JP4410844B1 - G−quadruplex検出方法、G−quadruplex形成DNA検出方法およびテロメラーゼ活性測定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明のG−quadruplex検出方法は、
(a)アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
(b)前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
(c)前記(b)工程後の混合液の640〜740nmの吸光度を測定する工程と、
を含むことを特徴とする。
【選択図】図9
Description
前記方法は、
(a)アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
(b)前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
(c)前記(b)工程後の混合液の640〜740nmの吸光度を測定する工程と、
(d)前記640〜740nmに吸収極大を有するピークが現れれば、G−quadruplexの構造を形成しているDNAが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするG−quadruplex検出方法である。
前記方法は、
(a)前記試料溶液をG−quadruplex形成反応条件下に置く工程と、
(b)アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
(c)前記(a)工程の前か後のいずれかにおいて、前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
(d)前記(a)〜(c)の一連の工程後の混合液の640〜740nmの吸光度を測定する工程と、
(e)前記640〜740nmに吸収極大を有するピークが現れれば、G−quadruplexの構造を形成しているDNAが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするG−quadruplex形成DNA検出方法である。
前記方法は、
(a)前記試料溶液を調製する工程と、
(b)テロメラーゼの基質となるDNAを含む基質溶液を調製する工程と、
(c)前記試料溶液と前記基質溶液を混合し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程と、
(d)前記テロメラーゼ反応溶液をテロメラーゼによるDNA付加反応が行われる条件下に置く工程と、
(e)アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
(f)前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を、前記(d)の工程後に得られる溶液と混合する工程と、
(g)前記(a)〜(f)の一連の工程後の混合液の640〜740nmの吸光度を測定する工程と、
(h)前記640〜740nmに吸収極大を有するピークが現れれば、G−quadruplexの構造を形成しているDNAが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするテロメラーゼ活性測定方法である。
本実施の形態1では、一本鎖構造か二本鎖構造かG−quadruplexの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているDNAを含む試料溶液中の、G−quadruplexを検出する方法について図9を用いて説明する。
本実施の形態2では、試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているDNAがG−quadruplexを形成するか否かについて調べる方法について図10を用いて説明する。
における特定の波長の吸光度を測定する(図10(B))。このとき、上記実施の形態1と同様に、この混合溶液中においてG−quadruplexを形成しているDNAが存在すると、640〜740nmの範囲でこれに依存した吸収ピークが現れ、さらにこの吸収ピークの吸光度値はG−quadruplexを形成しているDNA濃度が増大するにつれ大きくなる。
本実施の形態3では、試料中に含まれるテロメラーゼ活性を定量的に解析する方法について図11を用いて説明する。
以下に記載する実施例で用いられるDNAは、全て北海道システム・サイエンス株式会社の合成品である。また本実施例で用いられるフタロシアニンのうち、Copper(II)phthalocyanine−3,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid tetrasodium saltおよびNickel(II)phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium saltおよびIron(III)phthalocyanine−4,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid,compound with oxygen monosodium salt hydrateはシグマ・アルドリッチ(株)より購入した。Phthalocyanine tetrasulfonic acidおよびZinc(II) phthalocyaninetetrasulfonicacidは(株)フナコシより購入した。Cobalt(II)phthalocyanine tetracarboxylic acidは合成した。合成方法は下記のとおりである。
本実施例では、アニオン性平面型フタロシアニンを用いて、溶液中に存在するアンチパラレル型G−quadruplexを形成しているDNAを検出することを試みた。そのためにまず以下の手順でアンチパラレル型G−quadruplexを形成しているDNAを含む溶液を調製した。
まず5’−gggttagggttagggttaggg−3’の配列(配列番号:3)からなる一本鎖DNAを含む50mM HEPES、100mMNaCl、pH7の溶液(全量100μl)を調製した。この配列はヒトのテロメア部分の配列と同様のものであり、そのため以降このDNAをヒトテロメアDNAと呼ぶ。ここで、この溶液中に含まれるヒトテロメアDNA濃度は0.5、2、5、10、25、50、100μMのものをそれぞれ用意した。ネガティブコントロールとしてDNAを含まない50mMHEPES、100mMNaCl、pH7の溶液も調製した。
まず15μMのCopper(II)phthalocyanine−3,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid tetrasodium salt(配位金属として銅を有し、官能基としてスルホ基のナトリウム塩を有するアニオン性平面型フタロシアニン)を含む50mM HEPES、100mM NaCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Anti−G−quadruplex溶液C、D、E、FおよびNC溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。
まず15μMのNickel(II)phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt(配位金属としてニッケルを有し、官能基としてスルホ基のナトリウム塩を有するアニオン性平面型フタロシアニン)を含む50mMHEPES、100mMNaCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Anti−G−quadruplex溶液D、E、F、GおよびNC溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。
まず15μMのPhthalocyanine tetrasulfonic acid(配位金属を持たず、官能基としてスルホ基を有するアニオン性平面型フタロシアニン)を含む50mM HEPES、100mM NaCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。
まず15μMのCobalt(II)phthalocyanine tetracarboxylic acid(配位金属としてコバルトを有し、官能基としてカルボキシル基を有するアニオン性平面型フタロシアニン)を含む50mM HEPES、100mM NaCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Anti−G−quadruplex溶液B、C、D、GおよびNC溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。
まず15μMのIron(III)phthalocyanine−4,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid,compound with oxygen monosodium salt hydrate(配位金属として鉄を有し、官能基としてスルホ基を有するアニオン性フタロシアニン)を含む50mM HEPES、100mM NaCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Anti−G−quadruplex溶液BおよびNC溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。
本実施例では、アニオン性フタロシアニンを用いて、溶液中に混在するアンチパラレル型G−quadruplexとパラレル型G−quadruplexを形成しているDNAを検出することを試みた。そのためにまず以下の手順でアンチパラレル型G−quadruplexを形成しているDNAとパラレル型G−quadruplexを形成しているDNAが混在している溶液を調製した。
まず、ヒトテロメアDNAを含む50mM HEPES、100mM KCl、pH7の溶液(全量100μl)を調製した。ここで、この溶液中に含まれるヒトテロメアDNA濃度は1、2、10、25、50、100μMのものをそれぞれ用意した。ネガティブコントロールとしてDNAを含まない50mM HEPES、100mM KCl、pH7の溶液も調製した。次にこれらの溶液をアニーリング処理した。
まず、15μMのCopper(II)phthalocyanine−3,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid tetrasodium saltを含む50mM HEPES、100mM KCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Anti−Para−G−quadruplex溶液B、C、D、FおよびNC−2溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。
まず、15μMのNickel(II)phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium saltを含む50mM HEPES、100mM KCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Anti−Para−G−quadruplex溶液A、B、C、EおよびNC−2溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。
まず、15μMのPhthalocyanine tetrasulfonic acidを含む50mM HEPES、100mM KCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Anti−Para−G−quadruplex溶液B、C、D、FおよびNC−2溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。
まず、15μMのCobalt(II)phthalocyanine tetracarboxylic acidを含む50mM HEPES、100mM KCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Anti−Para−G−quadruplex溶液B、C、D、EおよびNC−2溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。
まず15μMのIron(III)phthalocyanine−4,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid,compound with oxygen monosodium salt hydrateを含む50mM HEPES、100mM KCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記Anti−Para−G−quadruplex溶液BおよびNC−2溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。
上記実施例1および実施例2の結果より、アニオン性鉄フタロシアニン以外のいずれのアニオン性フタロシアニンを用いてもパラレル型、アンチパラレル型に関わらずG−quadruplexが検出できることが分かった。本実施例3では、これらアニオン性フタロシアニンによるG−quadruplexに対する特異性について確かめるため、アニオン性フタロシアニンを用いた一本鎖DNAおよび二本鎖DNADNAの検出実験を行った。そのためにまず以下の手順で一本鎖DNAを含む溶液、二本鎖DNAを含む溶液を調製した。
5’−ttttttttttttttttttttt−3’の配列(配列番号:4)からなる一本鎖DNAが50μMの濃度で含まれる50mM HEPES、100mM NaCl、pH7の溶液(全量100μl)を調製し、これを90℃で5分間インキュベートした後、2℃/分の降温速度で0℃まで冷やし、最後に0℃で2時間インキュベートした。この結果得られる溶液中のDNAは、インキュベート後も一本鎖DNAである(以降、この溶液を一本鎖DNA溶液と呼ぶ)。
5’−AGAAGAGAAAGA−3’の配列(配列番号:5)からなる一本鎖DNAと5’−TCTTTCTCTTCT−3’の配列(配列番号:5のアンチセンス鎖)からなる一本鎖DNAがそれぞれ50μMの濃度で含まれる50mM HEPES、100mM NaCl、pH7の溶液(全量100μl)を調製し、これを90℃で5分間インキュベートした後、2℃/分の降温速度で0℃まで冷やし、最後に0℃で2時間インキュベートした。上記二種類のDNAは相補的な関係にあるため、このインキュベートの結果、溶液中において両DNAは二本鎖DNAを形成している(以降、この溶液を二本鎖DNA溶液と呼ぶ)。
まず15μMのCopper(II)phthalocyanine−3,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid tetrasodium saltを含む50mM HEPES、100mM NaCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖DNA溶液および二本鎖DNA溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。一本鎖DNA溶液および二本鎖DNA溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図22(A)および図22(B)に示す。
まず、15μMのNickel(II)phthalocyanine tetrasulfonic acid、tetrasodium saltを含む50mMHEPES、100mMNaCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖DNA溶液および二本鎖DNA溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。一本鎖DNA溶液および二本鎖DNA溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図23(A)および図23(B)に示す。それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例1においてNC溶液を用いた結果も併せて示す。
まず、15μMのPhthalocyanine tetrasulfonic acidを含む50mM HEPES、100mM NaCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖DNA溶液および二本鎖DNA溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。一本鎖DNA溶液および二本鎖DNA溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図24(A)および図24(B)に示す。
まず15μMのCobalt(II)phthalocyanine tetracarboxylic acidを含む50mMHEPES、100mMNaCl、pH7の溶液(全量20μl)を調製した。次に、このフタロシアニン溶液と上記一本鎖DNA溶液および二本鎖DNA溶液それぞれとを混合し、この混合液について480〜800nmの吸光度を測定した。一本鎖DNA溶液および二本鎖DNA溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を、図35(A)および図35(B)に示す。それぞれの図において、ネガティブコントロールとして実施例1においてNC溶液を用いた結果も併せて示す。
上記実施例1および実施例2では、ヒトのテロメア部分の配列と同じ配列からなる一本鎖DNAを用い、パラレル型、アンチパラレル型G−quadruplexのDNAを調製し、配位金属が鉄以外のアニオン性フタロシアニンによってこれらの検出が可能であることや、あるいはこの検出結果を基にして、上記一本鎖DNAを定量的に検出できることを示した。本実施例4では、上記実施例1および実施例2の結果が、ヒトテロメア部分の配列からなるG−quadruplexに限られたものであるのか、それともヒトテロメア部分の配列以外からなるG−quadruplexでも同様の結果が得られるのかについて検討した。
まず5’−ggggttttgggg−3’の配列(配列番号:6)からなる一本鎖DNA(以下、G4T4G4DNAと呼ぶ)と、2.5μMのCopper(II)phthalocyanine−3,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid tetrasodium saltと50mM HEPES、100mM KCl、pH7の溶液(全量100μl)を調製した。G4T4G4DNA配列はヒトテロメア部分の配列とは異なるが、K+存在下においてアニーリング処理することでパラレル型のG−quadruplexを形成することが知られている。上記溶液は、G4T4G4DNA濃度が0、1、2、3、4、5、10μMのものをそれぞれ用意した。
上記<アニオン性銅フタロシアニンによる5’−ggggttttgggg−3’ (配列番号:6)からなるパラレル型G−quadruplex形成DNAの検出>の実験と同様の方法で、Copper(II)phthalocyanine−3,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid tetrasodium saltの代わりに、Nickel(II)phthalocyanine tetrasulfonic acid、tetrasodium saltを用いて実験を行った。また、G4T4G4DNA濃度は0、1、2、3、4、5、10、25μMとした。結果を図26(A)に示す。これより、G4T4G4DNAが0μMの場合を除き、おおよそ640〜720nmの範囲でピークが現れることが分かる。
上記<アニオン性銅フタロシアニンによる5’−ggggttttgggg−3’ (配列番号:6)からなるパラレル型G−quadruplex形成DNAの検出>の実験と同様の方法で、Copper(II)phthalocyanine−3,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid tetrasodium saltの代わりに、Phthalocyanine tetrasulfonic acidを用いて実験を行った。またG4T4G4DNA濃度は0、1、2、10、25μMとした。結果を図27(A)に示す。これより、G4T4G4DNAが0μMの場合を除き、おおよそ660〜740nmの範囲で二つのピークが現れることが分かる。
(配列番号:6)からなるパラレル型G−quadruplex形成DNAの検出>
上記<アニオン性銅フタロシアニンによる5’−ggggttttgggg−3’ (配列番号:6)からなるパラレル型G−quadruplex形成DNAの検出>の実験と同様の方法で、Copper(II)phthalocyanine−3,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid、tetrasodium saltの代わりに、Cobalt(II)phthalocyanine tetracarboxylic acidを用いて実験を行った。ただし、Cobalt(II)phthalocyanine tetracarboxylic acidの濃度は30μMとした。また、G4T4G4DNA濃度は0、5、10、25、50μMとした。結果を図36(A)に示す。これより、G4T4G4DNAが0μMの場合を除き、おおよそ640〜720nmの範囲でピークが現れることが分かる。
上記<アニオン性銅フタロシアニンによる5’−ggggttttgggg−3’ (配列番号:6)からなるパラレル型G−quadruplex形成DNAの検出>の実験と同様の方法で、Copper(II)phthalocyanine−3,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid tetrasodium saltの代わりに、Iron(III)phthalocyanine−4,4’,4’’,4’’’−tetrasulfonic acid,compound with oxygen monosodium salt hydrateを用いて実験を行った。また、G4T4G4DNA濃度は0、1、2、3、4、5、10、25μMとした。
2 T−A塩基対
3 C−G塩基対
4 G−quadruplex
5 Gカルテット面
6 金属イオン
7 Gカルテット面の化学構造
8 容器
9 G−quadruplex以外のDNA鎖
10 G−quadruplexと結合したプローブ
11 遊離のプローブ
12 Quadruplex予想配列
13 TSプライマー
14 伸長されたTSプライマー
15 PCR用プライマー
16 試料溶液
17 アニオン性フタロシアニンを含む溶液
18 テロメラーゼの基質となる一本鎖DNAを含む溶液
19 会合したアニオン性フタロシアニン
20 単量体状態のフタロシアニン
21 G−quadruplexにインターカレートしたアニオン性フタロシアニン
22 平面型フタロシアニン
23 シャトルコック型フタロシアニン
Claims (9)
- 一本鎖構造か二本鎖構造かG−quadruplexの少なくともいずれか一種類以上の構造を形成しているDNAを含む試料溶液中のG−quadruplexを検出する方法であって、
前記方法は、
(a)アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
(b)前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
(c)前記(b)工程後の混合液の640〜740nmの吸光度を測定する工程と、
(d)前記640〜740nmに吸収極大を有するピークが現れれば、G−quadruplexの構造を形成しているDNAが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするG−quadruplex検出方法。 - 請求項1に記載のG−quadruplex検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性平面型フタロシアニンであるG−quadruplex検出方法。 - 請求項1に記載のG−quadruplex検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているG−quadruplex検出方法。 - 試料溶液中に含まれる一本鎖構造か二本鎖構造のいずれか一種類以上の構造を形成しているDNAがG−quadruplexを形成するか否かについて調べることにより、G−quadruplex形成DNAを検出する方法であって、
前記方法は、
(a)前記試料溶液をG−quadruplex形成反応条件下に置く工程と、
(b)アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
(c)前記(a)工程の前か後のいずれかにおいて、前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液と前記試料溶液を混合する工程と、
(d)前記(a)〜(c)の一連の工程後の混合液の640〜740nmの吸光度を測定する工程と、
(e)前記640〜740nmに吸収極大を有するピークが現れれば、G−quadruplexの構造を形成しているDNAが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするG−quadruplex形成DNA検出方法。 - 請求項4に記載のG−quadruplex形成DNA検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性平面型フタロシアニンのいずれかであるG−quadruplex形成DNA検出方法。 - 請求項4に記載のG−quadruplex形成DNA検出方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているG−quadruplex形成DNA検出方法。 - 試料溶液中のテロメラーゼ活性を測定する方法であって、
前記方法は、
(a)前記試料溶液を調製する工程と、
(b)テロメラーゼの基質となるDNAを含む基質溶液を調製する工程と、
(c)前記試料溶液と前記基質溶液を混合し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程と、
(d)前記テロメラーゼ反応溶液をテロメラーゼによるDNA付加反応が行われる条件下に置く工程と、
(e)アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を用意する工程と、
(f)前記アニオン性平面型フタロシアニンを含む溶液を、前記(d)の工程後に得られる溶液と混合する工程と、
(g)前記(a)〜(f)の一連の工程後の混合液の640〜740nmの吸光度を測定する工程と、
(h)前記640〜740nmに吸収極大を有するピークが現れれば、G−quadruplexの構造を形成しているDNAが前記試料溶液中に含まれると判定する工程と、
を順に含むことを特徴とするテロメラーゼ活性測定方法。 - 請求項7に記載のテロメラーゼ活性測定方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性平面型フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性平面型フタロシアニンのいずれかであるテロメラーゼ活性測定方法。 - 請求項7に記載のテロメラーゼ活性測定方法であって、
前記アニオン性平面型フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基、およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有しているテロメラーゼ活性測定方法。
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