CN110658172A

CN110658172A - 一种比率型双光子荧光探针对硫化氢快速灵敏检测的应用

Info

Publication number: CN110658172A
Application number: CN201911177434.8A
Authority: CN
Inventors: 颜梅; 卫先哲; 张晶; 杨小凤; 刘海云; 李增军; 于京华
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2020-01-07

Abstract

本发明公开了一种对肿瘤细胞中的硫化氢快速响应以及高选择性检测的比率型双光子荧光探针的制备方法和应用。该探针基于分子内电荷转移的荧光染料4‑羟基‑1,8‑萘二甲酰亚胺作为比率型双光子荧光团，引入硫化氢特异性识别的亲电子氰基单元(RO‑CN)构成。利用硫化氢与氰酸酯基团反应形成硫代氨基甲酸酯，随后水解生成羟基染料，导致荧光发射信号比例性的变化。优势在于，探针的斯托克斯位移大，吸收双光子能力强，可以超快速，高选择，无损伤的对活细胞中硫化氢进行检测与成像。为临床用于检测活体内硫化氢异常表达相关的疾病诊断提供了潜在工具。

Description

一种比率型双光子荧光探针对硫化氢快速灵敏检测的应用

技术领域

本发明涉及小分子荧光探针原位检测异常的生物活性硫簇小分子在活细胞中的位置和表达水平，更具体地说是一种基于分子内电荷转移的比率型双光子荧光探针对慢性肝肾功能损伤的重要标志物硫化氢的检测。

背景技术

硫化氢（H₂S）是一种具有臭鸡蛋气味的特殊气体，它被认为是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三种基本内源性信号分子，并且被视为有毒气体和环境污染物。越来越多的研究表明，H₂S在生物体内发挥着重要作用，因此对H₂S的检测获得了科学研究领域的广泛关注。细胞中的H₂S受各种生理过程的影响，包括抑制氧化应激反应，减少缺血性再灌注损伤，调节细胞生长和死亡等。同时，细胞中H₂S水平异常与唐氏综合症，糖尿病，阿尔茨海默氏病，特别是慢性肝肾功能损伤等一系列疾病有关。迄今为止，尽管H₂S已被证明存在于各种生理和病理过程中，但是H₂S的药理特性和可能涉及的确切作用机制仍然不明确，值得进行深入探讨。因此，开发一种高选择性和快速响应性的理想分析手段，对复杂生物系统中H₂S检测，甚至诊断H₂S相关疾病都具有重要意义。

目前，可用于检测H₂S的方法包括比色法、电化学法，气相色谱法和硫化物沉淀法。但是，这些技术无法对H₂S的反应性进行实时监测，并且不能应用于复杂生物样品以及组织或细胞微环境中的H₂S原位成像检测。为了克服这些缺点，在最近的研究中，基于荧光成像的方法已成为一种在生物系统中原位实时检测活性小分子的有效方法。因此，小分子荧光探针及其成像技术已被广泛用于可视化和量化活细胞中H₂S的动态过程中，其具有高选择性，快速响应性，优异的光稳定性以及对细胞和组织低毒性等优势。

多数检测H₂S的荧光探针是基于H₂S的特异性识别反应，其利用了H₂S的亲核反应性和还原性，将特异性反应位点与荧光基团连接，通过识别基团与H₂S的相互作用使荧光信号发生改变。但是这些探针在定量检测中会受到包括探针浓度、激发波长、以及溶液酸碱度等条件的影响。为了避免上述影响，比率型荧光探针可以通过在两个发射带上进行自校准，从而对待测物进行更准确的分析。具体来说，利用具有大的斯托克斯位移和显著的两光子吸收能力的4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺化合物作为比率型双光子荧光报告基团，引入亲电子的氰酸盐（RO-CN）作为H₂S识别基团，构建了基于典型的分子内电荷转移机理的荧光探针化合物CNR-1。经测试证明，CNR-1具有响应速度快、选择性高、细胞毒性低等特征。总之，本文中设计并合成了一种新的比率型双光子荧光化合物（CNR-1），用于检测生物系统中H₂S的活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题：一是提供一种原料廉价易得，合成步骤简单，反应条件温和的荧光探针合成方法。二是提供了一种具有大斯托克斯位移、响应速度快、选择性高、细胞毒性低，用于检测生物样品中硫化氢的新型比率双光子荧光探针。

为了解决上述技术问题，采取的技术方案如下，一种特异性识别硫化氢的比率型双光子荧光探针，具有如下分子结构式：

上述硫化氢荧光探针的制备方法如下：

1）将4-溴-1,8-萘酸酐（1 eq）与正丁胺（2.2 eq），溶解于乙醇中，将溶液回流10 h。待反应完全冷却至室温后，过滤收集淡黄色的沉淀物，然后在室温下的真空烘箱中干燥过夜，得到化合物1，其结构式如下：

；

2）将化合物1（1 eq）和K₂CO₃（5.3 eq）在30mL的CH₃OH中回流24 h。待反应完全后，过滤沉淀物，并用水（25mL）洗涤三次。获得黄色针状化合物2，其结构式如下：

；

3）将化合物2和浓的HI回流8 h，冷却至室温并调节pH为中性后，将沉淀物过滤，得到黄色针状化合物3，其结构式如下：

；

4）将溴化氰（1 eq）添加到无水四氢呋喃中，待溶液冷却至-10°C后，将化合物3（1 eq）溶解在其中。向混合液中滴加三乙胺（0.8 eq），在氩气气氛下搅拌2 h。通过过滤将沉淀物与溶液分离，利用柱色谱法进行纯化，得到呈浅黄色固体的化合物CNR-1。

。

所述步骤2）化合物1与碳酸钾的摩尔比值为1:5.3-1:5.5，碳酸钾应过量，以保证反应进行完全。

所述步骤3）中化合物2与浓HI回流时间超过8 h，反应后注意将pH调节至中性，使化合物3析出。

所述步骤4）中溴化氰与化合物3的摩尔比值为1:1-1:1.2，硅胶柱分离洗脱剂配比为二氯甲烷:乙酸乙酯=5:1。

本发明的优点:

本发明的荧光探针通过比率荧光成像可以用于检测细胞中内源性、外源性的H₂S，并且与加入H₂S抑制剂后的细胞进行区分。主要利用的活细胞为Hela细胞。内源性H₂S由市售SNP诱导产生，外源性H₂S由加入Na₂S产生，市售NMM可抑制H₂S的产生。

本发明的荧光探针，其本身不发射荧光，在与H₂S反应后，反应体系在552 nm处出现红移荧光峰，同时，448 nm处的荧光强度急剧下降，提供可视化的比率荧光信号（I_{552 nm}/I_{448 nm}），在与H₂S反应后增加了约15倍。

本发明的荧光探针对H₂S的检测表现出很高的灵敏度，具有高光稳定性。荧光强度比（I_{552 nm}/I_{448 nm}）在反应前60 S内迅速增加，在约300 S内获得最大强度。探针溶液荧光强度与H₂S浓度有很好的线性关系。检出限为0.24 μM。

本发明pH和温度的适用范围较宽，有利于生命系统中H₂S的检测。在pH值从5到9的变化以及温度从25℃到45℃的范围内，都不影响探针分子对H₂S的检测。

本发明的荧光探针对H₂S有很好的选择性和很强的抗干扰能力。可能干扰的物质，H₂O₂，NO₂ ⁻，阴离子F⁻，Cl⁻，Br⁻，I⁻，CO₃ ²⁻，PO₄ ³⁻，CN⁻，HCO₃ ⁻，金属离子Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，Ag⁺，Fe³⁺，内源性物质SO₄ ²⁻，SO₃ ²⁻，S₂O₃ ²⁻，S₂O₅ ²⁻，赖氨酸，丙氨酸，组氨酸，抗坏血酸，半胱氨酸和谷胱甘肽的存在不影响探针分子对H₂S的响应。

本发明的荧光探针具有较好的细胞靶向性、化学稳定性、生物相容性和H₂S选择性。双光子激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。

因此，本发明是一种简单、快速，灵敏的H₂S特异性检测试剂。在化学分析检测领域具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

1）化合物1的合成：

将4-溴-1,8-萘酸酐（10 g，0.036 mol），正丁胺（2.31 ml，0.08 mol）溶解于80 mL乙醇中，将溶液回流10 h，用TCL板监测反应。待反应完全冷却至室温后，过滤收集沉淀物，然后在室温下的真空烘箱中干燥过夜，得到化合物1，为淡黄色固体，产率为85%。

2）化合物2的合成：

将化合物1（3.32 g，10 mmol）和K₂CO₃（7.33 g，53 mmol）在30 mL的CH₃OH中回流24 h。待反应完全后，过滤沉淀物，并用水（25 mL）洗涤三次。获得黄色针状化合物2，产率为70%。

3）化合物3的合成：

将化合物2（1.43 g，5 mmol）和60 mL浓HI（57％）的混合物回流8小时。冷却并调节pH至中性后，将沉淀物过滤，得到黄色针状化合物3，产率为70%。

4）探针化合物CNR-1的合成：

将溴化氰（195 L，0.6 mmol）加入到无水四氢呋喃（1.5 mL）中，并将溶液冷却至-10°C。将化合物3（156 mg，0.6 mmol）溶解在冷却的溶液中，将三乙胺（70 L，0.48 mmol）的无水四氢呋喃（1 mL）滴加到该混合物中。在氩气气氛下，将混合物搅拌2 h，过滤将沉淀物与溶液分离。通过硅胶色谱纯化残余物，硅胶颗粒大小为200-300目，得到目标探针化合物CNR-1，为浅黄色固体，洗脱剂配比为二氯甲烷:乙酸乙酯=5:1。

实施例2

化合物CNR-1荧光探针随不同Na₂S浓度（0-25 μM）的荧光响应

取实施例1制备的CNR-1荧光探针溶于含有CH₃CN作为共溶剂（CH₃CN/PBS=1:10，v/v）的PBS（pH=7.4）溶液制备1 mmol/L储备溶液。从储备液中取出10 μL加入到5 mL的离心管当中，加入不同量（0-25 μM）的Na₂S标准溶液，用PBS缓冲溶液（0.1 mol/L，pH=7.5）与CH₃CN体积比为10:1的溶液稀释至5 mL，测量其荧光性质。以385 nm为激发光，随着Na₂S加入量的增加，450 nm处CNR-1的荧光发射峰急剧下降，并且在550 nm处出现新的荧光发射峰，并在Na₂S为20 μM时达到峰值。

实施例3

化合物CNR-1荧光探针的荧光线性范围测定

配制10份2 mL的CNR-1荧光探针溶液（10 μM），分别加入Na₂S（0-25 μM），进行荧光检测（λ_ex=385 nm），计算各体系中荧光强度，通过分析I_{550 nm}/I_{450 nm}处的荧光强度与Na₂S浓度的关系，评估探针对H₂S的响应性能。表明探针在Na₂S浓度0-10 μM范围内呈线性关系，并且探针对H₂S的检测限为0.24 μM。

实施例4

化合物CNR-1荧光探针对不同分子或离子的选择性

从实施例1中荧光探针储备液中取出10 μL加入到5 mL的离心管当中，分别加入100 eq的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的H₂S标准溶液，在37°C下30 min后以385 nm为激发光检测溶液的荧光发射光谱变化，可以发现，其他干扰物质对化合物CNR-1的荧光几乎没有影响，而H₂S的加入使化合物CNR-1的荧光显著增强。

实施例5

化合物CNR-1荧光探针响应时间的变化

从实施例1中荧光探针储备液中取出5份10 μL溶液加入到5 mL的离心管当中，分别加入0、1、2、5、10 μM的Na₂S，用荧光分光光度法测定荧光强度随时间的变化。I_{550 nm}/I_{450 nm}的荧光强度比在前40 s内迅速增加，然后在约300秒内获得最大强度。一旦达到平台，探针的荧光强度保持相对稳定，表明它具有光稳定性。此外，在没有Na₂S的情况下，在系统中没有观察到明显的荧光强度比变化，证实在实验条件下探针CNR-1是稳定的。

上述仅为本发明的优选具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，反利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims

1.一种如式Ⅰ所示的荧光探针在硫化氢分子检测中的应用，其特征在于，所述荧光探针用于体外环境和活体内硫化氢的含量传感检测；所述的传感检测包含目视定性检测，荧光检测，细胞成像检测；

该方法的制备步骤如下：

1）将4-溴-1,8-萘酸酐与正丁胺，于乙醇中回流，得到化合物1；

化合物1

2）将化合物1与碳酸钾在甲醇中回流，过滤后得到黄色针状化合物2；

化合物2

3）将化合物2与浓氢碘酸回流，调节pH为中性，过滤后得到黄色针状化合物3；

化合物3

4）将溴化氰溶于无水四氢呋喃，与化合物3氩气气氛下反应，纯化后得到浅黄色固体的式Ⅰ化合物。

2.一种权利要求1所述检测硫化氢的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤

。