DNA，并进一步合成单链DNA1，单链DNA1的核苷酸序列为5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGGAGGAGTTGGGGGAGCACATT-3’。
2、单链DNA2的合成，单链DNA2的核苷酸序列为5’FAM-CCGCGGCCAGGCTAGCTACAACGACCTGGACGATAATGTGCTCCCCCAA CTCCTC-3’。
3、dsDNA溶液的制备：用磷酸盐缓冲液分别溶解单链DNA1和单链DNA2，配制成100μM的单链DNA1溶液和100μM的单链DNA2溶液，然后取10μL 100μM DNA1溶液和10μL 100μMDNA2溶液混合，暗处杂交反应1h，得到dsDNA溶液。
4、dsDNA-AgNCs溶液的制备：将4μL 50μM dsDNA溶液与93.6μL磷酸盐缓冲液混合，然后加入1.2μL 1000μM AgNO3溶液，室温下避光孵育15min，然后迅速加入1.2μL 1000μMNaBH4溶液，搅拌混合后，于暗处室温反应60min，得到dsDNA-AgNCs溶液。
5、DNA-银纳米簇的制备：将上述dsDNA-AgNCs溶液于4℃，10,000rpm离心40分钟，弃掉上层溶液，向余下的20μL dsDNA-AgNCs溶液中加入0.2mM十二烷基硫醇的四氢呋喃溶液500μL，置于磁力搅拌器上搅拌过夜，离心(14,000rpm，4℃，40分钟)两次以除去磷酸盐和过量的烷基硫醇化合物，再用200μL磷酸缓冲液(PBS)分散，自组装得DNA-银纳米簇囊泡溶液，即纳米探针溶液。
实施例2DNA-银纳米簇荧光探针的效果实验
1、细胞培养：
将HeLa细胞(6000个细胞用于DNA-银纳米簇囊泡细胞内吞实验)接种到96孔微量培养板上并补充有10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素(青霉素/链霉素)的Dulbecco修饰的必需培养基)，在5％CO2，37℃孵箱中培养24h。
2、感应耦合等离子发射光谱分析(ICPES)测定DNA-银纳米簇囊泡的细胞摄取水平
将DNA-银纳米簇囊泡溶液在HEPES缓冲液(200μL，基于单个颗粒的90nM)中与Opti-MEM(2mL)混合，并将混合物加入到6孔板的各孔中，随后孵育2h。用磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次后，用500μL胰蛋白酶/EDTA胰蛋白酶消化细胞5分钟，计数细胞。通过离心沉淀细胞，除去上清液。细胞和纳米颗粒用1L王水溶解。孵育1h后，用6mL去离子水稀释溶液，通过ICPES测定溶液中银原子的浓度。动态光散射实验结果表明，平均每个囊泡直径约为30nm(图2)。
3、细胞成像
先将MCF-7细胞在DMEM中培育24小时，然后将细胞与实施例1制备的纳米探针dsDNA-AgNCs充分混合，每100个细胞添加1mL探针溶液，在37℃5％CO2孵箱中培养60分钟，然后用新鲜配制的DMEM洗涤上述细胞3遍。最后，纳米探针进入MCF-7细胞中并在DMEM培养媒介中保持3小时。然后用PBS洗细胞3遍。然后用聚焦激光扫描显微镜测量细胞的荧光信号。DNA2用FAM标记，在490nm激发波长下有绿色的荧光，DNA1用Cy5标记，在633nm的激发波长下有红色的荧光。MCF-7细胞与纳米探针培育作为实验组，不与纳米探针孵育作为对照组。
从共聚焦荧光显微镜成像图(图3)中可以看到MCF-7中的Egr-1mRNA的分布情况，并在120分钟内观测到该肿瘤细胞的凋亡。
实验结果表明，纳米荧光探针孵育的正常乳腺细胞在495nm激发波长下没有荧光，用纳米荧光探针孵育的MCF-7细胞在495nm激发波长下有荧光，发射波长分别为520nm，说明了纳米探针能够识别MCF-7细胞，并且能够剪切掉MCF-7细胞中的Egr-1，从而阻止MCF-7细胞基因的表达，达到对MCF-7细胞的成像及治疗目的。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 长沙理工大学
<120> 基于DNA-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针及应用
<130> KHP171117334.8
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgggagg agttggggga gcacatt 47
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgcggccag gctagctaca acgacctgga cgataatgtg ctcccccaac tcctc 55
Claims (6)
1.基于DNA-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针，其特征在于，所述荧光探针按如下方法制备：
1)合成单链DNA1，DNA1的核酸序列如下：
5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGGAGGAGTTGGGGGAGCACATT-3’
2)合成单链DNA2，DNA2的核酸序列如下：
5’FAM-CCGCGGCCAGGCTAGCTACAACGACCTGGACGATAATGTGCTCCCCCAACTCCTC-3’
3)合成dsDNA：将单链DNA1与单链DNA2杂交得到dsDNA；
4)合成dsDNA-AgNCs：以dsDNA为模板，加入AgNO3溶液和NaBH4溶液，反应得到dsDNA-AgNCs；
5)合成DNA-银纳米簇：将上述dsDNA-AgNCs与十二烷基硫醇混合，自组装成囊泡结构的DNA-银纳米簇，即为可用于检测癌细胞的靶向荧光探针。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述癌细胞为乳腺癌细胞。
3.权利要求1或2所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、dsDNA溶液的制备：用磷酸盐缓冲液分别溶解单链DNA1和单链DNA2，配制成100μM的单链DNA1溶液和100μM的单链DNA2溶液，然后取10μL 100μM DNA1溶液和10μL 100μM DNA2溶液混合，暗处杂交反应1h，得到50μM dsDNA溶液；
S2、dsDNA-AgNCs溶液的制备：将4μL 50μM dsDNA溶液与93.6μL磷酸盐缓冲液混合，然后加入1.2μL 1000μM AgNO3溶液，室温下避光孵育15min，然后迅速加入1.2μL 1000μMNaBH4溶液，搅拌混合后，于暗处室温反应60min，得到dsDNA-AgNCs溶液；
S3、DNA-银纳米簇的制备：将上述dsDNA-AgNCs溶液于4℃，10，000rpm离心40分钟，弃掉上层溶液，向余下的20μL dsDNA-AgNCs溶液中加入0.2mM十二烷基硫醇的四氢呋喃溶液500μL，搅拌过夜；
所得混合液经2次离心，以除去磷酸盐和过量的十二烷基硫醇化合物，再用500μL磷酸盐缓冲液分散，自组装得到囊泡结构的DNA-银纳米簇；离心的条件为4℃，14,000rpm离心40分钟；
其中，所述磷酸盐缓冲液的配方为20mmol/L Na2HPO4+20mmol/L NaH2PO4+1.0mmol/L Mg(CH3COO)2，pH 7.0。
4.权利要求1或2所述荧光探针的以下任一种应用：
1)制备癌细胞显像剂或诊断试剂中的应用；
2)制备Egr-1基因抑制分子中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述癌为乳腺癌。
6.由权利要求1或2所述荧光探针制备的Egr-1基因抑制分子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810332674.XA CN108486104B (zh) | 2018-04-13 | 2018-04-13 | 基于dna-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810332674.XA CN108486104B (zh) | 2018-04-13 | 2018-04-13 | 基于dna-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108486104A CN108486104A (zh) | 2018-09-04 |
| CN108486104B true CN108486104B (zh) | 2021-02-19 |
Family
ID=63315880
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810332674.XA Expired - Fee Related CN108486104B (zh) | 2018-04-13 | 2018-04-13 | 基于dna-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108486104B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110702911B (zh) * | 2019-10-23 | 2022-04-08 | 南通大学 | 一种银纳米团簇印迹聚合物对肿瘤标志物的靶向检测方法 |
| CN113960003B (zh) * | 2021-10-20 | 2023-10-24 | 吉林大学 | 基于dna银纳米簇和金纳米棒检测四环素的适配体传感器 |
| CN114164257B (zh) * | 2021-11-23 | 2023-09-01 | 北京工业大学 | 一种基于dna-银纳米团簇探针定量rna剪接变异体的检测方法及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106957895A (zh) * | 2016-01-11 | 2017-07-18 | 清华大学 | 一种dna银纳米簇检测单碱基错配位置的方法及其试剂盒 |
| CN106970229A (zh) * | 2017-01-25 | 2017-07-21 | 南京医科大学 | 一种基于dna‑银纳米簇分子信标与核酸外切酶iii循环信号放大的转录因子检测方法 |
| CN107245524A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-10-13 | 南京邮电大学 | 一种用于特异性识别dna序列的纳米探针及其应用方法 |
-
2018
- 2018-04-13 CN CN201810332674.XA patent/CN108486104B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106957895A (zh) * | 2016-01-11 | 2017-07-18 | 清华大学 | 一种dna银纳米簇检测单碱基错配位置的方法及其试剂盒 |
| CN106970229A (zh) * | 2017-01-25 | 2017-07-21 | 南京医科大学 | 一种基于dna‑银纳米簇分子信标与核酸外切酶iii循环信号放大的转录因子检测方法 |
| CN107245524A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-10-13 | 南京邮电大学 | 一种用于特异性识别dna序列的纳米探针及其应用方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Detection of large deletion in human BRCA1 gene in human breast carcinoma MCF-7 cells by using DNA-Silver Nanoclusters;Borghei YS等;《METHODS AND APPLICATIONS IN FLUORESCENCE》;20190131;第6卷(第1期);第1-12页 * |
| 寡聚核苷酸保护的银纳米簇的生成及其在生物成像中的应用;嘎鲁;《安徽农业科学》;20131231;第41卷(第1期);第30-32页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108486104A (zh) | 2018-09-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yue et al. | An enzyme-free molecular catalytic device: dynamically self-assembled DNA dendrimers for in situ imaging of microRNAs in live cells | |
| He et al. | A smart ZnO@ polydopamine-nucleic acid nanosystem for ultrasensitive live cell mRNA imaging by the target-triggered intracellular self-assembly of active DNAzyme nanostructures | |
| Wang et al. | Aqueous phase synthesis of highly luminescent, nitrogen-doped carbon dots and their application as bioimaging agents | |
| CN107469088B (zh) | 一种基于dna折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用 | |
| CN108486104B (zh) | 基于dna-银纳米簇检测癌细胞的靶向荧光探针及应用 | |
| Liu et al. | A Graphene-enhanced imaging of microRNA with enzyme-free signal amplification of catalyzed hairpin assembly in living cells | |
| CN106947811B (zh) | 一种检测miRNAs-21的方法、探针组及试剂盒 | |
| Ding et al. | Diagnostic applications of gastric carcinoma cell aptamers in vitro and in vivo | |
| Geng et al. | Cellular delivery of quantum dot-bound hybridization probe for detection of intracellular pre-microRNA using chitosan/poly (γ-glutamic acid) complex as a carrier | |
| Zhang et al. | Plasmonic biosensor for the highly sensitive detection of microRNA-21 via the chemical etching of gold nanorods under a dark-field microscope | |
| Mao et al. | Cubic DNA nanocage-based three-dimensional molecular beacon for accurate detection of exosomal miRNAs in confined spaces | |
| Zhu et al. | Poly-adenine-mediated fluorescent spherical nucleic acid probes for live-cell imaging of endogenous tumor-related mRNA | |
| CN111118004A (zh) | 一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针及其应用 | |
| Chen et al. | A cancer cell membrane vesicle-packaged DNA nanomachine for intracellular microRNA imaging | |
| CN104878100A (zh) | 长链非编码rna afap1-as1在制备肺癌辅助诊断和预后判断制剂上的应用 | |
| CN106884016A (zh) | 长链非编码rnalinc00472的表达载体、抑瘤试剂及其应用 | |
| Song et al. | A cell-anchored and self-calibrated DNA nanoplatform for in situ imaging and quantification of endogenous microRNA in live cells: introducing two controls to normalize the sensing signals | |
| Sun et al. | In situ detection of exosomal RNAs for cancer diagnosis | |
| CN107190005B (zh) | lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用 | |
| CN108265055A (zh) | 特异性结合人乳腺癌细胞mcf-7的dna核酸适配体及其应用 | |
| Wang et al. | Rational design of a HA-AuNPs@ AIED nanoassembly for activatable fluorescence detection of HAase and imaging in tumor cells | |
| CN111413303A (zh) | 一种熵驱动的dna纳米回路及其应用 | |
| Dong et al. | Cruciate DNA probes for amplified multiplexed imaging of microRNAs in living cells | |
| CN112159813B (zh) | 特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体及其用途 | |
| CN109295133B (zh) | 一种基于非线性杂交链式扩增的适配体-dna高分子聚合物的构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210219 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |