WO2009144914A1 - Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法およびテロメラーゼ活性測定方法 - Google Patents

Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法およびテロメラーゼ活性測定方法 Download PDF

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quadruplex
dna
phthalocyanine
solution
anionic
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夜久英信
三好大輔
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    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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    • Y10T436/145555—Hetero-N
    • Y10T436/147777—Plural nitrogen in the same ring [e.g., barbituates, creatinine, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a higher-order structure of DNA and a diagnostic method using the same.
  • Telomeres are structures consisting of DNA and various proteins located at both ends of eukaryotic chromosomes. Previous studies have shown that this telomere structure protects chromosomes from certain DNA-degrading enzymes and inappropriate DNA repair. The telomere portion is shortened with each cell division, and thus is considered to play an important role in a phenomenon called cell aging and immortalization.
  • telomeres have several characteristics when viewed from the structural side. That is, in most parts of the chromosomal DNA, an adenine (hereinafter referred to as A) base, a thymine (hereinafter referred to as T) base, and a guanine (hereinafter referred to as G) between two complementary DNA strands. ) Base and cytosine (hereinafter referred to as C) bases are specifically hydrogen bonded to form a Watson-Crick base pair, and a ⁇ - ⁇ stacking interaction occurs between the base pairs. A structure has been constructed (FIG. 1).
  • telomeric DNA most of it consists of double-stranded DNAs that are complementary to each other, but the 3 'end of the DNA protrudes (overhangs) in the most terminal part and is in a single-stranded state. .
  • the length of this overhanging part and the total length of telomeres vary depending on the species, but in the case of humans, the overhanging part is about 50-100 bases, and the total length is about 10,000 base pairs in the initial stage.
  • Another structural feature of the telomere sequence is that the overhanging strand is composed of a repetitive sequence containing a large amount of G, and the other strand that is the complementary strand is a repetitive sequence containing a large amount of C. That is the point.
  • the overhanging strand is a repeat of 5′-TTAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) (G-rich sequence), and the other is 5′-CCCTAA- It becomes a repeat (C-rich sequence) of 3 ′ (antisense strand of SEQ ID NO: 1).
  • G-quadruplex quadruplex structure
  • all four DNA strands are called parallel types in which the directions from 5 ′ to 3 ′ are in the same direction, or two are in the same direction.
  • the remaining two patterns are known as an anti-parallel type that faces in the opposite direction, all have the characteristics shown in FIG. That is, the four G bases form a structure called a G quartet through Hoogsteen-type hydrogen bonds, and the G quartet planes maintain a structure through ⁇ - ⁇ stacking interactions.
  • G-quadruplex structure requires coordination of metal ions between the G-quartet surface and the G-quartet surface, and K ions, Na ions, and the like are coordinated.
  • K ions, Na ions, and the like are coordinated.
  • the details of under what conditions such G-quadruplex is formed in the telomeres and what function it performs are unclear at present.
  • G-rich sequences do not exist only in telomeres.
  • a G-rich sequence that forms a G-quadruplex also exists in c-myc, which is a proto-oncogene.
  • G-rich sequences that form G-quadruplexes have been discovered in the promoter regions of c-kit, bcl-2, VEGF, H-ras, and N-ras genes. These are all genes related to cell canceration and the like, suggesting that G-quadruplex plays an important role for the human body.
  • G-rich sequences capable of forming more than 300,000 G-quadruplexes (hereinafter, such sequences are called quadruplex predicted sequences), and these actually form Gquadplexes. Attention has been paid to the function of the structure if it is formed and if it is formed.
  • One of the most necessary techniques in such a technical background is a method for specifically detecting G-quadruplex. That is, a technique is required for examining whether or not DNA in a sample contains G-quadruplex, or whether or not DNA comprising a predicted quadruplex in a sample actually forms G-quadruplex. For example, if the former is examined using conventional technology, it will be as follows. That is, a sample solution containing the target DNA is prepared, and a CD (Circular Dichroism) spectrum of this solution is measured. Then, it is only necessary to analyze whether or not the obtained CD spectrum is unique to G-quadruplex. However, the apparatus for measuring the CD spectrum is very expensive and large.
  • the analysis time is as long as about 30 minutes and the number of samples that can be analyzed at one time is usually one, it is remarkably inferior in terms of high throughput.
  • the form of the quadruplex there is a problem that it cannot be distinguished from other forms of DNA by using CD.
  • a probe material that emits a signal (absorbance, fluorescence intensity, etc.) that can be analyzed with an inexpensive device is mixed in the above solution.
  • a method for detecting a signal in the solution can be mentioned. What is important at this time is the specificity of this probe for G-quadruplex. That is, in the genomic DNA, there is a double-stranded DNA structure that occupies most of the DNA and a single-stranded DNA structure represented by the above-described overhanging portion of the telomere site. Therefore, the G-quadruplex when compared with these Specificity is important.
  • the specificity of the probe to G-quadruplex is low even though we want to investigate the presence or absence of only G-quadruplex, and as a result, it interacts with single-stranded or double-stranded DNA and emits a signal. This is because it becomes difficult to accurately detect G-quadruplex in the solution.
  • FIG. That is, first, a DNA having a predicted Quadruplex sequence is prepared in a solution. Thereafter, this solution is placed under G-quadruplex formation reaction conditions to cause a G-quadruplex formation reaction. Then, whether or not G-quadruplex is present in the solution after the reaction may be analyzed by performing CD spectrum measurement.
  • this probe may be mixed with the solution after the G-quadruplex formation reaction, and the signal emitted as a result may be measured.
  • the quadruplex predicted sequence DNA before the G-quadruplex formation reaction may be either a single-stranded DNA or a double-stranded DNA as described above, and therefore the specificity of the probe to G-quadruplex is extremely important. It is. That is, after the G-quadruplex formation reaction, when the predicted quadruplex DNA did not form G-quadruplex at all or only partially formed, the probe did not form the original quadruplex predicted sequence DNA.
  • the G-rich sequence forming G-quadruplex has been found in a site related to cancer, aging, etc. in the chromosome. Therefore, in the future, by examining G-quadruplex in the patient's chromosome, disease A diagnosis is expected. Therefore, the development of a method that can specifically detect G-quadruplex is a very important issue. Moreover, as a characteristic of the probe, not only can G-quadruplex and quadruplex predicted sequence DNA be specifically detected, but if there is a change such as an increase or decrease in signal depending on their abundance, not only detection but also quantification Needless to say, it is more useful because it makes it possible to perform a realistic analysis.
  • telomerase an enzyme called telomerase.
  • This enzyme is a complex composed of RNA and reverse transcriptase, and can replicate and extend a G-rich repetitive sequence of a telomere site shortened by cell division (ie, telomerase is 5 in humans).
  • the '-TTAGGG-3' sequence (SEQ ID NO: 1) is added.
  • This addition reaction is hereinafter referred to as telomerase reaction).
  • telomerase reaction is not found in normal human somatic cells, it is known to be expressed in large amounts in germ cells and most cancer cells. You can check whether or not.
  • TRAP assay As this conventional method, a so-called TRAP assay is known.
  • the TRAP assay will be described with reference to FIG.
  • a solution containing a synthetic single-stranded DNA serving as a telomerase template is prepared.
  • This single-stranded DNA is usually composed of the sequence 5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 2) and is called a TS primer (therefore, telomerase is 5′-TTAGGG-3 at the 3 ′ end of this TS primer.
  • 'Sequence SEQ ID NO: 1 is added (see Non-Patent Document 3).
  • the TS primer need not be limited to this sequence, and may be a single-stranded DNA that serves as a template for telomerase.
  • telomere reaction an extract from a cell sample or tissue sample suspected of being cancerous is added to the solution, mixed, and placed under conditions where a telomerase reaction is performed.
  • these samples are cancerous, since they have telomerase activity, a telomerase reaction starting from the TS primer occurs. On the other hand, the telomerase reaction does not occur unless it is cancerous.
  • the DNA extended by the telomerase reaction is amplified by PCR, and the amplified DNA fragment is detected by electrophoresis.
  • the obtained electrophoretic image is as shown in FIG. That is, when the telomerase activity of the sample used is strong, the length of the obtained DNA fragment appears as a ladder-like band covering a wide range from short to long, and the density of the band tends to be deep. On the other hand, since a long DNA fragment cannot be obtained from a weakly active telomerase, a ladder-like band appears in a short range, and the density of the band tends to be thin. Therefore, in order to judge canceration of a sample, it is sufficient to analyze the length range and band density of the DNA fragment of the electrophoretic image obtained from the result of the TRAP assay, but this is analyzed quantitatively. Since this is difficult, it will be a qualitative judgment.
  • the G-quadruplex specific detection probe described in FIGS. 3 and 5 is not only G-quadruplex-specific, but also depends on the abundance of G-quadruplex. When changing, it is also useful in cancer diagnosis using telomerase activity as an index.
  • the flowchart is shown in FIG.
  • a solution containing TS primer is prepared, and then an extract from a cell sample or tissue sample is added to and mixed with the solution, and a telomerase reaction is performed on this solution, followed by PCR.
  • the procedure up to the amplification of the DNA extended by the telomerase reaction by the method is the same as in FIG.
  • the solution after PCR is not subjected to electrophoresis, but a G-quadruplex formation reaction is performed in the same manner as in FIG. As a result, the formed G-quadrulex is detected using a G-quadruplex detection probe.
  • the amount of G-quadruplex formed reflects the strength of telomerase activity
  • the above-mentioned probe changes its signal amount according to the amount of G-quadruplex, it can be quantitatively determined by this method. Analysis of telomerase activity and determination of canceration can be performed.
  • the specificity of the probe to G-quadruplex is extremely important here. That is, when the cell sample is not cancerous, the telomerase reaction does not proceed, but as a result, the TS primer that is a single-stranded DNA remains in the reaction solution. Further, since the subsequent PCR reaction does not proceed, the PCR reaction primer also remains in a single-stranded DNA state. Therefore, if the cell sample is not cancerous, there will eventually be a large amount of single-stranded DNA in the reaction solution, and the probe will react with these single-stranded DNA and give a signal. This is because quantitative telomerase activity analysis and cancer diagnosis become difficult.
  • a method capable of specifically detecting G-quadruplex is very useful in the situation where either single-stranded DNA or double-stranded DNA can exist in the solution. Furthermore, if it also has quantitativeness, not only quantitative G-quadruplex can be detected, but also the problems of the conventional TRAP assay can be solved. Therefore, G-quadruplex detection methods using probes that specifically interact with G-quadruplexes and change signals depending on the amount of G-quadruplexes have been vigorously developed.
  • Patent Document 1 proposes a novel compound specific to G-quadruplex.
  • this probe has a higher binding selectivity to G-quadruplex than single- and double-stranded DNAs, it can confirm binding to single- and double-stranded DNAs.
  • Non-Patent Document 1 reports the specificity of G-quadruplex for a cationic porphyrin having the following structure (Chemical Formula 1).
  • This document uses the SPR (surface plasmon resonance) phenomenon to analyze the binding between the porphyrin and double-stranded DNA or G-quadruplex on a gold substrate.
  • SPR surface plasmon resonance
  • Non-Patent Document 2 reports the specificity of G-quadruplexes such as cationic porphyrins having the following structures (Chemical Formula 2) and (Chemical Formula 3).
  • G-quadruplexes such as cationic porphyrins having the following structures (Chemical Formula 2) and (Chemical Formula 3).
  • specific binding of these porphyrins to G-quadruplex has also been investigated by analyzing the SPR phenomenon and UV-visible absorption spectrum. It is described that these porphyrins bind nonspecifically.
  • any of the probes that have been developed for the purpose of detecting G-quadruplex so far is cationic.
  • G-quadruplex is anionic, and from the viewpoint of binding to G-quadruplex, it is considered that it is very advantageous to be cationic (ie, anionic is electrostatic. Repulsion occurs and is considered disadvantageous in the binding reaction).
  • anionic is electrostatic. Repulsion occurs and is considered disadvantageous in the binding reaction.
  • the present inventor has interacted with G-quadruplex with extremely high specificity even though the anionic planar phthalocyanine is anionic, and the absorbance depends on the concentration of G-quadruplex. Has been found to change, and the present invention has been achieved.
  • the present invention that solves the above problems detects G-quadruplex in a sample solution containing DNA that forms at least one of a single-stranded structure, a double-stranded structure, and a G-quadruplex structure.
  • a method The method (A) preparing a solution containing an anionic planar phthalocyanine; (B) mixing the solution containing the anionic planar phthalocyanine with the sample solution; (C) measuring the absorbance at 640 to 740 nm of the mixed solution after the step (b); (D) if a peak having an absorption maximum at 640 to 740 nm appears, determining that DNA forming a G-quadruplex structure is contained in the sample solution; Is a G-quadruplex detection method characterized in that
  • a method for detecting G-quadruplex-forming DNA comprising: The method (A) placing the sample solution under G-quadruplex formation reaction conditions; (B) preparing a solution containing an anionic planar phthalocyanine; (C) either before or after the step (a), the step of mixing the sample solution with a solution containing the anionic planar phthalocyanine; (D) measuring the absorbance at 640 to 740 nm of the mixed solution after the series of steps (a) to (c); (E) determining that a DNA having a G-quadruplex structure is contained in the sample solution if a peak having an absorption maximum at 640 to 740 nm appears; In order, a G-quadruplex-forming DNA detection method.
  • the present invention also relates to a method for measuring telomerase activity in a sample solution, The method (A) preparing the sample solution; (B) preparing a substrate solution containing DNA which is a substrate of telomerase; (C) mixing the sample solution and the substrate solution to prepare a telomerase reaction solution; (D) placing the telomerase reaction solution under conditions where a DNA addition reaction with telomerase is performed; (E) preparing a solution containing an anionic planar phthalocyanine; (F) mixing a solution containing the anionic planar phthalocyanine with a solution obtained after the step (d); (G) measuring the absorbance at 640 to 740 nm of the mixed solution after the series of steps (a) to (f); (H) if a peak having an absorption maximum at 640 to 740 nm appears, determining that DNA forming a G-quadruplex structure is contained in the sample solution; In order.
  • the anionic planar phthalocyanine is complexed with copper as a coordination metal, is complexed with zinc, is complexed with zinc, or is complexed with cobalt or an anion having nickel It is preferable that it is at least one selected from the group consisting of an anionic planar phthalocyanine, a complexed with an anionic planar phthalocyanine having no coordination metal, and a complexed one.
  • the anionic planar phthalocyanine preferably has at least one functional group obtained from the group consisting of a carboxyl group, a metal salt of a carboxyl group, a sulfo group, and a metal salt of a sulfo group. .
  • the present invention provides a method for specifically and quantitatively detecting G-quadruplex, a method for specifically and quantitatively detecting DNA capable of forming G-quadruplex, and a method for measuring telomerase activity.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the structure of double-stranded DNA.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the structure of the G-quadruplex.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining a specific detection method for G-quadruplex-forming DNA using a G-quadruplex-forming DNA-specific probe.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a quadruplex predicted sequence detection method using a CD analyzer.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining a method for detecting a predicted quadruplex using a G-quadruplex-forming DNA-specific probe.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining a conventional method for measuring telomerase activity.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of an electrophoretic image obtained by a conventional telomerase activity measurement method.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the structure of double-stranded DNA.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the structure of the G-quadruplex.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining
  • FIG. 8 is a diagram for explaining a method for measuring telomerase activity using a G-quadruplex-forming DNA-specific probe.
  • FIG. 9 is a diagram for explaining a specific detection method for G-quadruplex-forming DNA using anionic phthalocyanine.
  • FIG. 10 is a diagram for explaining a method for detecting a predicted Quadruplex sequence using an anionic phthalocyanine.
  • FIG. 11 is a diagram for explaining a method for measuring telomerase activity using anionic phthalocyanine.
  • FIG. 12 is a diagram showing a CD measurement result in Example 2.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results when anionic copper phthalocyanine is used in Example 2.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results when anionic nickel phthalocyanine is used in Example 2.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results when using an anionic phthalocyanine having no coordination metal in Example 2.
  • FIG. 16 is a diagram showing the results when anionic iron phthalocyanine is used in Example 2.
  • FIG. 17 is a diagram showing the CD measurement results in Example 1.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results when anionic copper phthalocyanine is used in Example 1.
  • FIG. 19 is a diagram showing the results when anionic nickel phthalocyanine is used in Example 1.
  • FIG. 20 is a diagram showing the results when Example 1 uses an anionic phthalocyanine having no coordination metal.
  • FIG. 21 is a diagram showing the results when anionic iron phthalocyanine is used in Example 1.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results when anionic copper phthalocyanine is used in Example 3.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results when anionic nickel phthalocyanine is used in Example 3.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results when Example 3 uses an anionic phthalocyanine having no coordination metal.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results when anionic copper phthalocyanine is used in Example 4.
  • FIG. 26 is a diagram showing the results when anionic nickel phthalocyanine is used in Example 4.
  • FIG. 27 is a diagram showing the results when using an anionic phthalocyanine having no coordination metal in Example 4.
  • FIG. 28 is a diagram showing the results when anionic iron phthalocyanine is used in Example 4.
  • FIG. 29 is a table summarizing the results of Examples 1 to 4.
  • FIG. 30 is a diagram illustrating a typical absorbance spectrum when the phthalocyanine is in an associated state and when it is dispersed.
  • FIG. 31 is a diagram showing the mechanism of the present invention.
  • FIG. 32 is a diagram illustrating planar phthalocyanine and shuttlecock phthalocyanine.
  • FIG. 33 is a diagram showing the results when anionic cobalt phthalocyanine is used in Example 1.
  • FIG. 34 is a diagram showing the results when anionic cobalt phthalocyanine is used in Example 2.
  • FIG. 35 is a diagram showing the results when anionic cobalt phthalocyanine is used in Example 3.
  • FIG. 36 is a diagram showing the results when anionic cobalt phthalocyanine is used in Example 4.
  • a sample solution and a solution containing an anionic planar phthalocyanine are mixed. Then, the absorbance of the mixed solution at a specific wavelength within the range of 640 to 740 nm is measured. At this time, if DNA forming a G-quadruplex is present in the sample solution, an absorption peak depending on this appears in the range of 640 to 740 nm. On the other hand, single-stranded structure, double-stranded structure Even in the presence of DNA, no peak depending on them appears within the above wavelength range. Therefore, by analyzing the presence or absence of this peak, it is possible to know whether or not DNA forming a G-quadruplex was present in the sample solution.
  • a reference solution that is known to contain no DNA that forms at least G-quadruplex is prepared, and this also includes a solution containing the anionic planar phthalocyanine. What is necessary is just to measure the light absorbency in the said specific wavelength at the time of mixing, and obtain
  • the absorbance value of this absorption peak increases as the concentration of DNA forming the G-quadruplex increases. Therefore, by analyzing the absorbance, the concentration of DNA forming G-quadruplex can be analyzed.
  • the anionic planar phthalocyanine used in Embodiment 1 is an anionic planar phthalocyanine having copper, zinc, cobalt or nickel as a coordination metal, or an anionic planar phthalocyanine having no coordination metal It is.
  • the anionic planar phthalocyanine used in Embodiment 1 has at least one functional group obtained from the group consisting of a carboxyl group, a carboxyl group metal salt, a sulfo group, and a sulfo group metal salt.
  • the specific wavelength may be any wavelength as long as it is within the range of 640 to 740 nm, but it is more preferable that the wavelength closer to the maximum peak wavelength appears because highly sensitive measurement is possible.
  • the sample solution and a solution containing an anionic planar phthalocyanine are mixed, and this is put under G-quadruplex formation conditions to perform a G-quadruplex formation reaction.
  • the absorbance at a specific wavelength in the range of 640 to 740 nm is measured (FIG. 10A), or the sample solution is subjected to a G-quadruplex formation reaction under a G-quadruplex formation condition and then an anion.
  • the solution is mixed with a solution containing sex-type planar phthalocyanine, and the absorbance of a specific wavelength in the range of 640 to 740 nm of this mixed solution is measured (FIG. 10B).
  • the absorbance value of the absorption peak increases as the concentration of DNA forming the G-quadruplex increases. Therefore, by analyzing the absorbance, it is possible to quantitatively analyze how much DNA in the sample has formed G-quadruplex.
  • the anionic planar phthalocyanine used in Embodiment 2 is an anionic planar phthalocyanine having copper, zinc, cobalt, or nickel as a coordination metal, as in Embodiment 1, or has a coordination metal. Not selected from anionic planar phthalocyanine.
  • the anionic planar phthalocyanine used in the second embodiment is at least one kind obtained from the group consisting of a carboxyl group, a metal salt of a carboxyl group, a sulfo group, and a metal salt of a sulfo group, as in the first embodiment.
  • the specific wavelength may be any wavelength as long as it is within the range of 640 to 740 nm, but it is more preferable that the wavelength closer to the maximum peak wavelength appears because highly sensitive measurement is possible.
  • Embodiment 3 a method for quantitatively analyzing telomerase activity contained in a sample will be described with reference to FIG.
  • the sample and a solution containing single-stranded DNA serving as a telomerase substrate are mixed, and the mixed solution is placed under conditions under which a telomerase reaction is performed.
  • a telomerase reaction is performed under these conditions.
  • the substrate single-stranded DNA is converted into a DNA comprising 5′-TTAGGG-3 ′.
  • there is no active telomerase in the sample such DNA addition is not performed.
  • the mixed solution after the telomerase reaction is placed under G-quadruplex formation conditions.
  • G-quadruplex is formed, and the amount depends on the telomerase activity in the sample (if the activity is large). The amount of G-quadruplex formed is also increased). Conversely, for example, if the sample does not contain active telomerase and, as a result, the telomerase reaction is not performed, no G-quadruplex is formed here.
  • the mixed solution after the G-quadruplex formation reaction and a solution containing an anionic planar phthalocyanine are mixed, and the absorbance of a specific wavelength within the range of 640 to 740 nm may be measured.
  • the absorbance value of the peak increases as the concentration of DNA forming the G-quadruplex increases.
  • the telomerase activity in the sample can be quantitatively analyzed by measuring the absorbance value of this peak.
  • the anionic planar phthalocyanine solution is added to the mixed solution after the G-quadruplex formation reaction, but the timing of adding the anionic planar phthalocyanine solution is not limited thereto. That is, as long as it is after the telomerase reaction and before the absorbance measurement, it may be added to the mixed solution containing the sample solution at any timing.
  • the anionic planar phthalocyanine used in the third embodiment is an anionic planar phthalocyanine having copper, zinc, cobalt, or nickel as a coordination metal, as in the first and second embodiments, or It is selected from an anionic planar phthalocyanine having no coordination metal.
  • anionic planar phthalocyanine used in the third embodiment is the same as in the first and second embodiments, from the group consisting of a carboxyl group, a metal salt of a carboxyl group, a sulfo group, and a metal salt of a sulfo group. It has at least one functional group obtained.
  • the specific wavelength may be any wavelength as long as it is within the range of 640 to 740 nm, but it is more preferable that the wavelength closer to the maximum peak wavelength appears because highly sensitive measurement is possible.
  • the DNAs used in the examples described below are all synthetic products of Hokkaido System Science Co., Ltd.
  • phthalocyanines used in this example Copper (II) phthalocyanine-3,4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfonic acid tetrasodium salt and Nickel (II) phthalocyanine tetrasulfidic acid tetrasulfidic acid Phthalocyanine-4,4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfonic acid, compound with oxygen monosodium salt hydrate were purchased from Sigma-Aldrich Corporation.
  • Phthalocyanine tetrasulfonic acid and Zinc (II) phthacyanine tetrasulfonic acid were purchased from Funakoshi Co., Ltd.
  • Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid was synthesized. The synthesis method is as follows.
  • trimellitic acid 20 g of urea, 4.75 g of cobalt chloride hexahydrate and 0.82 g of ammonium molybdate tetrahydrate were heated in an oil bath at 170-180 ° C. in 100 ml of nitrobenzene for 4.5 hours. After cooling, the nitrobenzene layer was removed by decantation. The residue was washed with methanol and water and then vacuum dried to obtain 8.66 g of a solid. After stirring 1.0 g of this solid in 30 g of 50% aqueous potassium hydroxide solution at 70 to 75 ° C. for 2 hours, 90 ml of water was added and stirred, and this was filtered.
  • the filtrate obtained here was made strongly acidic with 35-37% hydrochloric acid to precipitate a precipitate, which was collected by filtration. This precipitate was dissolved in 100 ml of 1N aqueous sodium hydroxide solution and filtered again. The filtrate obtained here was made strongly acidic again with hydrochloric acid, and the deposited precipitate was collected by filtration. This was washed with a large amount of water, and then vacuum-dried to obtain Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid as 0.1 g of powder. Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid used in the following examples is all obtained by this synthesis.
  • Example 1 an attempt was made to detect DNA forming an antiparallel G-quadruplex present in a solution using an anionic planar phthalocyanine.
  • a solution containing DNA forming an anti-parallel G-quadruplex was prepared by the following procedure.
  • telomere DNA concentrations contained in this solution were prepared at 0.5, 2, 5, 10, 25, 50, and 100 ⁇ M, respectively.
  • a solution of 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7 containing no DNA was also prepared.
  • FIG. 18 (B) shows that there is a high correlation between the two. Therefore, it is possible to quantitatively detect the concentration of single-stranded DNA forming an anti-parallel G-quadruplex by using Copper (II) phthalocyanine-3,4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfonic acid tetrasodium salt. I understand.
  • FIG. 18B shows the structure of the human telomeric DNA contained in the sample solution as described above after annealing to change the structure into an anti-parallel G-quadruplex, and then Coupler (II) phthalocyanine-3, 4 ′, 4 ′′. , 4 '' '-tetrasulfonic acidictetrasodium salt is added, but before annealing, Copper (II) phthalocyanine-3, 4', 4 ′′, 4 '' '-tetrasulfonic acid tetrasalt salt is used.
  • the obtained absorbance value at 691.5 nm and the human telomeric DNA of the sample are also obtained. A high correlation was obtained between the concentrations.
  • FIG. 19 (B) shows the result of adding nickel (II) phthalocyanine tetrasulfonitic acid tetrasodium salt after the structure of human telomeric DNA contained in the sample solution was changed to an anti-parallel G-quadruplex by annealing as described above.
  • Nickel (II) phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt is added before the annealing treatment (that is, in the case of the procedure shown in FIG. 10A), as in the case of FIG. A high correlation was obtained between the obtained absorbance value at 691.5 nm and the human telomeric DNA concentration of the sample.
  • this phthalocyanine solution and the above-mentioned Anti-G-quadruplex solutions D, E, F, G and NC solutions were mixed, and the absorbance at 480 to 800 nm was measured for this mixed solution.
  • the measurement results are shown in FIG. From this, it can be seen that two peaks appear in the range of 660 to 740 nm except for the NC solution containing no DNA, and these peaks are larger in the order of Anti-G-quadruplex solution D> E> F> G. From the above results, it can be seen that anti-parallel G-quadruplex-forming DNA in the solution can be detected by using Phthalocyanine tetrasulfonic acid.
  • FIG. 20 (B) the relationship between the absorbance value at 677.5 nm and the human telomere DNA concentration of the sample in each graph obtained in FIG. 20 (A) is shown in FIG. 20 (B).
  • the absorbance value at 710.0 nm and the human telomere of the sample are shown.
  • the relationship of the DNA concentration is shown in FIG. This shows that there is a high correlation between the two. Therefore, it can be seen that the concentration of single-stranded DNA forming the anti-parallel G-quadruplex can be quantitatively detected by using Phthalocyanine tetrasulfonic acid.
  • ⁇ Detection with anionic cobalt phthalocyanine> a solution (total amount 20 ⁇ l) of 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7 containing 15 ⁇ M Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid (anionic planar phthalocyanine having cobalt as a coordination metal and a carboxyl group as a functional group) was prepared. did.
  • this phthalocyanine solution and the above-mentioned Anti-G-quadruplex solutions B, C, D, G and NC solutions were mixed, and the absorbance at 480 to 800 nm was measured for this mixed solution.
  • FIG. 33 (B) shows the relationship between the absorbance value at 684.5 nm of each graph obtained in FIG. 33 (A) and the human telomeric DNA concentration of the sample.
  • FIG. 33 (B) shows the result of adding Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid after the structure of the human telomeric DNA contained in the sample solution is changed to an anti-parallel G-quadruplex by annealing as described above.
  • the peak rise in the range of 640 to 720 nm observed when Cobalt (II) phthalocyanine acid is used is Copper (II) phthalocyanine-3,4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfoacidoidet. It is smaller than the result of using salt or Nickel (II) phthalocyanine tetrasulfonic acidratetrasodium salt or Phthacyanine tetrasulfonic acid. This is probably because the synthesized Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid was not sufficiently purified.
  • peaks were observed in the range of 640 to 740 nm.
  • Example 1 it was found that anti-parallel G-quadruplex can be detected using any anionic planar phthalocyanine except when anionic iron phthalocyanine is used.
  • Zinc (II) phthalocyanine tetrasulfonicacid was used, a high correlation was observed between the absorbance value at a specific wavelength within the peak range and the human telomeric DNA concentration in the sample.
  • Example 1 except for the case where anionic iron phthalocyanine is used, the concentration of single-stranded DNA that forms an antiparallel G-quadruplex present in the sample solution with any anionic phthalocyanine is used. It was found that can be detected quantitatively.
  • Example 2 In this example, an anionic phthalocyanine was used to try to detect DNA forming an anti-parallel G-quadruplex and a parallel G-quadruplex mixed in the solution.
  • a solution in which DNA forming an anti-parallel G-quadruplex and DNA forming a parallel G-quadruplex was mixed was prepared by the following procedure.
  • telomere DNA a 50 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7 solution (total volume 100 ⁇ l) containing human telomere DNA was prepared.
  • human telomeric DNA concentrations contained in this solution were prepared as 1, 2, 10, 25, 50, and 100 ⁇ M, respectively.
  • a 50 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7 solution containing no DNA was also prepared. These solutions were then annealed.
  • the anti-parallel G-quadruplex shows a positive peak near 295 nm and a negative peak near 265 nm in the CD measurement result.
  • the parallel type G-quadruplex shows a positive peak around 260 nm and a negative peak around 240 nm.
  • both the positive peak near 295 nm and the negative peak near 240 nm increases as the human telomeric DNA concentration increases. This means that if the concentration of human telomere DNA initially contained is large, both the parallel-type G-quadruplex-forming DNA and the anti-parallel type G-quadruplex-forming DNA concentration in the solution obtained after the annealing treatment are increased. It is shown that.
  • NC-2 solution a solution obtained as a result of the above annealing treatment on a solution containing no DNA prepared as a negative control is referred to as NC-2 solution.
  • FIG. 13 (B) shows that there is a high correlation between the two. Therefore, the concentration of single-stranded DNA forming anti-parallel type and parallel type G-quadruplex is quantitatively determined by using Copper (II) phthalocyanine-3,4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfonic acidontetrasodium salt. It can be seen that it can be detected.
  • Copper (II) phthalocyanine-3,4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfonic acidontetrasodium salt It can be seen that it can be detected.
  • FIG. 13B shows the structure of human telomeric DNA contained in the sample solution as described above after annealing to change the structure into anti-parallel and parallel G-quadruplexes, and then Copper (II) phthalocyanine-3, 4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′ — The result of adding tetrasulfonic acid tetrasodium salt.
  • Copper (II) phthalocyanine-3, 4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfonic acid tetrasodium salt is added before the annealing treatment, as in FIG. 13B, A high correlation was obtained between the obtained absorbance value at 689.5 nm and the human telomeric DNA concentration of the sample.
  • FIG. 14 (B) shows that there is a high correlation between the two. Therefore, it can be seen that the concentration of single-stranded DNA forming the anti-parallel type and parallel type G-quadruplex can be quantitatively detected by using Nickel (II) phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt.
  • FIG. 14B shows the structure of human telomeric DNA contained in the sample solution as described above after annealing to change the structure into an anti-parallel type and parallel type G-quadruplex, followed by the addition of Nickel (II) phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt This is the result.
  • Nickel (II) phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt was added before annealing treatment, the absorbance value at 677.5 nm obtained and the human telomeric DNA of the sample were also obtained, as in FIG. 14B. A high correlation was obtained between the concentrations.
  • ⁇ Detection by anionic phthalocyanine having no coordination metal First, a solution of 50 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7 containing 15 ⁇ M Phthalocyanine tetrasulfonic acid (total amount 20 ⁇ l) was prepared. Next, this phthalocyanine solution and the above-mentioned Anti-Para-G-quadruplex solutions B, C, D, F and NC-2 solutions were mixed, and the absorbance at 480 to 800 nm was measured for this mixed solution.
  • FIG. 15B the relationship between the absorbance value at 708.0 nm of each graph obtained in FIG. 15A and the human telomeric DNA concentration of the sample is shown in FIG. 15B, and the absorbance value at 675.0 nm and the human telomeric DNA of the sample are shown.
  • the density relationship is shown in FIG. This shows that there is a high correlation between the two. Therefore, it can be seen that the concentration of single-stranded DNA forming the anti-parallel type and parallel type G-quadruplex can be quantitatively detected by using Phthalocyanine tetrasulfonic acid.
  • ⁇ Detection with anionic cobalt phthalocyanine First, a solution (total amount 20 ⁇ l) of 50 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7 containing 15 ⁇ M Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid was prepared. Next, this phthalocyanine solution and the above-mentioned Anti-Para-G-quadruplex solutions B, C, D, E and NC-2 solutions were mixed, and the absorbance at 480 to 800 nm was measured for this mixed solution.
  • FIG. 34 (B) shows the structure of human telomeric DNA contained in the sample solution as described above after annealing to change the structure into anti-parallel and parallel G-quadruplex, and then Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid was added. It is a result. However, even when Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid was added before the annealing treatment, the absorbance value at 679.0 nm obtained and the human telomeric DNA concentration of the sample, as well as in the case of FIG. 34 (B), A high correlation was obtained.
  • the peak increase in the range of 640 to 720 nm observed when Cobalt (II) phthalocyanine acid is used is Copper (II) phthalocyanine-3,4 ', 4' ', 4' ''-tetrasulfodiacid acid. It is smaller than the case of using salt or Nickel (II) phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt or Phthalocyanine tetrasulfonic acid. This is probably because the synthesized Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid was not sufficiently purified.
  • a peak in the range of 640 to 740 nm was observed only when mixed with the Para-G-quadruplex solution, so from the above results, any anionic phthalocyanine was used with any anionic phthalocyanine except when anionic iron phthalocyanine was used. It was found that the anti-parallel type and the parallel type G-quadruplex mixed in can be detected.
  • Zinc (II) phtalocyaninetrasulfonicacid when Zinc (II) phtalocyaninetrasulfonicacid was used, a high correlation was observed between the absorbance value at a specific wavelength within the peak range and the human telomeric DNA concentration in the sample. Therefore, it was found that the concentration of single-stranded DNA forming the anti-parallel type and parallel type G-quadruplex present in the sample solution can be quantitatively detected even when using Zinc (II) phtalocyaninetrasulfonicacid.
  • Example 3 From the results of Example 1 and Example 2 above, it was found that G-quadruplex can be detected regardless of parallel type or anti-parallel type using any anionic phthalocyanine other than anionic iron phthalocyanine.
  • Example 3 in order to confirm the specificity of these anionic phthalocyanines for G-quadruplex, an experiment for detecting single-stranded DNA and double-stranded DNA DNA using anionic phthalocyanines was conducted. For this purpose, first, a solution containing single-stranded DNA and a solution containing double-stranded DNA were prepared by the following procedure.
  • a 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7 solution (100 ⁇ l total volume) is prepared at a concentration of 5 ° C., incubated at 90 ° C. for 5 minutes, cooled to 0 ° C. at a rate of 2 ° C./min, and finally 0 ° C. And incubated for 2 hours. Since the two types of DNA have a complementary relationship, as a result of this incubation, both DNAs form double-stranded DNA in the solution (hereinafter, this solution is referred to as a double-stranded DNA solution).
  • Example 1 the result of using the NC solution in Example 1 as a negative control is also shown. From this, it can be seen that both the single-stranded DNA solution and the double-stranded DNA solution have almost the same results as those of the NC solution, even though high concentration DNA of 50 ⁇ M is contained. Therefore, based on the above results and the results of Example 1 and Example 2, detection of G-quadruplex-forming DNA using Copper (II) phthalocyanine-3,4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfuric acid tetrasodium salt Is very specific.
  • Copper (II) phthalocyanine-3,4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfuric acid tetrasodium salt Is very specific.
  • Example 1 the result of using the NC solution in Example 1 as a negative control is also shown. From this, it can be seen that both the single-stranded DNA solution and the double-stranded DNA solution have almost the same result as that of the NC solution, even though a high concentration of DNA of 50 ⁇ M is contained. Therefore, from the above results and the results of Example 1 and Example 2, it can be seen that the detection of G-quadruplex-forming DNA using Phthalocyanine tetrasulfonic acid has extremely high specificity.
  • Example 4 In Example 1 and Example 2 above, parallel-type and anti-parallel type G-quadruplex DNAs were prepared using single-stranded DNA having the same sequence as that of the human telomere part, and the coordination metal was other than iron. It was shown that these can be detected by anionic phthalocyanine, or that the single-stranded DNA can be quantitatively detected based on the detection result. In this Example 4, whether the results of Example 1 and Example 2 are limited to G-quadruplex consisting of the sequence of the human telomere part, or similar to G-quadruplex consisting of other than the sequence of the human telomere part. We examined whether the results were obtained.
  • G4T4G4 DNA a single-stranded DNA consisting of the 5′-ggggttttgggg-3 ′ sequence (SEQ ID NO: 6) and 2.5 ⁇ M Copper (II) phthalocyanine-3, 4 ′, 4 ′′,
  • G4T4G4 DNA sequence is different from the sequence of the human telomere part, it is known to form a parallel G-quadruplex by annealing treatment in the presence of K + .
  • the above solutions were prepared with G4T4G4 DNA concentrations of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 ⁇ M, respectively.
  • FIG. 25B shows the relationship between the absorbance value at 687 nm of each graph obtained in FIG. 25A and the G4T4G4 DNA concentration of the sample. This shows that there is a high correlation between the two. Therefore, it can be seen from this result that the concentration of G4T4G4 DNA can be quantitatively detected by using Copper (II) phthalocyanine-3, 4 ', 4 ", 4"'-tetrasulfonic acid tetrasodium salt.
  • Copper (II) phthalocyanine-3, 4 ', 4 ", 4"'-tetrasulfonic acid tetrasodium salt Copper (II) phthalocyanine-3, 4 ', 4 ", 4"'-tetrasulfonic acid tetrasodium salt.
  • the G4T4G4 DNA concentration was 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25 ⁇ M.
  • the results are shown in FIG. From this, it can be seen that a peak appears in the range of about 640 to 720 nm, except when the G4T4G4 DNA is 0 ⁇ M.
  • FIG. 26B the relationship between the absorbance value at 677.5 nm of each graph obtained in FIG. 26A and the G4T4G4 DNA concentration of the sample is shown in FIG. 26B. This shows that there is a high correlation between the two. Therefore, it can be seen from this result that the G4T4G4 DNA concentration can be quantitatively detected by using Nickel (II) phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt.
  • the G4T4G4 DNA concentrations were 0, 1, 2, 10, and 25 ⁇ M.
  • the results are shown in FIG. From this, it can be seen that two peaks appear in the range of about 660 to 740 nm except when the G4T4G4 DNA is 0 ⁇ M.
  • the concentration of Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid was 30 ⁇ M.
  • the G4T4G4 DNA concentration was 0, 5, 10, 25, and 50 ⁇ M.
  • the results are shown in FIG. From this, it can be seen that a peak appears in the range of about 640 to 720 nm, except when the G4T4G4 DNA is 0 ⁇ M.
  • the peak increase in the range of 640 to 720 nm observed when Cobalt (II) phthalocyanine acid is used is Copper (II) phthalocyanine-3,4 ', 4' ', 4' ''-tetrasulfodiacid acid. It is smaller than the case of using salt or Nickel (II) phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt or Phthalocyanine tetrasulfonic acid. This is probably because the synthesized Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid was not sufficiently purified.
  • Examples 1 to 4 are summarized in FIG. 29 together with a diagram showing the structure of each phthalocyanine.
  • ⁇ indicates that in the DNA detection experiment of each example, an absorbance peak was obtained within a wavelength range of 640 to 740 nm depending on the presence of the target DNA.
  • x indicates that such a peak was not obtained.
  • “-” Indicates that no experiment was performed.
  • anionic iron phthalocyanine regardless of the type of anionic functional group (sulfo group or carboxyl group) and the type of coordination metal, no matter what anionic phthalocyanine is used, G- It can be seen that quadruplex can be specifically detected.
  • G-quadruplex does not depend on the parallel type or the anti-parallel type, and the sequence is not limited to the human telomeric DNA sequence. It can be seen that the G-quadruplex can be detected with the G-quadruplex described with reference to FIG.
  • the first is about the absorbance of phthalocyanine.
  • phthalocyanines When phthalocyanines are usually dissolved in a solution, they have a stacking interaction with each other due to their wide ⁇ plane and are intermolecularly associated. A typical UV absorption spectrum at this time is shown in FIG.
  • a surfactant when added to the phthalocyanine solution in this state, a peak appears around 640 to 740 nm (FIG. 30B). It is known that this is a peak indicating that the association of phthalocyanines is dissolved by the addition of the surfactant (in other words, the monomer state).
  • the G-quadruplex has a structure in which a wide ⁇ plane called a G-qartet plane is stacked.
  • a G-qartet plane is stacked.
  • Such a structure is a structure in which molecules having other ⁇ planes easily intercalate between the G-qartet plane and the G-qartet plane.
  • molecules such as cationic anthraquinones and cationic porphyrins intercalate into G-quadruplexes due to the effects of their electrostatic and stacking interactions.
  • the results of Examples 1 to 4 show that the anionic phthalocyanine other than anionic iron phthalocyanine specifically detects G-quadruplex by the mechanism shown in FIG. It shows that you are doing. That is, when G-quadruplex does not exist, these anionic phthalocyanines are associated, and the UV absorption spectrum thereof is as shown in FIG. However, when G-quadruplex is mixed with this, at least a part of these anionic phthalocyanines are intercalated in Gquadruplex. Since the intercalated anionic phthalocyanine is the same as the monomer state, it shows an absorbance peak at 640 to 730 nm.
  • Iron (III) phthalocyanine-4,4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfonic acid, compound with oxygen monosodium salt hydrate used in this example has oxygen in the coordination metal iron.
  • This is a shuttlecock type phthalocyanine.
  • all the other phthalocyanines used in this example are planar.
  • the shuttlecock type phthalocyanine has a structure protruding from the central portion and has poor planarity. Accordingly, the planar phthalocyanine can be intercalated in Gquadruplex as shown in the mechanism shown in FIG. 31, whereas the shuttlecock phthalocyanine represented by the anionic iron phthalocyanine used in this example is not planar.
  • the inventor dared to use an anionic phthalocyanine contrary to conventional common sense, and found the difference in the interaction between planar phthalocyanine and shuttlecock phthalocyanine for G-quadruplex for the first time in the world.
  • the present inventors have completed a highly specific method for detecting G-quadruplex using the anionic planar phthalocyanine of the invention.
  • the specific detection method for G-quadruplex-forming DNA is useful as an analysis method in the biotechnology field.

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Abstract

　本発明は、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出する方法等を提供するものである。 　本発明のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法は、 （ａ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、 （ｂ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、 （ｃ）前記（ｂ）工程後の混合液の６４０～７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、 を含むことを特徴とする。

Description

Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法およびテロメラーゼ活性測定方法
　本発明はＤＮＡの高次構造の検出方法およびそれを利用した診断方法に関わる。
　テロメアは真核生物の染色体の両末端部分に位置するＤＮＡとさまざまなタンパク質からなる構造である。これまでの研究より、このテロメア構造がある種のＤＮＡ分解酵素や不適切なＤＮＡ修復などから染色体を保護していることが明らかになっている。またこのテロメア部分は細胞分裂のたびに短くなることから細胞の老化や不死化と呼ばれる現象において重要な役割を担っていると考えられている。
　一方、テロメアを構造的な側面から見るといくつかの特徴を有していることが分かる。すなわち、染色体ＤＮＡ中のほとんどの部分では、互いに相補的な二本のＤＮＡ鎖間において、アデニン（以下、Ａと呼ぶ）塩基とチミン（以下、Ｔと呼ぶ）塩基、グアニン（以下、Ｇと呼ぶ）塩基とシトシン（以下、Ｃと呼ぶ）塩基がそれぞれ特異的に水素結合してワトソン－クリック型塩基対を形成し、さらにその塩基対間においてπ－πスタッキング相互作用が生じることで二重らせん構造が構築されている（図１）。
　しかし、テロメアＤＮＡにおいては、やはりその大部分は互いに相補的な二本鎖ＤＮＡからなるものの、その最末端部分はＤＮＡの３’末端が突出（オーバーハング）して一本鎖状態になっている。このオーバーハングした部分の長さや、テロメアの全長は種によって異なるが、ヒトの場合はオーバーハングした部分は５０－１００塩基程度、全長は初期の段階で約１００００塩基対程度である。そしてテロメア配列のもう一つの構造的特徴としては、オーバーハングしている側の鎖はＧを多く含む繰り返し配列からなり、したがってその相補鎖となるもう一方の鎖はＣを多く含む繰り返し配列であるという点である。
　具体的には、ヒトの場合はオーバーハングしている側の鎖が５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’ （配列番号：１）の繰り返し（Ｇリッチな配列）であり、もう一方は５’－ＣＣＣＴＡＡ－３’ （配列番号：１のアンチセンス鎖）の繰り返し（Ｃリッチな配列）となる。
　近年、テロメア部位中のＧリッチな配列が特に精力的に研究されている。その理由は、この配列がＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと呼ばれる四重鎖ＤＮＡ構造を形成できるということが明らかになってきたためである。Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ（グアニン四重鎖構造）には、四本のＤＮＡ鎖全ての５’から３’への方向が同じ方向を向いているパラレル型と呼ばれるものや、あるいは二本は同じ方向を向いているが残りの二本は反対方向を向いているアンチパラレル型と呼ばれるものなど複数のパターンが知られているが、いずれも図２に示すような特徴を有している。すなわち、４つのＧ塩基がフーグスティーン型の水素結合を介してＧカルテットと呼ばれる構造を形成し、さらにこのＧカルテット面どうしがπ－πスタッキング相互作用することによって構造を保持している。
　また、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造形成にはＧ－カルテット面とＧ－カルテット面の間において金属イオンの配位が必要であり、ＫイオンやＮａイオンなどが配位することが知られている。このようなＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘがテロメア内においてどのような条件下で形成され、またそれがどのような機能を果たしているのかについての詳細は現時点では不明である。しかしながら上述の染色体保護や細胞の老化などと関連する重要な構造ではないかと考えられている。
　またさらに、上記のようなＧリッチな配列はテロメアだけに存在するわけではないことも明らかになってきている。例えば、ガン原遺伝子であるｃ－ｍｙｃ中においてもＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するＧリッチ配列が存在する。また、これ以外にもｃ－ｋｉｔ、ｂｃｌ－２、ＶＥＧＦ、Ｈ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のプロモーター領域においてＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するＧリッチ配列が発見されている。これらはいずれも細胞のガン化などに関連する遺伝子であり、このことは、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが人体に対して重要な役割を果たしていることを示唆している。そして現在のところ、さらに、３０万を超えるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成可能なＧリッチ配列が存在すると予想されており（以下、このような配列をＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列と呼ぶ）、これらが実際にＧｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するのか、そして形成するのであればその構造がどのような機能を果たしているのかが注目されている。
　このような技術背景において最も必要とされる技術の一つが、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出する方法である。すなわち試料中のＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを含んでいるか否か、あるいは試料中のＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列からなるＤＮＡが実際にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べる技術が必要とされる。例えば、前者について従来技術を用いて調べるとすると、次のように示すようになる。すなわち、目的のＤＮＡを含む試料溶液を用意し、この溶液のＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ　Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ：円二色性）スペクトルを測定する。そして、得られたＣＤスペクトルがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特有のものであるか否かについて解析すればよい。しかし、ＣＤスペクトルを測定する装置は非常に高価かつ大型である。また解析時間も３０分程度と長時間を要する上に、一度に解析できる試料数も通常一種類であるため、ハイスループット性の面で著しく劣る。さらに四重鎖の形によっては、ＣＤを用いることでＤＮＡの他の形からと識別することができないという問題もある。
　この課題に対する解決手段としては、図３に示すように、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの有無に依存して、安価な装置で解析可能なシグナル（吸光度や蛍光強度など）を発するプローブ材料を上記溶液中に混合しておき、この溶液中のシグナルを検出する方法が挙げられる。このとき重要なのは、このプローブのＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する特異性である。すなわちゲノムＤＮＡ中には、その大部分を占める二本鎖ＤＮＡ構造と、上述のテロメア部位のオーバーハング部分に代表される一本鎖ＤＮＡ構造が存在するため、これらと比較した場合のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が重要となる。したがって、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのみの有無を調べたいにも関わらず、プローブのＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が低く、その結果、一本鎖や二本鎖ＤＮＡとも相互作用してシグナルを発してしまえば、溶液中のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを正確に検出するのは困難となるためである。
　また、試料中のＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡが実際にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて従来技術を用いて調べる場合は、図４に示すようになる。すなわち、まずＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列を有するＤＮＡを溶液中に用意する。その後、この溶液をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下におき、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせる。そして、反応後の溶液中にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが存在しているか否かについてＣＤスペクトル測定を行うことで解析すればよい。ただし、この場合においても、上述したとおり装置が高価、大型であるという課題、およびハイスループット面での課題が生じる。したがって、やはりこの場合においても、図３で示したＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出用プローブがあれば非常に有用である。
　具体的には、図５に示すように、このプローブを、上記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後の溶液に混合し、その結果発せられるシグナルを測定すればよい。このとき、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応前のＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡは、上述のとおり、一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡの何れの可能性もあり得るため、プローブのＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性は極めて重要である。つまり、上記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後において、Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを全く形成しなかった場合や、あるいは一部しか形成しなかった場合に、上記プローブがＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡのもとの構造（一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡ）に対しても相互作用しシグナルを発してしまえば、形成されたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを正確に検出するのは困難となるためである。逆にプローブのＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する特異性が極めて高い場合、図５に示す方法において、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応前から溶液中にプローブを混合しておくことも可能となり、操作の煩雑性も防ぐことができる。
　上記のとおり、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するＧリッチ配列は、染色体中のガンや老化などに関わる部位において発見されており、それゆえ将来的には患者の染色体中のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを調べることで疾病診断を行うことが予想される。したがって、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できる方法の開発は非常に重要な課題と言える。また上記プローブの特性として、単にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘやＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列ＤＮＡを特異的に検出できるだけではなく、それらの存在量に依存してシグナルの増大あるいは減少といった変化があれば、単なる検出のみならず定量的な解析も可能となるためより有用となることは言うまでもない。
　また、テロメラーゼと呼ばれる酵素が知られている。この酵素はＲＮＡと逆転写酵素などからなる複合体であり、細胞分裂によって短くなるテロメア部位のＧリッチな側の繰り返し配列を複製し、伸ばしていくことができる（すなわちヒトの場合、テロメラーゼは５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’配列（配列番号：１）を付加していく。以下、この付加反応をテロメラーゼ反応と呼ぶ）。この酵素はヒトの通常の体細胞には見られないが、生殖細胞やほとんどのガン細胞において大量に発現していることが知られており、そのためテロメラーゼ活性を指標として被験者の細胞がガン化しているか否かについて調べることができる。
　この従来方法として、ＴＲＡＰアッセイと呼ばれるものが知られている。ＴＲＡＰアッセイについて図６を用いて説明する。ＴＲＡＰアッセイでは、まずテロメラーゼの鋳型となる合成一本鎖ＤＮＡを含む溶液を調製する。この一本鎖ＤＮＡは通常５’－ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ－３’（配列番号：２）という配列からなるもので、ＴＳプライマーと呼ばれる（したがって、テロメラーゼはこのＴＳプライマーの３’末端に５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’配列（配列番号：１）を付加していく。非特許文献３を参照）。ただし、ＴＳプライマーはこの配列に限られる必要はなく、テロメラーゼの鋳型となる一本鎖ＤＮＡであればよい。
　次に、この溶液中にガン化していると疑われる細胞試料や組織試料からの抽出物を添加、混合し、テロメラーゼ反応が行われる条件下に置く。ここで、もしこれら試料がガン化しているのであればテロメラーゼ活性があるため、ＴＳプライマーを起点としたテロメラーゼ反応が起こる。一方、ガン化していなければテロメラーゼ反応は起こらない。そして最後にテロメラーゼ反応により伸長されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、この増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法により検出する。
　テロメラーゼ反応より得られるＤＮＡの長さはさまざまであるため、得られる電気泳動像は図７のようになる。すなわち、用いた試料のテロメラーゼ活性が強い場合、得られるＤＮＡ断片の長さは短いものから長いものまで広範囲にわたるラダー（はしご）状のバンドとして現われ、またそのバンドの濃さは濃い傾向にある。一方、活性の弱いテロメラーゼからは長いＤＮＡ断片は得られないため、短い範囲でのラダー状のバンドが現れ、またバンドの濃さは薄い傾向にある。したがって試料のガン化を判断するためには、ＴＲＡＰアッセイの結果より得られる電気泳動像のＤＮＡ断片の長さの範囲とバンドの濃さを解析すればよいのだが、これを定量的に解析することは困難であるため、あくまで定性的な判断となってしまう。
　このような点に関して、図３および図５で説明したＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの特異的検出用プローブが、単にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特異的なだけではなく、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの存在量に依存してそのシグナル量を変える場合、テロメラーゼの活性を指標にしたガン診断においても有用である。その流れ図を図８に示す。
　この方法においても、まずＴＳプライマーを含む溶液を調製する、次にこの溶液中へ細胞試料や組織試料からの抽出物を添加、混合する、そして、この溶液についてテロメラーゼ反応を行わせた後、ＰＣＲ法によってテロメラーゼ反応により伸長されたＤＮＡを増幅させる、という操作までは図６と同じである。しかし、図８に示す方法では、このＰＣＲ後の溶液について電気泳動するのではなく、図５の場合と同様にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせる。その結果、形成されたＧ－ｑｕａｄｒｕｌｅｘをＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出用プローブを用いて検出する。ここで、形成されたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量はテロメラーゼ活性の強さを反映しているため、上記プローブがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量に応じてそのシグナル量を変えるのであれば、この方法により定量的なテロメラーゼ活性の解析およびガン化の判断を行うことが可能となる。
　言うまでもなくここでもプローブのＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が極めて重要となる。つまり、細胞試料がガン化していない場合、テロメラーゼ反応は進行しないことになるが、その結果、一本鎖ＤＮＡであるＴＳプライマーがそのまま反応液中に残る。また、さらにその後のＰＣＲ反応も進行しないため、ＰＣＲ反応用のプライマーも一本鎖ＤＮＡの状態で残る。したがって、細胞試料がガン化していない場合は、最終的に反応溶液中に大量の一本鎖ＤＮＡが存在していることになり、上記プローブがこれら一本鎖ＤＮＡと反応しシグナルを出してしまえば、定量的なテロメラーゼ活性解析およびガン診断が困難となるためである。
　以上、説明してきたように一本鎖、二本鎖ＤＮＡのいずれかが溶液中に存在しえる状況において、特異的にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出可能な方法は非常に有用である。またさらに定量性も備えていれば定量的なＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出が可能となるだけでなく、従来のＴＲＡＰアッセイの課題を解決できる。そのため、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと特異的に相互作用し、かつ、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量に依存してシグナルを変化させるプローブを用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法の開発が精力的になされている。
　例えば、特許文献１ではＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特異的な新規化合物を提案している。しかし、このプローブは確かに一本鎖、二本鎖ＤＮＡに比べＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの結合選択性は高いものの、一本鎖、二本鎖ＤＮＡに対しても結合が確認できる。
　また、非特許文献１では下記（化１）の構造からなるカチオン性ポルフィリンのＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性について報告がなされている。この文献ではＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：表面プラスモン共鳴）現象を利用して、金基板上での上記ポルフィリンと二本鎖構造ＤＮＡあるいはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとの結合を解析しており、その結果、確かに二本鎖ＤＮＡの場合に比べＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの場合の方がシグナルの変化は大きいものの、二本鎖ＤＮＡの場合においてもシグナルの変化は観察され、十分な特異性は確認されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　また、非特許文献２では下記（化２）および（化３）の構造からなるカチオン性ポルフィリンなどのＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性について報告がなされている。この文献でも、やはりＳＰＲ現象や紫外可視吸光スペクトルを解析することで、これらポルフィリンのＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異的結合が調べられているが、ＤＮＡ濃度が５μＭ以上の条件下において二本鎖ＤＮＡとこれらポルフィリンが非特異的に結合してしまうことが記されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　以上のように、これまでＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を目的として開発されてきたプローブはいずれもカチオン性のものである。これはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘがアニオン性であり、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへ結合させるという観点から考えた場合、カチオン性であることが非常に有利であると考えられるためである（すなわちアニオン性にすると静電的な反発が起こり、結合反応において不利と考えられる）。Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに限らず全てのＤＮＡ鎖はアニオン性であるため、これらをターゲットとしたプローブを開発する場合はカチオン性にすることが最も重要な設計指針であり、アニオン性にするという考え方はなかった。
国際公開第２００４／０７２０２７号パンフレット
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９，１５０２－１５０３ Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６８５－４６８７ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５，２５９５－２５９７
　以上のように、一本鎖、二本鎖ＤＮＡのいずれかが溶液中に存在しえる状況において、特異的にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出可能な方法は非常に有用である。またさらに定量性も備えていれば定量的なＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出が可能となるだけでなく、従来のＴＲＡＰアッセイの課題を解決できる。そのため、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと特異的に相互作用し、かつＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの量に依存してシグナルを変化させるプローブを用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法の開発が精力的になされているものの、これまで提案されてきた方法ではいずれの場合もＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できない。そこで本発明者は鋭意検討した結果、アニオン性の平面型フタロシアニンがアニオン性であるにも関わらず、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと極めて高い特異性をもって相互作用し、なおかつＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの濃度に依存して吸光度が変化することを見出し、本発明を達成するに至った。
　上記課題を解決する本発明は、一本鎖構造か二本鎖構造かＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡを含む試料溶液中の、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出する方法であって、
　前記方法は、
（ａ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｂ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程後の混合液の６４０～７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｄ）前記６４０～７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法である。
　また、本発明は、試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べることにより、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出する方法であって、
　前記方法は、
（ａ）前記試料溶液をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下に置く工程と、
（ｂ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｃ）前記（ａ）工程の前か後のいずれかにおいて、前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
（ｄ）前記（ａ）～（ｃ）の一連の工程後の混合液の６４０～７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｅ）前記６４０～７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法である。
　また、本発明は、試料溶液中のテロメラーゼ活性を測定する方法であって、
　前記方法は、
（ａ）前記試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）テロメラーゼの基質となるＤＮＡを含む基質溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記試料溶液と前記基質溶液を混合し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程と、
（ｄ）前記テロメラーゼ反応溶液をテロメラーゼによるＤＮＡ付加反応が行われる条件下に置く工程と、
（ｅ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
（ｆ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を、前記（ｄ）の工程後に得られる溶液と混合する工程と、
（ｇ）前記（ａ）～（ｆ）の一連の工程後の混合液の６４０～７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
（ｈ）前記６４０～７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするテロメラーゼ活性測定方法である。
　本発明では、前記アニオン性平面型フタロシアニンが、配位金属として銅、と錯形成しているもの、亜鉛、と錯形成しているもの、コバルト若しくはと錯形成しているもの、ニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンと錯形成しているもの、錯形成していないもの、からなる群より選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
　また本発明では、前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有していることが好ましい。
　本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
　本発明により、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的かつ定量的に検出する方法、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるＤＮＡを特異的かつ定量的に検出する方法、およびテロメラーゼ活性測定方法が提供される。
図１は、二本鎖ＤＮＡの構造を説明するための図である。 図２は、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を説明するための図である。 図３は、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ特異的プローブを用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの特異的検出方法を説明するための図である。 図４は、ＣＤ解析装置を用いたＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列の検出方法を説明するための図である。 図５は、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ特異的プローブを用いたＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列の検出方法を説明するための図である。 図６は、従来のテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図である。 図７は、従来のテロメラーゼ活性測定方法より得られる電気泳動像の一例を示す図である。 図８は、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ特異的プローブを用いたテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図である。 図９は、アニオン性フタロシアニンを用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの特異的検出方法を説明するための図である。 図１０は、アニオン性フタロシアニンを用いたＱｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列の検出方法を説明するための図である。 図１１は、アニオン性フタロシアニンを用いたテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図である。 図１２は、実施例２における、ＣＤ測定結果を示す図である。 図１３は、実施例２における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図１４は、実施例２における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図１５は、実施例２における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図１６は、実施例２における、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図１７は、実施例１における、ＣＤ測定結果を示す図である。 図１８は、実施例１における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図１９は、実施例１における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図２０は、実施例１における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図２１は、実施例１における、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図２２は、実施例３における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図２３は、実施例３における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図２４は、実施例３における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図２５は、実施例４における、アニオン性銅フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図２６は、実施例４における、アニオン性ニッケルフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図２７は、実施例４における、配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図２８は、実施例４における、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図２９は、本実施例１～４の結果をまとめた図である。 図３０は、フタロシアニンが会合した状態の場合と、分散した場合の典型的な吸光度スペクトルを表す図である。 図３１は、本発明のメカニズムを表す図である。 図３２は、平面型フタロシアニンとシャトルコック型フタロシアニンを表す図である。 図３３は、実施例１における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図３４は、実施例２における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図３５は、実施例３における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。 図３６は、実施例４における、アニオン性コバルトフタロシアニンを用いた場合の結果を示す図である。
以下本発明の実施の形態について、図９～１１を用いて説明する。
　（実施の形態１）
本実施の形態１では、一本鎖構造か二本鎖構造かＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡを含む試料溶液中の、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出する方法について図９を用いて説明する。
　本実施の形態１では、まず試料溶液とアニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を混合する。そして次にこの混合した溶液の６４０～７４０ｎｍの範囲内の特定の波長における吸光度を測定する。このとき、上記試料溶液中にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在すると、６４０～７４０ｎｍの範囲でこれに依存した吸収ピークが現れるが、その一方で、一本鎖構造、二本鎖構造のＤＮＡが存在したとしても上記波長範囲内ではそれらに依存したピークは現れない。したがって、このピークの有無を解析することで、上記試料溶液中にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在していたか否かを知ることができる。
　ピークの有無を解析するには、例えば、少なくともＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが含まれていないことが分かっている参照溶液を調製し、これについても上記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と混合した際の上記特定の波長における吸光度を測定し、これと試料溶液を用いた際に得られた吸光度値との差を求めればよい。
　さらに、この上記吸収ピークの吸光度値はＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。したがって、吸光度を解析することによりＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度を解析することができる。
　実施の形態１で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンから選ばれる。
　また、実施の形態１で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、スルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している。
　また、上記特定の波長は６４０～７４０ｎｍ範囲内であればいずれの波長でもよいが、現れるピークの極大値の波長に近いほうが高感度な測定が可能となるのでより好ましい。
　（実施の形態２）
本実施の形態２では、試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べる方法について図１０を用いて説明する。
　本実施の形態２では、まず上記試料溶液とアニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を混合し、これをＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置いてＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせた後、この混合溶液の６４０～７４０ｎｍの範囲内における特定の波長の吸光度を測定するか（図１０（Ａ））、あるいは上記試料溶液をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置いてＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応を行わせた後、アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と混合し、この混合溶液の６４０～７４０ｎｍの範囲内
における特定の波長の吸光度を測定する（図１０（Ｂ））。このとき、上記実施の形態１と同様に、この混合溶液中においてＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在すると、６４０～７４０ｎｍの範囲でこれに依存した吸収ピークが現れ、さらにこの吸収ピークの吸光度値はＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。
　しかし、その一方でこの混合溶液中に一本鎖構造、二本鎖構造のＤＮＡが存在したとしてもこの波長範囲内ではそれらに依存したピークは現れない。したがって、このピークの有無を解析することで、上記試料溶液中のＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成したか否かを知ることができる。ピークの有無を解析する手段としては、例えば、ＤＮＡが含まれていないか、あるいは含まれていたとしてもＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しないＤＮＡしか含まれていない参照溶液を調製し、この参照液について、上記試料溶液の場合と全く同じ工程を経て吸光度値を測定し、上記試料溶液の場合の吸光度値との差を解析すればよい。
　また、上記吸収ピークの吸光度値はＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。したがって、吸光度を解析することにより上記試料中のどれだけの濃度のＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成したかについて定量的に解析することができる。
　本実施の形態２で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１と同じく、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンから選ばれる。
　また、本実施の形態２で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１と同じく、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、スルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している。
　また、上記特定の波長は６４０～７４０ｎｍ範囲内であればいずれの波長でもよいが、現れるピークの極大値の波長に近いほうが高感度な測定が可能となるのでより好ましい。
　（実施の形態３）
本実施の形態３では、試料中に含まれるテロメラーゼ活性を定量的に解析する方法について図１１を用いて説明する。
　本実施の形態３では、まず上記試料とテロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを含む溶液を混合し、この混合溶液についてテロメラーゼ反応が行われる条件下に置く。このとき、上記試料中に活性を持つテロメラーゼが含まれていれば、この条件下に置いてテロメラーゼ反応が行われ、その結果、上記基質一本鎖ＤＮＡから５‘－ＴＴＡＧＧＧ－３’からなるＤＮＡが付加されていくが、その一方で、上記試料中において活性を持つテロメラーゼが存在しなければそのようなＤＮＡ付加は行われない。
　そして次に、上記テロメラーゼ反応後の混合溶液をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置く。ここで、仮に上記試料中に活性を持つテロメラーゼが含まれ、これによりテロメラーゼ反応が進んでいれば、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成され、その量は上記試料中のテロメラーゼ活性に依存する（活性が大きければ形成されるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ量も多くなる）。逆に例えば、上記試料中に活性を持つテロメラーゼが含まれておらず、その結果、上記テロメラーゼ反応が行われていなければ、ここでＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは形成されない。
　そして最後に、このＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後の混合溶液とアニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を混合し、この溶液の６４０～７４０ｎｍの範囲内における特定の波長の吸光度を測定すればよい。このとき、上記実施の形態１や２と同様に、この混合溶液中においてＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが存在すると、６４０～７４０ｎｍの範囲でこれに依存した吸収ピークが現れ、さらにこの吸収ピークの吸光度値はＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡ濃度が増大するにつれ大きくなる。しかし、その一方でこの混合溶液中に一本鎖構造、二本鎖構造のＤＮＡが存在したとしてもこの波長範囲内ではそれらに依存したピークは現れない。したがって、このピークの吸光度値を測定することで上記試料中のテロメラーゼ活性を定量的に解析することができる。
　ここで、図１１において上記アニオン性平面型フタロシアニン溶液はＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応後の混合溶液に対して加えられたが、上記アニオン性平面型フタロシアニン溶液を加えるタイミングはこれに限られない。すなわち、テロメラーゼ反応後であり、かつ、吸光度測定前までであれば、どのタイミングで上記試料溶液を含む混合溶液に加えてもよい。
　本実施の形態３で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１および実施の形態２と同じく、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンから選ばれる。
　また、本実施の形態３で用いられるアニオン性平面型フタロシアニンは、実施の形態１および実施の形態２と同じく、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、スルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している。
　また、上記特定の波長は６４０～７４０ｎｍ範囲内であればいずれの波長でもよいが、現れるピークの極大値の波長に近いほうが高感度な測定が可能となるのでより好ましい。
　［実施例］
　以下に記載する実施例で用いられるＤＮＡは、全て北海道システム・サイエンス株式会社の合成品である。また本実施例で用いられるフタロシアニンのうち、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔおよびＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔおよびＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－４，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｗｉｔｈ　ｏｘｙｇｅｎ　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｈｙｄｒａｔｅはシグマ・アルドリッチ（株）より購入した。Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄおよびＺｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄは（株）フナコシより購入した。Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄは合成した。合成方法は下記のとおりである。
　トリメリット酸６．４ｇ、尿素２０ｇ、塩化コバルト六水和物４．７５ｇおよびモリブデン酸アンモニウム四水和物０．８２ｇを１００ｍｌのニトロベンゼン中１７０～１８０℃の油浴中で４．５時間加熱し、放冷後、デカンテーションでニトロベンゼン層を除いた。残留物をメタノールおよび水で洗浄後、真空乾燥して８．６６ｇの固形物を得た。この固形物１．０ｇを５０％水酸化カリウム水溶液３０ｇ中、７０～７５℃で２時間攪拌後、９０ｍｌの水を添加、攪拌し、これをろ過した。ここで得られたろ液を３５～３７％塩酸で強酸性にすることで沈殿物を析出させ、これをろ取した。この沈殿物を１００ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶かして再度ろ過した。ここで得られたろ液を再び塩酸によって強酸性にし、析出した沈殿物をろ取した。これを大量の水で洗浄した後、真空乾燥することでＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを０．１ｇの粉末として得た。以下の実施例で用いられるＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄは全てこの合成により得られたものである。
　（実施例１）
本実施例では、アニオン性平面型フタロシアニンを用いて、溶液中に存在するアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡを検出することを試みた。そのためにまず以下の手順でアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡを含む溶液を調製した。
　＜アンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを含む溶液の調製＞
まず５’－ｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇ－３’の配列（配列番号：３）からなる一本鎖ＤＮＡを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製した。この配列はヒトのテロメア部分の配列と同様のものであり、そのため以降このＤＮＡをヒトテロメアＤＮＡと呼ぶ。ここで、この溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡ濃度は０．５、２、５、１０、２５、５０、１００μＭのものをそれぞれ用意した。ネガティブコントロールとしてＤＮＡを含まない５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液も調製した。
　次に、これらの溶液を９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした（以降、特に断りなく「アニーリング」あるいは「アニーリング処理」という表現が出てきた場合は、この一連の温度制御のことを言う）。
　次に、以上の結果得られた各溶液中のヒトテロメアＤＮＡがアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているかを確認するため、各溶液についてＣＤ解析を行った。その結果、図１７に示すように、ネガティブコントロールの溶液を除き、いずれの場合も２９５ｎｍ付近に正のピーク、２６５ｎｍ付近に負のピークが認められた。これはアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成されていることを示すものである。
　また、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が１００μＭであった溶液における上記正および負のピークの絶対値は最も大きく、その他については５０、２５、１０、５、２、０．５μＭの順で小さくなっている。このことは最初に含まれていたヒトテロメアＤＮＡ濃度が大きければ、得られるアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ濃度も大きいということを示している。
　以降、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が１００、５０、２５、１０、５、２、０．５μＭであった溶液について上記一連のアニーリング処理を行った結果得られた溶液をそれぞれＡｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇと呼ぶ。一方、ネガティブコントロールとして調製したＤＮＡが含まれていなかった溶液について上記一連のアニーリング処理を行った結果得られた溶液はＮＣ溶液と呼ぶ。
　次に、以上の工程より得られたＡｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液を用いて、アニオン性フタロシアニンによるアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出実験を行った。実験方法は下記のとおりである。
　＜アニオン性銅フタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（配位金属として銅を有し、官能基としてスルホ基のナトリウム塩を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図１８（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れた。また、このピークはＡｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ＞Ｄ＞Ｅ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出できることが分かる。
　さらに、図１８（Ａ）で得られた各グラフの６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１８（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　また、図１８（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図１８（Ｂ）の場合と同様に、得られた６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
　＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる検出＞
まず１５μＭのＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（配位金属としてニッケルを有し、官能基としてスルホ基のナトリウム塩を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図１９（Ａ）に示す。これより、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに、図１９（Ａ）で得られた各グラフの６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１９（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　また、図１９（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図１９（Ｂ）の場合と同様に、得られた６９１．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
　＜配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンによる検出＞
　まず１５μＭのＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（配位金属を持たず、官能基としてスルホ基を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。
　次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図２０（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、６６０～７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに、図２０（Ａ）で得られた各グラフの６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図２０（Ｂ）に示し、７１０．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図２０（Ｃ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　また、図２０（Ｂ）および図２０（Ｃ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図２０（Ｂ）および図２０(Ｃ)の場合と同様に、得られた６７７．５ｎｍおよび７１０．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が得られた。
　＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる検出＞
　まず１５μＭのＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（配位金属としてコバルトを有し、官能基としてカルボキシル基を有するアニオン性平面型フタロシアニン）を含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図３３（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いることで溶液中のアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに、図３３（Ａ）で得られた各グラフの６８４．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図３３（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。また、図３３（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを添加させた結果であるが、アニーリング処理をする前にＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを添加した場合（すなわち図１０（Ａ）で示す手順の場合）においても、図３３（Ｂ）の場合と同様に、得られた６８４．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が得られた。
　ところで、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いた場合に見られた６４０～７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔやＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔやＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いた場合の結果より小さい。これは合成したＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄが十分に精製されていなかったためと考えられる。
　＜アニオン性鉄フタロシアニンによる検出＞
　まず１５μＭのＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－４，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｗｉｔｈ　ｏｘｙｇｅｎ　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｈｙｄｒａｔｅ（配位金属として鉄を有し、官能基としてスルホ基を有するアニオン性フタロシアニン）を含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液ＢおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図２１に示す。これよりＡｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂの場合もＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果であった。以上の結果より、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－４，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｗｉｔｈ　ｏｘｙｇｅｎ　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｈｙｄｒａｔｅを用いても溶液中のアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができないことが分かる。
　以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（＝配位金属として亜鉛を有し、官能基としてスルホ基を有するアニオン性平面型フタロシアニン）についても同様の実験を行った結果、Ａｎｔｉ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液と混合した場合のみ６４０～７４０ｎｍの範囲でピークが観察された。
　したがって、実施例１の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性平面型フタロシアニンを用いてもアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できることが分かった。また、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いた場合も、上記ピーク範囲内の特定の波長における吸光度値とサンプル中のヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が認められた。
　したがって、以上実施例１の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いても試料溶液中に存在するアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かった。
　（実施例２）
　本実施例では、アニオン性フタロシアニンを用いて、溶液中に混在するアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡを検出することを試みた。そのためにまず以下の手順でアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡとパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているＤＮＡが混在している溶液を調製した。
　＜アンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡとパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡが混在している溶液の調製＞
　まず、ヒトテロメアＤＮＡを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製した。ここで、この溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡ濃度は１、２、１０、２５、５０、１００μＭのものをそれぞれ用意した。ネガティブコントロールとしてＤＮＡを含まない５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液も調製した。次にこれらの溶液をアニーリング処理した。
　次に、以上の結果得られた各溶液中のヒトテロメアＤＮＡがパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているかを確認するため、各溶液についてＣＤ解析を行った。その結果を、図１２に示す。
　ここで、実施例１でも説明したとおり、アンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの場合は、そのＣＤ測定結果において２９５ｎｍ付近に正のピーク、２６５ｎｍ付近に負のピークを示すことが知られている。一方、パラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの場合は、２６０ｎｍ付近に正のピーク、２４０ｎｍ付近に負のピークを示すことが知られている。これらの知見を踏まえると、図１２に示されたＣＤ結果では、ネガティブコントロールの溶液以外においては、２４０ｎｍ付近に負のピーク、２９５ｎｍ付近に正のピークが存在することから、これらはパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが混在していると考えられる。
　また、２９５ｎｍ付近の正のピーク、２４０ｎｍ付近の負のピークのいずれについても、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が大きくなるにつれ、その絶対値が大きくなっている。このことは、最初に含まれていたヒトテロメアＤＮＡ濃度が大きければ、上記アニーリング処理後に得られる溶液中のパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡとアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ濃度の何れもが大きくなるということを示している。
　以降、ヒトテロメアＤＮＡ濃度が１００、５０、２５、１０、２、１μＭであった溶液について上記アニーリング処理を行った結果得られた溶液をそれぞれＡｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆと呼ぶ。一方、ネガティブコントロールとして調製したＤＮＡが含まれていなかった溶液について上記アニーリング処理を行った結果得られた溶液はＮＣ－２溶液と呼ぶ。
　次に、以上の工程より得られたＡｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＮＣ－２溶液を用いて、アニオン性フタロシアニンによるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出実験を行った。実験方法は下記のとおりである。
　＜アニオン性銅フタロシアニンによる検出＞
まず、１５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＦおよびＮＣ－２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図１３（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ－２溶液の場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。
　以上の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに、図１３（Ａ）で得られた各グラフの６８９．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１３（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　また、図１３（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを添加した場合においても、図１３（Ｂ）の場合と同様に、得られた６８９．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
　＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる検出＞
　まず、１５μＭのＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＮＣ－２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図１４（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ－２溶液の場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｅの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに、図１４（Ａ）で得られた各グラフの６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図１４（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　また、図１４（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを添加した場合においても、図１４（Ｂ）の場合と同様に、得られた６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が得られた。
　＜配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンによる検出＞
　まず、１５μＭのＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＦおよびＮＣ－２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図１５（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ－２溶液の場合を除き、６６０～７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに、図１５（Ａ）で得られた各グラフの７０８．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を図１５（Ｂ）に示し、６７５．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を図１５（Ｃ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　また、図１５（Ｂ）および図１５(Ｃ)は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを添加した場合においても図１５（Ｂ）および図１５(Ｃ)の場合と同様に、得られた７０８．０ｎｍおよび６７５．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
　＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる検出＞
　まず、１５μＭのＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＮＣ－２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図３４（Ａ）に示す。これよりＤＮＡを含まないＮＣ－２溶液の場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＡｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｅの順番で大きいことが分かる。
　以上の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いることで溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに、図３４（Ａ）で得られた各グラフの６７９．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を、図３４（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いることでアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　また、図３４（Ｂ）は、上述のとおり試料溶液中に含まれるヒトテロメアＤＮＡをアニーリングによりアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに構造変化させた後、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを添加させた結果である。しかし、アニーリング処理をする前にＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを添加した場合においても、図３４（Ｂ）の場合と同様に、得られた６７９．０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が得られた。
　ところで、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いた場合に見られた６４０～７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔやＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔやＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いた場合より小さい。これは合成したＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄが十分に精製されていなかったためと考えられる。
　＜アニオン性鉄フタロシアニンによる検出＞
　まず１５μＭのＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－４，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｗｉｔｈ　ｏｘｙｇｅｎ　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｈｙｄｒａｔｅを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Ａｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液ＢおよびＮＣ－２溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図１６に示す。これよりＡｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液ＢおよびＮＣ－２溶液の場合の両方より得られる結果はほぼ同じであることが分かる。したがって以上の結果より、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－４，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｗｉｔｈ　ｏｘｙｇｅｎ　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｈｙｄｒａｔｅを用いて溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することはできないことが分かる。
　以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（＝官能基としてスルホ基を有し、配位金属として亜鉛を有するアニオン性平面型フタロシアニンを用いて、同様の実験を行った結果、Ａｎｔｉ－Ｐａｒａ－Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液と混合した場合のみ６４０～７４０ｎｍの範囲でピークが観察された。したがって以上の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いても溶液中に混在しているアンチパラレル型、パラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できることが分かった。
　また、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いた場合も、上記ピーク範囲内の特定の波長における吸光度値とサンプル中のヒトテロメアＤＮＡ濃度との間には高い相関関係が認められた。したがって、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いても試料溶液中に存在するアンチパラレル型およびパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する一本鎖ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かった。
　（実施例３）
　上記実施例１および実施例２の結果より、アニオン性鉄フタロシアニン以外のいずれのアニオン性フタロシアニンを用いてもパラレル型、アンチパラレル型に関わらずＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できることが分かった。本実施例３では、これらアニオン性フタロシアニンによるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する特異性について確かめるため、アニオン性フタロシアニンを用いた一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡＤＮＡの検出実験を行った。そのためにまず以下の手順で一本鎖ＤＮＡを含む溶液、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を調製した。
　＜一本鎖ＤＮＡを含む溶液の調製＞
　５’－ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ－３’の配列（配列番号：４）からなる一本鎖ＤＮＡが５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。この結果得られる溶液中のＤＮＡは、インキュベート後も一本鎖ＤＮＡである（以降、この溶液を一本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。
　＜二本鎖ＤＮＡを含む溶液の調製＞
　５’－ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡ－３’の配列（配列番号：５）からなる一本鎖ＤＮＡと５’－ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴ－３’の配列（配列番号：５のアンチセンス鎖）からなる一本鎖ＤＮＡがそれぞれ５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。上記二種類のＤＮＡは相補的な関係にあるため、このインキュベートの結果、溶液中において両ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成している（以降、この溶液を二本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。
　以上の工程で得られた一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液を用いて、アニオン性フタロシアニンによる一本鎖および二本鎖ＤＮＡ検出実験を行った。実験方法は下記のとおりである。
　＜アニオン性銅フタロシアニンによる検出＞
　まず１５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図２２（Ａ）および図２２（Ｂ）に示す。
　それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。これより一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は極めて特異性が高いことが分かる。
　＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる検出＞
　まず、１５μＭのＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図２３（Ａ）および図２３（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。
　これより一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は、極めて特異性が高いことが分かる。
　＜配位金属を持たないアニオン性フタロシアニンによる検出＞
　まず、１５μＭのＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図２４（Ａ）および図２４（Ｂ）に示す。
　それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。これより、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって、以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は極めて特異性が高いことが分かる。
　＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる検出＞
　まず１５μＭのＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μｌ）を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を、図３５（Ａ）および図３５（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例１においてＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。
　これより一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがって、以上の結果と実施例１および実施例２の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出は極めて特異性が高いことが分かる。
　以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（＝官能基としてスルホ基を有し、配位金属として亜鉛を有するアニオン性フタロシアニン）を用いて、同様の実験を行った結果、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となった。
　（実施例４）
　上記実施例１および実施例２では、ヒトのテロメア部分の配列と同じ配列からなる一本鎖ＤＮＡを用い、パラレル型、アンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのＤＮＡを調製し、配位金属が鉄以外のアニオン性フタロシアニンによってこれらの検出が可能であることや、あるいはこの検出結果を基にして、上記一本鎖ＤＮＡを定量的に検出できることを示した。本実施例４では、上記実施例１および実施例２の結果が、ヒトテロメア部分の配列からなるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに限られたものであるのか、それともヒトテロメア部分の配列以外からなるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘでも同様の結果が得られるのかについて検討した。
　＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’－ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ－３’（配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
　まず５’－ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ－３’の配列（配列番号：６）からなる一本鎖ＤＮＡ（以下、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡと呼ぶ）と、２．５μＭのＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔと５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μｌ）を調製した。Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ配列はヒトテロメア部分の配列とは異なるが、Ｋ＋存在下においてアニーリング処理することでパラレル型のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することが知られている。上記溶液は、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度が０、１、２、３、４、５、１０μＭのものをそれぞれ用意した。
　次に、これらの溶液をアニーリング処理し、これらについて４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図２５（Ａ）に示す。これより、上記Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れることが分かる。
　以上の結果より、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに図２５（Ａ）で得られた各グラフの６８７ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を、図２５（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果よりＣｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　＜アニオン性ニッケルフタロシアニンによる５’－ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ－３’（配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
　上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’－ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ－３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔの代わりに、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いて実験を行った。また、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、１、２、３、４、５、１０、２５μＭとした。結果を図２６（Ａ）に示す。これより、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れることが分かる。
　以上の結果より、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに図２６（Ａ）で得られた各グラフの６７７．５ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を、図２６（Ｂ）に示す。これより両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果よりＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　＜配位金属をもたないアニオン性フタロシアニンによる５’－ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ－３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
　上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’－ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ－３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔの代わりに、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いて実験を行った。またＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、１、２、１０、２５μＭとした。結果を図２７（Ａ）に示す。これより、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６６０～７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れることが分かる。
　以上の結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに、図２７（Ａ）で得られた各グラフの７０５．０ｎｍにおける吸光度値とそのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を図２７（Ｂ）に示し、６７４０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのヒトテロメアＤＮＡ濃度の関係を図２７（Ｃ）に示す。これより、両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果より、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　＜アニオン性コバルトフタロシアニンによる５’－ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ－３’
（配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
　上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’－ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ－３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ、ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔの代わりに、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いて実験を行った。ただし、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄの濃度は３０μＭとした。また、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、５、１０、２５、５０μＭとした。結果を図３６（Ａ）に示す。これより、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡが０μＭの場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れることが分かる。
　以上の結果より、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出することができることが分かる。
　さらに、図３６（Ａ）で得られた各グラフの６８０ｎｍにおける吸光度値とそのサンプルのＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の関係を、図３６（Ｂ）に示す。これより、両者の間には高い相関関係があることが分かる。したがって、この結果よりＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いることでＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かる。
　ところで、Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄを用いた場合に見られた６４０～７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔやＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔやＰｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用いた場合より小さい。これは合成したＣｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄが十分に精製されていなかったためと考えられる。
　＜アニオン性鉄フタロシアニンによる５’－ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ－３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞
　上記＜アニオン性銅フタロシアニンによる５’－ｇｇｇｇｔｔｔｔｇｇｇｇ－３’ （配列番号：６）からなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの検出＞の実験と同様の方法で、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔの代わりに、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－４，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｗｉｔｈ　ｏｘｙｇｅｎ　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｈｙｄｒａｔｅを用いて実験を行った。また、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度は０、１、２、３、４、５、１０、２５μＭとした。
　結果を図２８に示す。これよりいずれの濃度の場合も０μＭの場合と同じ結果であったことが分かる。したがって、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－４，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｗｉｔｈ　ｏｘｙｇｅｎ　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｈｙｄｒａｔｅによってＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出できないことが分かる。
　以上のフタロシアニンの他、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（＝官能基としてスルホ基を有し、配位金属として亜鉛を有するアニオン性フタロシアニン）を用いて同様の実験を行った結果、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度が０μＭの場合を除き、いずれの場合も６４０～７４０ｎｍの範囲でピークが観察された。したがって以上の結果より、アニオン性鉄フタロシアニンを用いた場合を除き、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いてもＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡからなるパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出できることが分かった。
　また、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いた場合も、上記ピーク範囲内の特定の波長における吸光度値とＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度の間には高い相関関係が認められた。したがって、Ｚｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄを用いてもＧ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡ濃度を定量的に検出できることが分かった。
　実施例１～実施例４までの結果を、各フタロシアニンの構造を示す図とともに図２９にまとめた。図２９中の○は、各実施例のＤＮＡ検出実験において、目的のＤＮＡの存在に依存して６４０～７４０ｎｍの波長範囲内で吸光度ピークが得られたことを示している。一方×はそのようなピークが得られなかったことを示している。また「－」は実験を行っていないことを示している。これより、アニオン性鉄フタロシアニンの場合を除き、アニオン性官能基の種類（スルホ基かカルボキシル基）に関わらず、また配位金属の種類に関わらず、いずれのアニオン性フタロシアニンを用いてもＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できることが分かる。またＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの種類に関してもパラレル型やアンチパラレル型に依存せず、さらに配列についてもヒトテロメアＤＮＡ配列に限られず、図２を用いて説明したＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘであれば検出できることが分かる。
　ところで、フタロシアニンおよびＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘについては下記の二つの重要な事柄が知られている。まず一つ目はフタロシアニンが示す吸光度についてである。フタロシアニン類は通常溶液中に溶かされている場合、その広いπ平面のために互いにスタッキング相互作用を起こし分子間会合している。このときの典型的なＵＶ吸収スペクトルが図３０（Ａ）に示すものである。一方、この状態のフタロシアニンの溶液に界面活性剤を加えると６４０～７４０ｎｍ付近にピークが現れてくる（図３０（Ｂ））。これは界面活性剤の添加によりフタロシアニンの会合が解けた状態（言い換えれば単量体の状態）として存在していることを示しているピークであることが知られている。すなわち、本実施例１～４の結果においては、アニオン性鉄フタロシアニンを除く他のアニオン性フタロシアニンはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと混合された状態であるときに、その少なくとも一部が単量体として存在しており、それが６４０～７３０ｎｍのピークとなって現れているのである。
　二つ目の重要な知見は、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと他の有機分子との相互作用についてである。Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは図２で説明したとおり、Ｇ－ｑａｒｔｅｔ面と呼ばれる広いπ平面がスタッキングした構造をとっている。このような構造は、他のπ平面を有する分子がこのＧ－ｑａｒｔｅｔ面とＧ－ｑａｒｔｅｔ面との間にインターカレートし易い構造となっている。したがって、例えばこれまでカチオン性のアントラキノン類やカチオン性のポルフィリンなどの分子が、その静電的相互作用とスタッキング相互作用の効果によってＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ中にインターカレートすることが示されている。
　したがって、これらの知見を考慮に入れると、本実施例１～実施例４の結果は、図３１に示すメカニズムで、アニオン性鉄フタロシアニンを除く他のアニオン性フタロシアニンがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出していることを示している。すなわち、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが存在してない場合は、これらアニオン性フタロシアニンは会合しており、そのＵＶ吸収スペクトルは図３０（Ａ）に示すものである。しかし、これにＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが混合されるとこれらアニオン性フタロシアニンはその少なくとも一部がＧｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ中にインターカレートする。インターカレートしたアニオン性フタロシアニンは単量体の状態と同じであるため６４０～７３０ｎｍの吸光度ピークを示す。
　ここで予想外であった点は、用いられているフタロシアニンが、上述のカチオン性アントラキノン類やカチオン性ポルフィリン類とは異なり、アニオン性であったにも関わらずこのような効果が得られた点である。一方で、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡにはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのような広いπ平面は存在せず、またアニオン性同士の静電的反発も働き、その結果、混合しても何も起こらない。したがって本発明者は、本来ＤＮＡ検出のプローブとしてはカチオン性が有利であると考えられていた常識に反し、アニオン性のフタロシアニンを用いることでＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する高い特異性が得られることを見出し、本発明を達成するにいたったと言える。
　また、図２９に示すフタロシアニンの配位金属に着目すると、鉄の場合のみ、ヒトテロメアＤＮＡ、Ｇ４Ｔ４Ｇ４ＤＮＡに関わらずＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが検出できないことが分かる。これは以下の理由による。すなわちフタロシアニンの代表的な構造として平面型と呼ばれるものとシャトルコック型と呼ばれるものがある。平面型はその名のとおり分子全体が平面となっている（図３２（Ａ））のに対し、シャトルコック型は金属やその配位子がフタロシアニン平面から一方向のみ突き出した構造（図３２（Ｂ））となっている。
　本実施例において用いたアニオン性鉄フタロシアニンであるＩｒｏｎ（ＩＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－４，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｗｉｔｈ　ｏｘｙｇｅｎ　ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｈｙｄｒａｔｅは配位金属の鉄に酸素が付いたものであり、これはシャトルコック型のフタロシアニンである。一方、本実施例において用いられた他のフタロシアニンは全て平面型である。上述のとおりシャトルコック型フタロシアニンは中央部分より突出した構造をとっており平面性に乏しい。したがって、平面型フタロシアニンが図３１に示すメカニズムのように、Ｇｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ中にインターカレートできるのに対して、本実施例において用いたアニオン性鉄フタロシアニンに代表されるシャトルコック型フタロシアニンは平面型でないために、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘにインターカレートできず、結果として他のアニオン性フタロシアニン類の場合には認められた６４０～７３０ｎｍの吸光度ピークが認められないのである。このようなＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する平面型フタロシアニンとシャトルコック型フタロシアニンの相互作用についての知見は、本発明者が世界で初めて見出したものである。
　以上まとめると、本発明者は、従来の常識に反してあえてアニオン性のフタロシアニンを用い、かつ世界で初めてＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに対する平面型フタロシアニンとシャトルコック型フタロシアニンの相互作用の違いを見出すことで、本発明のアニオン性平面型フタロシアニンを用いた極めて特異性の高いＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出方法を完成するに至った。
　上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
　本発明により、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡの特異的検出方法は、バイオテクノロジー分野における分析方法として有用である。
　１　相補的な関係にある二本のＤＮＡ鎖
　２　Ｔ－Ａ塩基対
　３　Ｃ－Ｇ塩基対
　４　Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ
　５　Ｇカルテット面
　６　金属イオン
　７　Ｇカルテット面の化学構造
　８　容器
　９　Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ以外のＤＮＡ鎖
　１０　Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと結合したプローブ
　１１　遊離のプローブ
　１２　Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ予想配列
　１３　ＴＳプライマー
　１４　伸長されたＴＳプライマー
　１５　ＰＣＲ用プライマー
　１６　試料溶液
　１７　アニオン性フタロシアニンを含む溶液
　１８　テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを含む溶液整理番号:2040300046 特願2008-137574　 (Proof) 提出日:平成20年 5月27日 27/E
　１９　会合したアニオン性フタロシアニン
　２０　単量体状態のフタロシアニン
　２１　Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘにインターカレートしたアニオン性フタロシアニン
　２２　平面型フタロシアニン
　２３　シャトルコック型フタロシアニン

Claims (9)

  1. 　一本鎖構造か二本鎖構造かＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡを含む試料溶液中のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出する方法であって、
    　前記方法は、
    （ａ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
    （ｂ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
    （ｃ）前記（ｂ）工程後の混合液の６４０～７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
    （ｄ）前記６４０～７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
    を順に含むことを特徴とするＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法。
  2. 　請求項１に記載のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法であって、
    　前記アニオン性平面型フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンであるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法。
  3. 　請求項１に記載のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法であって、
    　前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法。
  4. 　試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べることにより、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡを検出する方法であって、
    　前記方法は、
    （ａ）前記試料溶液をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下に置く工程と、
    （ｂ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
    （ｃ）前記（ａ）工程の前か後のいずれかにおいて、前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
    （ｄ）前記（ａ）～（ｃ）の一連の工程後の混合液の６４０～７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
    （ｅ）前記６４０～７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
    を順に含むことを特徴とするＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法。
  5. 　請求項４に記載のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法であって、
    　前記アニオン性平面型フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性平面型フタロシアニンのいずれかであるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法。
  6. 　請求項４に記載のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法であって、
    　前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法。
  7. 　試料溶液中のテロメラーゼ活性を測定する方法であって、
    　前記方法は、
    （ａ）前記試料溶液を調製する工程と、
    （ｂ）テロメラーゼの基質となるＤＮＡを含む基質溶液を調製する工程と、
    （ｃ）前記試料溶液と前記基質溶液を混合し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程と、
    （ｄ）前記テロメラーゼ反応溶液をテロメラーゼによるＤＮＡ付加反応が行われる条件下に置く工程と、
    （ｅ）アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
    （ｆ）前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を、前記（ｄ）の工程後に得られる溶液と混合する工程と、
    （ｇ）前記（ａ）～（ｆ）の一連の工程後の混合液の６４０～７４０ｎｍの吸光度を測定する工程と、
    （ｈ）前記６４０～７４０ｎｍに吸収極大を有するピークが現れれば、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を形成しているＤＮＡが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
    を順に含むことを特徴とするテロメラーゼ活性測定方法。
  8. 　請求項７に記載のテロメラーゼ活性測定方法であって、
    　前記アニオン性平面型フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性平面型フタロシアニンのいずれかであるテロメラーゼ活性測定方法。
  9. 　請求項７に記載のテロメラーゼ活性測定方法であって、
    　前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているテロメラーゼ活性測定方法。
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