JP6498412B2

JP6498412B2 - 新規チオフラビンｔ誘導体及びその利用

Info

Publication number: JP6498412B2
Application number: JP2014212645A
Authority: JP
Inventors: 正靖桑原
Original assignee: Gunma University NUC
Current assignee: Gunma University NUC
Priority date: 2014-10-17
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2019-04-10
Anticipated expiration: 2034-10-17
Also published as: JP2016079132A

Description

本発明は、新規チオフラビンＴ（ＴｈＴ）誘導体及びその利用に関し、より具体的には、新規ＴｈＴ誘導体のグアニン四重鎖構造の検出及び制御のための利用に関する。

近年、グアニン四重鎖やi-モチーフなど核酸の非二重鎖らせん構造(ノンカノニカル構造)の形成が、遺伝子発現などに大きな影響を及ぼすことが分かってきた(非特許文献１)。故に、それら核酸分子の構造形成を検出したり、構造変化を誘起したりするための小分子化合物の開発が進められている。その中で、従来、アミロイドβの重合検出プローブとして使用されてきた蛍光性のＴｈＴが、ある種のグアニン四重鎖構造の検出と誘起が可能であることが示された(非特許文献２)。しかし、蛍光の発光強度やグアニン四重鎖に対する選択性の向上、バックグラウンド発光(二重鎖らせん構造核酸や一本鎖核酸の存在下における発光)の低減などが、問題点としてあげられる。また、ＴｈＴが構造変化を誘起できるグアニン四重鎖構造の種類は限られている。以上の点から、ＴｈＴの誘導体化による新たな低分子化合物の創製が検討されている。特許文献１はＴｈＴ誘導体を開示しているが、改変部位はN3位ではなく、グアニン四重鎖に対する効果も示唆されていない。

特開2012-102106号公報

Nucleic Acids Res.,2013,41,7453. J. Am. Chem. Soc., 2013, 135(1), 367-376.

本発明は、グアニン四重鎖構造に特異的に結合し、その構造を変化させうる新規化合物を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、ＴｈＴのベンゾチアゾール環上のＮ３位にあるメチル基を改変した新規ＴｈＴ誘導体の合成に成功し、それらの誘導体がグアニン四重鎖（Ｇ４）ＤＮＡに選択的に結合して強い蛍光を発すること、およびＧ４−ＤＮＡの立体構造を変えることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］下記一般式（I）で表される化合物又はその塩。
［２］下記一般式（I）で表される化合物又はその塩を含む、グアニン四重鎖構造検出剤。
［３］下記一般式（I）で表される化合物又はその塩を、ＤＮＡ有試料と混合する工程を含む、グアニン四重鎖構造の検出方法。
［４］下記一般式（I）で表される化合物又はその塩を含む、グアニン四重鎖構造を含む標的遺伝子の発現調節剤。
［５］下記一般式（I）で表される化合物又はその塩を含む、アミロイドβ検出剤。

本発明では、ＴｈＴのＮ３位に置換基を導入することでグアニン四重鎖構造に対して発光の選択性を増強させ、且つ、バックグラウンド発光を抑えることを明らかにした。さらに、Ｇ４−ＤＮＡの構造誘起・変換において、従来のＴｈＴにはできなかったタイプのＧ４−ＤＮＡの構造誘起・変換についても可能にした。これら構造選択的蛍光発光や構造誘起・変換は、Ｎ３位の置換基を変えることによって、さまざまなノンカノニカル構造標的に対応した機能性分子アナログが創製されうることを示唆した。
本発明のＴｈＴ誘導体は、分子プローブとして生体内外における核酸分子のノンカノニカル構造の検出とそれに基づく診断用途に使用でき、さらには、ノンカノニカル構造を改変することで遺伝子発現制御分子として医薬品などの分野に幅広く応用されることが期待される。

２７Ｍｙｃ（Ａ、Ｃ及びＥ）とｄｓＤＮＡ（Ｂ、Ｄ及びＦ）の濃度を上昇させたとき（０、１、３、６、９、１２及び１５μＭ）のＰＢＳ１５３ＮＭ中のＴｈＴ（Ａ及びＢ）、ＴｈＴ−ＤＢ（Ｃ及びＤ）、ＴｈＴ−ＨＥ（Ｅ及びＦ）（３μＭ）の蛍光スペクトルを示す図。オリゴヌクレオチドの濃度：０μＭ（紫）、１μＭ（黒）、３μＭ（青）、６μＭ（水色）、９μＭ（緑）、１２μＭ（黄色）、および１５μＭ（赤）。ＴＲＳ５０Ｋ（Ａ）、ＰＢＳ１５０Ｋ（Ｂ）、ＰＢＳ１４０ＫＭ（Ｃ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｄ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのＴｈＴの蛍光スペクトルを示す図。ＴＲＳ５０Ｋ（Ａ）、ＰＢＳ１５０Ｋ（Ｂ）、ＰＢＳ１４０ＫＭ（Ｃ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｄ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのＴｈＴ−ＤＢの蛍光スペクトルを示す図。ＴＲＳ５０Ｋ（Ａ）、ＰＢＳ１５０Ｋ（Ｂ）、ＰＢＳ１４０ＫＭ（Ｃ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｄ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのＴｈＴ−ＨＥの蛍光スペクトルを示す図。ＰＢＳ１５０Ｋ（Ａ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｂ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのｄｓＤＮＡに対するＴｈＴの相対蛍光強度を示す図。ＰＢＳ１５０Ｋ（Ａ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｂ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのｄｓＤＮＡに対するＴｈＴ−ＤＢの相対蛍光強度を示す図。ＰＢＳ１５０Ｋ（Ａ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｂ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのｄｓＤＮＡに対するＴｈＴ−ＨＥの相対蛍光強度を示す図。ＰＢＳ１４０ＫＭ（緑）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（青）中での、各種オリゴヌクレオチドとのＴｈＴ（Ａ）、ＴｈＴ−ＤＢ（Ｂ）及びＴｈＴ−ＨＥ（Ｃ）の相対蛍光強度（Ｉ／Ｉ₀）を示す図。ここで、Ｉ／Ｉ₀比は同じ色素を含む緩衝液中でオリゴヌクレオチド（１５μＭ）およびｄｓＤＮＡ（１５μＭ；二本鎖の濃度）にそれぞれ結合したときに放出される蛍光の強度比を表す。緩衝液中にＴｈＴ（Ａ）、ＴｈＴ−ＤＢ（Ｂ）またはＴｈＴ−ＨＥ（Ｃ）（３μＭ）と、オリゴヌクレオチド（１５μＭ）を含有するアリコットの写真。ａ、ｂ、ｃ及びｄでは、それぞれＴＲＳ５０Ｋ、ＰＢＳ１５０Ｋ、ＰＢＳ１４０ＫＭ、ＰＢＳ１５３ＮＭの緩衝液を使用した。１、２、３、４、５、６、７、８はそれぞれ２２ＡＧ、２６Ｔｅｌ、２７Ｍｙｃ、２２Ｋｉｔ、２０Ｓｒｃ、１８Ｒａｓ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡを含有する。典型的なＧ４構造を示す図。ＴｈＴ類似体が存在する（赤）、または存在しない（青）状態でのＧ４−ＤＮＡ溶液（１２μＭ）のＣＤスペクトルを示す図。（Ａ）ＰＢＳ１５０Ｋ中にＴｈＴ−ＤＢ（２４μＭ）が存在する、または存在しない状態での２２ＡＧのＣＤスペクトル、（Ｂ）ＰＢＳ１５０Ｋ中にＴｈＴ−ＤＢ（２４μＭ）が存在する、または存在しない状態での２６ＴｅｌのＣＤスペクトル、（Ｃ）ＰＢＳ１５３ＮＭ中にＴｈＴ−ＤＢ（２４μＭ）が存在する、または存在しない状態での２２ＫｉｔのＣＤスペクトル、および（Ｄ）ＰＢＳ１５３ＮＭ中にＴｈＴ−ＨＥ（９６μＭ）が存在する、または存在しない状態での２６ＴｅｌのＣＤスペクトル。ＴｈＴおよびＴｈＴ−ＤＢのAβ(1-42)に対する結合特性を示す蛍光測定の結果を示す図。

本発明のＴｈＴ誘導体は、以下の構造を有する。
ここで、Ｒ¹は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい、通常には炭素数１〜１０（好ましくは１〜５）の炭化水素基を示す。炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよく、アルキル基などの脂肪族炭化水素基でもよいし、アリール基やアリールアルキル基などの芳香族炭化水素基でもよい。「Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでいてもよい」とは、炭化水素基が、アミノ基（−ＮＲ₂）（Ｒは独立して水素または炭素数１〜５のアルキル基）、ニトロ基（−ＮＯ₂）、シアノ基（−ＣＮ）、イソシアネート基（−ＮＣＯ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、メルカプト基（−ＳＨ）、スルホン酸基（−ＳＯ₃Ｈ）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む官能基を含んでいてもよいことを意味するほか、エーテル基（−Ｏ−）、イミノ基（−ＮＨ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、チオエステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む連結基が炭化水素基の炭素骨格の内部又は末端に含まれていてもよいことを意味する。

Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴はそれぞれ独立して炭素数１〜５の（脂肪族）炭化水素基を示し、より好ましくは炭素数１〜３の炭化水素基を示し、メチル基が特に好ましい。炭素数１〜５の炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよい。

ｎは０〜５の整数を示し、より好ましくは０〜３の整数を示し、特に好ましくは１である。
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示し、より好ましくはＯである。

具体的には以下のような化合物が例示される。

一般式（Ｉ）で示される化合物の塩としては、その酸付加塩が例示される。適切な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。例は、酢酸、アスパラギン酸、安息香酸、ベシル酸、重炭酸／炭酸、重硫酸／硫酸、ホウ酸、カンシル酸、クエン酸、エジシル酸、エシル酸、ギ酸、フマル酸、グルセプト酸、グルコン酸、グルクロン酸、ヘキサフルオロリン酸、ヒベンズ酸、塩酸／塩化物、臭化水素酸／臭化物、ヨウ化水素酸／ヨウ化物、イセチオン酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、メシル酸、メチル硫酸、ナフチル酸、２−ナプシル酸、ニコチン酸、硝酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸／リン酸水素／リン酸二水素、サッカラート、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、トシル酸及びトリフルオロ酢酸塩を包含する。

一般式（Ｉ）で示される化合物は、後述の実施例に記載された方法に準じて合成することができる。

一般式（Ｉ）で示される化合物はＤＮＡのグアニン四重鎖構造に特異的に結合するので、グアニン四重鎖構造検出剤として使用できる。具体的には、例えば、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と、被検ＤＮＡを含む試料を接触させ、グアニン四重鎖構造に結合した化合物を、化合物が発する蛍光に基づいて検出することにより、被検ＤＮＡ中のグアニン四重鎖構造を検出することができる。
被検ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ又はその断片が好ましく、特に多数のゲノムＤＮＡの断片をチップ上に固相化してＤＮＡチップとしたものが好ましい。グアニン四重鎖構造はプロモーター領域やCpG（シトシン(C)(5'側）とグアニン(G)が１個のリン酸エステル(p)を介して結合している部分）部位を複数含む領域(CpG islandと呼ばれる）に多く含まれることが予測されていることから、ゲノムＤＮＡのうち、プロモーターやCpG islandを含む断片だけを選択して、その中から検出操作を行うことも効率的で望ましい。

検出操作自体は、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を用いる点を除けば、公知の方法と同様であり、化合物を緩衝液中に溶解した溶液を、被検ＤＮＡを含む試料と接触させ、インキュベーション後、洗浄し、洗浄後に被検ＤＮＡと結合している蛍光色素の蛍光を検出することにより行うことができる。また、in vivo およびin situでの検出にも適用できる。

また、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩は、グアニン四重鎖構造に特異的に結合してその構造を変化させることができる。上記の通り、グアニン四重鎖構造は遺伝子のプロモーター領域に多く存在することから、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を用いて標的遺伝子のプロモーター領域に存在するグアニン四重鎖構造を改変できれば、当該遺伝子の発現量を調節することができる。そのような遺伝子としては、ｃ−ＭｙｃＰ１プロモーターのヌクレアーゼ高感受性エレメント領域（２７Ｍｙｃ）、チロシンキナーゼをコードするプロトオンコジーンの転写開始部位の８７ヌクレオチド上流域（２２Ｋｉｔ）、非受容体型チロシンキナーゼをコードするプロトオンコジーン（２０Ｓｒｃ）、およびヒトＮＲＡＳプロトオンコジーン転写物の５’非翻訳領域（１８Ｒａｓ）などが挙げられる。

特に、標的遺伝子が癌遺伝子などの疾患関連遺伝子である場合、有効量の一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を、薬学的に許容しうる担体と組合せて、癌などの疾患の治療や予防のための医薬組成物とすることができる。

医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、徐放製剤、液剤、懸濁剤として経口投与に；液剤、懸濁剤又は乳剤として非経口投与に；軟膏剤又はクリーム剤として局所投与に；あるいは坐剤として直腸内投与に適切な剤形にしてもよい。非経口投与は、特に限定されないが、組成物の注射による、外科的切開を介した組成物の適用による、組織浸透性の非外科的創傷を介した組成物の適用によるなどの医薬組成物の投与を包含する。非経口投与はまた、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射、及び腎臓透析点滴法を包含するものである。

適切な製剤担体は、不活性希釈剤又は増量剤、水及び種々の有機溶媒を包含する。医薬組成物は、必要に応じて、香味料、結合剤、賦形剤などのような追加の成分を含有してもよい。よって経口投与には、クエン酸のような種々の賦形剤を含有する錠剤を、デンプン、アルギン酸及びある種のケイ酸複合体のような種々の崩壊剤と、並びにショ糖、ゼラチン及びアカシアゴムのような結合剤と一緒にして利用してもよい。更には、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクのような滑沢剤は、錠剤化目的にしばしば有用である。同様のタイプの固体組成物はまた、軟及び硬充填ゼラチンカプセル剤にして利用することができる。このために好ましい材料は、ラクトース、即ち乳糖及び高分子量ポリエチレングリコール類を包含する。経口投与に水性懸濁剤又はエリキシル剤が必要
であれば、上記化合物は、種々の甘味剤又は着香剤、着色料又は色素、及び必要に応じて乳化剤又は懸濁剤と、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、又はこれらの組合せと一緒にして合せることができる。

治療用途には、組成物中の活性成分の有効な１日量は、一般に、０．０１mg/kg〜５０mg/kg体重、更に好ましくは０．１mg/kg〜１０mg/kg体重であろう。当然ながら、これは使用する誘導体、投与様式、必要な処置、適応疾患、更には患者の生理学的データ（例えば、年齢、サイズ、及び体重）により変化する。この１日総用量は、単回又は分割用量として投与することができる。治療剤の投与に適切な用量及び用法の決定は、当該分野において周知であり、当業者であれば含まれることを理解するであろう。

また、ＴｈＴおよびその誘導体は、アミロイドβ（Aβ1-42など）に結合し、その存在量に比例して蛍光強度が増加するので、本発明のＴｈＴ誘導体（一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩）はアミロイドβ検出（結合）剤として、アルツハイマー病の診断等の用途にも使用される。

以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

１．機器等
ＮＭＲスペクトルはＪＮＭ−ＥＣＳ４００およびＪＮＭ−ＥＣＡ６００（日本電子株式会社、東京、日本）を使用して測定された。ＥＳＩマススペクトルはＡＰＩ２０００質量分析計（アプライドバイオシステムズ株式会社、東京、日本）を使用して測定された。ＵＶスペクトルはＵＶ−１８００分光光度計（株式会社島津製作所、京都、日本）を使用して測定された。蛍光スペクトルはＬＳ−５５蛍光分光光度計（株式会社パーキンエルマージャパン、神奈川、日本）を使用して測定された。ＣＤスペクトルはＪＡＳＣＯＪ−８２０分光計（日本分光株式会社、東京、日本）を使用して取得された。オリゴヌクレオチドはＷＫ−０５１８サーマルサイクラー（和光純薬工業株式会社、大阪、日本）を使用してリフォールディングされた。蛍光量子収率は絶対光ルミネセンス量子収率測定システムＣ９９２０−０１（浜松ホトニクス株式会社、静岡、日本）とＦ−７０００蛍光分光光度計（株式会社日立製作所、東京、日本）を使用して測定された。蛍光寿命はＣ１１３６７Ｇ蛍光寿命分光計（浜松ホトニクス株式会社、静岡、日本）を使用して測定された。
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）はＨＰＬＣシステム（日本分光株式会社、東京、日本）を使用して実施された。

２．材料
２−アミノ−６−メチルベンゾチアゾール、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（ＤＨＰ）、ブロモ酢酸メチル、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）、および水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ₄）は東京化成工業株式会社（東京、日本）から購入したものである。シリカゲル６０、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は関東化学株式会社（東京、日本）から購入したものである。アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、塩化アンモニウム、ジクロロメタン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）、ジエチルエーテル、リン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ₄）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ₂ＨＰＯ₄）、エタノール（ＥｔＯＨ）、エチレングリコール、塩酸（ＨＣｌ水溶液）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ）、硫酸マグネシウム七水和物、メタノール（ＭｅＯＨ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸二水素ナトリウム二水和物（ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ）、硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄）およびチオフラビンＴ（ＴｈＴ）は和光純薬工業株式会社（大阪、日本）から購入したものである。ウシ胸腺ＤＮＡ（ウシの胸腺由来のデオキシリボ核酸、ＸＶ型）、４−（ジ
メチルアミノ）ベンゾイルクロリドおよびＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（ミズーリ州、米国）から購入したものである。オリゴヌクレオチドは株式会社日本バイオサービス（埼玉、日本）および株式会社ジーンデザイン（大阪、日本）から購入したものである。

３．チオフラビンＴ誘導体の合成
我々はＴｈＴ中の候補置換部位として４つのメチル基に焦点を当てた。分子動態（ＭＤ）シミュレーションに基づいて、ベンゾチアゾール環上のＮ３位のメチル基のみがＧカルテット平面と有意に重なり合うことが示唆された。したがって、我々はこの位置に置換基を導入することが異なるＧ４タイプを区別するための特異性を改善させることになるかもしれないと考えた。
そこで、最初に７ステップ反応により２−アミノ−６−メチルベンゾチアゾールからＴｈＴ−ＤＢとＴｈＴ−ＨＥを合成した。

化合物Ｔ１の合成：乾燥ＭｅＣＮ中の２−アミノ−６−メチルベンゾチアゾール（５３０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）の溶液にブロモ酢酸メチル（３５０μＬ、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、４時間還流した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させた。残留物をＭｅＣＮと懸濁し、そして、濾過した。得られた沈殿物を真空下で乾燥させてＴ１（８３７ｍｇ、定量的収量）を得た； ¹H NMR (400 MHz, メタノール-d4) 6 7.63 (1H, s) 7.40-7.33 (2H, q) 5.12 (2H, s) 3.80 (3H, s) 2.41 (3H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 237.1, [M⁺]の計算値 = 237.07。

化合物Ｔ２の合成：乾燥ＭｅＯＨ（６．８ｍＬ）中の化合物Ｔ１（５０２ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液にＮａＢＨ₄（９６０ｍｇ、２５ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、残留物を酢酸エチルと懸濁
した。懸濁液を冷水に注ぎ、有機層を水で洗浄し、次に硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濾過とその後の溶媒の蒸発により黄色の粉末として化合物Ｔ２を得た（７２７ｍｇ、７５％）； ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) 6 7.09 (1H, s) 7.04-7.02 (1H, d) 6.79-6.77 (1H, d) 4.15-4.13 (2H, t) 3.99-3.96 (2H, t) 2.33 (3H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z,
実測値 = 209.2, [M⁺]の計算値 = 209.07。

化合物Ｔ３の合成：５０％ＫＯＨ（重量／体積）水溶液（４７ｍＬ）とエチレングリコール（５０ｍＬ）の混合液に化合物Ｔ２（７１１ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下で２４時間還流し、そして、通気しながら２４時間さらに撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液で希釈し、そして、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして、濾過した。濾過物を乾燥するまで蒸発させ、結果生じた残留物をジクロロメタン中のメタノールの０％〜５％の濃度勾配によるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して黄色の油として化合物Ｔ３を得た（２５０ｍｇ、４０％）； ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) 6 7.11-7.10 (2H, d) 7.07-7.04 (2H, q) 6.60-6.57 (2H, d) 3.72-3.61 (4H, m) 3.28-3.22 (4H, d) 2.17 (6H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 365.2, [(M+H)⁺] の計算値 = 365.53。

化合物Ｔ４の合成：乾燥ジクロロメタン（３．６ｍＬ）中の化合物Ｔ３（１９０ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ）の溶液にｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（７８ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（４００μＬ、４．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で５時間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテルで希釈した。有機層を半飽和食塩水で洗浄して触媒を取り除き、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして、乾燥するまで蒸発させて黄色の油として化合物Ｔ４を得た（２７６ｍｇ、粗生成物）；ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 533.3, [(M+H)⁺] の計算値 = 533.24。

化合物Ｔ５の合成：乾燥エタノール（４．７ｍＬ）中の粗化合物Ｔ４（１５８ｍｇ）の溶液にＮａＢＨ₄（２２４ｍｇ、５．９ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、混合物を室温で８時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、残留物を酢酸エチルと懸濁し、そして、冷水に注いだ。有機層を水で洗浄し、次に硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濾過とその後の溶媒の蒸発により黄色の油として化合物Ｔ５を得た（１４９ｍｇ、粗生成物）； ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 268.0, [(M+H)⁺]の計算値 = 268.12。

ＴｈＴ−ＤＢおよびＴｈＴ−ＨＥの合成：乾燥ＭｅＣＮ（２．６ｍＬ）中の粗化合物Ｔ５（８６ｍｇ）の溶液に４−（ジメチルアミノ）ベンゾイルクロリド（８９ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、生成物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして、濾過した。濾過物を乾燥するまで蒸発させ、残留物をジクロロメタン中のメタノールの０％〜２０％の濃度勾配によるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して中間体Ｔ６と黄色の油としてＴｈＴ−ＤＢ（５７ｍｇ、粗精製品）を得た； T6: ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 397.2, [M⁺]の計算値 =397.19; ThT-DB: ESI-MS (陽イオンモード)
m/z, found=460.1, [M⁺]の計算値 =460.21。次に、Ｔ６とＴｈＴ−ＤＢ（５４ｍｇ）の混合物を２５０μＬのＴＦＡ／水／ＭｅＯＨ（２／１／２、体積／体積／体積）中に溶解し、混合物を室温で８時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、結果生じた残留物を、オクタデシルシリカ（ＯＤＳ）ゲルカラムを装着したＨＰＬＣシステムにより精製してそれぞれ黄色の粉末としてＴｈＴ−ＨＥ（２ｍｇ、Ｔ４より１．７％）およびＴｈＴ−ＤＢ（６．８ｍｇ、Ｔ４より５．７％）を得た；
ThT-HE: ¹H NMR (600 MHz, CDCl3) 6 8.13-8.12 (1H, d) 7.90-7.89 (2H, d) 7.73 (1H, s) 7.62-7.61 (1H, d) 6.86-6.85 (2H, d) 4.94 (2H, s) 4.37 (2H, s) 3.16 (6H, s) 2.57 (3H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 313.1, [M⁺]の計算値= 313.14;
ThT-DB: ¹H NMR (600 MHz, CDCl3) 6 8.20-8.19 (1H, d) 7.79 (1H, s) 7.70-7.69 (2H, d) 7.61-7.60 (1H, d) 7.55-7.54 (2H, d) 6.75-6.74 (2H, d) 6.53-6.52 (2H, d) 5.49 (2H, s) 4.74 (2H, s) 3.12 (6H, s) 3.04 (6H, s) 2.55 (3H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値=460.1, [M⁺]の計算値=460.21。

４．ＴＨＴ誘導体の評価
次に、様々なＧ４形成オリゴヌクレオチドが存在する状態でのＴｈＴとＴｈＴ誘導体の蛍光特性とＧ４における化合物誘導性のトポロジー変化を調べた。

Ｇ４を形成する次の６種類のヒト由来オリゴヌクレオチドを使用した：
22mer DNA（２２ＡＧ：5'-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3' （配列番号１）および
２２Ｋｉｔ：5'-AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3'（配列番号２））、
26mer DNA（２６Ｔｅｌ：5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3'（配列番号３））、
27mer DNA（２７Ｍｙｃ：5'-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGA AGG-3'（配列番号４））、
20mer DNA（２０Ｓｒｃ：5'-GGGCGGCGGGCTGGGCGGGG-3'（配列番号５））、および
18mer RNA（１８Ｒａｓ：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGG-3'（配列番号６））。

これらはヒト遺伝子から得られた：
テロメア領域（２２ＡＧおよび２６Ｔｅｌ）、
ｃ−ＭｙｃＰ１プロモーターのヌクレアーゼ高感受性エレメント領域（２７Ｍｙｃ）、
チロシンキナーゼをコードするプロトオンコジーンの転写開始部位の８７ヌクレオチド上流域（２２Ｋｉｔ）、
非受容体型チロシンキナーゼをコードするプロトオンコジーン（２０Ｓｒｃ）、および
ヒトＮＲＡＳプロトオンコジーン転写物の５’非翻訳領域（１８Ｒａｓ）。

これらの配列の他に、次の２種類のオリゴヌクレオチドを基準として使用した：
17mer DNA（ssDNA：5’-GGGTTACTACGAACTGG-3’（配列番号７））、及び
ssDNA の相補配列（cDNA：5’-CCAGTTCGTAGTAACCC-3’（配列番号８））。
ssDNAは一本鎖ＤＮＡとして使用し、cDNAはssDNAと１：１の比率で混合し、二本鎖DNA（dsDNA）として使用した。

緩衝条件のＧ４の立体構造への効果とそれによる蛍光放射への効果を分析するために４種類の緩衝液溶液を使用した：
ＴＲＳ５０Ｋ（５０ｍＭトリス塩酸、５０ｍＭＫＣｌ；ｐＨ７．２）；
ＰＢＳ１５０Ｋ（９２ｍＭＨＰＯ₄ ^2-、１５０ｍＭＫ⁺、１５ｍＭＮａ⁺；ｐＨ７．０）；
ＰＢＳ１４０ＫＭ（８０ｍＭＨＰＯ₄ ^2-、２．５ｍＭＳＯ_４ ^2-、１４０ｍＭＫ⁺、１０ｍＭＮａ⁺、２．５ｍＭＭｇ²⁺；ｐＨ７．４）、および
ＰＢＳ１５３ＮＭ（１０ｍＭＨＰＯ₄ ^2-、１４６ｍＭＣｌ^-、１５３ｍＭＮａ⁺、２．７ｍＭＫ⁺、２．５ｍＭＭｇ²⁺；ｐＨ７．４）。
ＰＢＳ１５０ＫとＰＢＳ１４０ＫＭは細胞内イオン成分と似ており、ＰＢＳ１５３ＮＭは典型的なリン酸生理食塩水である。

４−１．蛍光スペクトル分析
８種類のオリゴヌクレオチド（２２ＡＧ、２６Ｔｅｌ、２７Ｍｙｃ、２２Ｋｉｔ、２０Ｓｒｃ、１８Ｒａｓ、ｓｓＤＮＡ、およびｄｓＤＮＡ）を２１μＭの濃度でそれぞれ緩衝液ＴＲＳ５０Ｋ、ＰＢＳ１５０Ｋ、ＰＢＳ１４０ＫＭ、およびＰＢＳ１５３ＮＭに溶解し、サーマルサイクラーを使用して９５℃で０．５分間加熱して変性し（１８Ｒａｓについては４０℃で）、０．５℃／分の割合で２５℃まで冷却することによってリフォールディングさせた。これらの溶液を適切なオリゴヌクレオチド濃度まで希釈し、アリコット（５０
μＬずつ）を２５℃で３０分間保温し、次にそれぞれ緩衝液ＴＲＳ５０Ｋ、ＰＢＳ１５０Ｋ、ＰＢＳ１４０ＫＭ、およびＰＢＳ１５３ＮＭの中の色素（ＴｈＴ、ＴｈＴ−ＤＢ、およびＴｈＴ−ＨＥ；１０．５μＭ）の２０μＬの溶液と混合した。さらに、これらの混合物を２５℃で３０分間保温した。色素の放射スペクトルは、４１５ｎｍで励起し、４５０ｎｍと６００ｎｍの間で蛍光をモニターすることにより得た。
図１にＴｈＴ、ＴｈＴ−ＤＢ、およびＴｈＴ−ＨＥを２７ＭｙｃまたはｄｓＤＮＡと混合したときの結果を示し、図２−１〜２−３にＴｈＴ、ＴｈＴ−ＤＢ、およびＴｈＴ−ＨＥを各種緩衝液中で、各種オリゴヌクレオチドと混合したときの結果を示す。
図１より、ＴｈＴはｄｓＤＮＡ存在下でもかなりの蛍光を発しバックグラウンドが高いのに対し、ＴｈＴ−ＤＢ、およびＴｈＴ−ＨＥはｄｓＤＮＡ存在下ではほとんど蛍光を発しないのでグアニン四重鎖特異性が高いことがわかった。

図２−４〜２−６では、ｄｓＤＮＡと相互作用した色素の強度を１と設定し、４８５ｎｍ（ＴｈＴおよびＴｈＴ−ＨＥ）または５００ｎｍ（ＴｈＴ−ＤＢ）での放射光のピークとしての相対蛍光強度を表した。Ｘ軸はオリゴヌクレオチド濃度を表す。
Ｋｄ値を図２−４〜２−６中の滴定曲線から決定し、表１に記載した。
表１の結果から、ＴｈＴ−ＨＥの標的Ｇ４への親和性は概してＴｈＴの標的Ｇ４への親和性と比べて低かったが、ＴｈＴ−ＤＢの標的Ｇ４への親和性はほぼ同等であった。

表１．ＴｈＴおよび誘導体の標的オリゴヌクレオチドへの結合
n.d.:正確な値は測定不能であったが、Ｋｄ＞４０ｎＭと推定される。

各緩衝液溶液におけるｄｓＤＮＡ（１５μＭ）と混合した色素（ＴｈＴ、ＴｈＴ−ＤＢ、またはＴｈＴ−ＨＥ；３μＭ）の蛍光強度（Ｉ₀と定義する）を１に設定し、各緩衝溶液における各種オリゴヌクレオチドと混合した色素の相対蛍光強度（Ｉ／Ｉ₀）を決定した（表２）。図３はＰＢＳ１４０ＫＭおよびＰＢＳ１５３ＮＭ中の各オリゴヌクレオチドとのＴｈＴ（Ａ）、ＴｈＴ−ＤＢ（Ｂ）、およびＴｈＴ−ＨＥ（Ｃ）の相対蛍光強度（Ｉ／Ｉ₀）をプロットした。その結果、ＴｈＴ−ＤＢおよびＴｈＴ−ＨＥの相対蛍光強度はＴｈＴよりも高い値を示したが、特に、ＴｈＴ−ＨＥは２７Ｍｙｃに対する特異性があることがわかった。
表１のとおり、結合親和性は低いにもかかわらず、２７Ｍｙｃと相互作用したＴｈＴ−ＨＥは２６Ｔｅｌと相互作用したＴｈＴ−ＨＥおよび２７Ｍｙｃと相互作用した他の色素よりも強い相対蛍光強度を示すことができる。したがって、Ｋｄ値は必ずしも蛍光放射光と相関しなかった。

表２．各バッファー中、オリゴヌクレオチド(15 μM)存在下におけるThT, ThT-DB, および ThT-HE (3 μM) の蛍光強度
括弧内の数値は、dsDNAと色素を混合したときの蛍光強度をそれぞれ１として計算した相対蛍光強度である。

４−２．蛍光観察
色素（３μＭ）とオリゴヌクレオチド（１５μＭ）を含有する混合物（２０μＬずつ）を日本ジェネティクス株式会社（東京、日本）から購入した９６ウェルＰＣＲプレート・ウルトライージーカット（０．２ｍＬ／ノンスカート）に入れた。
図４中の写真は、８ｍｍＳｕｐｅｒＶｉｏｌｅｔＬＥＤＯＳＳＶ８１３１Ａを使用する４１０ｎｍの可視光の照射下でカットオフフィルター（４６０ｎｍ未満）を通して撮影された。０．４秒の露光時間と３．８のＦ値を用いた。
その結果、ＴＨＴは特異性がなかったが、ＴＨＴ−ＨＥは２７Ｍｙｃと１８ｒａｓに対して強い発光を示した。ＴｈＴ−ＤＢは弱い光を放射するのみであったのでＧ４間の差異はＴｈＴおよびＴｈＴ−ＨＥと共に撮った写真上では目視により決定することがほとんどできなかった。しかしながら、より長い露光時間を用いると、Ｇ４とのＴｈＴ−ＤＢの放射光を観察することができた（図は示さず）。

４−３．蛍光量子収率および蛍光寿命
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド（２７Ｍｙｃ、ｄｓＤＮＡ、およびウシ胸腺ＤＮＡ）をそれぞれ２５μＭの濃度で緩衝液ＰＢＳ１５３ＮＭに溶解し、サーマルサイクラーを使用して９５℃で０．５分間加熱して変性し、０．５℃／分の割合で２５℃まで冷却することによってリフォールディングさせた。これらの溶液（２，７００μＬずつ）を２５℃で３０分間保温し、次に緩衝液ＰＢＳ１５３ＮＭ中の色素（ＴｈＴ、ＴｈＴ−ＨＥ、およびＴｈＴ−ＤＢ；４５μＭ）の３００μＬの溶液と混合して２７Ｍｙｃ（２２．５μＭ）、ｄｓＤＮＡ（２２．５μＭ；二本鎖濃度）、またはウシ胸腺ＤＮＡ（７６５μＭ；塩基濃度）に加えて色素（４．５μＭ）を含有する混合物（３，０００μＬずつ）を供給した。さらに、これらの混合物を２５℃で３０分間保温し、１．０ｃｍの光路長での４３０ｎｍの吸光度が０．１であるように緩衝液ＰＢＳ１５３ＮＭで希釈した。
緩衝液ＰＢＳ１５３ＮＭ中で２７Ｍｙｃと相互作用した色素（ＴｈＴ、ＴｈＴ−ＨＥ、またはＴｈＴ−ＤＢ）の蛍光量子収率（Φ_f）は、絶対光ルミネセンス量子収率測定システムＣ９９２０−０１を使用して４３０ｎｍで励起し、４４０ｎｍと７４０ｎｍの間で蛍光をモニターすることにより得られた（表３）。
なお、量子収率（Φ_f、すなわち、Φ_unk）は次の式に従って計算された：
この式で、Φ_stdは、標準試料としてＰＢＳ１５３ＮＭ中でＴｈＴ−ＤＢと相互作用した２７Ｍｙｃの蛍光量子収率であり、Ｉ_stdとＩ_unkはそれぞれ標準試料と分析試料の放射スペクトル下の面積であり、Ａ_stdとＡ_unkはそれぞれ励起光の波長で測定された前者と後者の光学密度であり（本実験ではＡ_std＝Ａ_unk＝０．１）、ｎ_stdとｎ_unkはそれぞれ前者と後者に使用された緩衝液の屈折率である（本実験ではｎ_std＝ｎ_unk）。

表３より、ＴｈＴ−ＨＥ／２７Ｍｙｃは最も強い蛍光強度を示し、０．５３というΦ_f値をもたらしたが、ＴｈＴ／２７ＭｙｃとＴｈＴ−ＤＢ／２７Ｍｙｃはより低いΦ_f値、すなわち、それぞれ０．４４と０．１０という値をもたらした。ＴｈＴ誘導体は非常に低いバックグランド蛍光しか示さなかったので、ＴｈＴ−ＤＢ／ｄｓＤＮＡとＴｈＴ−ＨＥ／ｄｓＤＮＡのΦ_f値はそれぞれわずかに０．００１７と０．００３８であったが、一方、ＴｈＴ／ｄｓＤＮＡのΦ_f値はずっと高く、すなわち、０．０２２であった。色素／ウシ胸腺ＤＮＡについて同様の結果が得られた。

表３．DNAと色素を混合させたときの蛍光量子収率 (λ_ex = 430 nm)

さらに、上述の試料溶液（ＰＢＳ１５３ＮＭ）を使用して、２７Ｍｙｃと相互作用した色素（ＴｈＴ、ＴｈＴ−ＤＢ、またはＴｈＴ−ＨＥ）の蛍光寿命が、Ｃ１１３６７Ｇ蛍光寿命分光計を使用して４４０ｎｍで励起し、４９０ｎｍでモニターすることにより測定された（表４）。表４における括弧の中のパーセント値として提供されるτ₁とτ₂の構成比率（Component Ratio）はそれぞれ次の式にしたがって計算された：

さらに、平均寿命、すなわち、<τ>は次の式に従って得られた：

ＴｈＴ−ＨＥのτ₁とτ₂の両方はＴｈＴのそれらとほぼ同等であったが、ＴｈＴ−ＨＥのτ₂成分の比率はＴｈＴのそれよりも大きかった。ＴｈＴ−ＤＢはＴｈＴおよびＴｈＴ−ＨＥと比べて短いτ₁とτ₂、および大きいτ₁成分の比率を示した。

４−４．円偏光二色性（ＣＤ）分析
ＣＤ測定の前に８種類のオリゴヌクレオチド（２２ＡＧ、２６Ｔｅｌ、２７Ｍｙｃ、２２Ｋｉｔ、２０Ｓｒｃ、１８Ｒａｓ、ｓｓＤＮＡ、およびｄｓＤＮＡ）を２１μＭの濃度でそれぞれ緩衝液ＴＲＳ５０Ｋ、ＰＢＳ１５０Ｋ、ＰＢＳ１４０ＫＭおよびＰＢＳ１５３ＮＭに溶解し、サーマルサイクラーを使用して９５℃で０．５分間加熱して変性し（１８Ｒａｓについては４０℃で）、０．５℃／分の割合で２５℃まで冷却することによってリフォールディングさせた。これらの溶液（４０μＬずつ）を２５℃で３０分間保温し、次にそれぞれ緩衝液ＴＲＳ５０Ｋ、ＰＢＳ１５０Ｋ、ＰＢＳ１４０ＫＭ、およびＰＢＳ１５３ＮＭの中の色素（ＴｈＴおよびＴｈＴ−ＨＥについては０、５６、１１２、２２４μＭ、およびＴｈＴ−ＤＢについては０、５６μＭ）の３０μＬの溶液と混合した。ＴｈＴおよびＴｈＴ−ＨＥの終濃度は９６μＭであったが、ＴｈＴ−ＤＢの終濃度はその低い水溶性のために２４μＭに設定した。さらに、これらの混合物を２５℃で３０分間保温し、分析した（図６）。

各緩衝溶液中におけるオリゴヌクレオチドのＧ４位相構造、すなわち、平行型（Ｐ）、逆平行バスケット型（Ａ）、ハイブリッド‐１型（Ｈ１）、およびハイブリッド‐２型（Ｈ２）を、Ｊ−８２０ＣＤ分光計（日本分光株式会社日本）を使用して決定した（図５および表５）。１．０ｍｍの光路長を有する水晶キュベットを使用して２００〜６００ｎｍの波長域でＣＤスペクトルを測定した。スキャン速度を１００ｎｍ／分に設定し、反応時間は１秒であった。各スペクトルは２５℃で行われた１１回の測定の平均であった。

表５．色素の非存在下および存在下(ThTとThT-HE の場合は96 μM、ThT-DBの場合は24 μM)におけるグアニン四重鎖のCD測定 (左: 色素非存在下) → (右: 色素存在下)
n.d. = 未測定
H1:Hybrid-1、H2：Hybrid-2、P：Parallel、A：Antiparallel

化合物誘導性位相構造
ＣＤ分析により、ＴｈＴ類似体ならびにＴｈＴはＧ４においてトポロジーの変化を引き起こすことができることが示された（図６）。２２ＡＧ、２６Ｔｅｌ、および２２ＫｉｔについてＴｈＴ−ＤＢの添加前と添加後の間でＣＤスペクトル（範囲：２２０〜３２０ｎｍ）の重大な変化が存在した。例えば、２２ＡＧのトポロジーはＰＢＳ１５０Ｋ中でＨ１型からＡ型に変化した（図６Ａ）。さらに、２６ＴｅｌのトポロジーはＨ２型からＨ１様型に変化した（図６Ｂ）。ＰＢＳ１５３ＮＭ中では２２ＫｉｔのトポロジーはＰ型からＨ２様型に変化した（図６Ｃ）。同様に、ＰＢＳ１５３ＮＭの中にあるとき、ＴｈＴ−ＨＥは２６ＴｅｌのトポロジーをＡ様型からＨ１型に変えた（図６Ｄ）。これらの結果は、異なるＧ４の立体構造はＴｈＴ、ＴｈＴ−ＨＥ、およびＴｈＴ−ＤＢのＮ３置換基のためにそれらによって安定化され得ることを示した。生理学的塩濃度を有する緩衝液中でＧ４のトポロジーを変えることができる化合物は遺伝子発現制御のための魅力的な薬品候補である。

Amyloid Aβ(1-42)蛍光滴定
以下の手順で、ＴｈＴおよびＴｈＴ−ＨＥのAmyloid Aβ(1-42)に対する結合能を調べた。
用いたサンプル
Amyloid Aβ(1-42) H-DAE FRH DSG YEV HHQ KLV FFA EDV GSN KGA IIG LMV GGV VIA-OH（配列番号９）
Thioflavin T(ThT)
ThT-HE
用いたbuffer
リン酸緩衝液―PBS buffer(pH7.4) K⁺4.2mM、Na⁺154mM、PO₄ ^2-9.6mM、Cl^-140mM
実験手順
1. Amyloid Aβ(1-42)溶液の調製
Amyloid Aβ(1-42) を溶解させたリン酸緩衝液(2.8, 5.6, 14, 28 μM)をそれぞれ調製した。
2.色素溶液の調製
色素(ThT, ThT-HE)をそれぞれ溶解させたリン酸緩衝液(350μM)を調製した。
3.測定溶液の調製
30分程度静置しておいた各濃度のAmyloid Aβ(1-42)溶液(50 μL)に色素溶液(20 μL)を添加し、30分間静置後蛍光スペクトルを測定した。
測定溶液中の各成分最終濃度: Amyloid Aβ(1-42): 2, 4, 10, 20 μM、ThT, ThT-HE:
100 μM
4.蛍光スペクトル測定
蛍光スペクトル測定にはLS-55 (Perkin Elmer Japan Co., Ltd.)を用いた。435 nm で励起し、460〜660nmの間で発光を観測した。
結果を図7に示す。Amyloid Aβ(1-42)存在下で、ThT-HEはThTと同様に発光増大が観測された。

Claims

下記一般式（I）で表される化合物又はその塩。
Ｒ¹は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を示し、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴はそれぞれ独立して炭素数１〜５の炭化水素基を示し、
nは０〜５の整数を示し、
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。
Ｒ¹は水素、またはＯおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を示し、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴はそれぞれ独立して炭素数１〜５の炭化水素基を示し、
nは０〜５の整数を示し、
ＸはＯを示す、請求項１に記載の化合物又はその塩。
一般式（I）で表される化合物が下記式（II）または（III）で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を含む、グアニン四重鎖構造検出剤。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を、DNA含有試料と混合する工程を含む、グアニン四重鎖構造の検出方法。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を含む、グアニン四重鎖構造を含む標的遺伝子の発現調節剤。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を含む、アミロイドβ検出剤。