JP2014534241A - ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ、その製造方法及びその利用 - Google Patents
ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ、その製造方法及びその利用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
R3は、− CH2−、− (CH2)2−、−(CH2)3−、−(CH2)4−、−(CH2)5−、−(CH2)6−、−(CH2)7−、または−(CH2)8−から選択され、
R4は、C1−6アルキル基 、HOCH2−、HO(CH2)2−、HO(CH2)3−、HO(CH2)4−、HO(CH2)5−、またはHO(CH2)6−から選択され、
R5は、−H、−CN、−COOH、−NH2、−NO2、−OH、または−SHから選択される。
20mmolの4−ブロモ−1,8−ナフタル酸無水物と、25mmolのメチルアミン(methylamine)とを、10mlの酢酸溶液が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を100℃で2hし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、白い固体粉末の粗生成物である中間製品1を得た。収率は96%であった。
ステップ(1)で得られた、20mmolの粗生成物1と、30mmolのヘキサメチレンジアミン(hexamethylenediamine)とを、20mlの2−メトキシエタノール(2−methoxyethanol)が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を125℃で5hし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって黄色い固体粉末の中間体2を得た。収率は55%であった。
20mmolの黄色い固体粉末の中間体2と、25mmolのインドメタシン(indometacin)と、25mmolの1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド(1−(3−Dimethylaminopropyl)−3−ethylcarbodiimide)(EDC )と、少量の4−メチルピリジン(4−methylpyridine)とを、無水ジクロロメタン(dichloromethane)溶液に入れ、室温下で撹拌しながら24時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーによって山吹色の生成品を得た。収率は84%であった。
実施例1で合成された化合物A1を使用して、濃度が4μMのA1−DMSO溶液4μLがそれぞれ添加されたHela細胞とHEK293細胞を、培地において、37度、CO2が5%存在する条件下で60分培養する。そして、PBSで5 min×3回振とう洗浄した後、更に細胞培地を加えて、二光子を用いた共焦点レーザー法によりイメージングを行う。代表的な領域を選択して、油浸レンズ(100×)で観察する。観察は三回繰り返される。イメージングにより、Hela細胞内で強い蛍光信号が得られるが、HEK293細胞内では蛍光信号が得られないことが分かった。図2(a)はプローブA1を加えた後のHela細胞の焦準を合わせて撮った写真であり、図2(b)はプローブA1を加えた後のHela細胞の焦準を合わせて撮った写真である。写真を撮った波長は500〜550nmであった。
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むNaOH溶液(pH11)を参照とし、実施例1で合成された化合物A1をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル(acetonitrile)、ジオキサン(dioxane)、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、N,N−ジメチルホルムアミド(N,N−dimethylformamide )、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面の測定を行った。使用される溶液の濃度は全て1×10−4Mであり、以下の式で算出する。
20mmolの4−ブロモ−1,8−ナフタル酸無水物と、25mmolのo-フェニレンジアミン(o−phenylenediamine)とを、10mlの酢酸溶液が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を95℃で4hし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物である中間製品1を得た。収率は90%であった。
ステップ(1)で得られた、20mmolの粗生成物1と、25mmolのヘキサメチレンジアミンとを、20mlの2−メトキシエタノールが入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を125℃で5hし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって黄色い固体粉末の中間体2を得た。収率は63%であった。
20mmolの黄色い固体粉末の中間体2と、25mmolのインドメタシンと、25mmolの1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド(EDC)と、少量の4−メチルピリジンとを、無水ジクロロメタン溶液に入れ、室温下で撹拌しながら24時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーによってインディアンイエロー色の生成品A2を得た。収率は84%であった。ここで、1H NMR(400MHz、DMSO) δ8.99(d、J=7.2Hz、2H)、8.69(d、J=8.3Hz、1H)、8.43(d、J=7.2Hz、1H)、8.25(d、J=8.5Hz、1H)、8.19(d、J=6.3Hz、2H)、8.03(s、1H)、7.85(d、J=4.6Hz、1H)、7.72(d、J=3.5Hz、2H)、 7.64(dt、J=20.8、6.4Hz、5H)、7.12(d、J=2.4Hz、1H)、6.91(d、J=9.0Hz、1H)、6.72(d、J=8.6Hz、1H)、 6.68(dd、J=9.0、2.5Hz、1H)、4.22(s、1H)、3.48(s、2H)、3.37―3.12(m、16H)、3.08(d、J=6.1Hz、2H)、2.51(d、J=1.6Hz、6H)、2.22(s、3H)、1.71―1.57(m、3H)、1.37(ddd、J=24.7、14.6、6.8Hz、8H)、1.23(s、1H)であった。
マウスの肺部の腫瘍組織の切片およびマウスの肺部の非腫瘍組織の切片を、上記実施例4で合成された化合物A2を含む10μMのPBS溶液に浸す。30分後に取り出し、マウンテング及びシーリングしてから、二光子を用いた共焦点レーザー法により蛍光写真を撮った。二光子を用いた共焦点レーザー法によるイメージングにより、マウスの肺部の腫瘍組織の切片では強い蛍光信号が得られたが、マウスの肺部の非腫瘍組織の切片では蛍光信号が得られないことが分かった。図4(a)はプローブA2を添加した後のマウスの肺部の腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真であり、図4(b)はプローブA2を添加した後のマウスの肺部の非腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真である。写真を撮った波長は500〜550nmであった。
上記実施例4で合成された化合物A2を水に入れて、異なる濃度でA2を含む水溶液の、最大吸収波長での吸光度を測定した。測定結果により、化合物A2の濃度が5μMである場合、吸光度に変化が見られないことが分かった。即ち、化合物A2の水に対する溶解度は5μMであった。図5は、異なる濃度のプローブA2の最大吸収波長での吸光度を示す。使用される測定機器は、それぞれAgilent 8453紫外分光光度計である。
20mmolの4−ブロモ−1,8−ナフタル酸無水物と、25mmolの4−ニトロ−ο−フェニレンジアミン(4−Nitro−o−phenylenediamine)とを、10mlの酢酸溶液が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を105℃で3hし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物である中間製品1を得た。収率は87%であった。
ステップ(1)で得られた、20mmolの粗生成物1と、25mmolのヘキサメチレンジアミンとを、20mlの2−メトキシエタノールが入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を125℃で4hし続た後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、橙赤色の固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって橙赤色の固体粉末の中間体2を得た。収率は54%であった。
20mmolの橙赤色の固体粉末の中間体2と、25mmolのインドメタシンと、25mmolの1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド(EDC)と、少量の4−メチルピリジンとを、無水ジクロロメタン溶液に入れ、室温下で撹拌しながら28時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除し去、カラムクロマトグラフィーによって橙赤色の生成品A3を得た。収率は84%であった。ここで、1H NMR(400MHz、DMSO)δ8.99(d、J=7.2Hz、1H)、8.69(d、J=8.3Hz、1H)、8.43(d、J=7.2Hz、1H)、8.25(d、J= 8.5Hz、1H)、8.19(d、J=6.3Hz、1H)、8.03(s、1H)、7.85(d、J=4.6Hz、1H)、7.72(d、J=3.5Hz、2H)、7.64(dt、J=20.8、6.4Hz、5H)、7.12(d、J=2.4Hz、1H)、6.91(d、J=9.0Hz、1H)、6.72(d、J=8.6Hz、1H)、6.68(dd、J=9.0、2.5Hz、1H)、4.22(s、1H)、3.48(s、2H)、3.37−3.12(m、16H)、3.08(d、J=6.1Hz、2H)、2.51(d、J=1.6Hz、6H)、2.22(s、3H)、1.71−1.57(m、3H)、1.37(ddd、J=24.7、14.6、6.8Hz、8H)、1.23(s、1H)であった。
上記実施例7で合成された化合物A3をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、N,N−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、異なる溶媒での紫外吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルを測定した。測定結果により、溶媒の極性の変化に伴って、紫外吸収スペクトルでの最大吸収波長も変化し、蛍光発光スペクトルでも最大吸収波長が変化することが分かった。図6(a)は異なる溶媒でのプローブA3の紫外吸収スペクトルであり、図6(b)は異なる溶媒でのプローブA3の蛍光発光スペクトルである。使用される測定機器は、それぞれAgilent 8453紫外分光光度計、およびAgilent Cary Eclipse蛍光分光光度計である。
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むNaOH溶液(pH11)を参照とし、実施例7で合成された化合物A3をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、N,N−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面を測定する。使用される溶媒の濃度は全て1×10−4Mであり、式2.2により二光子を吸収する断面の値を得た。使用した異なる溶媒において、異なる波長で二光子を吸収する有効断面(Φδ)を測定した結果を図7に示す。二光子励起蛍光スペクトルの励起源はモード同期チタンサファイアレーザーである。レーザーパルス幅は70fsであり、重複周波数は80MHzであり、レーザーの平均出力電力は1.5W(780nm)であり、調節可能な波長範囲は700〜980 nmであった。実験中にフェムト秒レーザー波長が所望の測定波長に調節された。
33mmolのアセナフテンキノン、および180mmolの液体臭素をシングルネック(Single neck)フラスコに入れて、撹拌しながら、65℃までゆっくりと温度を上げた後、一定温度で3h撹拌し続けた。反応を停止してから、少量のH2SO4を含む300mlの蒸留水を加えると、黄色い固体が析出し、水溶液がインディアンイエロー色になった。更に、液体が無色になるまで加熱沸騰させて臭素と臭化水素を除去した。ろ過して、ろ過液が中性になるまで複数回溶解した。乾燥してから粗生成物である中間体1を得た。粗収率は90%であり、M.p.は、236〜238℃であった。
20mmolの中間体1と、25mmolのo−フェニレンジアミンとを10mlの酢酸を含む溶液が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を105℃で6hし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物である中間製品2を得た。収率は79%であった。
ステップ(2)で得られた、20mmolの中間製品2と、25mmolのヘキサメチレンジアミンとを、20mlの2−メトキシエタノールが入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を125℃で6hし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって黄色い固体粉末の中間体3を得た。収率は66%であった。
20mmolの黄色い固体粉末の中間体3と、30mmolのインドメタシンと、25mmolの1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド(EDC)と、少量の4−メチルピリジンとを、無水ジクロロメタン溶液に入れ、室温下で撹拌しながら25時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーによって黄色い生成品A4を得た。収率は74%であった。ここで、1H NMR (400MHz、DMSO)δ8.86(d、J=7.9Hz、2H)8.69(d、J=8.3Hz、1H)、8.43(d、J=7.2Hz、1H)、8.25(d、J=8.5Hz、1H)、8.17(d、J=6.3Hz、2H)、8.03(s、1H)、7.72(d、J=3.5Hz、2H)、7.64(dt、J=20.8、6.4Hz、5H)、7.12(d、J=2.4Hz、1H)、6.91(d、J=9.0Hz、1H)、6.72(d、J=8.6Hz、1H)、6.68(dd、J=9.0、2.5Hz、1H)、4.22(s、1H)、3.48(s、2H)、3.37−3.12(m、16H)、3.08(d、J=6.1Hz、2H)、2.51(d、J=1.6Hz、6H)、2.22(s、3H)、1.71−1.57(m、3H)、1.37(ddd、J=24.7、14.6、6.8Hz、8H)、1.23(s、1H)であった。
マウスの肺部の腫瘍組織の切片およびマウスの肺部の非腫瘍組織の切片を、上記実施例10で合成された化合物A4を10μM含むPBS溶液に浸した。30分後に取り出し、マウンテング及びシーリングしてから、二光子を用いた共焦点レーザー法により蛍光写真を撮った。二光子を用いた共焦点レーザー法によるイメージングにより、マウスの肺部の腫瘍組織の切片では強い蛍光信号が得られたが、マウスの肺部の非腫瘍組織の切片では蛍光信号が得られないことが分かった。図8(a1)および(a2)はプローブA4を添加した後のマウスの肺部の腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真であり、図8(b1)および(b2)は、プローブA4を添加した後のマウスの肺部の非腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真である。ここで、図8(a1)および図8(b1)の撮像波長は500〜550nmであり、図8(a2)および図8(b2)の撮像波長は570〜650nmである。
上記合成された化合物A4を水に入れて、異なる濃度のA4の最大吸収波長での吸光度を測定した。測定結果により、化合物A1の濃度が24μMである場合、吸光度の変化がないことが分かった。即ち、化合物A4の水に対する溶解度は24μMであった。図9は異なる濃度のプローブA4の最大吸収波長での吸光度である。使用される測定機器はそれぞれAgilent 8453紫外分光光度計である。
33mmolのアセナフテンキノン、および180mmolの液体臭素をシングルネックフラスコに入れて、撹拌しながら、65℃までゆっくりと温度を上げた後、一定温度で3h撹拌し続けた。反応を停止した後、少量のH2SO4を含む300mlの蒸留水を加えると、黄色い固体が析出し、水溶液がインディアンイエロー色になった。更に、液体が無色になるまで加熱沸騰させて臭素と臭化水素を除去した。ろ過して、ろ過液が中性になるまで複数回溶解させた。乾燥した後、粗生成物である中間体1を得た。粗収率は90%であり、M.p.は236〜238℃であった。
20mmolの中間体1と、30mmolのO−フェニレンジアミンとを10mlの酢酸を含む溶液が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を100℃で5hし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、赤い固体粉末の粗生成物である中間製品2を得た。収率は83%であった。
ステップ(2)で得られた、20mmolの中間製品2と、25mmolのヘキサメチレンジアミンとを、20mlの2−メトキシエタノールが入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を125℃で5.5hし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、橙赤色の沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって橙赤色の固体粉末の中間体3を得た。収率は72%であった。
20mmolの橙赤色の固体粉末の中間体3と、30mmolのインドメタシンと、25mmolの1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド(EDC)と、少量の4−メチルピリジンとを、無水ジクロロメタン溶液に入れ、室温下で撹拌しながら25時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーによって黄色い生成品A4を得た。収率は74%であった。ここで、1H NMR (400MHz、DMSO)δ8.86(d、J=7.9Hz、1H)8.69(d、J=8.3Hz、1H)、8.43(d、J=7.2Hz、1H)、8.25(d、J=8.5Hz、1H)、8.23(d、J=6.9Hz、1H)、8.18(d、J=6.3Hz、1H)、8.03(s、1H)、7.72(d、J=3.5Hz、162H)、7.64(dt、J=20.8、6.4Hz、5H)、7.12(d、J=2.4Hz、1H)、 6.91(d、J=9.0Hz、1H)、6.72(d、J=8.6Hz、1H)、6.68(dd、J=9.0、2.5Hz、1H)、4.22(s、1H)、3.48(s、2H)、3.37−3.12(m、16H)、3.08(d、J=6.1Hz、2H)、2.51(d、J=1.6Hz、6H)、2.22(s、3H)、1.71−1.57(m、3H)、1.37(ddd、J=24.7、4.6、6.8Hz、8H)、1.23(s、1H)であった。
実施例13で合成された化合物A5を使用して、濃度が4μMのA5−DMSO溶液4μLがそれぞれ添加されたHela細胞とHEK293細胞を、培地において、37度、CO2が5%存在する条件下で60分培養した。そして、PBSで5 min×3回振とう洗浄した後、更に細胞培地を加えて、二光子を用いた共焦点レーザー法によりイメージングを行った。代表的な領域を選択して、油浸レンズ(100×)で観察した。観察は三回繰り返された。イメージングにより、Hela細胞内では強い蛍光信号が得られるが、HEK293細胞内では蛍光信号が得られないことが分かった。図10(a1)および図10(a2)はHela細胞であり、図10(b1)および図10(b2)はHEK293細胞である。ここで、図10(a1)および図10(b1)の撮像波長は500〜550nmであり、図10(a2)および図10(b2)の撮像波長は570〜650nmであった。
マウスの肺部の腫瘍組織の切片およびマウスの肺部の非腫瘍組織の切片を上記実施例13で合成された化合物A5を含むPBS溶液(濃度は10μMである)に浸した。30分後に取り出し、マウンテング及びシーリングしてから、二光子を用いた共焦点レーザー法により蛍光写真を撮った。二光子を用いた共焦点レーザーによるイメージングにより、マウスの肺部の腫瘍組織の切片では強い蛍光信号が得られるが、マウスの肺部の非腫瘍組織の切片では蛍光信号が得られないことが分かった。図11(a1)および図11(a2)はマウスの肺部の腫瘍組織であり、図11(b1)および図11(b2)はマウスの肺部の非腫瘍組織である。ここで、図11(a1)および図11(b1)の撮像波長は500〜550nmであり、図11(a2)および図11(b2)の撮像波長は570〜650nmである。
0.5gのアセナフトキノンおよびと0.2gのマロノニトリル(Malononitrile)を50mlのジクロロメタンに溶解させて、寸胴のシリカゲルカラム(直径は50mmであり、シリカゲルの充填高さは約100mmである)に直接加え、ジクロロメタンで素早く連続的にカラム洗浄して、Rf=0.8の橙色バンドを収集して、ジクロロメタンを蒸発させて、橙赤色の固体の中間製品1を得た。収率は97%より高かった。
1.1gの中間製品と、0.2gの炭酸カリウムとを20mlに入れて、加熱還流した。数分後に大量の褐色結晶が現れた後、冷却ろ過して、水洗して炭酸カリウムおよび溶媒を除去した。更に、乾燥して純粋な中間製品2を得た。収率は93%より高かった。
ステップ(2)で得られた、20mmolの中間体2と、25mmolのヘキサンジアミンとを20mlのアセトニトリル (acetonitrile)が入った丸底フラスコに入れて、常温で撹拌しながら1h反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により溶媒を除去し、シリカゲルカラム・クロマトグラフィーによって分離を行い、Rf=0.25の赤色バンドを収集して、溶媒を除去し、純粋な中間製品3を得た。収率は73%であった。
20mmolの赤色の固体粉末の中間体3と、30mmolのインドメタシンと、25mmolの1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド(EDC)と、少量の4−メチルピリジンとを、無水ジクロロメタン溶液に入れ、室温下で撹拌しながら24時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーによって赤色の生成品A6を得た。収率は69%であった。ここで、1H NMR(400MHz、DMSO)δ8.95(d、J=7.6Hz、1H)、8.58(d、J= 7.2Hz、1H)、7.98(d、J=8.8Hz、1H)、7.88(t、J=7.8Hz、1H)、7.72(d、J=3.5Hz、2H)、7.64(dt、J=20.8、6.4Hz、5H)、7.12(d、J=2.4Hz、1H)、7.03(d、J= 9.2Hz、1H)、6.91(d、J=9.0Hz、1H)、6.72(d、J=8.6Hz、1H)、6.68(dd、J=9.0、2.5Hz、1H)、4.22(s、1H)、3.48(s、2H)、3.37−3.12(m、16H)、3.08(d、J= 6.1Hz、2H)、2.51(d、J=1.6Hz、6H)、2.22(s、3H)、1.71−1.57(m、3H)、1.37(ddd、J=24.7、14.6、6.8Hz、8H)、1.23(s、1H)であった。
上記の実施例16により合成された化合物A6を、それぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、N,N−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、異なる溶媒での紫外吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルを測定した。測定結果により、溶媒の極性の変化に伴って、紫外吸収スペクトルでの最大吸収波長も変化し、蛍光発光スペクトルでも最大吸収波長が変化することが分かった。図12(a)は異なる溶媒でのプローブA6の紫外吸収スペクトルであり、図12(b)は異なる溶媒でのプローブA6の蛍光発光スペクトルである。使用される測定機器はそれぞれAgilent 8453紫外分光光度計およびAgilent Cary Eclipse蛍光分光光度計であった。
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むNaOH溶液(pH11)を参照とし、実施例16で合成された化合物A6をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、N,N−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面を測定した。使用される溶媒の濃度は全て1×10−4Mであった。式2.2により二光子を吸収する断面の値が得られる。使用する異なる溶媒において、異なる波長で二光子を吸収する有効断面(Φδ)を測定した結果を図13に示す。二光子励起蛍光スペクトルの励起源はモード同期チタンサファイアレーザーである。レーザーパルス幅は70fsであり、重複周波数は80MHzであり、レーザーの平均出力電力は1.5W(780nm)であり、調節可能な波長範囲は700〜980 nmであった。実験中にフェムト秒レーザー波長が所望の測定波長に調節された。
実施例1で合成された化合物A1を使用して、濃度が4μMのA1−DMSO溶液4μLがそれぞれ添加されたHela細胞とHEK293細胞を、培地において、37度、CO2が5%存在する条件下で60分培養する。そして、PBSで5 min×3回振とう洗浄した後、更に細胞培地を加えて、二光子を用いた共焦点レーザー法によりイメージングを行う。代表的な領域を選択して、油浸レンズ(100×)で観察する。観察は三回繰り返される。イメージングにより、Hela細胞内で強い蛍光信号が得られるが、HEK293細胞内では蛍光信号が得られないことが分かった。図2(a)はプローブA1を加えた後のHela細胞の焦準を合わせて撮った写真であり、図2(b)はプローブA1を加えた後のHKE293細胞の焦準を合わせて撮った写真である。写真を撮った波長は500〜550nmであった。
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むNaOH溶液(pH11)を参照とし、実施例1で合成された化合物A1をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル(acetonitrile)、ジオキサン(dioxane)、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、N,N−ジメチルホルムアミド(N,N−dimethylformamide )、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面積の測定を行った。使用される溶液の濃度は全て1×10−4Mであり、以下の式で算出する。
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むNaOH溶液(pH11)を参照とし、実施例7で合成された化合物A3をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、N,N−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面積を測定する。使用される溶媒の濃度は全て1×10−4Mであり、式2.2により二光子を吸収する断面積の値を得た。使用した異なる溶媒において、異なる波長で二光子を吸収する有効断面積(Φδ)を測定した結果を図7に示す。二光子励起蛍光スペクトルの励起源はモード同期チタンサファイアレーザーである。レーザーパルス幅は70fsであり、重複周波数は80MHzであり、レーザーの平均出力電力は1.5W(780nm)であり、調節可能な波長範囲は700〜980 nmであった。実験中にフェムト秒レーザー波長が所望の測定波長に調節された。
ステップ(2)で得られた、20mmolの中間製品2と、25mmolのヘキサメチレンジアミンとを、20mlの2−メトキシエタノールが入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を125℃で5.5hし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、橙赤色の沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、橙赤色の固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって橙赤色の固体粉末の中間体3を得た。収率は72%であった。
1.1gの中間製品と、0.2gの炭酸カリウムとを20mlの溶媒に入れて、加熱還流した。数分後に大量の褐色結晶が現れた後、冷却ろ過して、水洗して炭酸カリウムおよび溶媒を除去した。更に、乾燥して純粋な中間製品2を得た。収率は93%より高かった。
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むNaOH溶液(pH11)を参照とし、実施例16で合成された化合物A6をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、N,N−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面積を測定した。使用される溶媒の濃度は全て1×10−4Mであった。式2.2により二光子を吸収する断面積の値が得られる。使用する異なる溶媒において、異なる波長で二光子を吸収する有効断面積(Φδ)を測定した結果を図13に示す。二光子励起蛍光スペクトルの励起源はモード同期チタンサファイアレーザーである。レーザーパルス幅は70fsであり、重複周波数は80MHzであり、レーザーの平均出力電力は1.5W(780nm)であり、調節可能な波長範囲は700〜980 nmであった。実験中にフェムト秒レーザー波長が所望の測定波長に調節された。
Claims (10)
- 一般式Iで示される構造を有する、ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。
R3は、− CH2−、− (CH2)2−、−(CH2)3−、−(CH2)4−、−(CH2)5−、−(CH2)6−、−(CH2)7−、または−(CH2)8−から選択され、
R4は、C1−6アルキル基 、HOCH2−、HO(CH2)2−、HO(CH2)3−、HO(CH2)4−、HO(CH2)5−、またはHO(CH2)6−から選択され、
R5は、−H、−CN、−COOH、−NH2、−NO2、−OH、または−SHから選択される。 - R1及びR2は、それぞれ−OCH3及びハロゲンから独立して選択される、
ことを特徴とする請求項1に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。 - R3は−(CH2)5−又は−(CH2)6−である、
ことを特徴とする請求項1に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。 - R4はC1−4アルキル基から選択される、
ことを特徴とする請求項1に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。 - R5 は−H、−CN、−COOH又は−NO2から選択される、
ことを特徴とする請求項1に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。 - 請求項1に記載するナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの製造方法であって、下記のステップ、つまり、
1)4−ブロモ−1,8−ナフタル酸無水物(4−bromo−1,8−naphthalic anhydride)と、R4−NH3とを1:1〜1:5のモル比で反応させて、化合物Vを製造するステップ、
2)4−ブロモ−1,8−ナフタル酸無水物と、式iの化合物とを1:1〜1:5のモル比で反応させて、化合物VIを製造するステップ、
3)4−ブロモアセナフテンキノン(4−bromoacenaphthenequinone)と、式iの化合物とを1:1〜1:5のモル比で反応させて、化合物VIIを製造するステップ、
4)アセナフテンキノンと、マロノニトリル(malononitrile)と、ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)とを1:1:5のモル比で反応させて、化合物VIIIを製造するステップ、
5)ステップ1)〜4)で製造された化合物V、VI、VII、VIIIをそれぞれNH2R3NH2と1:1〜1:2.5のモル比で反応させて、化合物IX、X、XI、XIIを製造するステップ、
6)化合物IX、X、XI、XIIと、式iiの化合物とを1:1〜1:3のモル比で反応させて、化合物Iを製造するステップ、
を含む二光子蛍光プローブの製造方法。 - 前記ステップ4)において、水と、ジメチルスルホキシド又はテトラヒドロフランとのモル比はそれぞれ1:1〜1:1.25である、
ことを特徴とする請求項6に記載の方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの生体試料の標識への利用。
- 前記生体試料は、腫瘍組織又は腫瘍細胞である、
ことを特徴とする請求項9に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの生体試料の標識への利用。
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