CN103820104A - 一类以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针、其制法及应用 - Google Patents

Abstract

一类以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针、其制法及应用。所述荧光探针具有通式Ⅰ的结构，如附图1。本发明的荧光探针有效地改进现有的肿瘤标记荧光探针的不足，能够更加灵敏准确地反应出COX-2表达量异常变化的靶细胞，适用于有效的、专一的标记癌症活细胞的近红外荧光探针。并且合成简便，产品易得，在非肿瘤细胞内具有很低的荧光背景，在肿瘤细胞内具有较强的荧光信号，且对肿瘤细胞具有很强的专一性标记。同时，这类化合物具有良好的细胞膜通透性，并具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性，并且能够定位于肿瘤细胞内的某种特殊细胞器。

Description

一类以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针、其制法及应用

技术领域

本发明涉及一类以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针、其制备方法，以及利用该类荧光探针在制备生物标记试剂盒、尤其是肿瘤细胞标记试剂盒中的应用。

背景技术

据世界卫生组织(WHO)统计，20世纪80年代全世界每年新患癌症的病人约700万，每年死于癌症者约500万人，癌症正以一股势不可挡的趋势向人类进攻，因此建立一种简便、快速、有效、灵敏的癌症标记技术是一项重要的工作。现有的标记成像的方法主要有：X线检测技术、超声波检测技术、CT检测技术、核磁共振（MRI）检测技术、红外热像图检测技术、近红外线扫描检测技术、PET-CT检测技术等。但上述方法在实际成像应用中存在以下缺陷：缺乏成像专一性，具有大的放射性损伤，无法独立标记诊断肿瘤，无法对肿瘤进行深度成像等等。

荧光探针由于具有非侵入性、易操作、能够实现可视化检测等特点，受到普遍的重视。近年来，应用荧光探针对生物标志物进行识别和检测的荧光显微成像及检测技术已逐渐被应用到生物识别、医学诊断、疾病治疗过程中。然而，这些荧光染料激发、发射波长都较短，在进行活细胞共聚焦成像时，对活细胞造成很大的损伤，同时，此类荧光染料容易发生光漂白，并易受到自发荧光的干扰，因此开发一种激发、发射波长长，光稳定性好，对细胞具有低毒性的近红外探针具有重要意义。尼罗蓝类荧光染料具有优良的光化学物理性质，例如高的摩尔消光系数、良好的光稳定性、高的荧光量子产率等优点。对细胞的内环境不敏感，而且可以解决探针对细胞高毒性和光漂白严重等弊端。

随着成像技术的发展，荧光显微镜在生命科学的研究中已经成为最重要的成像工具。与紫外-可见区相比，近红外荧光成像具有显著优势，包括暗场成像、避免荧光漂白和光致毒及降低组织自发荧光干扰等，因此近红外荧光成像技术为生物成像提供了一个崭新的平台。目前，对肿瘤标记成像、其活体内分布成像以及肿瘤深度成像的专一性近红外荧光探针还相对较少，开发专一性好的标记肿瘤的近红外荧光探针是实现近红外肿瘤成像的关键。但现有的靶向到生物标志物的荧光染料仍存在着特异性、专一性、灵敏度及生物适应性等问题。

环氧合酶-2（COX-2）属于一种同工的应激酶，一般情况下不表达。只有在机体处于炎症期间以及癌症的时候才表达，并且过度表达，随着炎症和癌症的发生与发展，COX-2的表达量也逐渐增加。并且已有文献报道，某些特定的COX-2羧酸类抑制剂可以通过氢键很好地与COX-2的膜结合区内的氨基酸（Arg120,Tyr355和Glu522）结合。基于此，以COX-2为生物标志物，将COX-2的羧酸类抑制剂——吲哚美辛引入至可检测的诊断剂中，使其作为分子的识别基团，靶向引导结合至COX-2的膜结合区域，从而实现靶细胞的检测是本研究领域极具吸引力的研究方向。CN101528222（公开日2009-09-09）所公开用于诊断性和治疗性靶向COX-2的方法和组合物（包括吲哚美辛通过连接单元与尼罗蓝分子连接而成的诊断剂27uu）即体现了此研究思路。然而，这类诊断剂在应用中仍然存在的问题是：当作为检测对象的组织、器官或个体中无高COX-2表达的靶标细胞时，荧光仍然存在，这会影响COX-2表达量增加初期的准确诊断，实际应用中，极可能导致肿瘤或炎症发生初期的诊断失准。因此，需要开发更为灵敏的诊断试剂。

发明内容

针对现有技术的应用缺陷，本发明拟提供一类新的包括尼罗蓝和吲哚美辛结构单元的近红外荧光探针，所述的荧光探针应当能够更加灵敏地反应出COX-2表达量的变化，所述荧光探针具有如下结构通式I：

通式Ⅰ中：

R₁和R₂各自独立地选自C_1-8烷基、C_1-6烷基磺酸基、C_1-6烷基羧酸基；

R₃选自-(CH₂)_n-，其中n为1～8的整数；

R₄和R₅各自独立地选自-OCH₃、-OCOCH₃和卤素。

本发明另一方面提供所述以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针的制备方法，所述方法包括如下步骤：

1)1-溴萘与H₂N-R₃-NH₂按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物Ⅲ：

反应温度为80-150℃，反应时间为1-24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙二醇单甲醚、甲醇、DMF或其混合物；

2)化合物Ⅲ与式i的化合物按照摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物Ⅳ：

反应温度为70-120℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、DMF或其混合物；

3)使化合物Ⅳ与式ii按照摩尔比1:1-1:3反应，制备化合物I：

反应温度为0-100℃，反应时间为12-48小时，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、DMF或其混合物，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶为催化剂。

再一方面，本发明提供上述以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针在制备生物样品标记试剂中的应用、尤其是针对肿瘤细胞的特异性识别标记试剂。

在现有技术基础上，本发明所提供的近红外荧光探针以适宜长度的烷基链来连接提供COX-2酶选择性结合位点的吲哚美辛结构单元以及提供荧光显示的尼罗蓝结构单元。COX-2在正常情况下不表达，当机体处于癌症时，才会过度表达。当其表达量达到一定程度后，COX-2将以二聚体的形成存在，并且在其二聚体的中间形成一个大的疏水空腔识别基团。所以，在正常细胞中不表现荧光，推测是分子呈折叠状态，可发生激发态分子内电子转移。而在癌细胞中表现强的荧光，是因为抑制基团进入到COX-2的疏水空腔中，并与其特定位点结合，导致分子呈伸展状态，分子内电子转移被抑制，荧光团荧光恢复。因此，与酶作用前后有着荧光变化的过程，能够更加灵敏准确地反应出COX-2表达量异常变化的靶细胞。本发明的荧光探针有效地改进现有的肿瘤标记荧光探针的不足，适用于有效的、专一的标记癌症活细胞的近红外荧光探针。并且合成简便，产品易得，在非肿瘤细胞内具有很低的荧光背景，在肿瘤细胞内具有较强的荧光信号，且对肿瘤细胞具有很强的专一性标记。同时，这类化合物具有良好的细胞膜通透性，并具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性，并且能够定位于肿瘤细胞内的某种特殊细胞器。

附图说明

本发明附图7幅：

图1是本发明的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针的结构通式I。

图2是本发明的荧光探针化合物Ⅱ的溶剂化效应表征结果。将2.5μM化合物Ⅱ分别加入到甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、乙酸乙酯、水等溶剂中。测定不同溶剂中的紫外吸收光谱（a）和荧光发射光谱（b）以及光学物理数据(c)。

图3是表征本发明的荧光探针化合物Ⅱ在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的近红外共聚焦成像图片。将5μL浓度为2.5μM的Ⅱ-DMSO溶液分别加入到乳腺癌细胞(MCF-7cells)、非洲绿猴上皮细胞(COS-7cells)、宫颈癌细胞(Hela cells)、成骨细胞(OB cells)、人肝癌细胞(HepG2cells)和人正常肝细胞(LO-2cells)中，在37℃，5%CO₂下孵育30分钟，选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次。图片收集波段645-700nm。图3(a)为MCF-7肿瘤细胞，图3(b)为COS-7非肿瘤细胞，图3(c)为Hela肿瘤细胞，图3(d)为OB非肿瘤细胞，图3(e)为HepG2肿瘤细胞，图3(f)为LO-2非肿瘤细胞。

图4是本发明的荧光探针化合物Ⅱ在癌细胞和正常细胞中的选择性和稳定性。将2.5μM荧光探针Ⅱ分别加入到培养着乳腺癌细胞(MCF-7cells)、宫颈癌细胞(Hela cells)和非洲绿猴上皮细胞(COS-7cells)的培养皿中。每隔一段时间进行一次共聚焦成像，观察细胞内荧光强度的变化。荧光强度信号收集波长范围分别是645-700nm。

图5是本发明的荧光探针化合物Ⅱ的细胞定位结果。选取MCF-7细胞为研究对象，在细胞内加入荧光探针Ⅱ(2.5μM)和染料NBD C6-ceramide(5.0μM)，并且在37℃、5%CO₂条件下孵育0.5h，在荧光显微镜下进行观察。图(a)是加入荧光探针Ⅱ后采集645-700nm波段内的荧光图。激发波长为635nm。图(b)是加入染料NBD C6-ceramide后采集500-540nm波段内的荧光图。激发波长为488nm。图(c)是a和b的叠加图。图(d)是共区域化分析图。

图6是本发明的荧光探针化合物Ⅱ在不同浓度塞来昔布作用下荧光强度的变化。选取MCF-7为研究对象，分别在三组细胞内加入一定浓度梯度的塞来昔布，抑制COX-2的表达。在37℃、5%CO₂条件下孵育3h后加入荧光探针Ⅱ(2.5μM)，并且在37℃、5%CO₂条件下孵育0.5h。随后移去培养基，用PBS清洗2-3遍，加入一定体积的新DMEM培养基后在荧光显微镜下进行观察。图(a)表示在被荧光探针化合物Ⅱ染色的细胞中加入0、2.5和5.0μg/mL塞来昔布后采集645nm-700nm波段内的荧光照片。激发波长为635nm。图(b)是在不同浓度塞来昔布作用下，分别选取10个区域计算的相对荧光强度平均值。

图7是本发明的荧光探针化合物Ⅱ的细胞毒性试验(MTT)结果。选取乳腺癌细胞株(MCF-7)为研究对象，以细胞的存活率来表征染料对细胞毒性大小。

具体实施方式

除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C_1-6烷基”包括C_1-4烷基、C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。

本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

本发明所述的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针具有如下结构通式I：

该通式Ⅰ中：

R₁和R₂各自独立地选自C_1-8烷基、C_1-6烷基磺酸基、C_1-6烷基羧酸基；

R₃选自-(CH₂)_n-，其中n为1～8的整数；

R₄和R₅各自独立地选自-OCH₃、-OCOCH₃和卤素。

具体的实施方案中，所述的n为3～7的整数；优选n是4～6的整数；最优选n=6。

具体的实施方案中，所述的的R₄和R₅各自独立地选自-OCH₃或卤素；优选的技术方案中，R₄固定地选择-OCH₃；最优选的，R₅选自F或Cl。

具体的实施方案中，所述的R₁和R₂各自独立地选自C_1-4烷基或C_1-4烷基磺酸基；优选所述的R₁和R₂各自独立地选自C_1-4烷基；最为优选的，所述的R₁和R₂均为甲基。

更为具体的实施方案中，本发明所述的近红外荧光探针选自化合物Ⅱ和II'，尤其优选化合物II：

另一方面，本发明提供了上述本发明的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1)1-溴萘与H₂N-R₃-NH₂按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物Ⅲ：

反应温度为80-150℃，反应时间为1-24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙二醇单甲醚、甲醇、DMF或其混合物；

优选的实施方式中，反应温度为90-140℃，反应时间为10-20小时，反应溶剂选自乙二醇单甲醚、甲醇、DMF或其混合物，1-溴萘与H₂N-R₃-NH₂摩尔为1:1-1:4；

进一步优选的实施方式中，反应温度为100-130℃，反应时间为12-18小时，反应溶剂选自乙二醇单甲醚、DMF或其混合物，1-溴萘与H₂N-R₃-NH₂摩尔为1:2-1:4；

最优选的实施方式中，反应温度为110-125℃，反应时间为15-18小时，反应溶剂选自乙二醇单甲醚，1-溴萘与H₂N-R₃-NH₂摩尔为1:2-1:3；

2)化合物Ⅲ与式i的化合物按照摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物Ⅳ：

反应温度为70-120℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、DMF或其混合物；

优选的实施方式中，反应温度为75-110℃，反应时间为2-8小时，反应溶剂选自乙醇、甲醇、DMF或其混合物，化合物Ⅲ与式i摩尔为1:1-1:4；

进一步优选的实施方式中，反应温度为80-100℃，反应时间为2-6小时，反应溶剂选自乙醇、DMF或其混合物，化合物Ⅲ与式i摩尔为1:1-1:3；

最优选的实施方式中，反应温度为90-95℃，反应时间为2-3小时，反应溶剂选自乙醇，化合物Ⅲ与式i摩尔为1:1-1:2；

3)使化合物Ⅳ与式ii按照摩尔比1:1-1:3反应，制备化合物I：

反应温度为0-100℃，反应时间为12-48小时，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、DMF或其混合物，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶为催化剂。

优选的实施方式中，反应温度为10-80℃，反应时间为12-32小时，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、DMF或其混合物，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶为催化剂，化合物Ⅳ与式ii摩尔为1:1-1:3；

进一步优选的实施方式中，反应温度为20-70℃，反应时间为12-28小时，反应溶剂为二氯甲烷、DMF或其混合物，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶为催化剂，化合物Ⅳ与式ii摩尔为1:1-1:2；

最优选的实施方式中，反应温度为25-40℃，反应时间为12-24小时，反应溶剂为DMF，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二甲氨基吡啶为催化剂，化合物Ⅳ与式ii摩尔为1:1-1:1.5；

上述对本发明的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针制备方法的描述中，各个取代基（R₁、R₂、R₃、R₄和R₅）的定义及优选，均与本发明中对化合物的描述中的定义及优选相同。

对本发明采用上述方法合成的近红外荧光探针化合物，采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构，并且辅以碳谱来辅助确认其结构。

本发明所述的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针具备以下优点：

所述化合物引入了专一性靶向点，提高了对肿瘤细胞和组织标记的专一性、特异性；

所述化合物具有优异的近红外特性，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白、光损伤和生物毒性，并且产生的荧光信号可以穿透较深的生物组织；

所述化合物分子的荧光发射波长大于600nm，可用于动物活体成像；

所述化合物能够定位于某种特殊细胞器；

所述化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化；

鉴于此，本发明所述的近红外荧光探针化合物可用于肿瘤细胞标记，并按照现有技术中的普遍方法制备成商业试剂，以便于保存和运输。除了以本文中所述的形式直接用于肿瘤细胞染色外，含有本发明的近红外荧光探针化合物的组合物也可以用于肿瘤细胞的染色。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的近红外荧光探针化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。

本发明还提供使用上述本发明的近红外荧光探针化合物标记肿瘤细胞生物样品的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

1.1荧光探针化合物Ⅱ的合成：

（1）中间体1的合成

将N,N-二甲基间氨基苯酚(62.72mmol)加入到含有30ml浓盐酸酸和10mL水的混合溶液的圆底烧瓶中，冰浴使温度保持在-5℃。配制含NaNO₂(4.36g,63.20mmol)的30mL水溶液，并缓慢滴加到烧瓶中，机械搅拌2h，过滤得棕黄色固体，用100mL饱和醋酸钠水溶液洗涤得到深红色固体中间体1，收率86%。

（2）中间体2的合成

将1-溴萘(4.12g)和己二胺(4.65g)加入到含有40ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，再加入CuI(190mg)和CsCO₃(3.0g)，溶液由棕黄色变为蓝绿色。加热至125℃回流持续反应24h后停止，抽滤得棕黄色滤液，柱色谱分离得棕黄色油状液体中间体2，收率52%。

（3）中间体3的合成

将中间体1(770.0mg)和中间体2(528.4mg)加入到含有20ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，冰浴下充分搅拌几分钟后滴入1mL浓HCl，继续搅拌10min，撤离冰浴装置，加热至90℃回流持续反应2.5h后停止，旋干溶剂，加入50mL的乙醇溶液，放置使之结晶，抽滤得蓝色固体，柱色谱分离得蓝色固体粉末中间体3，收率49%。

（4）探针化合物Ⅱ的合成

将蓝色固体粉末中间体3(120mg)，吲哚美辛(110.23mg)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)(70mg)，HOBt·H₂O(70mg)以及4-甲基吡啶(45mg)加入到10mLDMF溶液中，室温下搅拌反应24小时，停止反应，减压蒸出大部分溶剂，柱色谱分离得深蓝色固体产品，收率66%。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)，δ:8.74(d,J=8Hz,2H),8.21(d,J=8Hz,1H),7.86(d,J=8Hz,2H),7.73(q,3H),7.43(m,4H),7.15(d,J=8Hz,1H),6.69(d,J=4Hz,1H),6.66(s,1H),6.57(d,J=8Hz,1H),6.38(d,J=4Hz,1H),3.64(s,3H),3.56(s,2H),3.51(t,J=8Hz,2H),3.25(s,6H),2.22(s,3H),1.75–1.40(m,10H);¹³C NMR(100MHz,CD₃OD),δ:171.8,168.1,156.0,155.7,151.7,147.7,138.7,135.5,134.0,133.9,132.2,131.6,131.1,130.8,130.6,130.0,129.6,128.7,126.6,125.6,124.3,123.4,122.5,117.2,115.0,114.3,113.8,110.8,110.1,101.2,54.6,39.7,38.6,31.0,28.9,27.9,26.7,25.8,25.5,12.3ppm;TOF MS:m/z calcd for C₄₃H₄₃ClN₅O₄ ⁺:728.2998,found:728.2993.

1.2荧光探针化合物Ⅱ性能测定实验1

探针化合物Ⅱ的溶剂化效应检测试验

使用上述实施例1合成的化合物Ⅱ分别加入到的甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、乙酸乙酯、水等溶剂中，浓度为2.5μM，测定不同溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。测试结果显示，随着溶剂极性的改变，紫外吸收光谱中的最大吸收波长有相应的移动，荧光发射光谱也同样存在着最大发射波长的移动。图2(a)为探针Ⅱ在不同溶剂中的紫外吸收光谱，图2(b)为探针Ⅱ在不同溶剂中的荧光发射光谱，图2(c)为探针Ⅱ在不同溶剂中的光学物理数据。所用仪器分别是AgIIlent8453紫外分光光度计和AgIIlent CaryEclIIpse荧光分光光度计。

1.3荧光探针化合物Ⅱ性能测定实验2

探针化合物Ⅱ对肿瘤细胞与非肿瘤细胞的荧光对比试验

使用实施例1合成的化合物Ⅱ，以浓度为2.5μM的Ⅱ-DMSO溶液5μL分别加入到乳腺癌细胞(MCF-7cells)、非洲绿猴上皮细胞(COS-7cells)、宫颈癌细胞(Hela cells)、成骨细胞(OBcells)、人肝癌细胞(HepG2cells)和人正常肝细胞(LO-2cells)，在37℃，5%CO₂下将加入探针Ⅱ的这些细胞于培养基中孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，近红外激光共聚焦成像。细胞的培养密度为2×10⁵cells/mL。成像所用仪器为OlympusFV1000-IX81倒置显微镜，选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次。其中MCF-7细胞、Hela细胞和HepG2细胞是肿瘤细胞，COX-2大量表达；COS-7细胞、OB细胞和LO-2细胞是非肿瘤细胞，基本不含有COX-2。图3(a)-(f)分别为加入探针Ⅱ后MCF-7细胞、COS-7细胞、Hela细胞、OB细胞、HepG2细胞、LO-2细胞的聚焦图片。图片收集波段645-700nm。

成像显示肿瘤细胞中都有很强的荧光信号，而非肿瘤细胞中基本无荧光信号。COX-2在正常情况下不表达，当机体处于癌症时，才会过度表达。当其表达量达到一定程度后，COX-2将以二聚体的形成存在，并且在其二聚体的中间形成一个大的疏水空腔识别基团。所以，在正常细胞中不表现荧光，推测是分子呈折叠状态，可发生激发态分子内电子转移。而在肿瘤细胞中表现强的荧光，是因为抑制基团进入到COX-2的疏水空腔中，并与其特定位点结合，导致分子呈伸展状态，分子内电子转移被抑制，荧光团荧光恢复。因此，与酶作用前后有着荧光变化的过程，能够更加灵敏准确地反应出COX-2表达量异常变化的靶细胞。

1.4荧光探针化合物Ⅱ性能测定实验3

探针化合物Ⅱ在癌细胞和正常细胞中的选择性和稳定性

为了验证染料分子对癌细胞特异性选择，首先需要验证染料分子Ⅱ在对肿瘤细胞和正常细胞选择性成像能力。将2.5μM荧光探针Ⅱ分别加入到培养着乳腺癌细胞(MCF-7cells)、宫颈癌细胞(Hela cells)和非洲绿猴上皮细胞(COS-7cells)的培养皿中。每隔一段时间进行一次共聚焦成像，观察细胞内荧光强度的变化。结果表示，染料分子Ⅱ对肿瘤细胞均在短时间内就有了明显的荧光信号，且荧光信号在2h内稳定不变；而对非肿瘤细胞，如非洲绿猴上皮细胞（COS-7cells）在2h内没有明显的荧光响应（如图4所示）。另外，对染料分子的孵育时间延长，染料分子Ⅱ对肿瘤细胞的荧光信号一般在30min中就能达到最大，且能够稳定存在长达120min；对非肿瘤细胞的荧光信号在120min内都没有明显的荧光响应。这些结果说明染料分子Ⅱ对肿瘤细胞特异性识别。为了能够量化染料分子Ⅱ在细胞内的荧光强度变化，从每张图中选取10个区域计算其相对荧光强度平均值，如图4所示。文献报道，酶联免疫法对上述实验中使用的细胞进行了COX-2细胞内定量检测，发现在肿瘤细胞内COX-2的表达均很高，而在非肿瘤细胞中COX-2的表达量均很低，所以，随着COX-2含量的增加，荧光强度增强，与成像结果相符合，证明了成像结果的可靠性。

1.5荧光探针化合物Ⅱ性能测定实验4

探针化合物Ⅱ的细胞定位试验

选取MCF-7细胞为研究对象，在细胞内加入荧光探针Ⅱ(2.5μM)和染料NBDC6-ceramide(5.0μM)，并且在37℃、5%CO₂条件下孵育0.5h。随后移去培养基，用PBS清洗2-3遍，加入一定体积的新DMEM培养基后在荧光显微镜下进行观察。激光激发波长为635nm(Ⅱ)、488nm(NBD C6-ceramide)。荧光强度信号收集波长范围分别是645-700nm(Ⅱ)、500-540nm(NBD C6-ceramide)。为了确定染料分子Ⅱ的细胞内染色位置，将染料分子Ⅱ和商业化的高尔基体NBD C6-ceramide染色位置进行了对比分析。如图5所示，ANQ-IMC6染色位置和商业化高尔基体NBD C6-ceramide染色位置基本一致。由图5a和b叠加图c可以看出，图a红色和b绿色叠加后均产生了黄色图像，而原有的绿色荧光信号和红色荧光信号均消失，这说明图5a和b染色位置是一致的，即染料分子Ⅱ的染色位置为细胞内的高尔基体。由图(d)可以看出，通过共区域化分析结果：皮尔森系数Rrs=0.96，进一步证明了染料分子Ⅱ的染色位置为细胞内的高尔基体。因此，由上述实验证明染料分子Ⅱ是一例专一的癌细胞高尔基体的近红外染料。

1.6荧光探针化合物Ⅱ性能测定实验5

探针化合物Ⅱ对癌细胞比例成像

为了确定染料分子Ⅱ是与癌细胞内的COX-2(环氧化合酶-2)作用。选取MCF-7为研究对象，分别在三组细胞内加入一定浓度梯度的塞来昔布，抑制COX-2的表达。在37℃、5%CO₂条件下孵育3h，随后移去培养基，用PBS清洗2-3遍，加入一定体积的新DMEM培养基后，加入荧光探针Ⅱ(2.5μM)，并且在37℃、5%CO₂条件下孵育0.5h。随后移去培养基，用PBS清洗2-3遍，加入一定体积的新DMEM培养基后在荧光显微镜下进行观察。激光激发波长为635nm，荧光收集范围分别是645-700nm。由图6(a)可以看出，随着塞来昔布加入量的增加，癌细胞内的荧光强度减弱。为了能够量化染料分子Ⅱ在细胞内的荧光强度变化，从每张图中选取10个区域计算其相对荧光强度平均值，如图6(b)所示。因此，说明染料分子Ⅱ是与癌细胞内的COX-2发生作用。

1.7荧光探针化合物Ⅱ性能测定实验6

探针化合物Ⅱ的毒性检测试验。

为了使得染料分子Ⅱ能够实现对细胞、组织进行生物成像，采用MTT法对染料分子Ⅱ的细胞毒性进行了测试。选取乳腺癌细胞株(MCF-7)为研究对象，以细胞的存活率来表征染料对细胞毒性大小。以1×10⁵个/mL的细胞浓度接种于96孔板内，每孔内的体积为100μL，37℃5%CO₂条件下培养24h。然后添加2.5μM染料分子Ⅱ于培养基中，每个浓度梯度设置6个复孔，设置空白对照，培养后检测细胞的存活率。检测时移去原有培养液，每孔中加入100μL3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，37℃5%CO₂条件下培养4h。然后移去培养液并加入DMSO(100μL/孔)溶解产生的蓝紫色结晶物，稍振荡后使其结晶物充分溶解，而后用酶标仪测定570nm的OD值，设定参考波长为630nm，计算细胞存活率。由测试结果显示(图7)，细胞存活率在95%以上，说明染料分子Ⅱ具有较低的细胞毒性，使其在细胞、组织等生物成像中具有潜在的可能性。

实施例2

2.1荧光探针化合物II'的合成：

（1）中间体1的合成

将N,N-二甲基间氨基苯酚(62.72mmol)加入到含有30ml浓盐酸酸和10mL水的混合溶液的圆底烧瓶中，冰浴使温度保持在-5℃。配取NaNO₂(4.36g,63.20mmol)的30mL水溶液，并缓慢滴加到烧瓶中，机械搅拌2h，过滤得棕黄色固体，用100mL饱和醋酸钠水溶液洗涤得到深红色固体中间体1，收率86%。

（2）中间体2的合成

将1-溴萘(3.11g)和己二胺(2.64g)加入到含有40ml乙二醇单甲醚溶液的圆底烧瓶中，再加入CuI(190mg)和CsCO₃(3.0g)，溶液由棕黄色变为蓝绿色。加热至125℃回流持续反应24h后停止，抽滤得棕黄色滤液，柱色谱分离得棕黄色油状液体中间体2，收率56%。

（3）中间体3的合成

将中间体1(430.77mg)和中间体2(540mg)加入到含有20ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，冰浴下充分搅拌几分钟后滴入1mL浓HCl，继续搅拌10min，撤离冰浴装置，加热至90℃回流持续反应2.5h后停止，旋干溶剂，加入50mL的乙醇溶液，放置使之结晶，抽滤得蓝色固体，柱色谱分离得蓝色固体粉末中间体3，收率50%。

（4）探针化合物II'的合成

将蓝色固体粉末中间体3(111.33mg)，吲哚美辛(115mg)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)(70mg)，HOBt·H₂O(70mg)以及4-甲基吡啶(45mg)加入到12mLDMF溶液中，室温下搅拌反应24小时，停止反应，减压蒸出大部分溶剂，柱色谱分离得深蓝色固体产品，收率68%。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)，δ:8.49(d,J=8Hz,1H),8.12(d,J=8Hz,1H),7.73(m,1H),7.63(t,J=8Hz,1H),7.50(q,2H),7.41(q,4H),6.68(d,J=12Hz,1H),6.84(d,J=4Hz,1H),6.50(s,1H),6.39(d,J=4Hz,1H),6.35(d,J=8Hz,1H),6.09(d,J=8Hz,1H),3.59(t,J=8Hz,2H),3.54(s,2H),3.43(s,3H),3.38(t,J=8Hz,2H),3.18(s,6H),2.21(s,3H)1.82–1.73(m,4H);¹³C NMR(100MHz,CD₃OD),δ:172.1,167.9,157.8,155.7,155.6,151.5,147.5,138.7,135.7,133.8,133.9,132.2,131.5,131.1,130.8,130.7,130.4,129.9,129.5,128.7,124.2,123.3,122.4,114.9,113.9,113.6,110.3,101.3,95.8,93.0,54.3,43.7,39.7,38.0,31.0,26.4,25.4,12.3ppm;TOFMS:m/z calcd for C₄₁H₃₉ClN₅O₄ ⁺:700.50,found:700.43.

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一类以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针，所述荧光探针具有如下结构通式I： 

通式I中： 

R₁和R₂各自独立地选自C_1-8烷基、C_1-6烷基磺酸基、C_1-6烷基羧酸基； 

R₃选自-(CH₂)_n-，其中n为1～8的整数； 

R₄和R₅各自独立地选自-OCH₃、-OCOCH₃和卤素。 

2.权利要求1所述的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针，其特征在于所述的n为3～7的整数。 

3.权利要求1所述的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针，其特征在于所述的n是4～6的整数。 

4.权利要求1中任一权利要求所述的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针，其特征在于所述的R₄和R₅各自独立地选自-OCH₃或卤素。 

5.权利要求4所述的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针，其特征在于所述的R₄为-OCH₃，R₅选自F或Cl。 

6.权利要求1所述的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针，其特征在于所述的R₁和R₂各自独立地选自C_1-4烷基或C_1-4烷基磺酸基。 

7.权利要求1所述的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针，选自化合物Ⅱ和II'： 

。

8.权利要求1所述的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤： 

1)1-溴萘与H₂N-R₃-NH₂按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物III： 

反应温度为80-150℃，反应时间为1-24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙二醇单甲醚、甲醇、DMF或其混合物； 

2)化合物III与式i的化合物按照摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物IV： 

反应温度为70-120℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自二氯中烷、乙醇、中醇、DMF或其混合物； 

3)使化合物IV与式ii按照摩尔比1:1-1:3反应，制备化合物I： 

反应温率为0-100℃，反应时间为12-48小时，反应溶剂为二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、DMF或其混合物，反应在有机碱存在条件下进行，以4-二中氨基吡啶为催化剂。 

9.权利要求1所述的以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针在制备生物样品标记试剂中的应用。 

10.权利要求9所述的应用，其特征在于所述的生物样品是肿瘤细胞。 

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