JP2014534241A - ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ、その製造方法及びその利用 - Google Patents

ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ、その製造方法及びその利用 Download PDF

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Abstract

本発明は一般式Ｉで示される構造（図１）を有するナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブを提供する。式Ｉにおいて、Ｘは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４から選択される。当該二光子蛍光染料は、非腫瘍細胞と組織内では蛍光バックグラウンドが低いが、腫瘍細胞と組織内では蛍光信号が強く、且つ腫瘍細胞と組織に対して特異的な高い標識性能を示す。該化合物は、ある程度の水溶性を有すると共に、細胞膜透過性が良好であり、更に有効な二光子を吸収する断面が大きい。本発明のこの種類の化合物は更に生体毒性、光毒性、光による漂白性が低く、そのスペクトル範囲と生体試料のスペクトル範囲とは、かなり大きく異なる。【選択図】なし

Description

本発明は、ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ、その製造方法及び腫瘍細胞又は組織を標識するものとして、該蛍光プローブを利用することに関するものである。
近年、腫瘍の発症率は急増しており、「爆発」的に増加する寸前の状態である。世界保健機関（ＷＨＯ）の国際がん研究機関が公開した「世界がん報告」では、近年のがん発症率の増加傾向によれば、２０２０年には全世界のがんの発症率は現在より５０％増加し、新たに発症するがん患者数は毎年１５００万人になると説明されている。そこで、簡単、迅速、有効、且つ高感度のがん標識技術の開発が、重要な任務になっている。Ｘ線による検出技術、超音波による検出技術、ＣＴによる検出技術、核磁気共鳴（ＭＲＩ）による検出技術、赤外線サーモグラフィによる検出技術、近赤外線スキャニングによる検出技術、ＰＥＴ−ＣＴによる検出技術などが従来の標識を用いるイメージング法として用いられている。しかしながら、上記方法は、イメージングの実行時に、イメージングの特異性に欠け、放射線による損害が大きく、腫瘍を個別に標識により診断できず、腫瘍に対して深度イメージングができない等の欠点がある。蛍光標識の光学分子イメージング法により、既存の問題を解決するのに優れた方法が提供される。現在、フェナントリジン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅ）系(ＥＢ、ＰＩ)、アクリジン（ａｃｒｉｄｉｎｅ）系（ＡＯ）、イミダゾール（ｉｍｉｎａｚｏｌｅ）系（Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＤＡＰＩ）とシアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）族染料系（Ｃｙ、ＴＯＴＯ、ＳＹＴＯ）等の商品化された蛍光染料は、ゲノミクス技術、核酸の定量検出、血液細胞分析等の分野で大きな役割を果たしている。しかしながら、腫瘍細胞及び組織を標識するための蛍光染料は、プローブと比べてまだ少なく、標識性能も低い。
二光子技術の進展に伴って、二光子励起蛍光顕微鏡がライフサイエンスに関する研究でもっとも重要なイメージング手段になっている。従来の一光子励起型の共焦点蛍光顕微鏡に比べて、二光子励起蛍光顕微鏡は、近赤外線による励起、暗視野イメージング、蛍光漂白と光毒性の回避、固定されたターゲットの励起、横方向分解能及び縦方向分解能の高さ、生体組織の光吸収係数の低下及び組織からの自発蛍光の干渉の減少等（Ｈｅｌｍｃｈｅｎ Ｆ, Ｓｖｏｂｏｄａ Ｋ, Ｄｅｎｋ Ｗ ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ，１９９９, ２：９８９−９９６. Ｍａｉｔｉ Ｓ, Ｓｈｅａｒ Ｊ Ｂ, Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｒ Ｍ ｅｔ ａｌ. Ｓｃｉｅｎｃｅ, １９９７, ２７５：５３０. Ｖｅｎｔｅｌｏｎ Ｌ,Ｃｈａｒｉｅｒ Ｓ, Ｍｏｒｅａｕｘ Ｌ ｅｔ ａｌ. Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ, ２００１, ４０： ２０９８. ）の面で極めて優れている。そのため、二光子励起顕微鏡によるイメージング技術により、生体イメージングにおいて新たな議論の場が提供される。しかしながら、腫瘍の標識イメージング、生体内での腫瘍の分布のイメージング及び腫瘍の深度イメージング等に対応する特異的な蛍光プローブはまだ少なく、腫瘍標識用の特異性に優れた二光子蛍光プローブの開発は、二光子腫瘍イメージングを実現する要となっている。
本発明は、ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブを提供する。前記蛍光プローブは下記の一般式Ｉで示される構造（図１を参照）を有する。
Figure 2014534241
ここで、Ｘは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４から選択され、点線で示される結合によって一般式Ｉと結合され、
Figure 2014534241
 Ｒ１及び Ｒ２は、それぞれ−ＯＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、またはハロゲンから独立して選択され、
Ｒ３は、− ＣＨ２−、− （ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）７−、または−（ＣＨ２）８−から選択され、
Ｒ４は、Ｃ１−６アルキル基 、ＨＯＣＨ２−、ＨＯ（ＣＨ２）２−、ＨＯ（ＣＨ２）３−、ＨＯ（ＣＨ２）４−、ＨＯ（ＣＨ２）５−、またはＨＯ（ＣＨ２）６−から選択され、
Ｒ５は、−Ｈ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、または−ＳＨから選択される。
一方、本発明は、さらに以下のステップを含む前記ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの製造方法を提供する。
１）４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物（４−ｂｒｏｍｏ−１,８−ｎａｐｈｔｈａｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）と、Ｒ４−ＮＨ３と、を１：１〜１：５のモル比で反応させて、化合物Ｖを製造するステップ。
Figure 2014534241
ここで、反応温度は７０〜１５０℃、反応時間は１〜１２時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。
２）４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、式ｉの化合物と、を１：１〜１：５のモル比で反応させて、化合物ＶＩを製造するステップ。
Figure 2014534241
ここで、反応温度は７０〜１５０℃、反応時間は１〜１２時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。
３）４−ブロモアセナフテンキノン（４−ｂｒｏｍｏａｃｅｎａｐｈｔｅｎｅｑｕｉｎｏｎｅ）と、式ｉの化合物と、を１：１〜１：５のモル比で反応させて、化合物ＶＩＩを製造するステップ。
Figure 2014534241
ここで、反応温度は７０〜１５０℃、反応時間は１〜１２時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。
４）アセナフテンキノンと、マロノニトリル（ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）と、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）と、を１：１：５のモル比で反応させて、化合物ＶＩＩＩを製造するステップ。
Figure 2014534241
まず室温で０．５時間反応させてから、反応温度を徐々に７０〜１８０℃まで上昇させ、この温度を保ちながら４〜１２時間反応させる。反応溶媒はジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、又はそれらと水からなる混合物から選択される。
５）ステップ１）〜４）で製造された化合物Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩをそれぞれＮＨ２Ｒ３ＮＨ２と１：１〜１：２．５のモル比で反応させて、化合物ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩを製造するステップ。
Figure 2014534241
ここで、反応温度は１００〜１７５℃、反応時間は１〜７時間、反応溶媒はエタノール、２−メトキシエタノール（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ）、またはそれらの混合物である。
６）化合物ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩと、式ｉｉの化合物と、を１：１〜１：３のモル比で反応させて、化合物Ｉを製造するステップ。
Figure 2014534241
ここで、反応温度は０〜１００℃，反応時間は１２〜４８時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、またはそれらの混合物であり、反応は有機塩基の存在する条件下で行われ、４−ジメチルアミノピリジン（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）を触媒とする。
本発明のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの製造方法に対する上記記載において、各置換基の定義、即ちＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の定義は上記化合物に対する定義と同じである。
一方、本発明は、さらに上記ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの生体試料の標識、特に腫瘍細胞及び組織標識への利用を提供する。
本発明により、従来の腫瘍標識用の蛍光プローブの機能上の欠点を改善し、二光子励起され、生がん細胞と発がん組織を有効且つ特異的に標識するのに適用できる二光子蛍光プローブが設計され、合成された。このような種類の二光子蛍光染料は、非腫瘍細胞と組織内では蛍光バックグラウンドが低いが、腫瘍細胞と組織内では蛍光信号が高く、且つ腫瘍細胞と組織に対して特異的な高い標識性能を有する。この種の化合物は、ある程度の水溶性を有すると共に、細胞膜透過性が良好であり、更に有効な二光子を吸収する断面が大きい。本発明のこの種の化合物は、更に生体毒性、光毒性、光による漂白性が低く、そのスペクトル範囲と生体サンプルのスペクトル範囲とは、かなり大きく異なる。
本発明のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブを示す一般式Ｉである。 二光子共焦点イメージングによる、実施例２に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ１の腫瘍細胞および非腫瘍細胞の写真である。濃度が４μＭであるＡ１−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたＨｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３細胞を、３７度、ＣＯ２が５％存在する条件下で６０分培養した後、代表的な領域を選択して、油浸レンズ（１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。写真を撮像した波長は５００〜５５０ｎｍである。図２（ａ）はＨｅｌａ細胞であり、図２（ｂ）はＨＥＫ２９３細胞である。 実施例３に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ１の異なる溶媒での二光子を吸収する断面の測定結果を示す。測定溶媒はジメチルスルホキシドである。測定方法は以下の通りである：フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用いる。フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とする。使用するA１を含む溶液の濃度は全て１×１０−４Ｍである。レーザーパルス幅（ｌａｓｅｒ ｐｕｌｓｅ ｗｉｄｔｈ）は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）である。調節可能な波長範囲は７００〜９８０ｎｍである。実験中にフェムト秒レーザーの波長が所望の測定波長に調節される。 二光子共焦点イメージングによる、実施例５に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ２の腫瘍細胞および非腫瘍細胞の写真である。濃度が４μＭであるＡ２−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたＨｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３細胞を、３７℃、ＣＯ２が５％存在する条件下で６０分培養した後、代表的な領域を選択して、油浸レンズ（１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。写真を撮像した波長は５００〜５５０ｎｍである。図４（ａ）はＨｅｌａ細胞であり、図４（ｂ）はＨＥＫ２９３細胞である。 実施例６に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ２を水溶液に溶かしたときの結果を示す。濃度が異なる化合物Ａ２の水溶液を用いて、最大吸収波長での吸光度を測定する。測定は三回繰り返される。 実施例８に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ３の溶媒効果の結果を示す。化合物Ａ３をジメチルスルホキシドとテトラヒドロフランにそれぞれ添加し、異なる溶媒での紫外吸収スペクトル（ａ）と蛍光発光スペクトル（ｂ）を測定する。 実施例９に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ３の異なる溶媒での二光子を吸収する断面の結果を示す。測定溶媒はジメチルスルホキシドとテトラヒドロフランである。測定方法は以下の通りである：フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用いる。フルオレセインを含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とする。使用するＡ３を含む溶液の濃度は全て１×１０−４Ｍである。レーザーパルス幅は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）である。調節可能な波長範囲は７００〜９８０ ｎｍである。実験中にフェムト秒レーザーの波長が所望の測定波長に調節される。 実施例１１に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ４のマウスの肺部の腫瘍組織とマウスの肺部の非腫瘍組織での二光子共焦点イメージングによる写真を示す。濃度が１０μＭであるＡ４−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたマウスの肺部の腫瘍組織の切片およびマウスの肺部の非腫瘍組織の切片から代表的な領域を選択して、油浸レンズ（１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。図８（ａ１）と（ａ２）はプローブＡ４が加えられた後のマウスの肺部の腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真であり、図８（ｂ１）と図８（ｂ２）はプローブＡ４が加えられた後のマウスの肺部の非腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真である。ここで、図８（ａ１）と図８（ｂ１）で適用した波長は５００〜５５０ｎｍであり、図８（ａ２）と図８（ｂ２）で適用した波長は５７０〜６５０ｎｍである。 実施例１２に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ４を水溶液に溶かしたときの結果を示す。濃度が異なる化合物Ａ４の水溶液を使用して、最大吸収波長での吸光度を測定する。当該試験は三回繰り返される。 実施例１４に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ５の腫瘍細胞および非腫瘍細胞の二光子共焦点結像による写真を示す。濃度が４μＭであるＡ５−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたＨｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３細胞を、３７℃、ＣＯ２が５％存在する条件下で６０分培養した後、代表的な領域を選択して、油浸レンズ（１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。図１０（ａ１）および図１０（ａ２）はＨｅｌａ細胞であり、図１０（ｂ１）および図１０（ｂ２）はＨＥＫ２９３細胞である。ここで、図１０（ａ１）および図１０（ｂ１）で適用した波長は５００〜５５０ｎｍであり、図１０（ａ２）および図１０（ｂ２）で適用した波長は５７０〜６５０ｎｍである。 実施例１５に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ５のマウスの肺部の腫瘍組織とマウスの肺部の非腫瘍組織の二光子共焦点イメージングによる写真を示す。濃度が１０μＭであるＡ５−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたマウスの肺部の腫瘍組織の切片とマウスの肺部の非腫瘍組織の切片から代表的な領域を選択して、油浸レンズ（１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。図１１（ａ１）および図１１（ａ２）は、マウスの肺部の腫瘍組織であり、図１１（ｂ１）および図１１（ｂ２）は、マウスの肺部の非腫瘍組織である。ここで、図１１（ａ１）および図１１（ｂ１）で適用した波長は５００〜５５０ｎｍであり、図１１（ａ２）および図１１（ｂ２）で適用した波長は５７０〜６５０ｎｍである。 実施例１７に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ６の溶媒効果の結果を示す。測定溶媒はジメチルスルホキシドである。異なる溶媒での紫外吸収スペクトルと蛍光発光スペクトルを測定する。 実施例１８に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ６の異なる溶媒での二光子を吸収する断面の測定結果を示す。測定溶媒はジメチルスルホキシドとテトラヒドロフランである。測定方法は以下の通りである：フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用いる。フルオレセインを含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とする。使用するＡ１を含む溶液の濃度は全て１×１０−４Ｍである。レーザーパルス幅は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）である。調節可能な波長範囲は７００〜９８０ｎｍである。実験中にフェムト秒レーザーの波長が所望の測定波長に調節される。
本発明には、１３枚の図面が含まれる。
別途に説明する場合を除き、本明細書で使用されている用語の定義は下記の通りである。
本明細書で使用されている「アルキル基」は、直鎖アルキル基と分枝鎖アルキル基とを含む。単体のアルキル基、例えば「プロピル (ｐｒｏｐｙｌ) 」と言う場合には、直鎖アルキル基だけを指す。単体の分枝鎖アルキル基、例えば「イソプロピル（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）」と言う場合には、分枝鎖アルキル基だけを指す。例えば、「Ｃ１−６アルキル基」には、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−３アルキル基、メチル基、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルとターシャリーブチル（ｔｅｒｔｉａｒｙ−ｂｕｔｙｌ）基が含まれる。このような規則は、本明細書で使用された他のラジカルにも適用される。
本明細書で使用されている「ハロゲン」には、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が含まれる。
本発明の一般式の化合物において、上記Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に−ＯＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、またはハロゲンから選択される。好ましい態様では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に−ＯＣＨ３ またはハロゲンから選択される。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に−ＯＣＨ３または−Ｃｌである。最適には、Ｒ１は−ＯＣＨ３であり、Ｒ２は全て−Ｃｌである。
好ましくは、上記Ｒ３は−（ＣＨ２）３〜７−であり、最適には、Ｒ３は−（ＣＨ２）５−、または−（ＣＨ２）６−である。
上記Ｒ４は、Ｃ１−６ アルキル基、ＨＯＣＨ２−、ＨＯ（ＣＨ２）２−、ＨＯ（ＣＨ２）３−、ＨＯ（ＣＨ２）４−、ＨＯ（ＣＨ２）５−、またはＨＯ（ＣＨ２）６−から選択される。好ましい態様では、Ｒ４はＣ１−６アルキル基である。最適には、Ｒ４はＣ１−４アルキル基である。
上記Ｒ５は−Ｈ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、または−ＳＨから選択される。好ましくは、−Ｈ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、または−ＮＯ２である。より好ましくは、−Ｈ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、または−ＮＯ２である。最適には、−Ｈ、または−ＮＯ２である。
一方、本発明は、さらに以下のステップを含む前記ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの製造方法を提供する。
１）４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物（４−ｂｒｏｍｏ−１,８−ｎａｐｈｔｈａｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）と、Ｒ４−ＮＨ３とを１：１〜１：５のモル比で反応させて、化合物Ｖを製造するステップ。
Figure 2014534241
ここで、反応温度は７０〜１５０℃、反応時間は１〜１２時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。
好ましい実施形態では、反応温度は８０〜１４０℃、反応時間は２〜１０時間、反応溶媒はエタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、Ｒ４−ＮＨ３とのモル比は１：１〜１：４である。
より好ましい実施形態では、反応温度は９０〜１２０℃、反応時間は３〜１０時間、反応溶媒は酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、Ｒ４−ＮＨ３とのモル比は１：１〜１：３である。
最適な実施形態では、反応温度は９５〜１１０℃、反応時間は４〜８時間、反応溶媒は酢酸である。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、Ｒ４−ＮＨ３とのモル比は１：１〜１：２である。
２）４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、式ｉの化合物とを１：１〜１：５のモル比で反応させて、化合物ＶＩを製造するステップ。
Figure 2014534241
ここで、反応温度は７０〜１５０℃、反応時間は１〜１２時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。
好ましい実施形態では、反応温度は８０〜１４０℃、反応時間は２〜１０時間、反応溶媒はエタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、Ｒ４−ＮＨ３とのモル比は１：１〜１：４である。
より好ましい実施形態では、反応温度は９０〜１２０℃、反応時間は３〜１０時間、反応溶媒は酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、Ｒ４−ＮＨ３とのモル比は１：１〜１：３である。
最適な実施形態では、反応温度は９５〜１１０℃、反応時間は４〜８時間、反応溶媒は酢酸である。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、Ｒ４−ＮＨ３とのモル比は１：１〜１：２である。
３）４−ブロモアセナフテンキノン（４−ｂｒｏｍｏａｃｅｎａｐｈｔｅｎｅｑｕｉｎｏｎｅ）と、式ｉの化合物とを１：１〜１：５のモル比で反応させて、化合物ＶＩＩを製造するステップ。
Figure 2014534241
ここで、反応温度は７０〜１５０℃、反応時間は１〜１２時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。
好ましい実施形態では、反応温度は８０〜１４０℃、反応時間は２〜１０時間、反応溶媒はエタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、Ｒ４−ＮＨ３とのモル比は１：１〜１：４である。
より好ましい実施形態では、反応温度は９０〜１２０℃、反応時間は３〜１０時間、反応溶媒は酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、Ｒ４−ＮＨ３とのモル比は１：１〜１：３である。
最適な実施形態では、反応温度は９５〜１１０℃、反応時間は４〜８時間、反応溶媒は酢酸である。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、Ｒ４−ＮＨ３とのモル比は１：１〜１：２である。
４）アセナフテンキノンと、マロノニトリル（ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）と、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）とを１：１：５のモル比で反応させて、化合物ＶＩＩＩを製造するステップ。
Figure 2014534241
まず室温で０．５時間反応させた後、反応温度を徐々に７０〜１８０℃まで上昇させ、この温度を保ちながら４〜１２時間反応させる。反応溶媒は、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、又はそれらと水からなる混合物から選択される。
好ましい実施形態では、まず室温で０．５時間反応させた後、反応温度を徐々に８０〜１６０℃まで上昇させ、この温度を保ちながら４〜１０時間反応させる。反応溶媒は、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、又はそれらと水からなる混合物から選択される。
より好ましい実施形態では、まず室温で０．５時間反応させた後、反応温度を徐々に９０〜１４０℃まで上昇させ、この温度を保ちながら４〜８時間反応させる。反応溶媒は、ジメチルスルホキシド、又はそれと水からなる混合物から選択される。
最適な実施形態では、まず室温で０．５時間反応させた後、反応温度を徐々に１００〜１２０℃まで上昇させ、この温度を保ちながら４〜６時間反応させる。反応溶媒は、ジメチルスルホキシドである。
５）ステップ１）〜４）で製造された化合物Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩをそれぞれＮＨ２Ｒ３ＮＨ２と１：１〜１：２．５のモル比で反応させて、化合物ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩを製造するステップ。
Figure 2014534241
ここで、反応温度は１００〜１７５℃、反応時間は１〜７時間、反応溶媒は、エタノール、２−メトキシエタノール（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ）、またはそれらの混合物である。
好ましい実施形態では、反応温度は１００〜１６５℃、反応時間は１〜６時間、反応溶媒は、エタノール、２−メトキシエタノール、またはそれらの混合物であり、それぞれの化合物Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩと、ＮＨ２Ｒ３ＮＨ２とのモル比は１：１〜１：２．５である。
より好ましい実施形態では、反応温度は１００〜１５０℃、反応時間は１〜５時間、反応溶媒は、エタノール、２−メトキシエタノール、またはそれらの混合物であり、それぞれの化合物Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩと、ＮＨ２Ｒ３ＮＨ２とのモル比は１：１〜１：２である。
最適な実施形態では、反応温度は１００〜１３０℃、反応時間は１〜４時間、反応溶媒は２−メトキシエタノールであり、それぞれの化合物Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩと、ＮＨ２Ｒ３ＮＨ２とのモル比は１：１〜１：１．５である。
６）化合物ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩと、式ｉｉの化合物とを１：１〜１：３のモル比で反応させて、化合物Ｉを製造するステップ。
Figure 2014534241
ここで、反応温度は０〜１００℃，反応時間は１２〜４８時間、反応溶媒は、ジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、またはそれらの混合物である。反応は有機塩基の存在する条件下で行われ、４−ジメチルアミノピリジン（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）を触媒とする。
好ましい実施形態では、反応温度は１０〜８０℃、反応時間は１２〜３２時間、反応溶媒は、ジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、またはそれらの混合物である。反応は有機塩基の存在する条件下で行われ、４−ジメチルアミノピリジンを触媒とし、化合物ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩと、式ｉｉの化合物とのモル比は１：１〜１：３である。
より好ましい実施形態では、反応温度は２０〜７０℃、反応時間は１２〜２４時間、反応溶媒は、ジクロロメタン、酢酸エチル、またはそれらの混合物である。反応は有機塩基の存在する条件下で行われ、４−ジメチルアミノピリジンを触媒とし、化合物ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩと、式ｉｉの化合物とのモル比は１：１〜１：２．５である。
最適な実施形態では、反応温度は２５〜４０℃、反応時間は１２〜２４時間、反応溶媒はジクロロメタンである。反応は有機塩基の存在する条件下で行われ、４−ジメチルアミノピリジンを触媒とし、化合物ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩと、式ｉｉの化合物とのモル比は１：１〜１：１．５である。
上記本発明のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの製造方法に記載の各置換基（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５）の定義及び好ましい態様は、本発明の記載における化合物に対する定義、およびその好ましい態様と同じである。
本発明の上記方法で合成された二光子蛍光プローブ化合物に対して、核磁気共鳴スペクトルまたはマススペクトルを利用して、その構造を確認し、且つ補助的に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、融点試験によりその構造を確認する。
本発明に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブは下記の利点を有する。
上記化合物に特有の標的点が導入されることによって、腫瘍細胞と組織に対する標識の特異性、特殊性が高められた。
上記化合物は二光子を吸収する機能に優れるので、生体試料のイメージングに利用する際に、光による生体の漂白性、光損傷、生体への毒性が低く、且つ生成される蛍光信号は生体組織の深くまで透過できる。
上記化合物の一部の分子は、６００ｎｍより大きい蛍光発光波長を有し、動物の生体イメージングに利用できる。
上記化合物においてニトロ（ｎｉｔｒｏ）基を有する分子は、比例型プローブとして、腫瘍細胞および組織の標識に利用でき、定量的な標識を良好に実現でき、更に外部環境にある要素が、蛍光強度に及ぼす影響を防止できる。
上記化合物は毒性が低く、原料が入手しやすく、構造が簡単であり、製造しやすく、産業化しやすい。
上記に鑑みて、本発明に記載の二光子蛍光プローブ化合物は、腫瘍細胞および組織の標識に適用できる。本明細書に記載の形で腫瘍細胞および組織の染色に直接使用されるだけでなく、本発明に記載の二光子蛍光プローブ化合物を含む組成物も腫瘍細胞および組織の染色に使用できる。前記組成物は、本発明で提供される二光子蛍光プローブ化合物のうちの一つを有効量含むべきである。また、例えば、溶媒、ｐＨ調整剤等のような、生体試料の染色に必要な他の成分を含んでもよい。これらの成分はすべて当該技術分野で公知のものである。上記組成物は、水溶液で存在してもよく、又は使用直前に水で溶液を調合する等、他の適切な形で存在してもよい。
本発明は、更に上記本発明の二光子蛍光プローブ化合物により腫瘍細胞および組織の生体試料を標識する方法を提供する。該当方法は、前記化合物を生体試料に接触させるステップを含む。本明細書で使用される「接触」は溶液または固相中での接触を指してもよい。
下記の非限定的な実施例は、当業者に本発明の全体を理解させるものであって、本発明を限定するものではない。
（実施例１：プローブ化合物Ａ１の製造）
Figure 2014534241
（１）中間体１の合成
２０ｍｍｏｌの４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、２５ｍｍｏｌのメチルアミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）とを、１０ｍｌの酢酸溶液が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を１００℃で２ｈし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、白い固体粉末の粗生成物である中間製品１を得た。収率は９６％であった。
（２）中間体２の合成
ステップ（１）で得られた、２０ｍｍｏｌの粗生成物１と、３０ｍｍｏｌのヘキサメチレンジアミン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）とを、２０ｍｌの２−メトキシエタノール（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ）が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を１２５℃で５ｈし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって黄色い固体粉末の中間体２を得た。収率は５５％であった。
（３）プローブ化合物Ａ１の合成
２０ｍｍｏｌの黄色い固体粉末の中間体２と、２５ｍｍｏｌのインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔａｃｉｎ）と、２５ｍｍｏｌの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（１−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＥＤＣ ）と、少量の４−メチルピリジン（４−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）とを、無水ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）溶液に入れ、室温下で撹拌しながら２４時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーによって山吹色の生成品を得た。収率は８４％であった。
図１は化合物Ａ１の核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）である。ここで、１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、 ＤＭＳＯ） δ ８．６９ （ｄ、Ｊ ＝８．３ Ｈｚ、１Ｈ）、８．４３ （ｄ、Ｊ＝７．２ Ｈｚ、１Ｈ）、８．２５ （ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、 ８．０３ （ｓ、１Ｈ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６４（ｄｔ、Ｊ＝２０．８、６．４Ｈｚ、５Ｈ）、７．１２（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、 ６．７２（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．６８（ｄｄ、Ｊ＝９．０、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２（ｓ、１Ｈ）、３．７４（ｓ、３Ｈ）、３．４８（ｓ、２Ｈ）、３．３７―３．１２（ｍ、１６Ｈ）、３．０８（ｄ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．５１（ｄ、Ｊ＝１．６ Ｈｚ、６Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、１．７１―１．５７（ｍ、３Ｈ）、１．３７（ｄｄｄ、Ｊ＝２４．７、１４．６、６．８Ｈｚ、８Ｈ）、１．２３（ｓ、１Ｈ）である。
（実施例２：プローブ化合物Ａ１で腫瘍細胞および非腫瘍細胞を標識する試験）
実施例１で合成された化合物Ａ１を使用して、濃度が４μＭのＡ１−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたＨｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３細胞を、培地において、３７度、ＣＯ２が５％存在する条件下で６０分培養する。そして、ＰＢＳで５ ｍｉｎ×３回振とう洗浄した後、更に細胞培地を加えて、二光子を用いた共焦点レーザー法によりイメージングを行う。代表的な領域を選択して、油浸レンズ(１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。イメージングにより、Ｈｅｌａ細胞内で強い蛍光信号が得られるが、ＨＥＫ２９３細胞内では蛍光信号が得られないことが分かった。図２（ａ）はプローブＡ１を加えた後のＨｅｌａ細胞の焦準を合わせて撮った写真であり、図２（ｂ）はプローブＡ１を加えた後のＨｅｌａ細胞の焦準を合わせて撮った写真である。写真を撮った波長は５００〜５５０ｎｍであった。
（実施例３：プローブＡ１の二光子を吸収する有効断面の測定試験）
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とし、実施例１で合成された化合物Ａ１をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ,Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ ）、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面の測定を行った。使用される溶液の濃度は全て１×１０−４Ｍであり、以下の式で算出する。
Figure 2014534241
式中、Ｃは溶液の濃度、ｎは溶媒の屈折率を示し、表を調べることによって得られる。Ｆは転換された蛍光強度を示し、実験によって得られる。δは二光子を吸収する断面である。参照溶液の物理量は全て下付き文字ｒで示す。
異なる溶媒において、異なる波長で測定した二光子を吸収する有効な断面（Φδ）の結果を図３に示す。二光子励起蛍光スペクトルの励起源はモード同期チタンサファイアレーザーである。レーザーパルス幅は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）であり、調節可能な波長範囲は７００〜９８０ ｎｍであった。実験中に、フェムト秒レーザー波長は、所望の測定波長に調節された。
（実施例４：プローブ化合物Ａ２の製造）
Figure 2014534241
（１）中間体１の合成
２０ｍｍｏｌの４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、２５ｍｍｏｌのo-フェニレンジアミン（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）とを、１０ｍｌの酢酸溶液が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を９５℃で４ｈし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物である中間製品１を得た。収率は９０％であった。
（２）中間体２の合成
ステップ（１）で得られた、２０ｍｍｏｌの粗生成物１と、２５ｍｍｏｌのヘキサメチレンジアミンとを、２０ｍｌの２−メトキシエタノールが入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を１２５℃で５ｈし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって黄色い固体粉末の中間体２を得た。収率は６３％であった。
（３）プローブＡ２の合成
２０ｍｍｏｌの黄色い固体粉末の中間体２と、２５ｍｍｏｌのインドメタシンと、２５ｍｍｏｌの１−（３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）と、少量の４−メチルピリジンとを、無水ジクロロメタン溶液に入れ、室温下で撹拌しながら２４時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーによってインディアンイエロー色の生成品Ａ２を得た。収率は８４％であった。ここで、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ） δ８．９９（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、８．６９（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．４３（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．２５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．１９（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、８．０３（ｓ、１Ｈ）、７．８５（ｄ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、２Ｈ）、 ７．６４（ｄｔ、Ｊ＝２０．８、６．４Ｈｚ、５Ｈ）、７．１２（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．７２（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、 ６．６８（ｄｄ、Ｊ＝９．０、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２（ｓ、１Ｈ）、３．４８（ｓ、２Ｈ）、３．３７―３．１２（ｍ、１６Ｈ）、３．０８（ｄ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．５１（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、６Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、１．７１―１．５７（ｍ、３Ｈ）、１．３７（ｄｄｄ、Ｊ＝２４．７、１４．６、６．８Ｈｚ、８Ｈ）、１．２３（ｓ、１Ｈ）であった。
（実施例５：プローブ化合物Ａ２で腫瘍細胞および非腫瘍細胞を標識する試験）
マウスの肺部の腫瘍組織の切片およびマウスの肺部の非腫瘍組織の切片を、上記実施例４で合成された化合物Ａ２を含む１０μＭのＰＢＳ溶液に浸す。３０分後に取り出し、マウンテング及びシーリングしてから、二光子を用いた共焦点レーザー法により蛍光写真を撮った。二光子を用いた共焦点レーザー法によるイメージングにより、マウスの肺部の腫瘍組織の切片では強い蛍光信号が得られたが、マウスの肺部の非腫瘍組織の切片では蛍光信号が得られないことが分かった。図４（ａ）はプローブＡ２を添加した後のマウスの肺部の腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真であり、図４（ｂ）はプローブＡ２を添加した後のマウスの肺部の非腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真である。写真を撮った波長は５００〜５５０ｎｍであった。
（実施例６：プローブ化合物Ａ２の水溶性測定試験）
上記実施例４で合成された化合物Ａ２を水に入れて、異なる濃度でＡ２を含む水溶液の、最大吸収波長での吸光度を測定した。測定結果により、化合物Ａ２の濃度が５μＭである場合、吸光度に変化が見られないことが分かった。即ち、化合物Ａ２の水に対する溶解度は５μＭであった。図５は、異なる濃度のプローブＡ２の最大吸収波長での吸光度を示す。使用される測定機器は、それぞれＡｇｉｌｅｎｔ ８４５３紫外分光光度計である。
（実施例７：プローブ化合物Ａ３の製造）
Figure 2014534241
（１）中間体１の合成
２０ｍｍｏｌの４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、２５ｍｍｏｌの４−ニトロ−ο−フェニレンジアミン（４−Ｎｉｔｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）とを、１０ｍｌの酢酸溶液が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を１０５℃で３ｈし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物である中間製品１を得た。収率は８７％であった。
（２）中間体２の合成
ステップ（１）で得られた、２０ｍｍｏｌの粗生成物１と、２５ｍｍｏｌのヘキサメチレンジアミンとを、２０ｍｌの２−メトキシエタノールが入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を１２５℃で４ｈし続た後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、橙赤色の固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって橙赤色の固体粉末の中間体２を得た。収率は５４％であった。
（３）プローブＡ３の合成
２０ｍｍｏｌの橙赤色の固体粉末の中間体２と、２５ｍｍｏｌのインドメタシンと、２５ｍｍｏｌの１−（３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）と、少量の４−メチルピリジンとを、無水ジクロロメタン溶液に入れ、室温下で撹拌しながら２８時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除し去、カラムクロマトグラフィーによって橙赤色の生成品Ａ３を得た。収率は８４％であった。ここで、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ８．９９（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．６９（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．４３（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．２５（ｄ、Ｊ＝ ８．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．１９（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．０３（ｓ、１Ｈ）、７．８５（ｄ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６４（ｄｔ、Ｊ＝２０．８、６．４Ｈｚ、５Ｈ）、７．１２（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．７２（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．６８（ｄｄ、Ｊ＝９．０、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２（ｓ、１Ｈ）、３．４８（ｓ、２Ｈ）、３．３７−３．１２（ｍ、１６Ｈ）、３．０８（ｄ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．５１（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、６Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、１．７１−１．５７（ｍ、３Ｈ）、１．３７（ｄｄｄ、Ｊ＝２４．７、１４．６、６．８Ｈｚ、８Ｈ）、１．２３（ｓ、１Ｈ）であった。
（実施例８：プローブ化合物Ａ３の溶媒効果の測定試験）
上記実施例７で合成された化合物Ａ３をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、異なる溶媒での紫外吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルを測定した。測定結果により、溶媒の極性の変化に伴って、紫外吸収スペクトルでの最大吸収波長も変化し、蛍光発光スペクトルでも最大吸収波長が変化することが分かった。図６（ａ）は異なる溶媒でのプローブＡ３の紫外吸収スペクトルであり、図６（ｂ）は異なる溶媒でのプローブＡ３の蛍光発光スペクトルである。使用される測定機器は、それぞれＡｇｉｌｅｎｔ ８４５３紫外分光光度計、およびＡｇｉｌｅｎｔ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計である。
（実施例９：プローブ化合物Ａ３の二光子を吸収する有効断面の測定試験）
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とし、実施例７で合成された化合物Ａ３をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面を測定する。使用される溶媒の濃度は全て１×１０−４Ｍであり、式２．２により二光子を吸収する断面の値を得た。使用した異なる溶媒において、異なる波長で二光子を吸収する有効断面（Φδ）を測定した結果を図７に示す。二光子励起蛍光スペクトルの励起源はモード同期チタンサファイアレーザーである。レーザーパルス幅は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）であり、調節可能な波長範囲は７００〜９８０ ｎｍであった。実験中にフェムト秒レーザー波長が所望の測定波長に調節された。
（実施例１０：プローブ化合物Ａ４の製造）
Figure 2014534241
（１）中間体１の合成
３３ｍｍｏｌのアセナフテンキノン、および１８０ｍｍｏｌの液体臭素をシングルネック（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｅｃｋ）フラスコに入れて、撹拌しながら、６５℃までゆっくりと温度を上げた後、一定温度で３ｈ撹拌し続けた。反応を停止してから、少量のＨ２ＳＯ４を含む３００ｍｌの蒸留水を加えると、黄色い固体が析出し、水溶液がインディアンイエロー色になった。更に、液体が無色になるまで加熱沸騰させて臭素と臭化水素を除去した。ろ過して、ろ過液が中性になるまで複数回溶解した。乾燥してから粗生成物である中間体１を得た。粗収率は９０％であり、Ｍ.ｐ.は、２３６〜２３８℃であった。
（２）中間体２の合成
２０ｍｍｏｌの中間体１と、２５ｍｍｏｌのｏ−フェニレンジアミンとを１０ｍｌの酢酸を含む溶液が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を１０５℃で６ｈし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物である中間製品２を得た。収率は７９％であった。
（３）中間体３の合成
ステップ（２）で得られた、２０ｍｍｏｌの中間製品２と、２５ｍｍｏｌのヘキサメチレンジアミンとを、２０ｍｌの２−メトキシエタノールが入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を１２５℃で６ｈし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって黄色い固体粉末の中間体３を得た。収率は６６％であった。
（４）プローブＡ４の合成
２０ｍｍｏｌの黄色い固体粉末の中間体３と、３０ｍｍｏｌのインドメタシンと、２５ｍｍｏｌの１−（３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）と、少量の４−メチルピリジンとを、無水ジクロロメタン溶液に入れ、室温下で撹拌しながら２５時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーによって黄色い生成品Ａ４を得た。収率は７４％であった。ここで、１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ８．８６（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）８．６９（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．４３（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．２５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．１７（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、８．０３（ｓ、１Ｈ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６４（ｄｔ、Ｊ＝２０．８、６．４Ｈｚ、５Ｈ）、７．１２（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．７２（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．６８（ｄｄ、Ｊ＝９．０、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２（ｓ、１Ｈ）、３．４８（ｓ、２Ｈ）、３．３７−３．１２（ｍ、１６Ｈ）、３．０８（ｄ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．５１（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、６Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、１．７１−１．５７（ｍ、３Ｈ）、１．３７（ｄｄｄ、Ｊ＝２４．７、１４．６、６．８Ｈｚ、８Ｈ）、１．２３（ｓ、１Ｈ）であった。
（実施例１１：プローブＡ４の腫瘍組織および非腫瘍組織に対する標識試験）
マウスの肺部の腫瘍組織の切片およびマウスの肺部の非腫瘍組織の切片を、上記実施例１０で合成された化合物Ａ４を１０μＭ含むＰＢＳ溶液に浸した。３０分後に取り出し、マウンテング及びシーリングしてから、二光子を用いた共焦点レーザー法により蛍光写真を撮った。二光子を用いた共焦点レーザー法によるイメージングにより、マウスの肺部の腫瘍組織の切片では強い蛍光信号が得られたが、マウスの肺部の非腫瘍組織の切片では蛍光信号が得られないことが分かった。図８（ａ１）および（ａ２）はプローブＡ４を添加した後のマウスの肺部の腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真であり、図８（ｂ１）および（ｂ２）は、プローブＡ４を添加した後のマウスの肺部の非腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真である。ここで、図８（ａ１）および図８（ｂ１）の撮像波長は５００〜５５０ｎｍであり、図８（ａ２）および図８（ｂ２）の撮像波長は５７０〜６５０ｎｍである。
（実施例１２：プローブ４の水溶性測定試験）
上記合成された化合物Ａ４を水に入れて、異なる濃度のＡ４の最大吸収波長での吸光度を測定した。測定結果により、化合物Ａ１の濃度が２４μＭである場合、吸光度の変化がないことが分かった。即ち、化合物Ａ４の水に対する溶解度は２４μＭであった。図９は異なる濃度のプローブＡ４の最大吸収波長での吸光度である。使用される測定機器はそれぞれＡｇｉｌｅｎｔ ８４５３紫外分光光度計である。
（実施例１３：プローブ化合物Ａ５の合成）
Figure 2014534241
（１）中間体１の合成
３３ｍｍｏｌのアセナフテンキノン、および１８０ｍｍｏｌの液体臭素をシングルネックフラスコに入れて、撹拌しながら、６５℃までゆっくりと温度を上げた後、一定温度で３ｈ撹拌し続けた。反応を停止した後、少量のＨ２ＳＯ４を含む３００ｍｌの蒸留水を加えると、黄色い固体が析出し、水溶液がインディアンイエロー色になった。更に、液体が無色になるまで加熱沸騰させて臭素と臭化水素を除去した。ろ過して、ろ過液が中性になるまで複数回溶解させた。乾燥した後、粗生成物である中間体１を得た。粗収率は９０％であり、Ｍ.ｐ.は２３６〜２３８℃であった。
（２）中間体２の合成
２０ｍｍｏｌの中間体１と、３０ｍｍｏｌのＯ−フェニレンジアミンとを１０ｍｌの酢酸を含む溶液が入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を１００℃で５ｈし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、赤い固体粉末の粗生成物である中間製品２を得た。収率は８３％であった。
（３）中間体３の合成
ステップ（２）で得られた、２０ｍｍｏｌの中間製品２と、２５ｍｍｏｌのヘキサメチレンジアミンとを、２０ｍｌの２−メトキシエタノールが入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を１２５℃で５．５ｈし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、橙赤色の沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、黄色い固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって橙赤色の固体粉末の中間体３を得た。収率は７２％であった。
（４）プローブＡ５の合成
２０ｍｍｏｌの橙赤色の固体粉末の中間体３と、３０ｍｍｏｌのインドメタシンと、２５ｍｍｏｌの１−（３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）と、少量の４−メチルピリジンとを、無水ジクロロメタン溶液に入れ、室温下で撹拌しながら２５時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーによって黄色い生成品Ａ４を得た。収率は７４％であった。ここで、１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ８．８６（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、１Ｈ）８．６９（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．４３（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．２５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．２３（ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．１８（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．０３（ｓ、１Ｈ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、１６２Ｈ）、７．６４（ｄｔ、Ｊ＝２０．８、６．４Ｈｚ、５Ｈ）、７．１２（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、 ６．９１（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．７２（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．６８（ｄｄ、Ｊ＝９．０、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２（ｓ、１Ｈ）、３．４８（ｓ、２Ｈ）、３．３７−３．１２（ｍ、１６Ｈ）、３．０８（ｄ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．５１（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、６Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、１．７１−１．５７（ｍ、３Ｈ）、１．３７（ｄｄｄ、Ｊ＝２４．７、４．６、６．８Ｈｚ、８Ｈ）、１．２３（ｓ、１Ｈ）であった。
（実施例１４：プローブＡ５の腫瘍細胞および非腫瘍細胞に対する標識試験Ｉ）
実施例１３で合成された化合物Ａ５を使用して、濃度が４μＭのＡ５−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたＨｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３細胞を、培地において、３７度、ＣＯ２が５％存在する条件下で６０分培養した。そして、ＰＢＳで５ ｍｉｎ×３回振とう洗浄した後、更に細胞培地を加えて、二光子を用いた共焦点レーザー法によりイメージングを行った。代表的な領域を選択して、油浸レンズ(１００×）で観察した。観察は三回繰り返された。イメージングにより、Ｈｅｌａ細胞内では強い蛍光信号が得られるが、ＨＥＫ２９３細胞内では蛍光信号が得られないことが分かった。図１０（ａ１）および図１０（ａ２）はＨｅｌａ細胞であり、図１０（ｂ１）および図１０（ｂ２）はＨＥＫ２９３細胞である。ここで、図１０（ａ１）および図１０（ｂ１）の撮像波長は５００〜５５０ｎｍであり、図１０（ａ２）および図１０（ｂ２）の撮像波長は５７０〜６５０ｎｍであった。
（実施例１５：プローブＡ５の腫瘍組織および非腫瘍組織に対する標識試験ＩＩ）
マウスの肺部の腫瘍組織の切片およびマウスの肺部の非腫瘍組織の切片を上記実施例１３で合成された化合物Ａ５を含むＰＢＳ溶液（濃度は１０μＭである）に浸した。３０分後に取り出し、マウンテング及びシーリングしてから、二光子を用いた共焦点レーザー法により蛍光写真を撮った。二光子を用いた共焦点レーザーによるイメージングにより、マウスの肺部の腫瘍組織の切片では強い蛍光信号が得られるが、マウスの肺部の非腫瘍組織の切片では蛍光信号が得られないことが分かった。図１１（ａ１）および図１１（ａ２）はマウスの肺部の腫瘍組織であり、図１１（ｂ１）および図１１（ｂ２）はマウスの肺部の非腫瘍組織である。ここで、図１１（ａ１）および図１１（ｂ１）の撮像波長は５００〜５５０ｎｍであり、図１１（ａ２）および図１１（ｂ２）の撮像波長は５７０〜６５０ｎｍである。
（実施例１６：プローブ化合物Ａ６の合成）
Figure 2014534241
（１）中間体１の合成
０．５ｇのアセナフトキノンおよびと０．２ｇのマロノニトリル（Ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させて、寸胴のシリカゲルカラム（直径は５０ｍｍであり、シリカゲルの充填高さは約１００ｍｍである）に直接加え、ジクロロメタンで素早く連続的にカラム洗浄して、Ｒｆ＝０．８の橙色バンドを収集して、ジクロロメタンを蒸発させて、橙赤色の固体の中間製品１を得た。収率は９７％より高かった。
（２）中間体２の合成
１．１ｇの中間製品と、０．２ｇの炭酸カリウムとを２０ｍｌに入れて、加熱還流した。数分後に大量の褐色結晶が現れた後、冷却ろ過して、水洗して炭酸カリウムおよび溶媒を除去した。更に、乾燥して純粋な中間製品２を得た。収率は９３％より高かった。
（３）中間体３の合成
ステップ（２）で得られた、２０ｍｍｏｌの中間体２と、２５ｍｍｏｌのヘキサンジアミンとを２０ｍｌのアセトニトリル （ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）が入った丸底フラスコに入れて、常温で撹拌しながら１ｈ反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により溶媒を除去し、シリカゲルカラム・クロマトグラフィーによって分離を行い、Ｒｆ＝０．２５の赤色バンドを収集して、溶媒を除去し、純粋な中間製品３を得た。収率は７３％であった。
（４）プローブＡ６の合成
２０ｍｍｏｌの赤色の固体粉末の中間体３と、３０ｍｍｏｌのインドメタシンと、２５ｍｍｏｌの１−（３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）と、少量の４−メチルピリジンとを、無水ジクロロメタン溶液に入れ、室温下で撹拌しながら２４時間反応させた後、反応を停止した。減圧蒸留により大部分の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーによって赤色の生成品Ａ６を得た。収率は６９％であった。ここで、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ８．９５（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．５８（ｄ、Ｊ＝ ７．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．９８（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６４（ｄｔ、Ｊ＝２０．８、６．４Ｈｚ、５Ｈ）、７．１２（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．０３（ｄ、Ｊ＝ ９．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．７２（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．６８（ｄｄ、Ｊ＝９．０、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２（ｓ、１Ｈ）、３．４８（ｓ、２Ｈ）、３．３７−３．１２（ｍ、１６Ｈ）、３．０８（ｄ、Ｊ＝ ６．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．５１（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、６Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、１．７１−１．５７（ｍ、３Ｈ）、１．３７（ｄｄｄ、Ｊ＝２４．７、１４．６、６．８Ｈｚ、８Ｈ）、１．２３（ｓ、１Ｈ）であった。
（実施例１７：プローブ化合物Ａ６の溶媒化効果の測定試験）
上記の実施例１６により合成された化合物Ａ６を、それぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、異なる溶媒での紫外吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルを測定した。測定結果により、溶媒の極性の変化に伴って、紫外吸収スペクトルでの最大吸収波長も変化し、蛍光発光スペクトルでも最大吸収波長が変化することが分かった。図１２（ａ）は異なる溶媒でのプローブＡ６の紫外吸収スペクトルであり、図１２（ｂ）は異なる溶媒でのプローブＡ６の蛍光発光スペクトルである。使用される測定機器はそれぞれＡｇｉｌｅｎｔ ８４５３紫外分光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計であった。
（実施例１８：プローブ化合物Ａ６の二光子を吸収する有効断面の測定試験）
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とし、実施例１６で合成された化合物Ａ６をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面を測定した。使用される溶媒の濃度は全て１×１０−４Ｍであった。式２．２により二光子を吸収する断面の値が得られる。使用する異なる溶媒において、異なる波長で二光子を吸収する有効断面（Φδ）を測定した結果を図１３に示す。二光子励起蛍光スペクトルの励起源はモード同期チタンサファイアレーザーである。レーザーパルス幅は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）であり、調節可能な波長範囲は７００〜９８０ ｎｍであった。実験中にフェムト秒レーザー波長が所望の測定波長に調節された。
上記内容は、好ましい具体的な実施形態を用いて、本発明を詳細に説明したものであるが、本発明の具体的な実施はこれらの説明に限定されない。本発明が属する技術分野の当業者にとって、本発明の要旨を逸脱しない前提で、いくつかの簡単な推論または置換を行うことも、すべて本発明の保護範囲に含まれるとみなされるべきである。蛍光染料として用いることは本発明の新規な化合物の用途の一つであるが、本発明の化合物は、蛍光染料だけに用いられるものとみなされるべきではなく、本発明が属する技術分野の当業者にとって、本発明における化合物が蛍光染料として用いられる場合と同じメカニズムに基づき、いくつかの簡単な推論を経て得られる本発明の化合物の他の用途も、すべて本発明の保護範囲に含まれる。
本発明により、従来の腫瘍標識用の蛍光プローブの機能上の欠点を改善し、二光子励起され、生がん細胞と発がん組織を有効且つ特異的に標識するのに適用できる二光子蛍光プローブが設計され、合成された。このような種類の二光子蛍光染料は、非腫瘍細胞と組織内では蛍光バックグラウンドが低いが、腫瘍細胞と組織内では蛍光信号が高く、且つ腫瘍細胞と組織に対して特異的な高い標識性能を有する。この種の化合物は、ある程度の水溶性を有すると共に、細胞膜透過性が良好であり、更に有効な二光子を吸収する断面積が大きい。本発明のこの種の化合物は、更に生体毒性、光毒性、光による漂白性が低く、そのスペクトル範囲と生体サンプルのスペクトル範囲とは、かなり大きく異なる。
本発明のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブを示す一般式Ｉである。 二光子共焦点イメージングによる、実施例２に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ１の腫瘍細胞および非腫瘍細胞の写真である。濃度が４μＭであるＡ１−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたＨｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３細胞を、３７度、ＣＯ２が５％存在する条件下で６０分培養した後、代表的な領域を選択して、油浸レンズ（１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。写真を撮像した波長は５００〜５５０ｎｍである。図２（ａ）はＨｅｌａ細胞であり、図２（ｂ）はＨＥＫ２９３細胞である。 実施例３に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ１の異なる溶媒での二光子を吸収する断面積の測定結果を示す。測定溶媒はジメチルスルホキシドである。測定方法は以下の通りである：フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用いる。フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とする。使用するA１を含む溶液の濃度は全て１×１０−４Ｍである。レーザーパルス幅（ｌａｓｅｒ ｐｕｌｓｅ ｗｉｄｔｈ）は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）である。調節可能な波長範囲は７００〜９８０ｎｍである。実験中にフェムト秒レーザーの波長が所望の測定波長に調節される。 二光子共焦点イメージングによる、実施例５に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ２の腫瘍細胞および非腫瘍細胞の写真である。濃度が４μＭであるＡ２−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたＨｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３細胞を、３７℃、ＣＯ２が５％存在する条件下で６０分培養した後、代表的な領域を選択して、油浸レンズ（１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。写真を撮像した波長は５００〜５５０ｎｍである。図４（ａ）はＨｅｌａ細胞であり、図４（ｂ）はＨＥＫ２９３細胞である。 実施例６に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ２を水溶液に溶かしたときの結果を示す。濃度が異なる化合物Ａ２の水溶液を用いて、最大吸収波長での吸光度を測定する。測定は三回繰り返される。 実施例８に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ３の溶媒効果の結果を示す。化合物Ａ３をジメチルスルホキシドとテトラヒドロフランにそれぞれ添加し、異なる溶媒での紫外吸収スペクトル（ａ）と蛍光発光スペクトル（ｂ）を測定する。 実施例９に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ３の異なる溶媒での二光子を吸収する断面積の結果を示す。測定溶媒はジメチルスルホキシドとテトラヒドロフランである。測定方法は以下の通りである：フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用いる。フルオレセインを含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とする。使用するＡ３を含む溶液の濃度は全て１×１０−４Ｍである。レーザーパルス幅は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）である。調節可能な波長範囲は７００〜９８０ ｎｍである。実験中にフェムト秒レーザーの波長が所望の測定波長に調節される。 実施例１１に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ４のマウスの肺部の腫瘍組織とマウスの肺部の非腫瘍組織での二光子共焦点イメージングによる写真を示す。濃度が１０μＭであるＡ４−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたマウスの肺部の腫瘍組織の切片およびマウスの肺部の非腫瘍組織の切片から代表的な領域を選択して、油浸レンズ（１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。図８（ａ１）と（ａ２）はプローブＡ４が加えられた後のマウスの肺部の腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真であり、図８（ｂ１）と図８（ｂ２）はプローブＡ４が加えられた後のマウスの肺部の非腫瘍組織の切片の焦準を合わせて撮った写真である。ここで、図８（ａ１）と図８（ｂ１）で適用した波長は５００〜５５０ｎｍであり、図８（ａ２）と図８（ｂ２）で適用した波長は５７０〜６５０ｎｍである。 実施例１２に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ４を水溶液に溶かしたときの結果を示す。濃度が異なる化合物Ａ４の水溶液を使用して、最大吸収波長での吸光度を測定する。当該試験は三回繰り返される。 実施例１４に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ５の腫瘍細胞および非腫瘍細胞の二光子共焦点結像による写真を示す。濃度が４μＭであるＡ５−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたＨｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３細胞を、３７℃、ＣＯ２が５％存在する条件下で６０分培養した後、代表的な領域を選択して、油浸レンズ（１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。図１０（ａ１）および図１０（ａ２）はＨｅｌａ細胞であり、図１０（ｂ１）および図１０（ｂ２）はＨＥＫ２９３細胞である。ここで、図１０（ａ１）および図１０（ｂ１）で適用した波長は５００〜５５０ｎｍであり、図１０（ａ２）および図１０（ｂ２）で適用した波長は５７０〜６５０ｎｍである。 実施例１５に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ５のマウスの肺部の腫瘍組織とマウスの肺部の非腫瘍組織の二光子共焦点イメージングによる写真を示す。濃度が１０μＭであるＡ５−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたマウスの肺部の腫瘍組織の切片とマウスの肺部の非腫瘍組織の切片から代表的な領域を選択して、油浸レンズ（１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。図１１（ａ１）および図１１（ａ２）は、マウスの肺部の腫瘍組織であり、図１１（ｂ１）および図１１（ｂ２）は、マウスの肺部の非腫瘍組織である。ここで、図１１（ａ１）および図１１（ｂ１）で適用した波長は５００〜５５０ｎｍであり、図１１（ａ２）および図１１（ｂ２）で適用した波長は５７０〜６５０ｎｍである。 実施例１７に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ６の溶媒効果の結果を示す。測定溶媒はジメチルスルホキシドである。異なる溶媒での紫外吸収スペクトルと蛍光発光スペクトルを測定する。 実施例１８に係る本発明の蛍光プローブ化合物Ａ６の異なる溶媒での二光子を吸収する断面積の測定結果を示す。測定溶媒はジメチルスルホキシドとテトラヒドロフランである。測定方法は以下の通りである：フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用いる。フルオレセインを含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とする。使用するＡ１を含む溶液の濃度は全て１×１０−４Ｍである。レーザーパルス幅は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）である。調節可能な波長範囲は７００〜９８０ｎｍである。実験中にフェムト秒レーザーの波長が所望の測定波長に調節される。
好ましい実施形態では、反応温度は８０〜１４０℃、反応時間は２〜１０時間、反応溶媒はエタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、式ｉの化合物とのモル比は１：１〜１：４である。
より好ましい実施形態では、反応温度は９０〜１２０℃、反応時間は３〜１０時間、反応溶媒は酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、式ｉの化合物とのモル比は１：１〜１：３である。
最適な実施形態では、反応温度は９５〜１１０℃、反応時間は４〜８時間、反応溶媒は酢酸である。４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、式ｉの化合物とのモル比は１：１〜１：２である。
好ましい実施形態では、反応温度は８０〜１４０℃、反応時間は２〜１０時間、反応溶媒はエタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。４−ブロモアセナフテンキノンと、式ｉの化合物とのモル比は１：１〜１：４である。
より好ましい実施形態では、反応温度は９０〜１２０℃、反応時間は３〜１０時間、反応溶媒は酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される。４−ブロモアセナフテンキノンと、式ｉの化合物とのモル比は１：１〜１：３である。
最適な実施形態では、反応温度は９５〜１１０℃、反応時間は４〜８時間、反応溶媒は酢酸である。４−ブロモアセナフテンキノンと、式ｉの化合物とのモル比は１：１−１：２である。
（実施例２：プローブ化合物Ａ１で腫瘍細胞および非腫瘍細胞を標識する試験）
実施例１で合成された化合物Ａ１を使用して、濃度が４μＭのＡ１−ＤＭＳＯ溶液４μＬがそれぞれ添加されたＨｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３細胞を、培地において、３７度、ＣＯ２が５％存在する条件下で６０分培養する。そして、ＰＢＳで５ ｍｉｎ×３回振とう洗浄した後、更に細胞培地を加えて、二光子を用いた共焦点レーザー法によりイメージングを行う。代表的な領域を選択して、油浸レンズ(１００×）で観察する。観察は三回繰り返される。イメージングにより、Ｈｅｌａ細胞内で強い蛍光信号が得られるが、ＨＥＫ２９３細胞内では蛍光信号が得られないことが分かった。図２（ａ）はプローブＡ１を加えた後のＨｅｌａ細胞の焦準を合わせて撮った写真であり、図２（ｂ）はプローブＡ１を加えた後のＨＫＥ２９３細胞の焦準を合わせて撮った写真である。写真を撮った波長は５００〜５５０ｎｍであった。
（実施例３：プローブＡ１の二光子を吸収する有効断面積の測定試験）
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とし、実施例１で合成された化合物Ａ１をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ,Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ ）、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面積の測定を行った。使用される溶液の濃度は全て１×１０−４Ｍであり、以下の式で算出する。
Figure 2014534241
式中、Ｃは溶液の濃度、ｎは溶媒の屈折率を示し、表を調べることによって得られる。Ｆは転換された蛍光強度を示し、実験によって得られる。δは二光子を吸収する断面積である。参照溶液の物理量は全て下付き文字ｒで示す。
異なる溶媒において、異なる波長で測定した二光子を吸収する有効な断面積（Φδ）の結果を図３に示す。二光子励起蛍光スペクトルの励起源はモード同期チタンサファイアレーザーである。レーザーパルス幅は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）であり、調節可能な波長範囲は７００〜９８０ ｎｍであった。実験中に、フェムト秒レーザー波長は、所望の測定波長に調節された。
（実施例９：プローブ化合物Ａ３の二光子を吸収する有効断面積の測定試験）
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とし、実施例７で合成された化合物Ａ３をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面積を測定する。使用される溶媒の濃度は全て１×１０−４Ｍであり、式２．２により二光子を吸収する断面積の値を得た。使用した異なる溶媒において、異なる波長で二光子を吸収する有効断面積（Φδ）を測定した結果を図７に示す。二光子励起蛍光スペクトルの励起源はモード同期チタンサファイアレーザーである。レーザーパルス幅は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）であり、調節可能な波長範囲は７００〜９８０ ｎｍであった。実験中にフェムト秒レーザー波長が所望の測定波長に調節された。
（３）中間体３の合成
ステップ（２）で得られた、２０ｍｍｏｌの中間製品２と、２５ｍｍｏｌのヘキサメチレンジアミンとを、２０ｍｌの２−メトキシエタノールが入った丸底フラスコに入れて、窒素雰囲気にした。加熱還流を１２５℃で５．５ｈし続けた後、反応を停止した。混合物を氷水に注いだ後、橙赤色の沈殿物を析出させ、吸引ろ過して、橙赤色の固体粉末の粗生成物を得た。更にカラムクロマトグラフィーによって橙赤色の固体粉末の中間体３を得た。収率は７２％であった。
（２）中間体２の合成
１．１ｇの中間製品と、０．２ｇの炭酸カリウムとを２０ｍｌの溶媒に入れて、加熱還流した。数分後に大量の褐色結晶が現れた後、冷却ろ過して、水洗して炭酸カリウムおよび溶媒を除去した。更に、乾燥して純粋な中間製品２を得た。収率は９３％より高かった。
（実施例１８：プローブ化合物Ａ６の二光子を吸収する有効断面積の測定試験）
フェムト秒レーザーを用いた二光子誘導蛍光法を用い、フルオレセインを含むＮａＯＨ溶液（ｐＨ１１）を参照とし、実施例１６で合成された化合物Ａ６をそれぞれメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、水などの溶媒に加えて、二光子を吸収する断面積を測定した。使用される溶媒の濃度は全て１×１０−４Ｍであった。式２．２により二光子を吸収する断面積の値が得られる。使用する異なる溶媒において、異なる波長で二光子を吸収する有効断面積（Φδ）を測定した結果を図１３に示す。二光子励起蛍光スペクトルの励起源はモード同期チタンサファイアレーザーである。レーザーパルス幅は７０ｆｓであり、重複周波数は８０ＭＨｚであり、レーザーの平均出力電力は１．５Ｗ（７８０ｎｍ）であり、調節可能な波長範囲は７００〜９８０ ｎｍであった。実験中にフェムト秒レーザー波長が所望の測定波長に調節された。

Claims (10)

  1. 一般式Ｉで示される構造を有する、ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。
    Figure 2014534241
     ここで、Ｘは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４から選択されるものであり、点線で示される結合によって一般式Ｉと結合され、
    Figure 2014534241
     Ｒ１及び Ｒ２は、それぞれ−ＯＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、またはハロゲンから独立して選択されるものであり、
    Ｒ３は、− ＣＨ２−、− （ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）７−、または−（ＣＨ２）８−から選択され、
    Ｒ４は、Ｃ１−６アルキル基 、ＨＯＣＨ２−、ＨＯ（ＣＨ２）２−、ＨＯ（ＣＨ２）３−、ＨＯ（ＣＨ２）４−、ＨＯ（ＣＨ２）５−、またはＨＯ（ＣＨ２）６−から選択され、
    Ｒ５は、−Ｈ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、または−ＳＨから選択される。
  2. Ｒ１及びＲ２は、それぞれ−ＯＣＨ３及びハロゲンから独立して選択される、
    ことを特徴とする請求項１に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。
  3. Ｒ３は−（ＣＨ２）５−又は−（ＣＨ２）６−である、
    ことを特徴とする請求項１に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。
  4. Ｒ４はＣ１−４アルキル基から選択される、
    ことを特徴とする請求項１に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。
  5. Ｒ５ は−Ｈ、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ又は−ＮＯ２から選択される、
    ことを特徴とする請求項１に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。
  6. 以下の化合物Ａ１〜Ａ６から選択される、請求項１に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ。
    Figure 2014534241
  7. 請求項１に記載するナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの製造方法であって、下記のステップ、つまり、
    １）４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物（４−ｂｒｏｍｏ−１,８−ｎａｐｈｔｈａｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）と、Ｒ４−ＮＨ３とを１：１〜１：５のモル比で反応させて、化合物Ｖを製造するステップ、
    Figure 2014534241
     ここで、反応温度は７０〜１５０℃、反応時間は１〜１２時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される、
    ２）４−ブロモ−１,８−ナフタル酸無水物と、式ｉの化合物とを１：１〜１：５のモル比で反応させて、化合物ＶＩを製造するステップ、
    Figure 2014534241
     ここで、反応温度は７０〜１５０℃、反応時間は１〜１２時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される、
    ３）４−ブロモアセナフテンキノン（４−ｂｒｏｍｏａｃｅｎａｐｈｔｈｅｎｅｑｕｉｎｏｎｅ）と、式ｉの化合物とを１：１〜１：５のモル比で反応させて、化合物ＶＩＩを製造するステップ、
    Figure 2014534241
     ここで、反応温度は７０〜１５０℃、反応時間は１〜１２時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、酢酸、またはそれらの混合物から選択される、
    ４）アセナフテンキノンと、マロノニトリル（ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）と、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）とを１：１：５のモル比で反応させて、化合物ＶＩＩＩを製造するステップ、
    Figure 2014534241
     まず室温で０．５時間反応させてから、反応温度を徐々に７０〜１８０℃まで上昇させ、この温度を保ちながら４〜１２時間反応させ、反応溶媒はジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、又はそれらと水からなる混合物から選択される、
    ５）ステップ１）〜４）で製造された化合物Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩをそれぞれＮＨ２Ｒ３ＮＨ２と１：１〜１：２．５のモル比で反応させて、化合物ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩを製造するステップ、
    Figure 2014534241
     ここで、反応温度は１００〜１７５℃、反応時間は１〜７時間、反応溶媒はエタノール、２−メトキシエタノール（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ）、またはそれらの混合物である、
    ６）化合物ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩと、式ｉｉの化合物とを１：１〜１：３のモル比で反応させて、化合物Ｉを製造するステップ、
    Figure 2014534241
     ここで、反応温度は０〜１００℃，反応時間は１２〜４８時間、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、またはそれらの混合物であり、反応は有機塩基の存在する条件下で行われ、４−ジメチルアミノピリジン（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）を触媒とする、
    を含む二光子蛍光プローブの製造方法。
  8. 前記ステップ４）において、水と、ジメチルスルホキシド又はテトラヒドロフランとのモル比はそれぞれ１：１〜１：１．２５である、
    ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
  9. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの生体試料の標識への利用。
  10. 前記生体試料は、腫瘍組織又は腫瘍細胞である、
    ことを特徴とする請求項９に記載のナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブの生体試料の標識への利用。
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