CN106148517A - 一种基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法，其是在活性端粒酶存在时，其底物的延长产物能够与辅助DNA进行杂交，释放多个引发DNA，引发DNA能够引发发夹DNA探针H1和H2发生自组装链替代反应，在H1:H2的两个末端分别形成G‑四链体，氯化血红素(hemin)与G‑四链体作用，形成具有催化活性的G‑四链体DNA酶，催化TMB‑H2O2体系发生反应，溶液颜色由无色变为蓝色，在加入酸时溶液被氧化为黄色，活性端粒酶的加入，会使溶液颜色发生变化，实现端粒酶活性的可视化检测，同时还可以测定溶液的紫外吸收光谱，更准确，灵敏的测定端粒酶的活性。

Description

一种基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法
技术领域
本发明属于肿瘤活性检测技术领域，具体涉及一种基于链替代反应增强催化酶作用实现简单、快速利用比色方法检测癌细胞中端粒酶活性的方法。
背景技术
端粒是存在于真核细胞线性染色体末端的一段由端粒DNA和端粒结合蛋白组成的特殊结构，端粒DNA主要包含由几千个碱基组成的富G的双链部分和富G的3’悬突末端，它像一顶高帽子置于染色体头上，被称作生命时钟。正常细胞每复制一次，端粒就会缩短50-200bp的碱基，当端粒缩短到一定程度时，染色体不稳定，细胞就会趋于衰老。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，主要由RNA模板(hTR)催化亚基(hTERT)和端粒酶相关蛋白(hTEP)组成。端粒酶能以自身的RNA为模板在染色体的末端合成端粒DNA重复序列，保持端粒长度，使细胞具有无限增殖的特性。研究表明在85％-90％的肿瘤细胞中，端粒酶活性上调表达，与细胞的恶性转化及持续分裂增殖有密切关系。因此，端粒酶被认为是一种广谱的癌症标志物，灵敏可靠地检测端粒酶活性对于肿瘤的诊断、治疗以及预后评估都有很重要的意义。(ShayJ.W.,Wright W.E.Telomerase therapeutics for cancer:challenges and newdirections[J].Nat.Rev.Drug Discov.2006,5:577–584.)。
在已报道的端粒酶活性检测的方法中经典的方法是基于聚合酶链式反应(PCR)的端粒重复序列扩增法(TRAP)(Piatyszek,M.；Kim,N.；Weinrich,S.；Hiyama,K.；Hiyama,E.Wright,W.；Shay,J.Detection of telomerase activity in human cells and tumorsby a telomeric repeat amplification protocol(TRAP)[J].Methods Cell Sci.1995,17:1-15.)。该方法主要过程为：选取一段合成的特定的非端粒重复序列的寡核苷酸DNA序列作为端粒酶引物TS，当样本提取物中存在活性端粒酶时，引物TS被延长产生端粒重复序列。端粒酶延长产物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增技术使延长产物的浓度增大，再通过凝胶电泳进行结果对PCR结果进行表征。从而确定细胞提取物中的端粒酶活性。该方法是通过PCR放大技术对延长产物扩增，使延长产物的浓度指数倍的增加， 与之前的端粒重复序列延伸法相比，该方法的样品用量减少，实验所需时间缩短，污染较小。但是该方法仍然存在操作过程繁琐复杂，条件摸索困难，费时费力，同时需要用到多种试剂等缺点，这些都很容易使实验结果中出现假性信号，导致实验结果不是很可靠。为了克服这些缺点，许多研究工作者试图发展无需PCR辅助，同时能够灵敏检测端粒酶活性的检测技术。
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)是一种无色的物质，在过氧化氢(H2O2)存在时，辣根过氧化物酶能够催化使TMB被氧化成TMB+离子，溶液的颜色由无色变为蓝色，当加入硫酸(H2SO4)溶液时，TMB+离子被氧化为TMB3+离子，溶液的颜色变为黄色，反应终止。
辣根过氧化物酶来源于辣根，是一种生物酶，具有很强的催化酶活性。但是由于生物酶易受温度，pH等的影响，使用条件较为苛刻。而氯高铁血红素(hemin)与G-四链体作用形成的G-四链体DNA酶具有辣根过氧化物酶的活性，能够催化TMB，H2O2体系的颜色发生变化。
基于此，本发明结合了链替代反应可循环产生大量的G-四链体DNA酶的作用，提供了一种可视化检测端粒酶活性的方法。
发明内容
为了克服现有技术中成本较高、操作复杂、步骤繁琐、实用性不强等缺陷，本发明提供了一种基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法，无需通过聚合酶链式反应就能够可视化灵敏检测端粒酶活性，并且操作简单、快速。
本发明实现上述目的所采用的技术方案是由以下步骤组成：
(1)待检细胞裂解提取端粒酶，将所提取的端粒酶提取液与端粒酶底物一起加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中，30～37℃孵育0.5～2小时，得到待检液体系；
(2)用浓度为50mmol/L、pH＝7.0且含5mmol/L MgCl2的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液将发夹DNA探针H1、发夹DNA探针H2和单链A-DNA、单链T-DNA分别稀释至浓度为20μmol/L，制得H1溶液、H2溶液、A-DNA溶液以及T-DNA溶液，将H1溶液和H2溶液置于离心管中，水浴加热到80～90℃保持5～10分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备 用；
(3)将步骤(2)配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液，将其置于离心管中，水浴加热到80～90℃保持5～10分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用；
(4)向浓度为50mmol/L、pH＝7.4且含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液、H2溶液和步骤(3)制得的AT-DNA溶液，使最终100μL的混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30～37℃孵育30～60分钟；
(5)向与步骤(4)等量的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入步骤(1)的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液、H2溶液以及步骤(3)制得的AT-DNA溶液，使最终的100μL混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30～37℃孵育30～60分钟；
(6)向步骤(4)和步骤(5)的混合体系中分别加入浓度为1μmol/L的氯化血红素溶液和浓度为0.5mol/L的KCl溶液，室温孵育10～15分钟；
(7)用浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液和0.2mol/L Na2HPO4配制pH为5.2的柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液，将浓度为1.0mg/mL的TMB底物液和柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液以及体积浓度为30％H2O2按照体积比100：900：1新鲜配制成TMB显色液，向步骤(6)的两个混合体系中分别加入TMB显色液，室温下反应30～40分钟，再分别加入2mol/L的H2SO4溶液，目测观察两个混合体系的颜色变化，若步骤(5)对应的混合体系的颜色比步骤(4)对应的混合体系的颜色更深，则步骤(5)加入的待检细胞有活性端粒酶；否则，待检细胞中无活性端粒酶，从而完成待检细胞中端粒酶的检测。
上述步骤(4)中端粒酶重复序列扩增缓冲溶液与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的体积比为1:3.8～4.2。
上述步骤(5)中待检液的添加量与步骤(4)的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液的添加量相等。
上述氯化血红素溶液和KCl溶液与待检液的体积比为2:1:20。
本发明的基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法是基于链替代反应循环产生的G-四链体DNA酶增强催化作用，构建了一种可视化检测端粒酶活性的新策略，当存在活性端粒酶时，端粒酶通过其持续合成能力在端粒酶引物TS的3’末端合成TTAGGG重复序列，形成一条长的DNA单链，这条长的DNA单链能够与许多A-DNA杂交，释放出多个引发DNA链T-DNA，T-DNA能够引发发夹H1的和H2的自组装反应，形成许多末端含有的两个G-四链体的H1：H2复合物，G-四链体与Hemin作用形成具有辣根过氧物酶催化作用的G-四链体DNA酶，能催化四甲基联苯胺(TMB)被H2O2氧化，生成TMB+，溶液由无色变为蓝色，加入酸终止反应，溶液的颜色由蓝色变化为黄色，可以通过溶液颜色的变化，实现端粒酶活性的可视化检测，同时还可以测定溶液的紫外吸收光谱，更准确，灵敏地测定端粒酶的活性。该方法能够测定不同种类细胞中的端粒酶活性表达水平的高低，为临床医学肿瘤的诊断，治疗，预后评估以及关于疾病机理研究提供了新思路，该方法不需要任何仪器就能简单、快速、可靠的实现端粒酶活性的目视检测，在以端粒酶为靶点的的癌症的治疗诊断方面有很重要的意义。
附图说明
图1为加入活性海拉细胞(HeLa)端粒酶延长产物与时溶液的紫外吸收光谱图，内附图为对应的溶液颜色变化图。
图2为加入活性人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)端粒酶延长产物与时溶液的紫外吸收光谱图，内附图为对应的溶液颜色变化图。
图3为加入失活海拉细胞(HeLa)提取物时溶液的紫外吸收光谱图。
图4为加入正常细胞(HL-7702)提取物时溶液紫外吸收光谱图，内附图为对应的溶液颜色变化图。
图5加入不同数目海拉细胞(HeLa)端粒酶的延长产物时溶液颜色变化的结果。
具体实施方式
现结合实施例和实验数据、附图对本发明的技术方案进行进一步说明， 但是本发明不仅限于下述的实施情形。
实施例1
以检测海拉(HeLa)细胞中的端粒酶为例，本实施例的检测方法由以下步骤实现：
(1)按照常规方法将养好的HeLa细胞裂解提取端粒酶，向20μL的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中加入0.4μL浓度为10μmol/L的端粒酶底物TS(序列为：AAT CCG TCG AGCAGA GTT)和500个海拉细胞所对应的端粒酶提取液，37℃孵育1小时，得到待检液体系。
(2)用浓度为50mmol/L、pH＝7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(含5mmol/LMgCl2)将发夹DNA探针H1(序列为5’-GGGATGGGTTAGGGCGGGAATCAGAGGGCGGGATGGGGATTCCCGCCCTAACCCTAACTC-3’)、发夹DNA探针H2(序列为5’-GGGTTGGGCGGGATGGGGATTAGGGTTAGGGCGGGAATCCCCATCCCGCCCTCTGA-3’)和单链A-DNA(5’-AACCCTAACCCTAACCCTAACTCTGCTC-3’)、单链T-DNA(序列为5’-GAGTTAGGGTTAGGGCGGGAATC)分别稀释至浓度为20μmol/L，制得H1溶液、H2溶液、A-DNA溶液以及T-DNA溶液，将H1溶液和H2溶液置于1.5mL离心管中，水浴加热到90℃保持5分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
(3)将步骤(2)配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液，将其置于1.5mL离心管中，水浴加热到90℃保持5分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
(4)向80μ浓度为50mmol/L、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(其中含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl)中加入20μL端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)H1溶液0.75μL、H2溶液1μL和步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.5μL，使最终100μL的混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，37℃孵育30分钟。
(5)向与步骤(4)等量的浓度为50mmol/L、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(其中含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl)中加入20μL 步骤(1)的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液0.75μL、H2溶液1μL以及步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.5μL，使最终的100μL混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，37℃孵育30分钟。
(6)向步骤(4)和步骤(5)的混合体系中分别加入2μL 1μmol/L的氯化血红素(hemin)溶液和1μL 0.5mol/L的KCl溶液，室温孵育10分钟；
(7)用浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液和0.2mol/L Na2HPO4配制pH为5.2的柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液，取100μL浓度为1.0mg/mL的TMB底物液(乙醇溶解)与900μL柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液以及1μL体积浓度为30％的H2O2混合，新鲜配制成TMB显色液，并各取30μL，分别加入步骤(6)添加了氯化血红素溶液和KCl溶液的两个混合体系中，在室温下反应30分钟，再分别加入40μL 2mol/L的H2SO4溶液，观察两个混合体系的颜色变化，若步骤(5)对应的混合体系的颜色比步骤(4)对应的混合体系的黄色更深，则步骤(5)加入的海拉细胞(Hela)中的端粒酶活性上调表达，即具有活性端粒酶；否则，拉细胞(Hela)中无活性端粒酶。
本实施例的步骤(5)对应的混合体系的颜色较深，即海拉细胞(Hela)中的端粒酶活性上调表达。
为了进一步验证本发明的比色结果是否可靠，利用佳能相机记录步骤(5)和步骤(4)各自对应的溶液颜色变化，在观察两个混合体系的颜色变化的同时利用紫外可见分光光度计测定其各自对应的吸光度值，参见图1中a线为空白体系对应的吸光度变化，b线为待检体系对应的吸光度变化，由图1可知，在相同波长的可见光范围内，b线在a线的上方，即待检体系对应的吸光度值大于空白体系的吸光度值，与本发明的比色法检测的结果一致，说明本实施例的海拉细胞(Hela)中的端粒酶活性上调表达，也同时说明本发明的比色法检测结果准确。
上述的端粒重复序列扩增缓冲中包含有20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，pH＝8.3，1.5mmol/L MgC12，1mmol/L EGTA，63mmol/L KCl，0.05％Tween 20，0.2mmol/LdNTPs，0.1mg/mL BSA。(Wang J.S.，Wu L.,Ren J.S.,and Qu X.G.[J].Visualizing HumanTelomerase Activity with Primer-Modified Au Nanoparticles.Small.2012,8(2):259-264)。
实施例2
以检测人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)中端粒酶为例，本实施例的检测方法由以下步骤实现：
(1)按照常规方法将养好的人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)裂解提取端粒酶，向20μL的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中加入0.4μL浓度为10μmol/L的端粒酶底物TS和500个人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)对应的活性端粒酶提取液，30℃孵育2小时，得到待检液体系。
(2)用浓度为50mmol/L、pH＝7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(含5mmol/LMgCl2)将发夹DNA探针H1(序列为5’-GGGATGGGTTAGGGCGGGAATCAGAGGGCGGGATGGGGATTCCCGCCCTAACCCTAACTC-3’)、发夹DNA探针H2(序列为5’-GGGTTGGGCGGGATGGGGATTAGGGTTAGGGCGGGAATCCCCATCCCGCCCTCTGA-3’)和单链A-DNA(序列为5’-AA CCCTAACCCTAACCCTAACTCTGCTC-3’)、单链T-DNA(序列为5’-GAGTTAGGG TTAGGGCGGGAATC)分别稀释至浓度为20μmol/L，制得H1溶液、H2溶液、A-DNA溶液以及T-DNA溶液，将H1溶液和H2溶液置于1.5mL离心管中，水浴加热到80℃保持10分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
(3)将步骤(2)配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液，将其置于1.5mL离心管中，水浴加热到80℃保持10分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
(4)向76μL的浓度为50mmol/L、pH＝7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(其中含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl)中加入20μL端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)H1溶液0.75μL、H2溶液1.0μL和步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.5μL，使最终混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30℃孵育60分钟。
(5)向与步骤(4)等量的浓度为50mmol/L、pH＝7.4的三羟甲基氨基 甲烷-盐酸缓冲溶液中加入20μL步骤(1)的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液0.75μL、H2溶液1.0μL以及步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.5μL，使最终的100μL混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30℃孵育60分钟。
(6)向步骤(4)和步骤(5)的混合体系中分别加入2μL 1μmol/L的氯化血红素(hemin)溶液和1μL 0.5mol/L的KCl溶液，室温孵育15分钟。
(7)用浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液和0.2mol/L Na2HPO4配制pH为5.2的柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液，取100μL浓度为1.0mg/mL的TMB底物液(乙醇溶解)与900μL柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液以及1μL体积浓度为30％的H2O2混合，新鲜配制成TMB显色液，并各取30μL，分别加入步骤(6)添加了氯化血红素溶液和KCl溶液的两个混合体系中，在室温下反应40分钟，再分别加入40μL 2mol/L的H2SO4溶液，观察两个混合体系的颜色变化，利用佳能相机记录步骤(5)和步骤(4)各自对应的溶液颜色变化，本实施例的步骤(5)对应的混合体系的颜色较深，即人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)中的端粒酶活性上调表达。
为了进一步验证本发明的比色结果是否可靠，利用佳能相机记录步骤(5)和步骤(4)各自对应的溶液颜色变化，在观察两个混合体系的颜色变化的同时利用紫外可见分光光度计测定其各自对应的吸光度值，参见图2中a线为空白体系对应的吸光度变化，b线为待检体系对应的吸光度变化，从图2结果可以看出，在没有延长产物存在时，溶液吸光度值较低(如图2中a线)，在有人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)对应的端粒酶延长产物时，溶液吸光度值增加(如图2中b线)，说明人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞中含有活性端粒酶，是肿瘤细胞，与本发明的比色法检测的结果一致，进一步说明本发明的比色法检测结果准确。
实施例3
以检测肺癌细胞(SCLC)中端粒酶为例，本实施例的检测方法由以下步骤实现：
(1)按照常规方法将养好的肺癌细胞(SCLC)裂解提取端粒酶，向20μL的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中加入0.4μL浓度为10μmol/L的端粒酶底物 TS和500个肺癌细胞(SCLC)对应的活性端粒酶提取液，35℃孵育0.5小时，得到待检液体系。
(2)用浓度为50mmol/L、pH＝7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(含5mmol/LMgCl2)将发夹DNA探针H1(序列为5’-GGGATGGGTTAGGGCGGGAATCAGAGGGCGGGATGGGGATTCCCGCCCTAACCCTAACTC-3’)、发夹DNA探针H2(序列为5’-GGGTTGGGCGGGATGGGGATTAGGGTTAGGGCGGGAATCCCCATCCCGCCCTCTGA-3’)和单链A-DNA(序列为5’-AA CCCTAACCCTAACCCTAACTCTGCTC-3’)、单链T-DNA(序列为5’-GAGTTAGGG TTAGGGCGGGAATC)分别稀释至浓度为20μmol/L，制得H1溶液、H2溶液、A-DNA溶液以及T-DNA溶液，将H1溶液和H2溶液置于1.5mL离心管中，水浴加热到85℃保持8分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
(3)将步骤(2)配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液，将其置于1.5mL离心管中，水浴加热到85℃保持8分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
(4)向76μL的浓度为50mmol/L、pH＝7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(其中含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl)中加入20μL端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)H1溶液0.75μL、H2溶液1.0μL和步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.5μL，使最终混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，35℃孵育40分钟。
(5)向与步骤(4)等量的浓度为50mmol/L、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入20μL步骤(1)的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液0.75μL、H2溶液1.0μL以及步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.5μL，使最终的100μL混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，35℃孵育50分钟。
(6)向步骤(4)和步骤(5)的混合体系中分别加入2μL 1μmol/L的氯化血红素(hemin)溶液和1μL 0.5mol/L的KCl溶液，室温孵育12分钟。
(7)用浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液和0.2mol/L Na2HPO4配制pH为 5.2的柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液，取100μL浓度为1.0mg/mL的TMB底物液(乙醇溶解)与900μL柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液以及1μL体积浓度为30％的H2O2混合，新鲜配制成TMB显色液，并各取30μL，分别加入步骤(6)添加了氯化血红素溶液和KCl溶液的两个混合体系中，在室温下反应35分钟，再分别加入40μL 2mol/L的H2SO4溶液，观察两个混合体系的颜色变化，利用佳能相机记录步骤(5)和步骤(4)各自对应的溶液颜色变化，本实施例的步骤(5)对应的混合体系的颜色较深，即肺癌细胞(SCLC)中的端粒酶活性上调表达。
上述实施例中所制得的H1、H2、AT-DNA溶液还可以在4℃以下、-80℃以上的任意温度保存，不仅限于上述实施例的温度条件。在步骤(1)中还可以加入肝癌细胞、乳腺癌细胞等作为待检细胞按照上述实施例的方法进行端粒酶活性的测定。
为了验证本发明的有益效果，申请人进行了大量的对比实验验证，具体可参见下述的实验：
1、荧光强度对照
按照实施例1的方法制得H1溶液、H2溶液以及AT-DNA溶液，将实施例1的荧光信号变化与对比例1、2进行对比，其中，
对比例1：向步骤(1)的待检液体系中加入失活海拉细胞(HeLa)端粒酶；
对比例2：向步骤(1)的待检液体系中加入正常细胞提取的端粒酶；
将其分别按照实施例1的方法进行检测，结果分别如图3、4所示。
由图3、4的对比结果可以看出，加入失活的端粒酶或者无活性端粒酶的正常细胞提取物，溶液的吸光度值几乎没有变化，而本发明实施例1在加入活性端粒酶和端粒酶底物时，溶液的吸光度值明显增加。说明存在活性端粒酶时，会引起溶液的颜色发生变化，使溶液吸光度值增加。
2、灵敏度验证
按照实施例1的方法观察加入不同个数海拉细胞(Hela)对应的端粒酶延长产物时溶液的颜色变化，结果如图5所示。
从图5的结果可以看出，随着海拉(HeLa)细胞数目的逐渐增加，溶液的黄色逐渐加深，并且在加入相当于10个海拉(HeLa)细胞对应的端粒酶延 长产物时，溶液的黄色有明显变化，说明本发明的方法可以灵敏的实现端粒酶活性的可视化检测。

Claims (4)

1.一种基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法，其特征在于由以下步骤组成：
(1)待检细胞裂解提取端粒酶，将所提取的端粒酶提取液与端粒酶底物一起加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中，30～37℃孵育0.5～2小时，得到待检液体系；
(2)用浓度为50mmol/L、pH＝7.0且含5mmol/L MgCl2的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液将发夹DNA探针H1、发夹DNA探针H2和单链A-DNA、单链T-DNA分别稀释至浓度为20μmol/L，制得H1溶液、H2溶液、A-DNA溶液以及T-DNA溶液，将H1溶液和H2溶液置于离心管中，水浴加热到80～90℃保持5～10分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用；
(3)将步骤(2)配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液，将其置于离心管中，水浴加热到80～90℃保持5～10分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用；
(4)向浓度为50mmol/L、pH＝7.4且含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液、H2溶液和步骤(3)制得的AT-DNA溶液，使最终100μL的混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30～37℃孵育30～60分钟；
(5)向与步骤(4)等量的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入步骤(1)的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液、H2溶液以及步骤(3)制得的AT-DNA溶液，使最终的100μL混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30～37℃孵育30～60分钟；
(6)向步骤(4)和步骤(5)的混合体系中分别加入浓度为1μmol/L的氯化血红素溶液和浓度为0.5mol/L的KCl溶液，室温孵育10～15分钟；
(7)用浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液和0.2mol/L Na2HPO4配制pH为5.2的柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液，将浓度为1.0mg/mL的TMB底物液和柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液以及体积浓度为30％H2O2按照体积比100：900：1新鲜配制成TMB显色液，向步骤(6)的两个混合体系中分别加入TMB显色液，室温下反应30～40分钟，再分别加入2mol/L的H2SO4溶液，目测观察两个混合体系的颜色变化，若步骤(5)对应的混合体系的颜色比步骤(4)对应的混合体系的颜色更深，则步骤(5)加入的待检细胞有活性端粒酶；否则，待检细胞中无活性端粒酶，从而完成待检细胞中端粒酶的检测。
2.根据权利要求1所述的基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法，其特征在于：所述步骤(4)中端粒酶重复序列扩增缓冲溶液与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的体积比为1:3.8～4.2。
3.根据权利要求1所述的基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法，其特征在于：所述步骤(5)中待检液的添加量与步骤(4)的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液的添加量相等。
4.根据权利要求1所述的基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法，其特征在于：所述氯化血红素溶液和KCl溶液与待检液的体积比为2:1:20。
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