CN108956990A - 端粒酶活性检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

端粒酶活性检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种端粒酶活性检测试剂盒，其包括：端粒酶底物引物、dNTPs、端粒酶逆转录缓冲液、氯化血红素、过氧化氢、量子点比率荧光探针，其中该量子点比率荧光探针包含量子点部分和染料部分，该量子点部分和该染料部分发射不同颜色的荧光，且过氧化氢能淬灭该量子点部分发射的荧光但不能淬灭该染料部分发射的荧光，该量子点部分和该染料部分通过硫代磷酸酯修饰的DNA复合，该量子点部分为CdZnTeS量子点，该染料部分为Rox。本发明还提供了一种用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法。通过本发明的检测试剂盒和检测方法，可以实现端粒酶的定量检测和可视化区分。

Description

端粒酶活性检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法。
背景技术
人端粒酶是一种核蛋白反转录酶，包括三个组分：端粒酶反转录酶、端粒酶RNA组分和相关蛋白质。端粒酶负责将端粒重复序列(TTAGGG)n添加到人染色体的末端，其在85％的恶性肿瘤细胞中过度表达，但在正常组织中不表达。因此，端粒酶可用作特异性肿瘤标志物，端粒酶活性的有效检测在癌症诊断和治疗中具有巨大的价值。
端粒重复序列扩增法(TRAP)已被认为是检测端粒酶的金标准方法。尽管这个最常用的方法灵敏度高，但仍有许多缺点，如费时、需要进行复杂的优化、产生假阳性。最近有越来越多的新测定法被开发出来以取代TRAP法，包括荧光法、比色法、电化学法、化学发光法、电化学发光法和表面增强拉曼散射法(SERS)。
在荧光法方面，有研究使用比率荧光探针通过单一波长处的荧光强度变化，即简单的颜色变化来检测靶分析物。这种方法容易受许多干扰因素的影响，如探针浓度、激发强度和环境影响。比率荧光法是通过测量两种不同波长处荧光强度的比值测定目标物的一种分析方法。由于所测得的荧光比值信号能够极大地降低光源强度波动和仪器稳定性变化的影响，从而赋予该方法更高的灵敏度和准确度，因此比率荧光探针的构建引起研究者的广泛关注。
量子点(quantum dots,QDs)是一种纳米半导体材料，直径在2-20nm之间。由于量子点的电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。量子点具有独特的量子尺寸效应和表面效应，与传统荧光染料相比，显示出优良的荧光性质、光化学稳定性、生物兼容性，成为构建比率纳米探针的优选纳米材料之一。量子点比率荧光探针法与其他分析方法相比，更加便捷、成本更低、灵敏度更高、选择性更好。由于其独特的光学性质，量子点已被应用于生物识别和检测中，可用于检测蛋白质、核酸、微生物等生物样品。
中国发明专利申请CN201310453815公开了一种用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标。该分子信标包括核酸茎环结构、与核酸茎环结构5’端连接的荧光基团和与核酸茎环结构3’端连接的淬灭基团，其中所述荧光基团为半导体量子点材料，所述淬灭基团为核黄素。在检测过程中，如果样品中不存在靶标，分子信标的茎环结构呈发夹结构，量子点荧光基团与核黄素淬灭基团接近，产生荧光共振能量转移(FRET)，量子点荧光基团发出的荧光被核黄素淬灭基团吸收，此时检测不到量子点荧光基团发出的荧光；如果有靶标存在，分子信标的茎环结构与靶标特异性结合，量子点荧光基团与核黄素淬灭基团分开，可以检测到量子点的荧光信号，从而实现对靶标的检测。该专利的主要缺点是基于单色荧光的强度变化对端粒酶活性进行检测，荧光强度的变化不利于进行可视化检测区分。
中国发明专利申请CN201710509991公开了一种合成染料修饰DNA功能化含镉量子点的方法及其应用。该量子点是由一端染料修饰另一端硫代磷酸酯修饰的DNA通过硫与镉的强相互作用连接到量子点表面。是在量子点的合成过程中，将这种双修饰的DNA加入，作为量子点的共稳定剂，而得到该量子点探针。该量子点探针在比率荧光方面具有广泛应用，可实现核酸、蛋白质、小分子及金属离子的精准检测。利用该专利方法制备的荧光染料修饰的DNA功能化CdZnTeS量子点可以用来检测过氧化氢，因为量子点的荧光会被过氧化氢淬灭，而染料的荧光基本不发生变化。但该专利方法仍不能实现对端粒酶活性的检测。
发明内容
本发明的目的是提供端粒酶活性检测试剂盒及检测方法，该检测试剂盒及检测方法通过比率荧光法实现对端粒酶的检测。
因此，在第一个方面，本发明提供一种端粒酶活性检测试剂盒，其包括：端粒酶底物引物、dNTPs和端粒酶逆转录缓冲液、氯化血红素、过氧化氢、量子点比率荧光探针，其中该量子点比率荧光探针包含量子点部分和染料部分，该量子点部分和该染料部分发射不同颜色的荧光，且过氧化氢能淬灭该量子点部分发射的荧光但不能淬灭该染料部分发射的荧光，该量子点部分和该染料部分通过硫代磷酸酯修饰的DNA复合，该量子点部分为CdZnTeS量子点，该染料部分为Rox。
在优选的实施方案中，该端粒酶底物引物如SEQ ID NO:1所示，该端粒酶逆转录缓冲液包含20mM Tris-HCl(pH＝8.3),1.5mM MgCl2,63mM KCl,0.005％Tween 20,BSA0.1mg/mL。
在优选的实施方案中，本发明的端粒酶活性检测试剂盒还包括Tris缓冲液，该量子点比率荧光探针溶于该Tris缓冲液中形成量子点比率荧光探针溶液。
在一个具体的实施方案中，本发明的端粒酶活性检测试剂盒包括：
第一试剂容器，该第一试剂容器包含该端粒酶底物引物、dNTPs和该端粒酶逆转录缓冲液，
第二试剂容器，该第二试剂容器包含氯化血红素，
第三试剂容器，该第三试剂容器包含过氧化氢，
第四试剂容器，该第四试剂容器包含该量子点比率荧光探针溶于Tris缓冲液中形成的量子点比率荧光探针溶液。
在另一个具体的实施方案中，本发明的端粒酶活性检测试剂盒包括：
第一试剂容器，该第一试剂容器包含该端粒酶底物引物、dNTPs和该端粒酶逆转录缓冲液，
第二试剂容器，该第二试剂容器包含氯化血红素，
第三试剂容器，该第三试剂容器包含过氧化氢，
试纸传感器，该试纸传感器通过将试纸接触该量子点比率荧光探针溶于Tris缓冲液中形成的量子点比率荧光探针溶液而制得。
优选地，该试纸传感器通过将试纸浸入该量子点比率荧光探针溶液中并干燥而制得。干燥可例如为风干。
在第二个方面，本发明提供一种用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取端粒酶样品；
(2)向该端粒酶样品加入端粒酶底物引物、dNTPs和端粒酶逆转录缓冲液进行反应，形成端粒酶延伸反应产物，然后加入氯化血红素进行反应，形成氯化血红素/G-四链体；
(4)向该步骤(3)得到的氯化血红素/G-四链体加入固定量的过氧化氢进行反应；
(5)将该步骤(4)中反应后的混合体系与固定量的量子点比率荧光探针进行反应，其中该量子点比率荧光探针包含量子点部分和染料部分，该量子点部分和该染料部分发射不同颜色的荧光，且过氧化氢能淬灭该量子点部分发射的荧光但不能淬灭该染料部分发射的荧光，该量子点部分和该染料部分通过硫代磷酸酯修饰的DNA复合，该量子点部分为CdZnTeS量子点，该染料部分为Rox；然后测量CdZnTeS量子点的发射荧光和Rox的发射荧光并计算两者的发射荧光比率，或者观察所述量子点比率荧光探针的发射荧光颜色。
优选地，该端粒酶底物引物如SEQ ID NO:1所示，该端粒酶逆转录缓冲液包含20mMTris-HCl(pH＝8.3),1.5mM MgCl2,63mM KCl,0.005％Tween 20,BSA 0.1mg/mL。
在优选的实施方案中，本发明的用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法还包括制作端粒酶活性标准谱，并将该步骤(5)得到的该发射荧光比率与该端粒酶活性标准谱进行比较，得到该端粒酶样品的端粒酶活性，其中该制作端粒酶浓度标准谱包括：提供一系列浓度的端粒酶溶液，按该步骤(2)至(5)的操作得到一系列的发射荧光比率，和建立该端粒酶溶液的浓度与该发射荧光比率的关联。
在一个具体的实施方案中，本发明的用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法的该步骤(5)中，该量子点比率荧光探针溶于Tris缓冲液中形成量子点比率荧光探针溶液，该步骤(4)中反应后的混合体系在该量子点比率荧光探针溶液中与该量子点比率荧光探针反应；该建立该端粒酶溶液的浓度与该发射荧光比率的关联包括以该端粒酶溶液的浓度为横坐标，以该发射荧光比率为纵坐标，制作出端粒酶活性标准曲线。
在另一个具体的实施方案中，本发明的用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法的该步骤(5)中，该量子点比率荧光探针溶于Tris缓冲液中形成量子点比率荧光探针溶液并通过将试纸浸入该量子点比率荧光探针溶液中并干燥而形成试纸传感器，该步骤(4)中反应后的混合体系通过该试纸传感器与该量子点比率荧光探针反应；该建立该端粒酶溶液的浓度与该发射荧光比率的关联包括建立该端粒酶溶液的浓度与该发射荧光颜色的对应关系。具体地，该一系列浓度的端粒酶溶液的一系列发射荧光颜色被拍摄制作成包括一系列颜色的标准色卡，该标准色卡中的每种颜色对应相应的端粒酶溶液浓度。
优选地，在本发明的用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法中，过氧化氢的浓度为5-50μM，优选10μM。
本发明的有益技术效果
一方面，本发明基于CdZnTeS量子点的优异的光学性质，利用Rox荧光染料修饰的DNA对CdZnTeS量子点进行功能化，即构建了多颜色的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针，其中Rox染料部分能发射红色荧光，该红色荧光不被过氧化氢淬灭，而CdZnTeS量子点能发射绿色荧光，该绿色荧光会被过氧化氢淬灭。另一方面，通过向端粒酶样品加入端粒酶底物引物、dNTPs和端粒酶逆转录缓冲液进行反应，形成端粒酶延伸反应产物，然后加入氯化血红素进行反应，形成氯化血红素/G-四链体，该氯化血红素/G-四链体能催化过氧化氢分解为H2O和O2。从而，本发明巧妙地在反应体系中设计固定量的过氧化氢和固定量的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针，通过待测数量的端粒酶所形成的氯化血红素/G-四链体的量的不同，造成过氧化氢被催化分解的量的不同，进而导致Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针中的CdZnTeS量子点的绿色荧光被淬灭程度的不同，最终导致CdZnTeS量子点发射荧光(524nm，绿色)和Rox发射荧光(605nm，红色)的发射荧光比率的不同。通过测定发射荧光比率，可以实现端粒酶活性的定量检测，通过观测荧光颜色，可以实现可视化区分端粒酶活性。
附图说明
图1显示了本发明的用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法的原理；
图2显示了用于本发明的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针的透射电子显微镜(TEM图像)(图2A，其中右上方插图为高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)图像)和紫外-可见光吸收光谱(图2B)；
图3显示了用于本发明的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针与不同物质反应的荧光光谱和照片，其中(a)Tris缓冲液，(b)Tris缓冲液加过氧化氢，(c)Tris缓冲液加端粒酶样品，(d)Tris缓冲液加过氧化氢和氯化血红素/G-四链体；
图4显示了用得自热失活的HeLa细胞的端粒酶样品进行的端粒酶活性检测；
图5显示了用于本发明的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针与不同浓度的过氧化氢(0-50μM)的荧光光谱；
图6显示了在固定浓度的过氧化氢(5-50μM)下，加入不同浓度的端粒酶样品(得自0-500个HeLa细胞)，Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针的荧光强度增加。
图7显示了用于本发明的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针与不同浓度的端粒酶反应产物的荧光光谱(图7A)和端粒酶活性测定的校准曲线(CdZnTeS量子点发射荧光(524nm)和Rox发射荧光(605nm)的发射荧光比率与HeLa细胞数目之间的线性关系)(图7B)。误差条基于三个重复实验获得。激发波长：340nm。
图8显示了比率荧光探针(对照)及比率荧光探针与不同数量的端粒酶反应产物在过氧化氢存在下的照片。HeLa细胞的数目分别为0、25、250、500、1250和3750个细胞。所有的照片均在365nm紫外灯下获取。
图9显示了试纸传感器(对照)及试纸传感器与不同数量的端粒酶反应产物在过氧化氢存在下的照片。HeLa细胞的数目分别为0、5、25、250、500、1000个细胞。所有的照片均在365nm紫外灯下获取。
具体实施方式
以下对本发明进行进一步的详细描述。应当理解，这些描述仅出于说明本发明的目的，并不意在以任何方式限制本发明。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域技术人员通常理解的含义相同。如果有冲突，以本说明书的定义为准。除另有说明的外，本文所用的化学物质和仪器可市售获得。本文中使用的材料、方法和示例仅作说明用途，无意作为限制，除非特别指明。
I.检测原理
本发明的端粒酶活性定量检测方法使用了Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针，其中Rox染料能发出红色荧光，而CdZnTeS量子点能发射绿色荧光。过氧化氢能淬灭CdZnTeS量子点的绿色荧光，但不能淬灭Rox染料的红色荧光。
在本发明的端粒酶活性定量检测方法中，设计端粒酶底物引物的序列为5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’(SEQ ID NO:1)。将端粒酶底物引物、dNTPs与端粒酶样品在端粒酶逆转录缓冲液(加钾离子)中进行温育，使端粒重复单元(TTAGGG)n延伸到端粒酶底物引物的末端上以形成更长的单链DNA，然后加入氯化血红素形成具有四链DNA结构的氯化血红素/G-四链体。该氯化血红素/G-四链体具有辣根过氧化物酶活性，可将过氧化氢催化为H2O和O2。
在本发明的端粒酶活性定量检测方法中，巧妙地使待测端粒酶浓度的端粒酶样品与端粒酶底物引物、dNTPs、钾离子和氯化血红素反应，形成具有辣根过氧化物酶活性即过氧化氢催化活性的氯化血红素/G-四链体，然后使氯化血红素/G-四链体与固定量的过氧化氢反应，最后向反应体系中加入固定量的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针进行反应。端粒酶样品中的端粒酶活性越高，氯化血红素/G-四链体的过氧化氢催化活性就越高，Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针中的CdZnTeS量子点的绿色荧光被淬灭的程度就越低。由Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针的CdZnTeS量子点绿色发射荧光与Rox染料的红色发射荧光的发射荧光比率，或者Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针的发射荧光颜色，可以反映端粒酶样品的端粒酶浓度。
本文所用的术语“端粒酶样品”是指任何需要测量其中的端粒酶活性的样品，优选生物样品，例如但不限于组织细胞液、血液、体液、尿液等。该样品的获取方法是本领域公知的，例如将组织或细胞破碎获得组织细胞液，或者通过抽取的方法获得血液、体液或尿液。
II.量子点比率荧光探针的制备与表征
1.制备方法
根据之前的文献(Mao G.,Q.Cai,F.Wang,C.Luo,X.Ji&Z.He,One-Step Synthesisof Rox-DNA Functionalized CdZnTeS Quantum Dots for the Visual Detection ofHydrogen Peroxide and Blood Glucose.Anal Chem 89,11628-11635(2017))，用一锅水热法制备CdZnTeS量子点比率荧光探针。具体制备步骤如下。
A.Rox染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA序列的设计与合成
设计Rox染料与硫代磷酸酯共同修饰的DNA序列如下：
G*G*G*G*G*G*G*G*AAAAAAAACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGTAAA-Rox(5’→3’，其中*表示硫代磷酸酯修饰)。即该修饰的DNA序列5’端修饰有硫代磷酸酯、3’端修饰有Rox染料，或者可以改成3’端修饰有硫代磷酸酯，5’端修饰有Rox染料。
设计好的修饰的DNA序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
B.量子点比率荧光探针的合成
a.将氯化镉、氯化锌和N-乙酰-L-半胱氨酸溶解于去离子水中，得到混合溶液1，用氢氧化钠溶液调节混合溶液1的pH值至8.0-10.0，加入亚碲酸钠与2,3-二巯基丁二酸，得到混合溶液2，再用氢氧化钠溶液调节混合溶液2的pH值至10.0-12.0，最后加入20-200μM的步骤1)所得的修饰的DNA，搅拌均匀后转移至水热反应釜中，150-200℃下反应15-30min，得到Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针溶液；其中氯化镉、氯化锌、N-乙酰-L-半胱氨酸、亚碲酸钠和2,3-二巯基丁二酸的摩尔比为1:(0.5-3):(1-10):(0.2-0.7):(0.05-0.5)，优选所用的Zn/Cd/Te/DMSA/NAC的比率为1:1:4:0.2:0.2。
b.将所得到的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针溶液用分子截留量为30000的超滤管进行离心纯化，将废液倒掉，再加入超纯水洗涤离心，如此循环洗涤离心4次，将超滤管倒置离心，得到Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针纯品，置于4℃下保存备用。
2.量子点比率荧光探针的表征
通过透射电子显微镜(TEM)观测了所制得的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针的形状和尺寸。观察到所制备的探针颗粒分散性良好，平均尺寸为约4nm(图2A)。
还测定了所制备的探针的紫外-可见光吸收光谱(图2B)。可以明显看出，DNA序列、CdZnTeS量子点和Rox的三个吸收峰分别出现在257nm、495nm和588nm处，提示Rox-DNA成功地与CdZnTeS量子点连接。
III.将Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针用于检测端粒酶
本发明利用Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针、氯化血红素/G-四链体和过氧化氢开发了一种端粒酶活性定量检测方法，其尤其用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测。
1.可行性
将所制得的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针(20nM)与(a)Tris缓冲液(20mM)、(b)Tris缓冲液(20mM)加过氧化氢(10uM)、(c)Tris缓冲液(20mM)加端粒酶样品(5000个HeLa细胞/uL)或者(d)Tris缓冲液(20mM)加过氧化氢(10uM)和氯化血红素(2uM)/G-四链体(5000个HeLa细胞/uL的端粒酶样品反应所得)一起在室温下温育1小时，并测量荧光光谱(参见图3)。
由图3可见，在340nm的激发波长下，在Tris缓冲液中，Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针的Rox染料发射红色荧光，CdZnTeS量子点发射绿色荧光，因此该荧光探针呈现黄绿色(曲线a)；在Tris缓冲液加过氧化氢的情况下，过氧化氢淬灭了CdZnTeS量子点的绿色荧光，而Rox的红色荧光不受影响，因此该荧光探针呈现红色(曲线b)；在Tris缓冲液加端粒酶样品的情况下，发现端粒酶样品没有干扰CdZnTeS量子点和Rox的荧光强度(曲线c)；在Tris缓冲液加过氧化氢和氯化血红素/G-四链体的情况下，CdZnTeS量子点的荧光强度只显示微小的变化(曲线d)，证明过氧化氢被氯化血红素/G-四链体降解，从而避免CdZnTeS量子点荧光减弱。
另外，用得自HeLa细胞的端粒酶样品进行失活试验，将该样品加热至95℃处理15分钟使端粒酶失活时，没有记录到明显的荧光强度增加(图4)。
这些结果提示，Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针与氯化血红素/G-四链体和过氧化氢相组合可成功地用于端粒酶活性的检测。
2.过氧化氢浓度的优化
为实现本发明的端粒酶活性定量检测方法高灵敏度和准确性，对过氧化氢的浓度进行了优化。如图5所示，Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针中的CdZnTeS量子点的发射荧光强度随着过氧化氢浓度的增加(0-50μM)而下降，而Rox的发射荧光强度不受影响。如图6所示，对于不同浓度的过氧化氢(5-50μM)，在氯化血红素/G-四链体的催化下，CdZnTeS量子点的发射荧光强度都是增加的。
因此，在本发明的端粒酶活性定量检测方法中，过氧化氢的浓度在5-50μM之间，优选为10μM。如果过氧化氢浓度过高，需要大量的端粒酶相关产物(氯化血红素/G-四链体)对Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针的荧光进行恢复，会降低检测的灵敏度。
3.线性关系
用提取自Hela细胞的端粒酶样品研究本发明的端粒酶活性定量检测方法的线性关系。图7A显示了随着端粒酶反应产物的浓度的增加，Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针的荧光光谱的演变。加入10μM的过氧化氢大大减少了CdZnTeS量子点在524nm处的绿色荧光，而Rox在605nm处的红色荧光不受影响。在10μM的过氧化氢的存在下，随着HeLa细胞数目从10个细胞增加到1000个细胞，绿色荧光增加。HeLa细胞数目在10-500个细胞的范围内时，量子点和Rox的荧光强度比率表现出线性关系，检测限(LOD)为10个细胞。该比率荧光探针对于端粒酶分析具有良好的线性度(R2＝0.99382)，校准函数为y＝2.3746+0.0026x(细胞数)，式中y为荧光强度比率，x为HeLa细胞数目(图7B)。
IV.端粒酶活性检测试剂盒
为了便于进行本发明的端粒酶活性定量检测方法，设计了本发明的端粒酶活性检测试剂盒，其包括以下组分：端粒酶底物引物、dNTPs和端粒酶逆转录缓冲液、氯化血红素、过氧化氢和Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针，该量子点比率荧光探针例如可以如以上II所述制备。
优选地，端粒酶底物引物如SEQ ID NO:1所示，端粒酶逆转录缓冲液包含20mMTris-HCl(pH＝8.3),1.5mM MgCl2,63mM KCl,0.005％Tween 20,BSA 0.1mg/mL。
端粒酶底物引物、dNTPs和端粒酶逆转录缓冲液用于与端粒酶样品反应，形成端粒酶延伸反应产物。为了实际使用的方便，在本发明的优选实施方案中，将端粒酶底物引物、dNTPs和端粒酶逆转录缓冲液一起装在一个试剂容器中。
氯化血红素用于与端粒酶延伸反应产物反应，形成氯化血红素/G-四链体，该氯化血红素/G-四链体具有辣根过氧化物酶活性，能催化降解过氧化氢成为H2O和O2。为了实际使用的方便，在本发明的优选实施方案中，将氯化血红素装在一个试剂容器中。
过氧化氢一方面被氯化血红素/G-四链体降解，一方面能淬灭Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针中的CdZnTeS量子点的绿色荧光。本发明的端粒酶活性检测试剂盒包含固定量的过氧化氢。为了实际使用的方便，在本发明的优选实施方案中，过氧化氢单独装在一个试剂容器中。
Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针中的Rox染料能发射红色荧光，而CdZnTeS量子点能发射绿色荧光，但在过氧化氢存在下绿色荧光会被淬灭。本发明的端粒酶活性检测试剂盒包含固定量的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针。为了实际使用的方便，在本发明的优选实施方案中，Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针单独装在一个试剂容器中。
为了实际使用的方便，优选地，将Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针溶于Tris缓冲液中形成Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针溶液；更优选地，通过将试纸浸入该Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针溶液中并干燥而形成试纸传感器。
实施例
以下通过非限制性实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
本实施例以得自HeLa细胞的端粒酶样品，说明本发明的端粒酶活性定量检测方法，其中显色反应在Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针的Tris缓冲液溶液中进行。
(1)获得端粒酶样品
在含有10％热失活FBS的DMEM培养基中培养HeLa细胞。用胰蛋白酶收获细胞后，将1×106个细胞收集到1.5mL EP管中，在1000rpm下离心10分钟。将细胞用磷酸缓冲盐水(pH＝7.4)洗涤一次，再次离心，然后分配在200μL的冰冷的1×CHAPS裂解缓冲液中。然后，将细胞在冰上温育30分钟，在4℃下12000rpm离心20分钟，所得上清液即为端粒酶样品。将上清液转移到新鲜管中，于-80℃下保藏。
(2)形成氯化血红素/G-四链体
首先，将1μL的端粒酶样品加入到9μL的端粒酶逆转录缓冲液(20mM Tris-HCl(pH8.3),1.5mM MgCl2,63mM KCl,0.005％Tween 20,BSA 0.1mg/mL)，该端粒酶逆转录缓冲液中还加入了0.04mM dNTPs和200nM端粒酶底物引物5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’。将所得溶液在37℃下温育60分钟，然后在室温下用2×10-6M的氯化血红素处理120分钟，形成氯化血红素/G-四链体。
(3)与过氧化氢反应
将步骤(2)得到的氯化血红素/G-四链体和10μM的过氧化氢添加到Tris缓冲液(20mM,pH＝8.4)并在室温下温育60分钟。混合溶液的总体积为390μL。
(4)与Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针反应，得到发射荧光比率
将Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针溶于Tris缓冲液中形成Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针溶液(20nM)，取10μL的该溶液添加到步骤(3)的390μL的混合溶液，在室温下温育60分钟。然后，用荧光分光光度计在340nm的激发波长下测量CdZnTeS量子点发射荧光和Rox发射荧光。
(5)标准曲线的制作
按前述步骤(1)的方法，从0、25、250、500、1250和3750个HeLa细胞中提取端粒酶，作为一系列浓度的端粒酶溶液，按前述步骤(2)至(4)的操作，得到一系列的发射荧光测量值，以端粒酶溶液的浓度为横坐标，以发射荧光比率为纵坐标，制作出端粒酶活性标准曲线。
图8的照片显示了365nm紫外灯下，给定浓度的端粒酶反应产物所致的Rox-CdZnTeS比率荧光探针的荧光显现。通过将HeLa细胞数目从0个细胞增加到25个、250个、500个、1250个和3750个细胞，该溶液的肉眼可见荧光从红色逐渐变成黄绿色。图中的对照为不加过氧化氢的情况下Rox-CdZnTeS比率荧光探针的发射荧光，由于CdZnTeS量子点荧光比Rox荧光强度高很多，所以基本上呈现CdZnTeS量子点的绿色荧光。
实施例2：试纸传感器法
本实施例的步骤(1)至(3)与实施例1相同，但在步骤(4)中显色反应用试纸传感器进行，以下主要描述与实施例1不同之处。
具体而言，在步骤(4)之前，事先将Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针溶于Tris缓冲液(10uL)中形成Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针溶液(200nM)，并通过将试纸浸入该Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针溶液中，在室温下风干5分钟，形成试纸传感器。
步骤(4)：用微量滴定管取步骤(4)中反应后的混合体系10uL，滴到试纸传感器上，与试纸传感器上的Rox-CdZnTeS量子点比率荧光探针反应5分钟，显示荧光颜色。
步骤(5)：标准色卡的制作
由于本实施例中使用试纸传感器，因此，建立端粒酶溶液的浓度与发射荧光比率的关联包括建立端粒酶溶液的浓度与发射荧光的颜色对应关系。具体地，用数码相机拍摄一系列浓度的端粒酶溶液(从0、5、25、250、500、1000个HeLa细胞中提取端粒酶)在反应后的一系列发射荧光颜色，制作成包括一系列颜色的标准色卡，该标准色卡中的每种颜色对应相应的端粒酶溶液浓度。
图9显示了试纸传感器(对照)及试纸传感器与不同数量的端粒酶反应产物在过氧化氢存在下的照片。所有的照片均在365nm紫外灯下获取。HeLa细胞的数目分别为0、5、25、250、500、1000个HeLa细胞，相应地试纸传感器的发射荧光颜色从红色逐渐变成黄橙色(由于本实施例最多采用1000个HeLa细胞，因此端粒酶较少，过氧化氢被催化得比实施例1少些，因此还没达到黄绿色)。图中的对照为不加过氧化氢的情况下Rox-CdZnTeS比率荧光探针的发射荧光颜色，由于CdZnTeS量子点荧光比Rox荧光强度高很多，所以基本上呈现CdZnTeS量子点的绿色荧光。
以上应用了具体实例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市第二人民医院
<120> 端粒酶活性检测试剂盒及检测方法
<130> 18I26317
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 端粒酶底物引物序列
<400> 1
aatccgtcga gcagagtt 18

Claims (10)

1.一种端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括端粒酶底物引物、dNTPs、端粒酶逆转录缓冲液、氯化血红素、过氧化氢、量子点比率荧光探针，其中所述量子点比率荧光探针包含量子点部分和染料部分，所述量子点部分和所述染料部分发射不同颜色的荧光，且过氧化氢能淬灭所述量子点部分发射的荧光但不能淬灭所述染料部分发射的荧光，所述量子点部分和所述染料部分通过硫代磷酸酯修饰的DNA复合，所述量子点部分为CdZnTeS量子点，所述染料部分为Rox。
2.根据权利要求1所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述端粒酶底物引物如SEQ ID NO:1所示，所述端粒酶逆转录缓冲液包含20mM Tris-HCl(pH＝8.3),1.5mM MgCl2,63mM KCl,0.005％Tween 20,BSA 0.1mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，还包括Tris缓冲液，所述量子点比率荧光探针溶于所述Tris缓冲液中形成量子点比率荧光探针溶液。
4.根据权利要求3所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括：
第一试剂容器，所述第一试剂容器包含所述端粒酶底物引物、dNTPs和所述端粒酶逆转录缓冲液，
第二试剂容器，所述第二试剂容器包含所述氯化血红素，
第三试剂容器，所述第三试剂容器包含所述过氧化氢，
第四试剂容器，所述第四试剂容器包含所述量子点比率荧光探针溶液。
5.根据权利要求3所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括：
第一试剂容器，所述第一试剂容器包含所述端粒酶底物引物、dNTPs和所述端粒酶逆转录缓冲液，
第二试剂容器，所述第二试剂容器包含所述氯化血红素，
第三试剂容器，所述第三试剂容器包含所述过氧化氢，
试纸传感器，所述试纸传感器通过将试纸接触所述量子点比率荧光探针溶液而制得。
6.一种用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取端粒酶样品；
(2)向所述端粒酶样品加入端粒酶底物引物、dNTPs和端粒酶逆转录缓冲液进行反应，形成端粒酶延伸反应产物，然后加入氯化血红素进行反应，形成氯化血红素/G-四链体；
(4)向所述步骤(3)得到的氯化血红素/G-四链体加入固定量的过氧化氢进行反应；
(5)将所述步骤(4)中反应后的混合体系与固定量的量子点比率荧光探针进行反应，其中所述量子点比率荧光探针包含量子点部分和染料部分，所述量子点部分和所述染料部分发射不同颜色的荧光，且过氧化氢能淬灭所述量子点部分发射的荧光但不能淬灭所述染料部分发射的荧光，所述量子点部分和所述染料部分通过硫代磷酸酯修饰的DNA复合，所述量子点部分为CdZnTeS量子点，所述染料部分为Rox；然后测量所述CdZnTeS量子点的发射荧光和所述Rox的发射荧光并计算两者的发射荧光比率，或者观察所述量子点比率荧光探针的发射荧光颜色。
7.根据权利要求6所述的用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法，其特征在于，所述端粒酶底物引物如SEQ ID NO:1所示，所述端粒酶逆转录缓冲液包含20mM Tris-HCl(pH＝8.3),1.5mM MgCl2,63mM KCl,0.005％Tween 20,BSA 0.1mg/mL。
8.根据权利要求6或7所述的用于非诊断治疗目的的端粒酶活性定量检测方法，其特征在于，还包括制作端粒酶活性标准谱，并将所述步骤(5)得到的所述发射荧光比率与所述端粒酶活性标准谱进行比较，得到所述端粒酶样品的端粒酶活性，其中所述制作端粒酶浓度标准谱包括：提供一系列浓度的端粒酶溶液，按所述步骤(2)至(5)的操作获得一系列的发射荧光比率，和建立所述端粒酶溶液的浓度与所述发射荧光比率的关联。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述量子点比率荧光探针溶于Tris缓冲液中形成量子点比率荧光探针溶液，所述步骤(4)中反应后的混合体系在所述量子点比率荧光探针溶液中与所述量子点比率荧光探针反应；所述建立所述端粒酶溶液的浓度与所述发射荧光比率的关联包括以所述端粒酶溶液的浓度为横坐标，以所述发射荧光比率为纵坐标，制作出端粒酶活性标准曲线。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述量子点比率荧光探针溶于Tris缓冲液中形成量子点比率荧光探针溶液并通过将试纸浸入所述量子点比率荧光探针溶液中并干燥而形成试纸传感器，所述步骤(4)中反应后的混合体系通过所述试纸传感器与所述量子点比率荧光探针反应；所述建立所述端粒酶溶液的浓度与所述发射荧光比率的关联包括建立所述端粒酶溶液的浓度与所述发射荧光颜色的对应关系。
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