KR101822761B1

KR101822761B1 - 베타 아밀로이드 플라그에 선택적인 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 이용한 생체 내 베타 아밀로이드 플라그의 영상화 방법

Info

Publication number: KR101822761B1
Application number: KR1020160175855A
Authority: KR
Inventors: 김환명
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2016-03-23
Filing date: 2016-12-21
Publication date: 2018-01-29
Also published as: KR20170110496A

Abstract

본 발명은 베타 아밀로이드 플라그에 선택적인 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 이용한 생체 내 베타 아밀로이드 플라그의 영상화 방법에 관한 것으로서 보다 구체적으로는 높은 감도와 선택성으로 형질변환 쥐의 뇌에 존재하는 아밀로이드 침착을 낮은 에너지 여기원의 이광자 현미경을 통해 고화질 3차원 영상화 할 수 있는 방법과 이에 사용되는 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 합성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 베타 아밀로이드 플라그에 선택적인 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 강한 이광자 형광을 방출하고 아밀로이드에 선택적으로 염색된다. 또한 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 적은 분자량과 전기적으로 중성의 성질을 가지고 있어 쥐의 혈액 뇌 관문을 효율적으로 통과하는 성질을 나타낸다. 이와 같은 성질에 기반하여 형질변환 쥐의 뇌에 존재하는 아밀로이드 침착을 이광자 현미경을 이용하여 고화질 3차원 영상으로 이미징할 수 있다.

Description

베타 아밀로이드 플라그에 선택적인 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 이용한 생체 내 베타 아밀로이드 플라그의 영상화 방법{New compounds or pharmaceutically acceptable salt thereof selective for amyloid-β plaque and method for imaging amyloid-β plaque in vivo using the same}

본 발명은 생체 내에서 베타 아밀로이드(amyloid-β; 이하 ‘Aβ’) 플라그의 밝은 이광자 현미경(Two-photon microscopy; 이하 ‘TPM’) 이미지를 실시간으로 제공할 수 있는 베타 아밀로이드 침착에 선택적인 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 이용한 생체 내 베타 아밀로이드 플라그의 영상화 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병(Alzheimer's disease; 이하 ‘AD’)은 신경퇴행적 장애(Neurodegenerative disorder)로 만성 치매(chronic dementia) 및 인지력 감퇴(cognitive decline)로 이어지는 질환이다.

AD의 병리학적 특성(pathological hallmarks)은 미스폴딩된 단백질 응집과 불균형한 반응 산소, 금속 이온, 및 아세틸콜린 수준을 포함하고 있다.

이들 가운데, 베타 아밀로이드(beta amyloid; 이하 ‘Aβ’) 플라그의 형성 및 구체적인 뇌 영역 내의 신경섬유매듭(neurofibrillary tangles)은 AD의 초기 발명으로 확인되었다.

AD에 대한 추가적인 노력과 동시에, Aβ 종을 감소 또는 억제하기 위해 AD 약물 개발에 몰두하였다.

그러나, Aβ 플라그의 형성에 대한 근원적인 메카니즘 및 AD에 대한 Aβ 플라그의 영향에 대해 거의 알려지지 않았다.

따라서, 상기 문제점을 해결하기 위해, 생체 내(in vivo)에서 실시간 방법을 통해 Aβ 플라그의 명확한 3차원(3D) 시각화하는 것이 매우 바람직하다.

상기 3D 시각화 방법을 수행하기 위한 TPM은 매력적인 도구이며, 특히 TPM은 심부 조직 이미징 및 고유한 절편 안정성을 포함하고 있으며, 두 개의 인접한 적외선 광자(IR Photon) (>700 nm)를 이용한다.

TPM은 필수적인 높은 공간 해상도(spatial resolution)를 가지며, 손상되지 않은 조직(intact tissue) 심부(deep inside)의 3D 시각화를 제공할 수 있기 때문에 비침습(noninvasive) 방법으로 수행할 수 있다.

미세내시경(micro-endoscopic) 및 비디오-속도 스캐팅 시스템의 진전과 더불어, TPM 또한 조기 진단, 모니터링 치료, 및 정확한 진단을 포함하는 임상용으로서 많은 잠재력을 가지고 있다.

그러나, TPM의 실제 적용을 위해서는 높은 신호-잡음 비율(signal-to-noise; 이하 ‘S/N’)을 통한 시각화를 부여하기 위해, 민감하고, 광안정성의 이광자 프로브와 이광자 여기 형광(TP excited fluorescence; 이하 'TPEF')의 기술이 결합되어야 한다.

Aβ 플라그를 시각화하기 위해, 여러 가지 저분자 화합물이 개발되었고, MeO-X04와 같은 비스-스티릴벤젠(bis-styrylbenzene) 유도체가 생체 내 TPM 이미징하기 위해 종종 이용되었으나, 작은 값의 이광자 동작 단면적(two photon action cross section; 이하 ‘Φδ_TPA’), 및 낮은 용해도에 의해 TPM에서 비스-스티릴벤젠 유도체의 사용은 제한되었다.

또한, 광-이성질화(photo-isomerization)와 같은 광화학적 불안정 진행에 기인하여 저분자 화합물 내에서 컨쥬게이팅 브릿지(C=C)의 개방사슬 시스템(open chain system)은 빠른 광퇴색을 유도하기 문에 장기간 영상화하는 것은 불가능하다.

이러한 이유로, 큰 값의 Φδ_TPA, 우수한 용해도, 및 광안정성을 갖는 Aβ 플라그의 생체 내 영상화하기 위한 신규한 화합물의 합성 및 이의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제2016-0067208호

본 발명의 목적은 선택적으로 베타 아밀로이드(beta amyloid; 이하 ‘Aβ’) 플라그와 결합할 수 있는 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이용함으로써 알츠하이머를 치료 또는 예방하고, 또한 생체 내 또는 생체 외에서 Aβ 플라그의 분포를 영상화하는 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R₁ 내지 R₄는 서로 동일하거나 상이하고,

수소, 수산화기, 할로겐, C₁ 내지 C₄의 알콕시, C₁ 내지 C₄의 알킬, C₁ 내지 C₄의 알코올, 또는 하기 화학식 1-1이며,

[화학식 1-1]

m은 1 내지 5의 정수이고,

R₅ 내지 R₆는 서로 동일하거나 상이하고,

수소, 수산화기, 할로겐, C₁ 내지 C₄의 알콕시, C₁ 내지 C₄의 알킬, C₁ 내지 C₄의 알코올, 하기 화학식 1-2 또는 화학식 1-3이며,

[화학식 1-2]

[화학식 1-3]

n은 8 내지 15의 정수이고,

R₇ 내지 R₁₀는 서로 동일하거나 상이하고,

2 이상이 플루오르(F)이고, 나머지는 수소임.

또한 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 이광자 형광 프로브를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 베타 아밀로이드 검출용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 생리활성물질을 포함하는, 알츠하이머 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 생체로부터 분리된 시료에 주입하는 단계; 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 생체로부터 분리된 시료 내 베타 아밀로이드 플라그와 결합하는 단계; 상기 생체로부터 분리된 시료에 여기원을 조사하는 단계; 및 이광자 현미경으로 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 발생하는 형광을 관측하는 단계;를 포함하는, 베타 아밀로이드 플라크의 영상화 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 큰 이광자 동작 단면적(Φδmax = 420 GM)을 가지며, 이를 정맥 내 주입한 후 실시간 TPM 영상을 이용함으로써 생체 내 개별적인 베타 아밀로이드(beta amyloid; 이하 ‘Aβ’) 플라그의 높은 S/N 비 이미지를 제공할 수 있다.

또한 내부의 혈관 및 대뇌 아밀로이드 맥관병증(cerebral amyloid angiopathy; 이하 ‘CAA’)과 함께 Aβ 플라그의 3D 시각화를 위한 듀얼-컬러 TPM 영상화에 이용할 수 있어 AD의 조기 진단 및 치료에 유용한 효과가 있다.

도 1은 CDCl₃에서 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼(400 MHz)을 나타낸 도면;
도 2는 d₆-DMSO 2 방울을 포함한 CDCl₃에서 화합물 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼(100 MHz)을 나타낸 도면;
도 3은 화합물 1의 고분해능 질량분석(high-resolution mass spectrometry; 이하 ‘HRMS’) 스펙트럼을 나타낸 도면;
도 4는 d₆-DMSO에서 화합물 2(QAD1)의 ¹H-NMR 스펙트럼(400 MHz)을 나타낸 도면;
도 5는 d₆-DMSO에서 화합물 2(QAD1)의 ¹³C-NMR 스펙트럼(100 MHz)을 나타낸 도면;
도 6은 화합물 2(QAD1)의 HRMS 스펙트럼을 나타낸 도면;
도 7은 CDCl₃에서 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼(400 MHz)을 나타낸 도면;
도 8은는 d₆-DMSO 2 방울을 포함한 CDCl₃에서 화합물 2의 ¹³C-NMR 스펙트럼(100 MHz)을 나타낸 도면;
도 9는 화합물 3의 HRMS 스펙트럼을 나타낸 도면;
도 10은 화합물 1(a,b), 화합물 2(QAD1)(c,d), 및 화합물 3(e,f)에 대한 일광자 흡수 스펙트럼(a,c,e) 및 인산완충식염수(phosphate buffer saline; 이하 ‘PBS’) 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 화합물 1, 화합물 2, 및 화합물 3에 대해서 형광 강도의 플롯을 나타낸 도면;
도 11은 1,4-다이옥세인(1,4-dioxane), 에탄올(EtOH), EtOH : PBS (v/v, 1:1) 및 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 화합물 1(a, b), 화합물 2(QAD1)(c, d), 및 화합물 3(e, f) 각각의 정규 흡수(Normalized absorption) 스펙트럼(a, c, e) 및 발광 스펙트럼(b, d, f)을 나타낸 도면;
도 12는 1,4-dioxane, EtOH, 및 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 1 μM의 화합물 2(QAD1)에 대한 정규 흡수 스펙트럼(a) 및 발광 스펙트럼(b); 화합물 2(QAD1)로 표지된 뇌 절편에서 베타 아밀로이드(beta amyloid; 이하 ‘Aβ’) 플라그로부터 얻어진 이광자 여기 형광(Twophoton excited fluorescence; 이하 ‘TPEF’) 스펙트럼; 에탄올에서 얻어진 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3에 대한 발광 스펙트럼(c); 에탄올에서 얻어진 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3에 대한 이광자 동작(Two-photon action; 이하 ‘TPA’) 스펙트럼(d)을 나타낸 도면;
도 13은 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 Aβ₁ _-42 올리고머(0 내지 10 μM)를 갖는 화합물 2(QAD1)(1 μM)의 복합체에 대한 형광 강도의 변화(a) 및 형광 적정곡선의 변화(b)를 나타낸 도면(산출된 값은 실선으로 나타내었으며, 여기 파장은 407 nm이다);
도 14는 에탄올에서 얻은 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3의 몰 흡광계수 스펙트럼(molar absorptivity spectra)을 나타낸 도면;
도 15는 에탄올에서 DFT에 의한 최적화된 기하학적 구조인 화합물 2(QAD1)(a), 및 화합물 3(b)의 시스-올리고머(cis-isomer) 구조를 나타낸 도면;
도 16은 에탄올에서 화합물 2(QAD1)(a), 및 화합물 3(b)의 밀도범함수이론(density functional theory; 이하 ‘DFT’)에 의한 최적화된 기하학적 구조 및 분자궤도함수 분포를 나타낸 도면;
도 17은 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에 Aβ₁ _-42 올리고머 및 BSA의 존재 하에 화합물 1(a, 여기 파장: 417 nm), 화합물 2(QAD1)(b, 417 nm), 및 화합물 3(c, 326 nm)에 대한 발광 강도의 변화를 나타낸 도면;
도 18은 범용 완충용액(0.1 M 시트르산(citric acid), 0.1 M KH₂PO₄, 0.1 M Na₂B₄O₇, 0.1 M Tris, 및 0.1 M KCl)에서 화합물 2(QAD1)에 대한 pH의 영향을 나타낸 도면(여기 파장: 407 nm);
도 19는 정맥 내(intravenously; 이하 ‘i.v.’) 화합물 2(QAD1)(10mg/kg)를 주입한 후에 0분(a), 30분(b), 60분(c), 및 150분(d)에서 형질변환 5XFAD 쥐(mouse)의 전두엽에 대한 생체 내 TPM 이미지; Aβ 플라그 분포를 시각화하기 위해, 외피의 표면으로부터 약 300 μm의 깊이에서 z-방향에 따른 축적된 230 TPM 이미지(e); 정맥 내 화합물 2(QAD1)(10mg/kg) 및 dextran 40kDa-Texas red를 주입한 후에 형질변환 5XFAD 쥐의 전두엽에 대한 3D 재생 TP 이미지(f, g)(외피의 표면으로부터 약 300 μm의 깊이에서 z-방향에 따른 축적된 약 270 TPM 이미지이고, 스케일 바는 50 μm(a) 및 30 μm(e)이다.);를 나타낸 도면;
도 20은 37℃에서 90분 동안 20 μM의 화합물 1(a), 화합물 2(QAD1)(c), 및 화합물 3(e)으로 염색된 형질변환 5XFAD 쥐 뇌의 외피 조직절편의 TPM 이미지(a,c,e); 화합물 1, 화합물 2, 및 화합물 3과 이광자 여기 형광(TP excited fluorescence; 이하 'TPEF') 강도(a,c,e)에 의해 측정된 신호-잡음 비율(signal-to-noise; 이하 ‘S/N’)(b,d,f)을 나타낸 도면(TPEF는 펨토초 펄스에서 750 nm의 여기시에 450 내지 520 nm에서 수집하였고, 스케일 바는 48 μm이다.);
도 21은 37℃에서 90분 동안 화합물 2(QAD1)(a) 및 콩고 레드(Congo red)(b)로 공동-표지(co-labeled)된 형질변환 5XFAD 쥐 뇌의 외피 조직절편의 TPM 이미지(a,b,c); 및 20배 확대한 병합된 이미지(merged images)(c); 화합물 2(QAD1)로 처리된 형질변환 5XFAD 쥐 뇌의 외피 조직절편의 TPM 이미지(d); 시간 함수로서, (d)에 표시된 A, B, 및 C에 대해 대응하는 TPEF 강도(e) (xyt 모드를 이용하여 지속적으로 1시간 동안 2초 간의 간격으로 디지털화된 강도를 연속적으로 기록하였다. TPEF는 펨토초 펄스에서 750 nm의 여기시에 450 내지 520 nm에서 수집하였고, 스케일 바는 (c) 72 μm 및 (d) 96 μm이다)를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명인 베타 아밀로이드 플라그에 선택적인 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 이용한 생체 내 베타 아밀로이드 플라그의 영상화 방법을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이용할 경우 생체 내 선택적으로 베타 아밀로이드와 특이적 결합함으로써 실시간으로 TPM 영상화할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 1-1]

m은 1 내지 5의 정수이고,

R₅ 내지 R₆는 서로 동일하거나 상이하고,

[화학식 1-2]

[화학식 1-3]

n은 8 내지 15의 정수이고,

R₇ 내지 R₁₀는 서로 동일하거나 상이하고,

2 이상이 플루오르(F)이고, 나머지는 수소임.

상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서, R₁ 내지 R₄는 서로 동일하거나 상이하고,

수소, C₁ 내지 C₄의 알킬, C₁ 내지 C₄의 알코올, 또는 하기 화학식 2-1이며,

[화학식 2-1]

R₅ 내지 R₆는 서로 동일하거나 상이하고,

수소, C₁ 내지 C₄의 알코올, 하기 화학식 2-2 또는 화학식 2-3임.

[화학식 2-2]

[화학식 2-3]

상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 화학식 3-1 내지 화학식 3-14 중 어느 하나로 표시될 수 있다.

[화학식 3-1]

[화학식 3-2]

[화학식 3-3]

[화학식 3-4]

[화학식 3-5]

[화학식 3-6]

[화학식 3-7]

[화학식 3-8]

[화학식 3-9]

[화학식 3-10]

[화학식 3-11]

[화학식 3-12]

[화학식 3-13]

[화학식 3-14]

본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 중 대표적인 화합물은 하기 화학식 3-2로 표시되는 화합물(QAD1)일 수 있고, 상기 QAD1은 사이클릭 컨쥬게이팅 브릿지(cyclic conjugating bridge) 및 용해 단위(solubilizing unit)를 갖는 중심대칭(D-A-D) 구조를 가지고 있으며, 특히 QAD1은 밝은 이광자 여기 형광(Twophoton excited fluorescence; 이하 ‘TPEF’), 상당한 용해도, 광안정성 및 Aβ에 대한 높은 민감도와 선택도를 나타내고 있다.

[화학식 3-2]

상기 이광자 형광 프로브는 베타 아밀로이드 플라크에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 생리활성물질은 약물, 펩타이드, 단백질, 및 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 여기원은 700 내지 800 nm 범위의 파장을 가질 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명인 베타 아밀로이드 플라그에 선택적인 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 이용한 생체 내 베타 아밀로이드 플라그의 영상화 방법을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

사이클릭 컨쥬게이팅 브릿지를 갖는 사중극자 형태의 신규한 화합물인 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3은 하기 반응식 1에 의해 합성되었고, 합성경로은 다음과 같다.

[반응식 1]

(a) 포타슘 터트-부톡사이드(Potassium tert-butoxide, 이하 ‘KOtBu’), THF, 0 내지 20℃;

(b) 트리에틸 포스페이트(Triethyl phosphite, 이하 ‘P(OEt)₃’), 125℃;

(c) i: 화합물 1, 2-브로모에틸아세테이트(2-bromoethylacetate), 수소화나트륨(NaH), 18-크라운-6(18-Crown-6), THF, 80℃; ii: 소듐메톡사이드(Sodium metoxide, 이하 ‘NaOMe’), 메탄올, 0 내지 20℃.

상기 반응식 1을 참조하면, 화합물 1 및 화합물 2(QAD1)는 축소 유발 고리화(reduction-induced cyclization)에 따른 4-다이알킬아미노-2-나이트로벤즈알데하이드(4-dialkylamino-2-nitrobenzaldehyde) 및 테트라플루오로벤젠으로 치환된 비스포스포네이트(bisphosphonates) 간의 Horner-Wadsworth-Emmons 커플링 반응을 통해 65 내지 75% 수율로 합성하였다.

화합물 3은 가수분해반응(hydrolysis)에 의해 화합물 1과 2-브로모에틸아세테이트(2-bromoethylacetate)의 치환반응에 의해 58% 수율로 합성하였다.

구체적으로, 반응식 2 내지 반응식 4에 따라 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3을 합성하였고, 반응식 2 내지 반응식 4에 따른 시약 및 조건은 다음과 같다.

[반응식 2]

시약 및 조건: (i) 요오드화메틸(Iodomethane), 양성자 스폰지(proton-sponge), CH₃CN, 환류, 16시간; (ii) 옥시 염화인(Phosphorous oxychloride, 이하 ‘POCl₃’), DMF, 90℃, 8시간; (iii) 포타슘 터트-부톡사이드(Potassium tert-butoxide, 이하 ‘KOtBu’), THF, 0℃에서 상온, 12시간; (iv) 트리에틸 포스페이트(Triethyl phosphite, 이하 ‘P(OEt)₃’), 125℃, 12시간.

[반응식 3]

시약 및 조건: (i) 2-브로모에탄올(2-Bromoethanol), 탄산칼슘, 요오드화칼륨(potassium iodide), H₂O, 100℃, 8시간; (ii) 염화아세틸, 트리에틸아민, 35℃, 12시간; (iii) POCl₃, DMF, 90℃, 12시간; (iv) 포타슘 터트-부톡사이드 THF, 0℃에서 상온, 12시간; (v) P(OEt)₃, 125℃, 12시간; (vi) 소듐 메톡사이드(Sodium methoxide, 이하 ‘NaOMe’), 메탄올, 0℃에서 상온, 12시간.

[반응식 4]

시약 및 조건: (i) 2-브로모에틸아세테이트(2-bromoethylacetate), 수소화나트륨(NaH), 18-크라운-6(18-Crown-6), THF, 80℃에서 상온; (ii) NaOMe, 메탄올.

<실시예 1>

화합물 A

무수 아세토나이트릴(anhydrous CH₃CN, 70 ㎖)에 3-니트로아닐린(3-nitro aniline, 2.0 g, 14.5 mmol) 및 양성자 스폰지(proton-sponge, 6.83 g, 31.86 mmol)를 혼합한 교반용액에 요오드화메틸(iodomethane, 2.0 ㎖, 31.9 mmol)을 첨가하였다.

전체 반응물을 질소분위기 하에서 8시간 동안 80℃에서 교반시켰다. 잔유물을 얻기 위해 클로로폼(CHCl₃, 100 ㎖)에 용해한 후 용매를 증발시켰고, 이후 물(100 ㎖) 및 1(N) H₂SO₄ (50 ㎖)로 세정하였다.

유기 부분(organic portion)을 황산나트륨(Na₂SO₄)으로 건조시키고 조생성물(crude product)을 용리액(eluent)인 EtOAc/hexane(에틸렌아세테이트/헥산, 1 : 1 v/v)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 붉은색 고형물(화합물 A)을 수득하였다.

수율: 1.51 g (63 %). ¹H-NMR (400MHz, CDCl₃): δ(ppm) 7.52-7.47 (m, 2H), 7.32 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.8 Hz, J = 2.8 Hz, 1H), 3.03 (s, 6H). ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 150.4, 148.9, 129.3, 117.4, 110.2, 105.7, 40.2.

화합물 B

무수 DMF(2.17 ㎖, 28.27 mmol)에 용해된 A(1.3 g, 7.83 mmol) 용액을 아이스 배스에서 0℃까지 냉각시켰고, POCl₃(1.07 ㎖, 11.74 mmol)를 적하(dropwise)하였다.

그 후 반응 혼합물을 1시간 이내에 80℃까지 가열하였고, 80℃에서 추가적으로 6시간 동안 교반하였다.

교반 후 암용액(dark solution)을 상온까지 냉각시켰고, 냉각된 암용액에 냉각수를 부은 후 얻은 침전물을 여과하였다. 잔유물을 아세톤으로 재결정시켜 갈색 고형물(화합물 B)을 수득하였다.

수율: 1.2 g (79%). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 10.12 (s, 1H), 7.91 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 6.84 (dd, J = 8.8 Hz, J = 2.0 Hz, 1H), 3.14 (s, 6H) ppm;

¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 186.5, 154.2, 150.9, 131.5, 117.3, 114.5, 105.9, 40.3.

화합물 D

질소분위기 하에 0℃에서 NaOtBu(0.654 g, 5.83 mmol)을 무수 TFH(80 ㎖)에 용해된 화합물 C(1.0 g, 2.33 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다.

30분 후, 화합물 B(0.95 g, 4.89 mmol)를 THF(20 ㎖)에 용해한 용액을 반응물에 첨가하였고, 상온에서 밤새도록 교반하였다.

반응을 종결하기 위해 물을 첨가하였고, 이후 붉은색 침전물인 고체 잔유물을 수득하였고, 물과 헥산으로 세정한 이후 THF로 세정하였다. 잔유물을 진공에서 건조하여 붉은색 고체(화합물 D)를 수득하였다.

수율: 0.730 g (63%). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 7.86 (d, J =16 Hz, 1H), 7.64 (d, J =8.0 Hz, 1H), 7.19 (s, 1 H), 6.92 - 6.87 (m, 2H), 3.07 (s, 6 H).

화합물 1

화합물 D(0.05 g, 0.094 mmol)를 P(OEt)₃ (5 ㎖)에 용해한 용액을 질소분위기 하에서 밤새도록 환류하여 가열하였다.

진공상태에서 용매를 제거하였고, 생성물을 EtOAc/hexane(에틸렌아세테이트/헥산, 3 : 7 v/v)을 사용하여 실리카 컬럼으로 정제하여 붉은 벽돌색(brick red) 고형물(화합물 1)을 수득하였다.

도 1 내지 도 3은 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼(400 MHz), d₆-DMSO 2 방울을 포함한 CDCl₃에서 ¹³C-NMR 스펙트럼(100 MHz), 및 고분해능 질량분석(high-resolution mass spectrometry; 이하 ‘HRMS’) 스펙트럼을 나타낸 것이며, 도 1 내지 도 3에 대한 데이터는 다음과 같다.

수율: 0.032 g (72%). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 9.12 (s, 1H), 7.40 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 6.97 (s, 1H), 6.69-6.64 (m, 2H), 2.90 (s, 6 H).

¹³C-NMR (100 MHz,CDCl₃ contained 2-drops of d₆-DMSO): δ (ppm) 148.5, 144.7, 142.3 (d, J = 10.7Hz), 138.2, 122.2, 121.1, 119.7, 110.1, 106.8, 93.5, 41.4. HRMS (FAB⁺): m/z calcd for [C₂₆H₂₂N₄F₄]: 466.1775, found: 466.1776

화합물 E

물(150 ㎖)에 3-니트로아닐린(3-nitro aniline, 10.0 g, 72.4 mmol), 2-브로모에탄올(2-bromoethanol, 12.14 ㎖, 181.0 mmol), 탄산칼슘(CaCO₃ _,18.11 g, 181.0 mmol) 및 요오드화칼륨 (KI, 1.2 g, 7.2 mmol)를 첨가하여 16시간 동안 환류하였다.

여과한 후, 여과액을 EtOAc(50 ㎖ x 3)으로 추출하였고, 결합된 유기층을 포화된 NaCl(50 ㎖ x 2)로 세정하였고, 무수 Na₂SO₄로 건조한 후 여과 및 농축하여 조생성물을 얻었다.

조생성물을 용리액인 EtOAc/hexane(에틸렌아세테이트/헥산, 3 : 7 v/v)을 사용하여 실리카 컬럼 크로마토피로 정제하여 노란색 고형물(화합물 E)을 수득하였다.

수율: 6.20 g (38 %). ¹H-NMR (400MHz, CDCl₃): δ (ppm) 7.36-7.35 (m, 2H), 7.16 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.4 Hz, J = 2.8 Hz, 1H), 4.68 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.69-3.65 (m, 4H), 3.47 (t, J = 5.6 Hz, 4H).

¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 148.9, 148.6, 129.3, 117.7, 110.2, 105.8, 59.4, 54.8.

화합물 F

화합물 E(5.4 g, 23.87 mmol)를 트리에틸아민(triethylamine, 7.33 ㎖, 52.52 mmol)에 용해한 용액을 0℃까지 냉각시켰다.

이후, 아세틸클로라이드(Acetyl chloride, 3.73 ㎖, 52.52 mmol)를 용액에 적하한 후 35℃에서 밤새도록 교반하였다. 상온까지 냉각한 후, 물(25 ㎖)을 첨가하여 혼합물을 가수분해하였다.

가수분해 후 1시간 동안 격렬한 교반과정 후에, THF를 증발시켰고, 중성화하기 위해, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 사용하였다.

클로로폼(3 x 50 ㎖)으로 추출한 후, 결합된 유기층을 Na₂SO₄로 건조하였고, 여과한 후 진공상태에서 용매를 제거하여 노란색 고형물(화합물 F)를 수득하였다.

수율: 7.0 g (95%). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 7.45 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 8.0 Hz, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.17 (t, J = 8 Hz, 1H), 6.94 (dd, J = 8.4 Hz, J = 6.0 Hz, 1 H), 4.12 (t, J = 6.0 Hz, 4 H), 3.56 (t, J = 6.4 Hz, 4 H), 1.88 (s, 6H).

¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 170.2, 148.9, 147.8, 129.5, 117.1, 110.7, 105.7, 60.8, 49.3, 20.4.

화합물 G

신선하게 증류된 DMF(3.10 ㎖, 32.22 mmol)를 아이스 배스에서 0℃까지 냉각시킨 후 POCl₃(1.62 ㎖, 17.72 mmol)를 적하하였다.

상온에서 1시간 동안 교반한 후 화합물 F(5.0 g, 16.11 mmol)를 DMF에 첨가하였고, 반응물을 밤새도록 70℃에서 교반하였다. 그 후, 암용액을 상온까지 냉각한 후 냉각수를 부었다.

포화된 아세트산나트륨 수용액을 천천히 첨가하였고, 혼합물을 밤새도록 교반하였다. 밤새도록 교반한 후 갈색 침전물을 수득하였고, 아세톤으로 세정하여 진갈색 고형물(화합물 G)을 수득하였다.

수율: 2.80 g (52%). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 10.09 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 5.6 Hz, 1 H), 6.98 (dd, J = 8.8, J = 2.8 Hz, 1 H), 4.27 (t, J = 5.6 Hz , 4 H), 3.74 (t, J = 5.6 Hz, 4 H), 2.03 (s, 6 H).

¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 186.2, 170.6, 152.4, 151.8, 131.5, 118.4, 114.7, 106.5, 60.8, 49.8, 20.9.

화합물 H

화합물 C(0.5 g, 1.11 mmol)를 무수 THF (25 ㎖)에 첨가하여 교반한 용액에 질소분위기 하에 0℃에서 NaOtBu(0.274 g, 2.44 mmol)를 첨가하였다.

30분 후, 무수 THF(20 ㎖)에 화합물 G(0.826 g, 2.44 mmol)를 용해한 용액을 반응물에 첨가한 후 상온에서 밤새도록 교반하였다.

그 후 반응을 종결하기 위해 물을 첨가하였고, 침전물을 수득한 후 물 및 헥산으로 순차적으로 세정하여 조생성물을 얻었다.

조생성물을 용리액인 EtOAc/hexane(에틸렌아세테이트/헥산, 7 : 3 v/v)을 사용하여 실리카 컬럼 크로마토피로 정제하여 붉은색 고형물(화합물 H)을 수득하였다.

수율: 0.205 g, 25%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 7.83 (d, J = 16.8 Hz, 1 H), 7.64 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 7.34 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.02 (dd, J = 9.2, J = 5.6 Hz, 1 H), 6.88 (d, J = 16.8 Hz, 1 H), 4.28 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 3.70 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 2.05 (s, 6 H) ppm.

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 170.7, 149.4, 147.9, 145.9, 143.3, 131.7, 128.9, 120.2, 116.3, 115.2, 107.3, 61.2, 49.8, 21.1.

화합물 I

화합물 H(0.08 g, 0.098 mmol)를 P(OEt)₃(5 ㎖)에 용해한 용액을 질소분위기 하에 125℃에서 밤새도록 환류반응을 통해 가열하였다.

진공상태에서 용매를 제거하였고, 생성물을 용리액인 EtOAc/hexane(에틸렌아세테이트/헥산, 7 : 3 v/v)을 사용하여 실리카 컬럼 크로마토피로 정제하여 붉은색 고형물(화합물 I)을 수득하였다.

수율: 0.050 g (68%). ¹H-NMR (400 MHz,CDCl₃ contained 2-drops of d₆-DMSO): δ (ppm) 9.31 (s, 1H), 7.34 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 6.89 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 6.58 (dd, J = 8.8 Hz, J = 1.6 Hz, 1 H), 4.15 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 3.54 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 1.93 (s, 6H).

¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃ contained 2-drops of d₆-DMSO): δ (ppm) 170.5, 144.6, 142.2, 138.5, 138.3, 122.3, 121.5, 119.9, 108.9, 106.5, 93.3, 61.4, 50.3, 20.8.

화합물 2(QAD1)

화합물 I(0.05 g, 0.026 mmol)를 메탄올(10 ㎖)에 용해한 용액을 메톡사이드나트륨(NaOMe, 20 μL) 용액에 첨가하였고, 60분 동안 0℃에서 반응물을 교반하였다.

그 후 용매를 증발하였고, 잔유물을 2.5 ㎖ 메탄올을 포함한 CHCl₃(25 ㎖)에 용해시킨 후 포화된 염화암모늄(NH₄Cl) 수용액(25 ㎖)으로 세정하였다.

유기층을 무수 황산마그네슘(MgSO₄)으로 건조한 후 진공상태에서 농축시켰다.

조생성물을 용리액인 MeOH/CHCl₃(메탄올/클로로폼, 1 : 20 v/v)을 사용하여 실리카 컬럼 크로마토피로 추가적으로 정제하여 진한 갈색 고형물(화합물 2)을 상당한 양으로 수득하였다.

도 4 내지 도 6은 화합물 2(QAD1)의 d₆-DMSO에서 ¹H-NMR 스펙트럼(400 MHz), d₆-DMSO에서 ¹³C-NMR 스펙트럼(100 MHz), 및 HRMS 스펙트럼을 나타낸 것이며, 도 4 내지 도 6에 대한 데이터는 다음과 같다.

¹H-NMR(300 MHz, d₆-DMSO): δ(ppm) 10.89 (s, 1H), 7.41 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 6.85 (s, 1H), 6.73 (s, 1 H), 6.57 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.78 (bs, 2H), 3.59 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 3.48 (t, J = 6 .4 Hz, 4H).

¹³C-NMR(100 MHz, d₆-DMSO): δ(ppm) 145.3, 139.1, 127.8, 124.5, 122.7, 120.8, 120.4, 118.7, 109.6, 108.6, 58.3, 53.9. HRMS (FAB⁺): m/z calcd for [C₃₀H₃₀N₄O₄F₄]: 586.2198, found: 586.2198

화합물 J

질소분위기 하에서 수소화나트륨(NaH, 0.016 g, 0.68 mmol) 및 18-크라운-6(18-Crown-6, 0.011 g, 0.045 mmol)을 무수 THF(10 ㎖) 용해시킨 후 10분 동안 교반시켰다. 적하하였고, 80℃에서 1시간 동안 환류시켰다.

1시간 후에, 반응물을 상온에서 교반시킨 후 THF에 2-브롬에틸아세테이트(2-bromoethylacetate, 36 μL, 0.33 mmol)를 용해한 용액을 0℃에서 적하하였고, 상온에서 밤새도록 교반시켰다.

반응을 완결한 후, THF를 진공에서 증발시켰고, 잔유물을 에틸아세테이트(ethylacetate, 50 ㎖)에 용해시키고, 물(2 x 25 ㎖)로 세정하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조시킨 후 유기용매를 증발시켰다.

생성물을 용리액인 EtOAc/hexane(에틸렌아세테이트/헥산, 3 : 7 v/v)을 사용하여 컬럼 크로마토피로 정제하여 노란색 고형물(화합물 I)을 수득하였다.

수율: 0.067 g (71%). ¹H-NMR(400MHz, CDCl₃): δ (ppm) 7.55 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.84 (dd, J = 8.8 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H ), 6.70 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.50 (s, 1H), 4.30-4.27 (m, 4H), 3.04 (s, 6H), 1.92 (s, 3H).

¹³C-NMR(100 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 170.6, 148.5, 145.9, 143.3, 139.1, 122.2, 121.7, 120.3, 113.2, 110.2, 106.7, 93.1, 64.4, 41.9, 29.9, 20.8.

화합물 3

화합물 J(0.05 g, 0.078 mmol)를 메탄올(10 ㎖)에 용해한 용액을 NaOMe(20 μL)에 첨가하였고, 60분 동안 0℃에서 반응 혼합물을 교반하였다.

조생성물을 용리액인 EtOAc/hexane(에틸렌아세테이트/헥산, 7 : 3 v/v)을 사용하여 실리카 컬럼 크로마토피로 정제하여 노란색 고형물(화합물 3)을 수득하였다.

도 7 내지 도 9는 화합물 3의 CDCl₃에서 화합물 3의 ¹H-NMR 스펙트럼(400 MHz), d₆-DMSO 2 방울을 포함한 CDCl₃에서 ¹³C-NMR 스펙트럼(100 MHz), 및 HRMS 스펙트럼을 나타낸 것이며, 도 7 내지 도 9에 대한 데이터는 다음과 같다.

수율: 0.034 g (81 %). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ (ppm) 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.83 (dd, J = 8.8 Hz, J = 2.0 Hz, 1 H), 6.68 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 6.63 (s, 1 H), 4.21 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 4.84 (t, J = 5.2 Hz, 2H).

¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃ contained 2-drops of d₆-DMSO): δ (ppm) 145.5, 138.9, 132.6, 122.6, 121.4, 120.2, 113.4, 109.9, 106.3, 93.4, 57.8, 42.8, 29.8. HRMS (FAB⁺): m/z calcd for [C₃₀H₃₀N₄O₂F₄]: 554.2299, found: 554.2297.

화합물 A1

¹H-NMR(400MHz, d₆-DMSO): δ (ppm) 10.89 (s, 1H), 7.32 (d, J = 8.4Hz, 1H), 6.50-6.48 (m, 2H), 5.66 (s, 1H), 2.72 (s, 3H).

화합물 A2

¹H-NMR(400MHz, CDCl₃): δ (ppm) 7.53 (d, J = 8.8Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 8.8 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H ), 6.70 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.61 (s, 1H), 4.23 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.69 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.52-3.48 (m, 4H), 3.46-3.43 (m, 4H), 3.33 (s, 3H), 3.02 (s, 6H).

화합물 A3

¹H-NMR(400MHz, CDCl₃): δ (ppm) 7.52 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.81 (dd, J = 8.8 Hz, J = 2.0 Hz, 1 H ), 6.70 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 3.65-3.60 (m, 31H), 3.54-3.52 (m, 9H), 3.48-3.42 (m, 5H), 3.38-3.37 (m, 6H), 3.02 (s, 6H).

화합물 A4

¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃ contained 2-drops of d₆-DMSO): δ (ppm) 8.83 (s, 1H), 7.47 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 7.09 (s, 1H), 6.72-6.70 (m, 1 H), 3.74 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 3.68-3.60 (m, 34H).

화합물 B1

화합물 B2

화합물 B3

화합물 B4

화합물 B5

화합물 B6

화합물 B7

<실험예 1> 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 특징 분석

1. 용해도 측정

저장용액(1.0 x 10^-2 M)을 준비하기 위해, 사중극자 형태의 신규한 화합물인 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3을 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; 이하 ‘DMSO’)에 용해시켰다.

상기 저장용액을 1.0 x 10^-5 내지 1.0 x 10^-7로 희석시키고, PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4) 3.0 ㎖을 포함한 큐벳(cuvette)에 마이크로 시린지(micro syringe)를 이용하여 첨가하였다. PBS 완충용액에서 DMSO의 농도는 0.1%로 유지하였다.

흡수강도의 플롯(plots)은 큐벳에 주입된 염료의 총 양에 대해 낮은 농도에서는 선형(linear)을 나타내며, 농도가 높아질수록 곡선(curvature)을 나타냈다. 선형 구간의 최대점은 용해도를 의미한다.

2. 옥탄올-물 분배계수(logP _oct )의 측정

DMSO에 화합물 용액(20 mM)의 소량의 부분 표본(aliquot, 10 μL)을 용해시킨 용액을 n-옥탄올(n-octanol, 5 ㎖)을 포함한 바이알에 마이크로 실린지를 이용하여 첨가하였다. 상기 바이알에 PBS 완충용액(5 ㎖)을 첨가한 후 혼합물을 격렬하게 교반하고 1시간 동안 암(dark) 상태에서 유지하였다.

각각의 레이어 내의 화합물의 농도를 측정하였고, log P_oct 값은 각 염료의 몰 흡광계수(molar extinction coefficient)를 측정한 다음 하기 수학식 1에 의해 산출되었다.

[수학식 1]

log P_oct = log [probe]_oct - log [probe]_PBS

상기 수학식 1에서, [probe]_oct and [probe]_PBS 는 n-옥탄올 및 PBS 내의 화합물 농도를 나타낸 것이다.

3. 분광 측정

흡수 스펙트럼은 UV-Vis 분광 광도계(S-3100)로, 형광 스펙트럼은 형광 분광 광도계(FluoroMate FS-2)로 1 cm 표준 석영셀(1 cm standard quartz cell)에서 측정하였다. 형광 양자 수율(fluorescence quantum yield)은 문헌 방법에 의해 레퍼런스로서 쿠마린(coumarin) 307(Φ = 메탄올에서 0.95)을 이용하여 결정하였다.

4. 이광자 단면적(Two-Photon Cross Section) 측정

이광자 단면적(δ)은 펨토 초단위(femto second; 이하 'fs') 형광 측정법을 이용하여 측정하였다. 화합물 2(QAD1)(1.0 × 10^-6 M)를 에탄올에 용해시키고 이광자 감응 형광 강도(two-photon induced fluorescence intensity)를 720 내지 880 nm에서 로다민(rhodamine) 6G를 이용하여 측정하였다.

레퍼런스와 샘플의 이광자 감응 형광 스펙트럼의 강도는 동일한 여기 파장에서 결정되었다. 하기 식을 이용하여 상기 이광자 형광 단면적을 산출하였다.

[수학식 2]

상기 수학식 2에서 s 및 r은 샘플 및 레퍼런스 분자를 나타내고, S는 전하결합소자(Charge Coupled Device; 이하 ‘CCD’) 검출기로부터 수집된 신호 강도를 나타내며, Φ는 형광 양자 수율을 나타내고, Φ는 실험기기의 전체 형광 수집 효율을 나타내며, c는 용액 내 분자 밀도를 나타내며, δ_r는 레퍼런스 분자의 이광자 형광 단면적을 나타낸다.

5. 동물(Animal)

생체 내 및 생체 외 뇌 영상을 연구하기 위해, 5 가족성 알츠하이머 질환(five familial Alzheimer's disease; 이하 ‘5XFAD’) 형질변환 쥐(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)를 사용하였다.

5XFAD 쥐는 뉴런 특이적 프로모터를 통해 인간 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; 이하‘APP’) 3개의 돌연변이와 인간 프레세닐린-1 (human presenilin-1; 이하 ‘PS-1’) 2개의 돌연변이를 나타내기 때문에 생후 10개월의 뇌에서 대량의 베타 아밀로이드(beta amyloid; 이하 ‘Aβ’) 플라그가 발견되었다.

따라서, 대량의 Aβ 플라그로 인하여 신경세포사멸(neuronal cell death) 및 기억손실이 발생한다.

실험에 사용된 쥐는 특정 병원체(pathogen)가 없는 시설에서 12/12시간의 명암주기에서 사육하였다. 모든 동물 실험은 서울대학교 동물실험 윤리위원회에 의해 승인되었다.

6. 동물 수술(Animal Surgery)

생체 내의 이광자 이미지를 관찰하기 위해, 두개골 개두술을 수행하였다.

조레틸 50(Zoletil 50, 2 ㎖/kg; Virbac, Carros, France)-럼푼(Rompun, 25%; Bayer Korea, Seoul, South Korea) 마취제의 혼합물을 5XFAD 형질변환 쥐근육에 주입하여 쥐를 마취시켰다. 이후, 가열 플레이트에 쥐 머리를 고정시키고 수술 및 영상을 관찰하는 동안 쥐의 체온(37℃)을 유지하였다.

쥐의 두피(scalp) 및 골막(periosteum)을 제거한 후에, 브레그마(bregma)를 기준으로 -0.5 mm 에서 -3.5 mm 사이 및 시상 봉합(sagittal suture)을 기준으로 0.5 mm에서 3.5 mm 사이의 두개골 지역을 천공(drilling)하였고, 노출 지역을 약 3 mm의 커버글라스로 덮었다.

영상화 하기 전에, 화합물 2(QAD1)을 정맥 내(intravenously; 이하 ‘i.v.’) 주입(10 mg/kg)하였다.

7. 이광자 형광 현미경(Two-Photon Fluorescence Microscopy; TPFM) 분석

본 발명의 실시예에 따라 합성된 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3이 표지된 조직의 이광자 형광 현미경 영상은 개구수(numerical aperture; NA) 0.30, 1.30, 및 1.30으로 ×10 dry 렌즈, × 40 oil 렌즈 및 × 100 oil objectives 렌즈로 스펙트럼 공 초점 및 다중광자 현미경(spectral confocal and multiphoton microscopes, Leica TCS SP8 MP)을 통해 얻을 수 있었다.

상기 이광자 형광 현미경 영상은 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3을 모델-잠금 티타늄-사파이어 레이져 광원장치(Mai Tai HP; Spectra Physics, 초당 80 MHz, 100 fs 펄스 폭)에 750 nm 파장, 2680 mW(초점면에서 대략 3.0 mW의 평균 출력에 상응) 출력으로 여기시켜 DMI6000B 현미경(Leica)으로 관측하였다.

안정적인 영상 환경을 위해 장기간 적절한 온도, 습도, 및 pH 값을 유지함으로써 세포 배양 시스템(Chamlide IC; Live Cell Instrument)을 이용한 실시간 영상화를 수행하였다.

450 내지 520 ㎚의 범위에서 영상을 얻기 위해, 400 Hz의 스캔 속도에서 각각 8 비트의 512 × 512 및 1024 × 1024 화소의 신호를 수집하기 위해 내부 PMTs를 사용하였다.

본 발명의 실시예에 따라 합성된 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3을 이용한 Aβ 플라그 염색의 관찰에는 이광자 레이저 주사현미경(LSM 7 MP, Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany)을 사용하였다.

또한 본 발명의 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3은 티타늄-사파이어 펨토초 레이저(Chameleon Ultra®, Coherent, Santa Clara, CA)를 이용하여 생체 내 이광자 뇌 영상을 관찰하였다.

뇌 영상을 관찰하기 위해, 30 내지 50 mW로 레이저 파워를 세팅하였고 780 nm 파장을 이용하였다.

4D 영상을 얻기 위해, 심부조직의 z-stack 영상 기법을 이용하였으며, 구체적으로 1 μm 간격을 조정하고, 저속 촬영(time-lapse) z-stack 영상을 이용하였다. 영상 처리는 Volocity 소프트웨어(PerkinElmer, Boston, MA)로 진행하였다.

8. 외피 조직절편 내부 영상화 분석(Cortical Slice Preparation for ex vivo Two Photon Imaging)

유전자 변형 쥐인 5XFAD 쥐로부터 외피 조직 절편을 준비하였다.

구체적으로, 5XFAD 쥐를 희생시킨 후 전체 뇌를 재빠르게 적출하여 NaCl(124 mM), KCl(3 mM), NaH₂PO₄(1.25 mM), MgCl₂(1 mM), NaHCO₃(36 mM), D-glucose(10 mM), 및 CaCl₂(2 mM)를 포함하고, 95% O₂, 및 5% CO₂로 버블링(bubbled)한 차가운 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid; 이하 ‘aCSF’)에 30초 동안 침지하였다.

그 다음 aCSF 내에서 진동 블레이드 절단기(vibrating-blade microtome)를 이용하여 조직 절편을 400 μm 두께로 절단하였다.

95% O₂, 및 5% CO₂로 버블링(bubbled)한 aCSF 내에서 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3(총 20 μM)을 2 μL로 절단하여 절편들을 준비한 후 37℃에서 1시간 30분 동안 배양시켰다.

그 후 절편들을 aCSF로 3회 세척하고, 유리 바닥 디쉬(glass-bottomed dishes, NEST)로 이동시킨 후 공 초점 현미경으로 관찰하였다.

9. 실험결과

도 10은 화합물 1(a,b), 화합물 2(QAD1)(c,d), 및 화합물 3(e,f)에 대한 일광자 흡수 스펙트럼(a,c,e) 및 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3에 대해서 형광 강도의 플롯을 나타낸 도면이다.

도 10을 참조하면, UV-vis 적정법에 의해 결정된 인산완충식염수(phosphate buffer saline; 이하 ‘PBS’, pH 7.4) 완충용액에서 화합물 2(QAD1) 및 화합물 3의 용해도는 각각 4 μM 및 3 μM인 반면, 화합물 1의 용해도는 1.0 μM이었다. 이는 화합물 2(QAD1)는 PBS 완충용액에서 높은 용해도를 가짐을 알 수 있다.

다음으로, 용매 극성에 대한 민감도를 분석하였다.

도 11은 1,4-다이옥세인(1,4-dioxane), 에탄올(EtOH), EtOH : PBS (v/v, 1:1) 및 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 화합물 1(a, b), 화합물 2(QAD1)(c, d), 및 화합물 3(e, f) 각각의 정규 흡수(Normalized absorption) 스펙트럼(a, c, e) 및 발광 스펙트럼(b, d, f)을 나타낸 도면이고, 표 1 및 표 2는 다양한 용매(1,4-다이옥세인, 에탄올, 에탄올:PBS 완충용액(1: 1, v/v), 및 PBS 완충용액)에서 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3과, 또 다른 신규 화합물인 화합물 A1 내지 화합물 A7에 대한 광물리학적 데이이터를 나타낸 표이다.

도 11 및 표 1을 참조하면, 화합물 1의 경우, 1,4-다이옥세인(1,4-dioxane)에서 에탄올로 용매 극성이 증가함에 따라 발광 최대값(emission maximum, 이하 ‘λ_fl’)이 489 nm 에서 515 nm로 점진적으로 붉은색 영역으로 이동하였다. 반면에, PBS 완충용액에서 화합물 1의 용해도가 매우 작기 때문에 PBS 완충용액에서는 어떠한 발광이 관찰되지 않았다.

[표 1]

[표 2]

a: 괄호 안의 숫자는 용매 극성의 평균적인 파라미터이다.

b: 일광자(one-photon) 흡수 스펙트럼 최대 파장(λ_max) (단위: ㎚).

c: 일광자 방출 스펙트럼 최대 파장(λ_max) (단위: ㎚).

d: 형광 양자 효율(Fluorescence quantum yield, 오차범위: ± 10%).

e: 이광자 여기 스펙트럼 최대 파장(λ_max) (단위: ㎚).

f: 10^-50 cm⁴s/photon에서의 광자당 피크 이광자 단면적 (단위: GM).

g The peak two-photon action crosssection in 10^-50 cm⁴s/photon.

h: PBS 완충용액(10mM, pH 7.4).

E^N _T 값은 물을 기준으로 하였다.

i: 측정되지 않음.

일광자 및 이광자 여기 형광 신호는 값을 정하기에는 너무 작게 나타났다.

도 12(a) 및 도 12(b)는 1,4-dioxane, EtOH, 및 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 1 μM의 화합물 2(QAD1)에 대한 정규 흡수 스펙트럼(a) 및 발광 스펙트럼(b)을 나타낸 도면이다.

도 12(a) 및 도 12(b)를 참조하면, 화합물 2(QAD1)는 화합물 1의 PBS 완충용액에서 λ_fl 부분을 제외하고는 유사한 거동을 나타내었다. 구체적으로, 화합물 1의 에탄올에서 λ_fl 보다 더욱 붉은색 영역(546 nm)으로 이동하였다. 이는 화합물 2(QAD1)가 화합물 1보다 극성에 민감한 화합물임을 확인하였다.

또한, 도 13(a)는 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 Aβ₁ _-42 올리고머(0 내지 10 μM)를 갖는 화합물 2(QAD1)(1 μM)의 복합체에 대한 형광 강도의 변화를 나타낸 도면이다.

도 13(a)를 참조하면, Aβ₁ _-42 올리고머(Aβ₁ _-42 oligomer; 이하 ‘AβO’)의 존재 하에 화합물 2(QAD1)의 λ_fl는 PBS 완충용액에서 파란색 영역(λ_fl = 510 nm)으로 이동하였다.

도 12(b)를 참조하면, 형질변환 쥐 뇌 절편에서 화합물 2(QAD1)로 표지된 Aβ 플라그로부터 유사한 결과(508 nm)를 얻었다. 이는, 에탄올 용매가 Aβ 플라그의 미소환경(microenvironmen)에 대한 극성을 적절히 나타냄을 알 수 있다.

에탄올에서 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3의 광물리학적 특성을 분석하였고, 이를 표 3에 요약하였다.

[표 3]

도 12(c)는 에탄올에서 얻어진 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3에 대한 발광 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

도 12(c)를 참조하면, 화합물 2(QAD1)의 밝기(brightness, 이하 ‘εΦ’)는 화합물 1의 εΦ보다 상당히 크게 나타났다.

도 11 및 표 1을 참조하면, 화합물 3이 용매화 발색 변화(solvatochromic shift)를 나타내었음에도 불구하고, 도 14를 참조하면 화합물 3은 푸른색으로 이동된 흡수 스펙트럼에서 급격하게 감소된 밝기를 나타내었다.

화합물 2(QAD1)와 화합물 3 간의 큰 차이점을 확인하기 위해, B3LYP/6-31G* 레벨에서 밀도범함수이론(density functional theory; 이하 ‘DFT’)에 의해 화합물 2(QAD1)와 화합물 3의 구조를 분석하였다.

표 4는 에탄올에서 얻어진 화합물 2(QAD1)와 화합물 3의 DET 산출값을 나타낸 표이다.

표 4를 참조하면, 첫째, 화합물 2(QAD1)와 화합물 3의 시스 이성질체 및 트렌스 이성질체 사이에 대한 각각의 에너지 차이는 거의 동일하게 나타났다.

[표 4]

도 15는 에탄올에서 DFT에 의한 최적화된 기하학적 구조인 화합물 2(QAD1)(a), 및 화합물 3(b)의 시스-올리고머(cis-isomer) 구조를 나타낸 도면이다.

도 15를 참조하면, 화합물 3은 중심 π-코어와 브리지 헤테로 고리 간의 뒤틀림 구조를 포함하는 반면, 화합물 2(QAD1)의 바닥 상태(ground state)에서 최적화된 기하학적 구조는 평면 구조이다.

도 16은 에탄올에서 화합물 2(QAD1)(a), 및 화합물 3(b)의 밀도범함수이론(density functional theory; 이하 ‘DFT’)에 의한 최적화된 기하학적 구조 및 분자궤도함수 분포를 나타낸 도면이다.

도 16을 참조하면, 화합물 3의 HOMO-LUMO 에너지 및 진동자 강도(oscillator strength)는 각각 2.67 eV 및 0.98인 반면, 화합물 2(QAD1)는 2.56 eV의 HOMO-LUMO 에너지 및 1.91의 진동자 강도를 나타내었는 바, 화합물 2(QAD1)는 화합물 3보다 HOMO-LUMO 에너지가 더 작으며, 2배의 진동자 강도 값을 나타내었다.

그러므로, 화합물 2(QAD1)의 더 강한 밝기는 평면 구조에서 기인하였으며, 효율적인 ICT를 가능하게 할 수 있다. 그러나, 화합물 3의 더 약한 밝기는 꼬인 구조에서 기인한 것으로서 비스-에탄올과 π-코어 간의 입체 반발(steric repulsion)을 야기한다.

또한, AβO 및 소혈청알부민(bovine serum albumin; 이하 ‘BSA’)에 대한 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3의 선택적인 결합 프로파일(binding profile)을 분석하였다.

도 13(a)는 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에서 Aβ₁ _-42 올리고머(0 내지 10 μM)를 갖는 화합물 2(QAD1)(1 μM)의 복합체에 대한 형광 강도의 변화를 나타낸 도면이다.

형광 적정법에 의해 화합물 2(QAD1)/AβO에 대한 해리상수(dissociation constant; 이하 ‘K_d’)를 결정하였다.

구체적으로, 화합물 2(QAD1)/AβO에 대한 K_d 값은 21.5 nM 이었다. 이는 화합물 1, 및 화합물 3에 대한 K_d값 보다 화합물 2(QAD1)의 AβO에 대한 결합 친화도(binding affinity)가 더 높음을 의미한다.

도 17(b)는 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에 Aβ₁ _-42 올리고머 및 BSA의 존재 하에 화합물 2(QAD1)(b, 417 nm)에 대한 발광 강도의 변화를 나타낸 도면이다.

도 17(b)를 참조하면, 화합물 2(QAD1)는 유사한 실험 조건 하에서 수행하였을 때 BSA와는 무시할 수 있는 상호작용을 나타내었다.

도 17(a)는 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에 Aβ₁ _-42 올리고머 및 BSA의 존재 하에 화합물 1(a, 여기 파장: 417 nm)에 대한 발광 강도의 변화를 나타낸 도면이다.

도 17(a)를 참조하면, BSA 존재 하에 화합물 1의 발광 강도의 증가는 AβO 보다 높았으며, 이는 화합물 1이 BSA에 대한 결합 친밀도가 높음을 암시한다.

도 17은 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4)에 Aβ₁ _-42 올리고머 및 BSA의 존재 하에 화합물 3(c, 326 nm)에 대한 발광 강도의 변화를 나타낸 도면이다.

도 17을 참조하면, 미미한 발광 광도를 제외하고는 화합물 3에서 유사한 결과를 관찰하였다.

따라서, 개선된 용해도 및 평면 형태에 기인하여, 화합물 2(QAD1)는 BSA 보다 AβO에 대해 특이적으로 결합함을 알 수 있다.

[표 5]

a: 반응식 1에서 화학구조에 대한 문자.

b: 모든 측정은 PBS 완충용액(10 mM, pH 7.4) 부재 하에 Aβ₁ _-42 올리고머(10 μM) 존재 하에서 수행되었다.

c: 일광자 흡수 흡수 스펙트럼의 최대 파장(λ_max) (단위: nm).

d: 일광자 방출 스펙트럼의 최대 파장(λ_max) (단위: nm).

e: 형광 양자 효율(Fluorescence quantum yield, 오차범위: ± 10%).

f: Aβ₁ _-42 올리고머(0 내지 10 μM) 존재 하에 일광자 공정에 의해 측정된 해리 상수(Dissociation constants, 오차범위: ± 10%)

g: 형광 향상 계수(Fluorescence enhancement factor, (F-F_min)/F_min)

도 18은 407 nm의 여기 파장에서 범용 완충용액(0.1 M 시트르산(citric acid), 0.1 M KH₂PO₄, 0.1 M Na₂B₄O₇, 0.1 M Tris, 및 0.1 M KCl)에서 화합물 2(QAD1)에 대한 pH의 영향을 나타낸 도면이다.

도 18을 참조하면, 화합물 2(QAD1)의 발광 강도는 생물학적으로 관련된 pH 범위에서 pH 변화에 민감하게 반응하지 않았다.

상기 결과를 통해 화합물 2(QAD1)는 BSA 및 pH에 의해 최소한의 간섭을 받아 AβO에 민감한 결합을 할 수 있음을 알 수 있다.

TPEF에 의해 결정된 화합물 2(QAD1)의 Φδ_TPA 값을 분석하였다.

도 12(d)는 에탄올에서 얻어진 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3에 대한 이광자 동작(Two-photon action; 이하 ‘TPA’) 스펙트럼(d)을 나타낸 도면이다.

표 3은 에탄올에서 얻어진 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3의 광물리학적 특성을 분석하여 나타낸 표이다.

도 12(d) 및 표 3을 참조하면, 화합물 2(QAD1) Φδ_TPA 값은 750 nm에서 420 GM을 나타내었고, 이는 약 100 GM의 Φδ_TPA 값을 갖는 비극성 화합물에 비해 높은 값을 나타내었다.

표 3을 참조하면, 화합물 1이 화합물 2(QAD1) 보다 더 작은 값을 나타낸 이유는 화합물 1의 더 작은 Φ 값에 의해 기인된 것이다. 또한, 화합물 3의 최소 Φδ_max 값은 뒤틀린 구조에 기인하여 효율적인 분자내 전하이동(intramolecular charge transfer; 이하 ‘ICT’)을 훼방한다.

구체적으로, 이광자 동작 단면적(Φδ_TPA) 값과 관련하여, 분자의 이광자 흡수 단면적(δ_TPA) 크기는 ICT 특성의 범위에 비례하며, 이는 전자 주기(donating) 및 받기(accepting) 능력, 컨주게이션 길이, 형태 제안, 및 대칭성 등에 의해 기인한 것이다.

다양한 형태의 이광자 흡수 염료 중에서, 전자 주개(D)-치환된 받개(A) 및 중심 대칭 사중극자(D-A-D)는 δ_TPA 값에 대해 유망한 모티프임을 증명하였다.

또한, 비스-스티릴벤젠(bis-styrylbenzene) 유도체를 포함한 다중-플루오르화 중심은 Aβ 플라그에 대해 선택적인 결합 친화도를 나타내고 있다.

따라서, 강한 전자 주개로서 아미노 기 및 전자 받개로서 테트라플루오르벤젠을 포함한 Aβ 플라그에 대한 D-A-D 타입이 바람직하며, 또한 열린 사슬계(open chain system)보다 높은 광안정성을 기대할 수 있는 인돌일(indolyl) 고리 내에서 C=C 결합을 캡슐화하는 것이 바람직한 바, 화합물 2(QAD1)를 이용하는 것이 바람직하다.

화합물 2(QAD1)는 광퇴색(photobleaching)에 저항할 수 있도록 420 GM 보다 큰 Φδ_TPA 값을 나타내었고, 또한 Aβ 플라그에 대한 높은 결합 친밀도, 및 BBB를 침투하는 능력을 나타내었다. 그것 때문에 실시간을 가능하게 하며, 생체 내 Aβ 플라그에 대한 높은 공간 해상도(spatial resolution) 3D 영상을 제공할 수 있다.

표 6은 화합물 1, 화합물 2(QAD1), 및 화합물 3에 대한 log P_oct값을 나타낸 표이다.

[표 6]

표 6을 참조하면, n-옥탄올과 PBS 완충용액 간의 분할에 의해 얻어진 화합물 2(QAD1)의 친유성 값(logP_oct)은 3.42이며, 이것은 혈액뇌관문(blood brain barrier; 이하 ‘BBB’)을 침투하기 위한 추정 범위(logP = 2.0 내지 3.5)와 잘 부합하였다.

[표 7]

도 19는 정맥 내(intravenously; 이하 ‘i.v.’) 화합물 2(QAD1)(10mg/kg)를 주입한 후에 0분(a), 30분(b), 60분(c), 및 150분(d)에서 형질변환 5XFAD 쥐의 전두엽에 대한 생체 내 TPM 이미지; Aβ 플라그 분포를 시각화하기 위해, 외피의 표면으로부터 약 300 μm의 깊이에서 z-방향에 따른 축적된 230 TPM 이미지(e); 정맥 내 화합물 2(QAD1)(10mg/kg) 및 dextran 40kDa-Texas red를 주입한 후에 형질변환 5XFAD 쥐의 전두엽에 대한 3D 재생 TP 이미지(f, g)(외피의 표면으로부터 약 300 μm의 깊이에서 z-방향에 따른 축적된 약 270 TPM 이미지이고, 스케일 바는 50 μm(a) 및 30 μm(e)이다.);를 나타낸 도면이다.

도 19를 참조하면, 이러한 결과를 통해 화합물 2(QAD1)는 생체 내에서 Aβ 플라그의 밝은 TPM 영상화 하는 민감한 화합물임을 암시한다.

뇌 조직에서 Aβ 플라그에 대한 화합물 2(QAD1)의 능력을 모니터링하였다.

뇌의 Aβ 플라그를 형성한 AD 모델 쥐인 형질변환 5XFAD 쥐로부터 외피 조직절편을 얻었다.

도 20은 37℃에서 90분 동안 20 μM의 화합물 1(a), 화합물 2(QAD1)(c), 및 화합물 3(e)으로 염색된 형질변환 5XFAD 쥐 뇌의 외피 조직절편의 TPM 이미지(a,c,e)를 나타낸 도면이다.

도 20을 참조하면, 화합물 1 및 화합물 3으로 표지된 절편에서는 중요한 백그라운드 신호를 갖는 희미한 TPEF를 나타낸 반면, 가장 높은 S/N 비를 갖는 화합물 2(QAD1)로 표지된 절편에서 TPM 영상의 명점(Bright spots)을 관찰하였다.

상기 결과는 화합물 2(QAD1)의 Aβ 플라그에 대한 큰 Φδ_TPA 값 및 높은 민감도에 기인한 것이다.

화합물 2(QAD1)가 Aβ 플라그에 정확히 위치할 수 있는지 확인하기 위해, Aβ 플라그에 대해 잘 알려진 형광 마커인 콩고 레드와 화합물 사이에 국재화 분석(co-localization experiment)을 수행하였다.

도 21(a) 내지 도 21(c)는 37℃에서 90분 동안 화합물 2(QAD1)(a) 및 콩고 레드(Congo red)(b)로 공동-표지(co-labeled)된 형질변환 5XFAD 쥐 뇌의 외피 조직절편의 TPM 이미지(a,b,c) 및 20배 확대한 병합된 이미지(merged images)(c)를 나타낸 도면이다.

도 21(a) 내지 도 21(c)를 참조하면, 화합물 2(QAD1)의 밝은 TPEF 영역은 피어슨의 국재화(Pearson's colocalization) 계수(0.85)를 갖는 콩고 레드의 시그널과 병합되었다. 이는 TPM 이미지의 명점은 Aβ 플라그를 반영하였음을 확인하였다.

조직 내에서 Aβ 플라그의 TPEF 스펙트럼은 대칭적이었고, 도 12(b)를 참조하면, 에탄올에서 얻어진 발광 스펙트럼과 잘 부합하였다.

또한, 도 16(d) 및 도 16(e)를 참조하면, 60분 이후 펨토초 펄스에서 750 nm의 여기시에 TPEF 강도는 거의 동일하게 남아있었다.

고리 내의 C=C 결합의 캡슐화에 따른 화합물 2(QAD1)의 구조모티프(structural motif)에 기인하여 높은 광안정성을 나타내었다.

따라서, 생체 내 화합물 2(QAD1)의 유용성을 분석 하였다.

형질변환 5XFAD 쥐를 마취시키고, 직접 TPM 이미징을 위해 두개골 윈도우(cranial window)를 외과적으로 설치하였다.

화합물 2(QAD1)(10 mg/kg)를 정맥 내 주입한 후 780 nm의 여기에서 TPM 이미지를 직접 수집하였다.

도 19(a)를 참조하면, 초기 영상은 외피 영역에서 혈관을 통해 밝은 TPEF를 나타내었다. 도 19(b) 내지 도 19(d)의 흰색 화살표를 참조하면, 시간에 따라 혈관 근처의 플라그로 급격히 이동하였다.

BBB의 침투를 통해 플라그에 QAD의 염색 공정으로 명확히 시각화 할 수 있었다.

또한, 도 19(e)를 참조하면, 보다 깊은 곳의 영역에서 TPM 영상을 얻었을 때, 표지된 개별적인 플라그들은 높은 S/N 비로 명확히 시각화 되었다.

혈관을 따라 Aβ 플라그의 3D 시각화가 임상 적용에 중요하기 때문에, 혈액 마커로 잘 알려진 dextran 40 kDa-Texas red를 주입하였다.

그 후, 외피 표면으로부터 300 μm보다 더 깊은 곳에서 z-방향에 따라 듀얼-컬러 TPM 영상을 즉시 얻을 수 있었고, z-방향에 따른 축적된 약 270 3D TPM 영상을 얻었다.

도 19(f), 및 도 19(g)를 참조하면, 특정 지역에서 다양한 크기의 개별적인 Aβ 플라그를 혈관에 따라 명확히 시각화하였다.

또한, 대뇌 아밀로이드 맥관병증(cerebral amyloid angiopathy; 이하 ‘CAA’)는 중추신경계(central nervous)의 혈관 벽 주변에 형성된 Aβ 플라그에 증착되었고, 직접 관찰하였다.

이러한 결과를 통해 실시간으로 생체 내 Aβ 플라그의 3D 시각화하기 위한 화합물 2(QAD1)의 유용성, 및 Aβ 플라그의 진단 및 정밀한 치료용으로서 임상시험에 유용함을 증명하였다.

Aβ 플라그의 생체 내 영상화하기 위해 합성된 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 이러한 Aβ 플라그에 대한 큰 이광자 동작 단면적(Φδ_max = 420 GM), 상당한 용해도, 높은 민감도, 및 선택성을 나타내고 있으며, 또한 살아있는 쥐 뇌의 Aβ 플라그로 쉬운 로딩 능력을 나타내고 있다.

이러한 사중극자 형태의 화합물 특징들은 개별적인 플라그의 직접적으로 3D 시각화 할 수 있을 뿐만 아니라, 사중극자 형태의 화합물은 AD의 쉬운 진단 및 치료를 포함한 바이오메디컬 적용에 유용할 수 있음을 증명하였다.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R₁ 내지 R₄는 서로 동일하거나 상이하고,
수소, 수산화기, 할로겐, C₁ 내지 C₄의 알콕시, C₁ 내지 C₄의 알킬, C₁ 내지 C₄의 알코올, 또는 하기 화학식 1-1이며,
[화학식 1-1]

m은 1 내지 5의 정수이고,
R₅ 내지 R₆는 서로 동일하거나 상이하고,
수소, 수산화기, 할로겐, C₁ 내지 C₄의 알콕시, C₁ 내지 C₄의 알킬, C₁ 내지 C₄의 알코올, 하기 화학식 1-2 또는 화학식 1-3이며,
[화학식 1-2]

[화학식 1-3]

n은 8 내지 15의 정수이고,
R₇ 내지 R₁₀는 서로 동일하거나 상이하고,
2 이상이 플루오르(F)이고, 나머지는 수소임.
청구항 1에 있어서,
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은,
하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 2]

상기 화학식 2에서, R₁ 내지 R₄는 서로 동일하거나 상이하고,
수소, C₁ 내지 C₄의 알킬, C₁ 내지 C₄의 알코올, 또는 하기 화학식 2-1이며,
[화학식 2-1]

R₅ 내지 R₆는 서로 동일하거나 상이하고,
수소, C₁ 내지 C₄의 알코올, 하기 화학식 2-2 또는 화학식 2-3임.
[화학식 2-2]

[화학식 2-3]
청구항 1에 있어서,
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은,
하기 화학식 3-1 내지 화학식 3-14 중 어느 하나로 표시되는 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 3-1]

[화학식 3-2]

[화학식 3-3]

[화학식 3-4]

[화학식 3-5]

[화학식 3-6]

[화학식 3-7]

[화학식 3-8]

[화학식 3-9]

[화학식 3-10]

[화학식 3-11]

[화학식 3-12]

[화학식 3-13]

[화학식 3-14]
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 이광자 형광 프로브.
청구항 4에 있어서,
상기 이광자 형광 프로브는,
베타 아밀로이드 플라크에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 이광자 형광 프로브.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 베타 아밀로이드 검출용 조성물.
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청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 생체로부터 분리된 시료에 주입하는 단계;
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 생체로부터 분리된 시료 내 베타 아밀로이드 플라그와 결합하는 단계;
상기 생체로부터 분리된 시료에 여기원을 조사하는 단계; 및
이광자 현미경으로 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 발생하는 형광을 관측하는 단계;를 포함하는, 베타 아밀로이드 플라크의 영상화 방법.
청구항 9에 있어서,
상기 여기원은,
700 내지 800 nm 범위의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는, 베타 아밀로이드 플라크의 영상화 방법.