CN103403158B - 检测g-四联体螺旋形成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的方法的目的在于，即使在钾离子存在下，也特异地检测G-四联体螺旋。本发明的方法利用在钾离子的存在下硫代黄素T和G-四联体螺旋的反应时发出强的荧光的现象，判定靶DNA是否形成了G-四联体螺旋。本发明的方法中，在G-四联体螺旋形成的条件下维持含有钾离子和靶DNA的第一试样溶液之后，添加硫代黄素T，测定第一荧光强度值。在G-四联体螺旋不稳定的条件下维持含有靶DNA的第二试样溶液，添加硫代黄素T，测定第二荧光强度值，如果这些值之差为0以上，则判定为靶DNA能够形成G-四联体螺旋。

Description

检测G-四联体螺旋形成的方法
技术领域
本发明涉及DNA的高级结构的检测方法。
背景技术
人体的端粒DNA包括含有5′-TTAGGG-3′（序列编号：1）和5′-CCCTAA-3′（序列编号：2，序列编号1的互补链）的双链DNA重复的序列以及在其最末端只有5′-TTAGGG-3′（序列编号1）重复的单链DNA。该5′-TTAGGG-3′（序列编号1）重复的序列，能够形成称为G-四联体螺旋（G-quadruplex）的四链DNA结构。G-四联体螺旋中，4个鸟嘌呤形成称为G-四联体（G-quartet）的结构，这是通过π-π堆积相互作用形成的堆积结构（图1）。该G-四联体螺旋认为与细胞的癌化和寿命相关，因此近年来被着力研究。
最近流行的利用计算机进行的全基因组分析显示，认为能够形成G-四联体螺旋的序列在基因组DNA中除了端粒DNA以外也大量存在。这些中的多数存在于包括c-kit、c-myc、H-ras、K-ras基因的原癌基因的启动子区域中。因此，对这些认为能够形成G-四联体螺旋的序列也进行着研究。以上事实暗示，G-四联体螺旋在细胞活动中具有重要的作用。
根据以上的背景，需要简便地解析认为能够形成G-四联体螺旋的DNA是否真的能够形成G-四联体螺旋的技术。特别是，细胞内的钾离子浓度大约为100-150mM，因此，需要在该钾离子浓度条件下解析G-四联体螺旋的形成的技术。因此，进行了与单链DNA或双链DNA相比，与G-四联体螺旋反应时发出特别强的荧光的化合物（以下，称为G-四联体螺旋探针）的探索。换言之，G-四联体螺旋探针必须具有与单链DNA或双链DNA反应时几乎不发出荧光、但是与G-四联体螺旋反应时发出强烈的荧光的性质。
近年来，花精力最多的研究的G-四联体螺旋探针之一为苯并噻唑衍生物。苯并噻唑衍生物的研究盛行的原因在于，苯并噻唑衍生物水溶性高，荧光强度变化非常大。例如，在非专利文献1中，报道了使用了Cyan40（化1）和Cyan2（化2）的G-四联体螺旋检测技术。该报道显示，在钾离子不存在的条件下，使Cyan2与G-四联体螺旋反应时，与双链DNA反应的情况相比，发出更强的荧光。但是，也显示在100mM钾离子存在下，即使Cyan2与G-四联体螺旋反应也几乎检测不到荧光。因此，Cyan2在钾离子存在下的G-四联体螺旋检测中无法使用。此外，在非专利文献2中，报道了使用噻唑橙（化3）（以下，称为TO）的G-四联体螺旋检测技术。该报道显示，TO在100mM钾离子的存在下，与G-四联体螺旋反应则发出强烈的荧光。但是，相同条件下，TO与双链DNA反应时，比TO与G-四联体螺旋反应时发出更强的荧光。因此，在100mM钾离子的存在下，无法使用TO特异性检测出G-四联体螺旋。
（化1）
（化2）
（化3）
如上所述，近年来，将苯并噻唑衍生物作为G-四联体螺旋探针使用，进行着特异性检测G-四联体螺旋的技术的开发。但是，在与细胞内同样条件的钾离子存在的条件下能够特异性检测G-四联体螺旋的技术仍是未知的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：J.Flucresc.,2011,21(1),223-230
非专利文献2：J.Am.Chem.Soc.,2006,128(36),11890-11893
非专利文献3：J.Am.Chem.Soc.,2006,128(30),9963-9970
非专利文献4：Nucleic Acids Res.,2006,34(19),5715-5719
发明内容
发明所要解决的课题
简便地解析在钾离子的存在下认为能够形成G-四联体螺旋的DNA是否真的能够形成G-四联体螺旋的技术非常有用。因此，着力研究着使用苯并噻唑衍生物的G-四联体螺旋检测技术的研究，但是没有开发出在钾离子存在下特异性检测G-四联体螺旋的技术。因此，本发明的发明人进行了深入研究，结果发现，在钾离子的存在下，硫代黄素T（化4）与G-四联体螺旋反应时发出强烈的荧光。该荧光强度与硫代黄素T与双链DNA或单链DNA反应时相比，明显更强。因此，根据本发明，发现了即使在钾离子的存在下也能够特异性检测G-四联体螺旋。
（化4）
用于解决课题的方法
解决上述课题的本发明为一种判定靶DNA在钾离子存在下是否形成了G-四联体螺旋的方法，其具备以下的工序：
在G-四联体螺旋形成的反应条件下维持含有钾离子、硫代黄素T和上述靶DNA的第一试样溶液的工序；
测定λ1的波长时的第一荧光强度值A的工序，其中，
上述第一荧光强度值A来自上述第一试样溶液中所含有的硫代黄素T，
λ1在465纳米以上505纳米以下；
在使上述G-四联体螺旋的结构不稳定化的条件下维持含有硫代黄素T和上述靶DNA的第二试样溶液的工序；
测定上述λ1的波长时的第二荧光强度值B的工序，其中，
上述第二荧光强度值B来自上述第二试样溶液中所含有的硫代黄素T；和，
如果满足以下不等式，则判定为上述靶DNA在钾离子存在下形成上述G-四联体螺旋的工序，
上述第一荧光强度值A－上述第二荧光强度值B＞0。
本发明的方法中，优选如果满足上述第一荧光强度值－上述第二荧光强度值≤0的不等式，则判定为上述靶DNA在钾离子存在下没有形成上述G-四联体螺旋。
本发明的方法中，优选使上述G-四联体螺旋结构不稳定化的条件为锂存在下的条件。
本发明的方法中，优选上述λ1为485纳米。
本发明的上述目的、其它目的、特征和优点，通过参照附图，从以下的适宜实施方式的详细说明更加明确。
发明的效果
根据本发明，提供一种在钾离子存在下特异性且定量地检测G-四联体螺旋的方法、特异性且定量地检测能够形成G-四联体螺旋的DNA的方法。
附图说明
图1表示用于说明G-四联体螺旋结构的图。
图2表示用于说明本实施方式的研究在钾离子存在下靶DNA是否形成G-四联体螺旋的方法的图。
图3表示比较例1中在0mM-KCl存在下的荧光光谱的结果和描绘各DNA浓度与530nm时的荧光强度的关系的图。
图4表示描绘比较例1中在50mM-KCl存在下各DNA浓度与530nm时的荧光强度的关系的图。
图5表示描绘比较例1中在100mM-KCl存在下各DNA浓度与530nm时的荧光强度的关系的图。
图6表示描绘比较例1中在150mM-KCl存在下各DNA浓度与530nm时的荧光强度的关系的图。
图7表示描绘比较例1中在500mM-KCl存在下各DNA浓度与530nm时的荧光强度的关系的图。
图8表示实施例1中在0mM-KCl存在下的荧光光谱的结果和描绘各DNA浓度与450nm时的荧光强度的关系的图。
图9表示描绘实施例1中在50mM-KCl存在下各DNA浓度与450nm时的荧光强度的关系的图。
图10表示描绘实施例1中在100mM-KCl存在下各DNA浓度与450nm时的荧光强度的关系的图。
图11表示描绘实施例1中在150mM-KCl存在下各DNA浓度与450nm时的荧光强度的关系的图。
图12表示描绘实施例1中在500mM-KCl存在下各DNA浓度与450nm时的荧光强度的关系的图。
图13表示实施例2中的荧光光谱的结果和描绘G-DNA2的浓度与450nm时的荧光强度的关系的图。
图14表示实施例3中的荧光光谱的结果和描绘G-DNA3的浓度与450nm时的荧光强度的关系的图。
图15是表示实施例4中的G-DNA2和双链体-C存在状态的图。
图16是表示实施例4中的485nm时的荧光强度值之差的图。
图17是表示实施例5中的485nm时的荧光强度值之差的图。
具体实施方式
以下，参照附图说明本发明的实施方式。
本实施方式中，使用图2说明研究在钾离子存在下靶DNA是否形成G-四联体螺旋的方法。
本实施方式中，实施以下工序。
（工序1）制备含有钾离子、靶DNA和硫代黄素T的试样溶液1。混合钾离子、靶DNA和硫代黄素T的顺序没有限定。
（工序2）在工序1后，将该试样溶液1置于G-四联体螺旋形成条件下。
（工序3）工序2后，测定该试样溶液1中的来自硫代黄素T的荧光强度值（A）。
（工序4）将含有靶DNA和硫代黄素T的试样溶液2置于使G-四联体螺旋结构不稳定化的条件下。
（工序5）在工序4后，测定试样溶液2中的来自硫代黄素T的荧光强度值（B）。荧光强度值A和B为相同波长的荧光强度值。
（工序6）A－B＞0时，判断为靶DNA在钾离子存在下形成G-四联体螺旋。
上述步骤为在工序1中在试样溶液1中加入硫代黄素T。但是，不一定必须在工序1中在试样溶液1中加入硫代黄素T。直到工序3，在试样溶液1中加入硫代黄素T即可。此外，上述步骤为在试样溶液2中加入硫代黄素T。但是，不一定在工序4中在试样溶液2中加入硫代黄素T。直到工序5，在试样溶液2中加入硫代黄素T即可。
本发明的发明人还发现，使硫代黄素T与G-四联体螺旋反应时，在485nm附近观察到具有极大荧光波长的强烈的荧光。另一方面，使硫代黄素T与单链DNA或者双链DNA反应时，完全没有观察到荧光，或者即使观察也极其微弱。换言之，本发明的发明人发现，硫代黄素T是G-四联体螺旋的特异性荧光探针。因此，在钾离子的存在下，靶DNA形成G-四联体螺旋时和不形成时，分别如下所述。
（1）在钾离子存在下，靶DNA形成G-四联体螺旋时
上述工序1～2之后，由于靶DNA形成G-四联体螺旋，在上述工序3中确认了来自硫代黄素T的强烈的荧光。但是，上述工序4之后，靶DNA的一部分或者全部形成单链DNA或者双链DNA，因此，在上述工序5中完全没有确认到来自硫代黄素T的荧光，或者即使确认到，其荧光强度值也显著小于上述工序3中得到的值。因此，上述工序6中得到的值大于0。
（2）在钾离子存在下，靶DNA没有形成G-四联体螺旋时
上述工序1～2之后，上述工序4之后，靶DNA没有形成G-四联体螺旋，因此，在上述工序3和上述工序5中测得的来自硫代黄素T的荧光强度实质上相同。因此，上述工序6中得到的值实质上为0。
上述工序4中的使G-四联体螺旋结构不稳定化的条件是指例如锂离子存在的条件。已知在锂离子存在下，G-四联体螺旋结构不稳定化。此外，其它的使G-四联体螺旋结构不稳定化的条件为高温。已知在高温条件下（～100℃），G-四联体螺旋结构不稳定化。上述工序4中的使G-四联体螺旋结构不稳定化的条件，不限于这里举出的例子。只要是使G-四联体螺旋结构不稳定化的条件即可。
另外，上述工序3和上述工序5中使用的激发光的波长，只要是在硫代黄素T的吸收带的范围内的波长即可。但是，硫代黄素T的极大激发波长在450nm附近，因此，上述工序3中和上述工序5中使用的激发光的波长优选在450nm附近。
[实施例]
以下记载的实施例和比较例中使用的DNA全部从北海道SystemScience株式会社购入。另外，硫代黄素T从Sigma Aldrich（株）购入。另外，噻唑橙从和光纯药工业（株）购入。另外，荧光强度分析使用Thermo Fisher Scientific（株）制造的Varioskan Flash。
（比较例1）
本比较例1中，使用作为代表的苯并噻唑衍生物的噻唑橙，进行G-四联体螺旋和双链DNA的检测。本比较例中使用的G-四联体螺旋包括5′-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3′（序列编号：3）的人的端粒序列的DNA（以下，将该序列的DNA称为G-DNA1）。此外，本比较例中使用的双链DNA的序列为5′-AGTTCAAGGCGCCTTGAACT-3′（序列编号：4）（以下，将该序列DNA称为双链体1）。使用这些双链DNA，进行以下的实验。首先，制备表1中所示的反应溶液。
[表1]
MES-LiOH,pH7 50mM
KCl X mM
G-DNA1或双链体1 YμM
TO 1μM
总容量 100μL
X为0、50、100、150或500。Y为0、10或50。接着，将该反应溶液在90℃保温2分钟，以0.5℃/分钟的降温速度降温到25℃。已知以上工序后，G-DNA1形成G-四联体螺旋。同样，已知双链体1形成分子内双链结构。此后，对该反应溶液进行荧光强度分析。激发光波长为501nm。结果如图3所示。图3（A）为KCl浓度为0mM时的荧光谱图的结果。图3（B）为基于该荧光谱图结果将各DNA浓度与530nm时的荧光强度的关系图表化的图。同样，图4～7分别为在50、100、150、500mM-KCl存在下，将各DNA浓度与530nm时的荧光强度的关系图表化的图。由以上结果可知，噻唑橙与G-DNA1反应产生荧光，但是与双链体1反应时也产生同程度或者其以上的荧光。即，这些结果表示噻唑橙完全没有对G-四联体螺旋的特异性。因此，不能使用噻唑橙来判定靶DNA是否能够形成G-四联体螺旋。
（实施例1）
本实施例1与比较例1同样，进行G-DNA1和双链体1的检测。但是，代替TO使用硫代黄素T（浓度为1μM）。另外，仅在100mM-KCl的条件下，作为测定对象DNA，使用5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′（序列编号：5）（以下，将包括该序列的DNA称为T21）。已知T21作为单链DNA在溶液中存在。此外，激发光波长不是501nm，而是450nm，除此以外，与比较例1同样进行实验。
结果如图8所示。图8（A）表示KCl浓度为0mM时的荧光谱图的结果。图8（B）为基于该谱图的结果描绘各DNA浓度与485nm时的荧光强度的关系的图。同样地，图9～12分别表示在50、100、150和500mM-KCl存在下，描绘各DNA浓度与485nm时的荧光强度的关系的图。由以上结果可知，任一个浓度的KCl存在下，硫代黄素T与G-DNA1反应则发出荧光。但是，硫代黄素T与双链体1或T21反应时，几乎不发出荧光。即，这些结果表示硫代黄素T对G-四联体螺旋的特异性极高。因此，显示通过使用硫代黄素T能够与在钾离子存在下判断靶DNA能否形成G-四联体螺旋。
（实施例2）
实施例1中，使用硫代黄素T，进行了包括G-DNA1的G-四联体螺旋的检测。已知G-DNA1形成（3+1）型的G-四联体螺旋结构（非专利文献3、非专利文献4）。本实施例2中，使用硫代黄素T，进行不同结构的G-四联体螺旋的检测。本实施例2中，以5′-GGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGG-3′（序列编号：6）的序列的DNA形成的G-四联体螺旋为测定对象DNA（以下，将包括该序列的DNA称为G-DNA2）。此外，KCl浓度仅为100mM。除此以外，与实施例1进行同样的实验。该实验条件下，已知G-DNA2形成逆平行型G-四联体螺旋。
结果如图13所示。图13（A）表示荧光谱图的结果。图13（B）表示基于该结果描绘G-DNA2的浓度与485nm时的荧光强度的关系。由以上结果可知，硫代黄素T与G-DNA2反应则发出荧光。因此，显示使用硫代黄素T，能够检测逆平行型G-四联体螺旋。
（实施例3）
实施例1和2中分别使用硫代黄素T，进行（3+1）型的G-四联体螺旋和逆平行型G-四联体螺旋的检测。于是，本实施例3中，使用硫代黄素T，与实施例1、2不同，进行平行型G-四联体螺旋的检测。本实施例3中，以5′-GGGTGGGTGGGTGGG-3′（序列编号：7）的序列的DNA形成的G-四联体螺旋作为测定对象DNA（以下，将该序列构成的DNA称为G-DNA3）。此外，KCl浓度仅为100mM。除此以外，进行与实施例1同样的实验。该实验条件下，已知G-DNA3形成平行型G-四联体螺旋。
结果如图14所示。图14（A）表示荧光谱图的结果。图14（B）表示基于该结果描绘G-DNA3的浓度与485nm时的荧光强度的关系。由以上结果可知，硫代黄素T与G-DNA3反应则发出荧光。因此，显示使用硫代黄素T，能够检测平行型G-四联体螺旋。
（实施例4）
G-DNA2和5′-CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCC-3′（序列编号：8，G-DNA2的互补链）（以下，将该DNA称为双链体-C）在如锂离子存在下的使G-四联体螺旋的结构不稳定化的条件下，相互互补结合形成双链DNA。但是，在钾离子存在下，G-DNA2形成G-四联体螺旋结构，双链体-C以单链DNA的状态存在（图15）。本实施例4中，对混合有G-DNA2和双链体-C的DNA试样通过钾离子存在下的来自硫代黄素T的荧光强度和锂离子存在下的来自硫代黄素T的荧光强度之差能否判别是否在钾离子存在下能够形成G-四联体螺旋进行了研究。
实验步骤如下所述。首先，制备表2所示的反应溶液1。
[表2]
MES-LiOH,pH7 50mM
KCl 100mM
G-DNA2 10μM
双链体-C 10μM
硫代黄素T 1μM
总容量 100μL
同样地，制备反应溶液2。反应溶液2的组成，除了将反应溶液1中的KCl换为LiCl之外，与反应溶液1的组成相同。将这些反应溶液在90℃下保温2分钟，之后，以0.5℃/分钟的降温速度降温到25℃。已知以上工序后，反应溶液1中的G-DNA1的大部分形成G-四联体螺旋，双链体-C以单链DNA的状态存在。另一方面，已知在反应溶液2中，在锂离子的存在下，G-四联体螺旋的结构不稳定化，G-DNA2和双链体-C的大部分相互互补结合，形成双链DNA。此后，对这些反应溶液进行485nm时的荧光强度分析。激发光波长为450nm。
另外，同样地，作为比较实验，代替G-DNA2和双链体-C，使用5′-AGAAGAGAAAGA-3′（序列编号：9）（以下，将该DNA称为双链体-AGA）和5′-TCTTTCTCTTCT-3′（序列编号：10，序列编号9的互补链）（以下，将该DNA称为双链体-TCT），除此以外，进行完全相同的实验。双链体-AGA和双链体-TCT互补。并且任一个均不形成G-四联体螺旋。因此，即使在锂离子存在下或者在钾离子存在下，这些DNA相互互补结合，形成双链DNA。
结果如图16所示。图16中的右侧的柱表示从使用G-DNA2和双链体-C时的来自反应溶液1的荧光强度值减去来自反应溶液2的荧光强度值的值。该值大约为30，大于0。另一方面，左侧的柱表示从使用双链体-AGA和双链体-TCT时的来自反应溶液1的荧光强度值减去来自反应溶液2的荧光强度值的值。该值大约为0。由以上结果可知，使用硫代黄素T，能够判断靶DNA在钾离子存在下能否形成G-四联体螺旋。
（实施例5）
已知G-DNA1在钾离子存在下几乎形成G-四联体螺旋。另一方面，G-DNA1在锂离子存在下，使G-四联体螺旋结构不稳定化，因此，其一部分以单链DNA的状态存在。本实施例5中，对在含有G-DNA1的试样溶液中使用硫代黄素T能否检测在钾离子存在下G-DNA2形成的G-四联体螺旋进行了研究。本实施例5中，对通过钾离子存在下的来自硫代黄素T的荧光强度和在锂离子存在下的来自硫代黄素T的荧光强度之差能否判别G-DNA1在钾离子存在下能够形成G-四联体螺旋进行了研究。
实验顺序为，代替G-DNA2和双链体-C使用G-DNA1，除此以外，与实施例4完全相同。此外，作为比较实验，代替G-DNA2和双链体-C使用T21进行实验。T21在锂离子存在下或者在钾离子存在下，都以单链DNA的状态存在。
结果如图17所示。图17中的右侧的柱表示从使用G-DNA1时的来自反应溶液1的荧光强度值减去来自反应溶液2的荧光强度值的值。该值大约为6，大于0。另一方面，左侧的柱表示从使用T21时的来自反应溶液1的荧光强度值减去来自反应溶液2的荧光强度值的值。该值大约为0。由以上结果可知，使用硫代黄素T，能够判断靶DNA在钾离子存在下能否形成G-四联体螺旋。
总结以上结果，可知本发明的发明人在世界中首次发现了使用硫代黄素T能够实现使用现有的苯并噻唑衍生物所无法实现的G-四联体螺旋的特异性检测，从而完成了本发明。
从上述说明，本领域技术人员可以得到本发明的多个改良及其它的实施方式。因此，上述说明应当仅作为例示来解释，以对本领域技术人员例示实施本发明的最优的方式为目的。只要不脱离本发明的精神，能够对其结构和/或功能的具体内容进行实质性的变更。
工业上的可利用性
根据本发明，G-四联体螺旋的特异性检测方法在生物技术领域作为分析方法有用。
符号说明
1  G-四联体螺旋
2  G四联体面
3  金属离子
4  G四联体面的化学结构
5  容器
6  含有钾离子、靶DNA和硫代黄素T的试样溶液1
7  含有靶DNA和硫代黄素T的试样溶液2
8  双链DNA中的双链体-C
9  双链DNA中的G-DNA2
10 单链DNA状态的双链体-C
12 由G-DNA2形成的G-四联体螺旋

Claims (4)

1.一种判定靶DNA在钾离子存在下是否形成了G-四联体螺旋的方法，其特征在于，具备以下的工序：
在G-四联体螺旋形成的反应条件下维持含有钾离子、硫代黄素T和所述靶DNA的第一试样溶液的工序；
测定λ1的波长时的第一荧光强度值A的工序，其中，
所述第一荧光强度值A来自所述第一试样溶液中所含有的硫代黄素T，
λ1为465纳米以上、505纳米以下；
在使所述G-四联体螺旋的结构不稳定化的条件下维持含有硫代黄素T和所述靶DNA的第二试样溶液的工序；
测定所述λ1的波长时的第二荧光强度值B的工序，其中，
所述第二荧光强度值B来自所述第二试样溶液中所含有的硫代黄素T；和，
如果满足以下不等式，则判定为所述靶DNA在钾离子存在下形成了所述G-四联体螺旋的工序，
所述第一荧光强度值A－所述第二荧光强度值B＞0。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
如果满足所述第一荧光强度值－所述第二荧光强度值≤0的不等式，则判定为所述靶DNA在钾离子存在下没有形成所述G-四联体螺旋。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
使所述G-四联体螺旋结构不稳定化的条件为锂离子存在下的条件。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述λ1为485纳米。
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