CN114164257B - 一种基于dna-银纳米团簇探针定量rna剪接变异体的检测方法及应用 - Google Patents

一种基于dna-银纳米团簇探针定量rna剪接变异体的检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种基于DNA‑银纳米团簇探针定量RNA剪接变异体的检测方法及应用，涉及核酸检测领域，该探针能够特异性识别并进入到细胞中，与细胞中的RNA剪接变异体互补配对，同时对该RNA剪接变异体标记荧光。利用该探针精确分子式的性质，通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱仪(LA‑ICP‑MS)上实现对单细胞RNA剪接变异体的定量分析。本发明的RNA剪接变异体的检测方法具有免标记，无酶，操作简单，灵敏度高的优点，可用于血液、体液、细胞、组织切片等临床样本RNA剪接变异体的快速检测及成像，在解释细胞功能多样性、理解免疫反应和辅助临床监测等方面具有广阔的前景。

Description

一种基于DNA-银纳米团簇探针定量RNA剪接变异体的检测方 法及应用
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体为一种基于DNA-银纳米团簇探针定量RNA剪接变异体的检测方法及应用。
背景技术
RNA选择性剪接是生物体基因表达的基本调控机制，它允许从单个基因中通过多种不同的剪切拼接组合产生多个mRNA剪接变异体亚型，是促成转录组表达复杂多样、决定细胞命运以及机体发育方向的关键步骤。据全基因组研究数据估计，95％人类基因都会经历选择性剪接过程，RNA剪接异常会导致细胞功能障碍及癌症、神经退役性和自身免疫性等疾病发生。由于RNA剪接过程调控以及细胞的性状、行为都反应在RNA剪接变异体表达的基础上，对RNA剪接产物的定量和表征是研究RNA剪接与转录功能以及人类疾病之间精确关联的最有力工具。特别的，单细胞之间的RNA剪接变异体差异是导致基因表达异质性的一个主要因素，它在免疫系统中发挥重要作用，RNA剪接变异体在免疫应答过程中发生演化形成多种不同功能，有效对抗丰富多变的病原体。然而，对于RNA剪接变异体差异性表达的作用，如单细胞表达水平、空间定位、细胞异质性以及与免疫炎症反应调控关系的研究尚不清楚。因此，在单细胞水平上实现对RNA剪接变异体的原位成像及表达水平精准分析，对理解单细胞剪接调控、细胞异质行为、免疫等疾病发生机理等具有非常重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提出一种基于DNA-银纳米团簇探针定量RNA剪接变异体的检测方法及其应用，本发明的基于DNA-银纳米团簇探针能够特异性识别并进入到细胞中，与细胞中的RNA剪接变异体互补配对，同时对该RNA剪接变异体标记荧光。利用该探针精确分子式的性质，通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱仪(LA-ICP-MS)上实现对单细胞RNA剪接变异体的定量分析。
本发明的检测方法包括以下步骤：
(1)以直链DNA为模板，加入硝酸银溶液，混合搅拌后加入硼氢化钠，使其还原生成DNA-银纳米团簇，生成荧光；
(2)将构建的DNA-银纳米团簇探针导入细胞中，靶向RNA剪接变异体，在激光共聚焦显微镜成像下在原位观察RNA剪接变异体；
(3)通过利用激光消蚀电感耦合等离子质谱(LA-ICP-MS)定量单细胞内的银原子浓度，然后通过定量公式及标准曲线得到单细胞内RNA剪接变异体的表达量。
本发明设计的DNA是一种带有特定结构的寡核苷酸分子，分别包含富含胞嘧啶碱基的结合银原子/离子区以及核酸靶向区，其序列(5’-3’)为：CCCCCCCCGCATATGCCCAATGCTGG。
本发明所述DNA-银纳米团簇探针的DNA终浓度为10-250μM，硝酸银的终浓度为40-1500μM，硼氢化钠的终浓度为20-500μM。
本发明所述DNA的加入量为10-1000μL，硝酸银的加入量为50-5000μL，硼氢化钠的加入量为50-6000μL。
本发明所述DNA-银纳米团簇探针的反应温度为0-6℃，反应时间为1-24小时。
本发明所述细胞为免疫细胞小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7，所述RNA剪接变异体为RNA剪接变异体亚型MyD88S。
本发明的RNA剪接变异体的检测方法具有免标记，无酶，操作简单，灵敏度高的优点，可用于血液、体液、细胞、组织切片等临床样本RNA剪接变异体的快速检测及成像，在解释细胞功能多样性、理解免疫反应和辅助临床监测等方面具有广阔的前景，有助力于精准医学的研究。
附图说明
图1为本发明(Ag)7(DNA)1银纳米团簇的合成示意图
图2为本发明实施例1的(Ag)7(DNA)1银纳米团簇的紫外吸收及荧光光谱图
图3为本发明实施例1的(Ag)7(DNA)1银纳米团簇的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)图
图4为本发明实施例1的(Ag)7(DNA)1银纳米团簇的DLS粒径分布图
图5为本发明实施例2的(Ag)7(DNA)1银纳米团簇的共聚焦成像图
图6为本发明实施例3的(Ag)7(DNA)1银纳米团簇的激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)信号图
图7为本发明实施例3的(Ag)7(DNA)1银纳米团簇的激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)标准曲线图
具体实施方式
下述实施例为便于更好地理解本发明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，不能理解为对本发明保护范围的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除特殊说明，实施例中各实验材料、试剂及设备均可通过常规购买渠道所得。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：DNA合成精确分子数银纳米团簇(Ag)7(DNA)1的制备
以下的25μM单链DNA、AgNO3(150μM)、NaBH4(50μM)均表示终浓度。
将序列为CCCCCCCCGCATATGCCCAATGCTGG的25μM单链DNA和AgNO3(150μM)分别溶解在去离子水中。随后将NaBH4(50μM)加入溶液中以在4℃下搅拌6小时以还原AgNO3。通过离心过滤器(Millipore，30kDa和3kDa MWCO膜)分离和纯化合成的银纳米团簇(Ag)7(DNA)1，以切断聚集的纳米团簇、游离离子。然后通过HPLC系统(Agilent 1260Infinity，美国)在260nm的吸收来纯化和收集银纳米团簇(Ag)7(DNA)1。银纳米团簇(Ag)7(DNA)1溶液在进一步使用前在4℃下避光储存。合成的银纳米团簇(Ag)7(DNA)1在可见光下呈现出淡黄色，在紫外光下呈现出绿色的荧光。
如图2所示，单纯的DNA样品在267nm有一个很强的吸收峰，银纳米团簇(Ag)7(DNA)1在267nm没有吸收峰，银纳米团簇(Ag)7(DNA)1在262nm和400nm有强吸收峰，说明成功合成了银纳米团簇。另外，因为(Ag)7(DNA)1形成，它显示出良好的荧光特征。图2所示的荧光光谱图显示，(Ag)7(DNA)1的最佳荧光激发峰是466nm，最佳荧光发射峰在547nm。
如图3所示，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的结果显示，一条DNA链上结合了7个银原子(m/z＝8574)，可以得出银纳米团簇的组成为(Ag)7(DNA)1。
如图4所示，(Ag)7(DNA)1采用DLS测定的水合粒径大约为2.4nm。
实施例2：(Ag)7(DNA)1在RAW264.7细胞上的激光共聚焦显微镜定位研究
将RAW 264.7细胞接种在共聚焦培养皿上，在37℃下孵育24小时。然后，用PBS洗涤细胞并用4％多聚甲醛固定15分钟，用PBS清洗。用0.5％Triton X-100处理5分钟，然后用PBS洗涤。(Ag)7(DNA)1与目标mRNA剪接变体MyD88S的杂交在20μL的体积中进行，其中包含2μL 20×柠檬酸钠缓冲液(SSC)，2μL(Ag)7(DNA)1探针(20μM)、1μL DTT(100mM)、2μL酵母转运RNA(10mg mL-1)、2μL 10ngμL-1鲑鱼精子DNA和0.5μL RiboLock RNase抑制剂(40UμL-1)在37℃下孵育60分钟。然后在室温下使用PBS-T(含有0.05％Tween-20的DEPC-PBS)洗涤样品3分钟后进行成像。最后，使用UltraVIEW Vox(PerkinElmer)共聚焦激光扫描系统附件和带有60×1.4数值孔径平面复消色差油浸透镜的Nikon Ti-e显微镜对细胞进行成像。结果如图5所示，在共聚焦显微镜成像下，(Ag)7(DNA)1探针在RAW 264.7细胞原位有很好的成像效果，绿色荧光即为细胞内原位的RNA剪接变异体MyD88S。
实施例3：通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱仪(LA-ICP-MS)在单个RAW 264.7细胞上对MyD88S进行定量分析。
使用NWR 213激光烧蚀系统和NexION 300D ICP-MS仪器(PerkinElmer,Norwalk,CT,USA)进行LA-ICP-MS测量。氦气用作烧蚀气体。氦气的流速为0.6L min-1。细胞消融后，通过Y形件注入氩气。在NIST 612玻璃烧蚀过程中，115In信号强度被调至最大值，并将UO/U比值保持在较低水平。将信号强度记录为时间的函数(每秒计数(CPS))。我们在盖玻片上接种RAW 264.7细胞(2×104)。用(Au)6(DNA)1探针孵育细胞60分钟。为了完全消融单个细胞，在对应于细胞的位置消融直径为35μm的区域。选择点的直径以确保单元的边界被完全覆盖，并且与相邻单元没有重叠。如图6所示，单个信号强度峰即为单个细胞原位的RNA剪接变异体MyD88S。

Claims (1)

1.一种基于DNA-银纳米团簇探针定量RNA剪接变异体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
以直链DNA为模板，加入硝酸银溶液，混合搅拌后加入硼氢化钠，使其还原生成DNA-银纳米团簇，生成荧光；
直链DNA是一种带有特定结构的寡核苷酸分子，分别包含富含胞嘧啶碱基的结合银原子/离子区以及核酸靶向区，其序列5’-3’为：CCCCCCCCGCATATGCCCAATGCTGG；所述DNA-银纳米团簇探针的DNA终浓度为10-250μM，硝酸银的终浓度为40-1500μM，硼氢化钠的终浓度为20-500μM；还原反应温度为0-6℃，反应时间为1-24小时；
将构建的DNA-银纳米团簇探针导入细胞中，靶向RNA剪接变异体，在激光共聚焦显微镜成像下在原位观察RNA剪接变异体；
通过利用激光消蚀电感耦合等离子质谱LA-ICP-MS定量单细胞内的银原子浓度，然后通过标准曲线及定量公式得到单细胞内RNA剪接变异体的表达量；
所述细胞为免疫细胞小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7，所述RNA剪接变异体为RNA剪接变异体亚型MyD88S。
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