CN102603725A

CN102603725A - 水相中检测锌离子的近红外荧光探针及其制备和应用

Info

Publication number: CN102603725A
Application number: CN201210053802XA
Authority: CN
Inventors: 路建美; 张欠欠; 葛健锋; 孙如; 王丽华
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2032-03-02
Also published as: CN102603725B

Abstract

本发明属于小分子荧光探针领域，特别涉及一种用于检测水相中锌离子的近红外荧光探针及其制备方法及该荧光探针在生物活细胞检测中的应用。一种水相中检测锌离子的近红外荧光探针，其结构式如下所示：其中，X为卤素、高氯酸根、硝酸根、硫酸氢根。本发明所述荧光探针分子在水相中与锌离子作用后，荧光发射强度增强，具有选择性好、灵敏度高等优点。荧光光谱的发射峰在近红外区，低细胞毒性，良好的细胞膜透性。本发明所述荧光探针可用于细胞内检测锌离子及荧光成像。

Description

水相中检测锌离子的近红外荧光探针及其制备和应用

技术领域

本发明属于小分子荧光探针领域，特别涉及一种用于检测水相中锌离子的近红外荧光探针及其制备方法及该荧光探针在生物活细胞检测中的应用。

背景技术

锌作为人体必需的微量元素之一，在人体内各种生理活动中起着重要作用，可作为一种辅助因子调控蛋白质或酶的活性。缺锌时可引起神经生长发育受阻，而且会导致性器官发育迟缓。但许多试验和流行病学调查已经证实，具有重要生理作用的微量元素锌在人体内含量过高将会变利为害。因此，定量检测生命体系中的锌离子成为研究的焦点。目前，测定锌离子的方法一般是利用其还原性及其与某些有机试剂发生反应后，用原子吸收光谱法，电化学、分光光度法、化学发光法、催化动力学方法及荧光方法进行分析测定，但对于痕量元素的测定灵敏度低，选择性差，预处理操作复杂，而且费用高昂，使其大规模应用受到了一定的限制。另外，这些方法不能够实时检测生物体系中的锌离子浓度的变化。

近年来，荧光探针由于其具有选择性好、灵敏度高、响应时间快、可实现原位检测等优点，在微量物质检测方面得到很好的应用。各种能够识别锌离子的探针分子成功研制出来。然而，大部分锌离子荧光探针存在以下缺点：1.部分荧光分子探针在水溶液中溶解性差，只有在有机溶剂中或者混合溶剂中才能表现出良好的性能(参见：(a)Natali，M.；Sol di，L.；Giordani，S.Tetrahedron.2010，66，7612；(b)Helal，A.；Kim，H.-S.Tetrahedron Letters.2009，50，5510.)。2.大部分对锌离子识别的荧光探针分子处于短波长区，激发时会对细胞产生损伤，并且其发射波长位于紫外或者可见区，生物体中自发荧光对检测也产生了严重的干扰，对pH变化比较敏感，使其在应用中受到了一定的限制。因此设计合成能在水相中检测锌离子的近红外的荧光探针在实际应用中具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的荧光探针性能上的不足之处，提供一种能够准确、灵敏地检测出水相中锌离子的近红外荧光探针。

为了达到上述发明目的，本发明的技术方案为：一种水相中检测锌离子的近红外荧光探针，其结构式如下所示：

其中，X为卤素(Cl、Br、I)、高氯酸根(ClO₄)、硝酸根(NO₃)、硫酸氢根(HSO₄)。

上述近红外荧光探针的制备方法包括以下步骤：

(1)将2-氯甲基吡啶盐酸盐、氢氧化钠、N-3-甲氧基苯基-N-甲基乙二胺、相转移催化剂、碘化钾，加入水和四氢呋喃混合溶液中，室温下搅拌2-3天，制备得到中间产物N-3-甲氧基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺，其结构式为：

其中2-氯甲基吡啶盐酸盐、氢氧化钠、N-3-甲氧基苯基-N-甲基乙二胺、碘化钾的摩尔比为1∶2～3∶0.3～0.5∶1～1.5，水和四氢呋喃的体积比为0.9～1.1∶1；所述相转移催化剂为十六烷基三甲基溴化铵；

(2)在0～5℃下，将N-3-甲氧基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺和浓盐酸水溶液混合，边搅拌边分批加入亚硝酸钠，加入完毕后，继续搅拌1～2小时，制备得到中间产物N-3-甲氧基-4-亚硝基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺，其结构式为：

其中，浓盐酸水溶液浓度为5～7mol/L，每4～6分钟加入5～7g亚硝酸钠/1Kg反应体系，N-3-甲氧基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺与亚硝酸钠的摩尔比为1∶1～1.5；

(3)以体积浓度80～90％的异丙醇为溶剂，加入3-(二乙基氨基)苯酚，氮气保护下搅拌，加热至70～80℃；分批加入N-3-甲氧基-4-亚硝基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺、体积浓度80～90％异丙醇的无机酸溶液，搅拌、回流反应1～2小时，得到近红外荧光探针；其中，3-(二乙基氨基)苯酚、N-3-甲氧基-4-亚硝基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺、无机酸的摩尔比为1∶1～1.2∶1～1.1；所述无机酸选自：盐酸HCl、氢溴酸HBr、氢碘酸HI、高氯酸HClO₄、硝酸HNO₃、硫酸H₂SO₄，根据阴离子X的种类选择。

本发明提供了一种以酚噁嗪为母体，经光诱导电荷转移(PET)机制，可用于水相中检测锌离子的近红外荧光探针。对水相中的锌离子(Zn²⁺)有很好的识别效果，溶液的荧光强度与锌离子的浓度在1×10^-6M到1×10^-5M范围内有较好的线性关系；而且该近红外荧光探针的最大发射峰位于长波长区域，具有膜透性好、低毒等优点，表现出良好的实际应用性。因此，上述近红外荧光探针可以用于生物体外水相中锌离子的检测及生物活细胞和生物活组织内的锌离子的分析检测和荧光成像检测。

因此，本发明同时要求保护上述近红外荧光探针检测生物体外水相中锌离子的应用。

本发明同时要求保护上述近红外荧光探针在检测离体生物活细胞或离体生物活组织内的锌离子中的应用。

本发明同时要求保护上述近红外荧光探针在检测生物活细胞或生物活组织内的锌离子中的应用。

本发明同时要求保护上述近红外荧光探针在离体生物活细胞或离体生物活组织内的荧光成像检测中的应用。

本发明同时要求保护上述近红外荧光探针在生物活细胞或生物活组织内的荧光成像检测中的应用。

由于上述技术方案的应用，本发明和现有技术相比具有以下优点：

1.本发明合成了基于酚噁嗪衍生物作为在水相中检测锌离子的近红外荧光探针，与前人的工作相比((a)Chen，H.；Gao，W.；Zhu，M.；Gao，H.；Xue，J.；Li，Y.Chemical Communications.2010，46，8389；(b)Joseph，R.；Ramanujam，B.；Pal，H.；Rao，C.P.Tetrahedron Letters.2008，49，6257；(c)Teolato，P.；Rampazzo，E.；Arduini，M.；Mancin，F.；Tecilla，P.；Tonellato，U.Chemistry-A European Journal.2007，13，2238.)，本发明具有以下优点：荧光探针分子在水相中与锌离子作用后，荧光发射强度增强，具有选择性好、灵敏度高等优点。荧光光谱的发射峰在近红外区，低细胞毒性，良好的细胞膜透性。

2.本发明所述荧光探针可用于细胞内检测锌离子及荧光成像，为临床医学中相关疾病的诊断研究提供参考。

附图说明

图1.实施例一的荧光探针1的合成路线图；

图2.实施例一中荧光探针1在不同浓度锌离子的水溶液中的荧光图；

图3.实施例一中荧光探针1在不同浓度锌离子水溶液中的荧光强度与锌离子浓度的线性关系图；

图4.实施例二中荧光探针1在生物体外与各种金属离子作用的荧光柱形图；灰色柱：荧光探针1中加入4倍的各种金属离子后荧光的变化；黑色柱：荧光探针1中加入4倍的各种金属离子及4倍的锌离子后的荧光变化，从左到右依次为：1：Blank；2：Ag⁺；3：Ba²⁺；4：Ca²⁺；5：Co²⁺；6：Cu²⁺；7：Cd²⁺；8：Fe²⁺；9：Hg²⁺；10：K⁺；11：Mg²⁺；12：Mn²⁺；13：Na⁺；14：Ni²⁺；15：Pb²⁺；

图5.实施例三中荧光探针1在活生物细胞中的荧光成像照片；(a)以10×10^-6M探针的PBS溶液培养30分钟后的细胞明场图；(b)(a)的荧光图；(c)先用10×10^-6M锌离子溶液培养1小时后，然后用PB S溶液洗三次，最后再用10×10^-6M探针的PBS溶液培养30分钟后的细胞明场图；(d)(c)的荧光图。

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明作进一步描述：

实施例一：制备近红外荧光探针。

如图1所示，将5.6g 2-氯甲基吡啶盐酸盐，3.24g N-3-甲氧基苯基-N-甲基乙二胺(4)，2.72g氢氧化钠，109mg相转移催化剂，5.45g碘化钾，溶解在35mL水及35mL四氢呋喃的混合溶液中，上述溶液在剧烈搅拌下，室温反应2天。二氯甲烷萃取，干燥，蒸除溶剂后得粗产品。经过硅胶柱分离得到中间产物N-3-甲氧基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺(3)，为无色油状物。

表征数据为：¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δ8.53(d，J＝4.8，2H，2×Ar-H)，7.63(td，J＝7.7，1.4，2H，2×Ar-H)，7.50(d，J＝7.8，2H，2×Ar-H)，7.18-7.11(m，2H，2×Ar-H)，7.04(t，J＝8.2，1H，Ar-H)，6.21(d，J＝8.5，2H，2×Ar-H)，6.17(d，J＝2.0，1H，Ar-H)，3.91(s，4H，2×Ar-CH₂N)，3.74(s，3H，OCH₃)，3.48(t，J＝7.1，2H，NCH₂CH₂N)，2.84(s，3H，NCH₃)，2.79(t，J＝7.1，2H，NCH₂CH₂N).HRMS(ESI)calcd.for(M+H)⁺363.2107，found 363.2192.

冰水浴中，将3.62g N-3-甲氧基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺(3)溶解在8.45mL浓盐酸及8.45mL水中。搅拌条件下，每隔5分钟缓慢地向溶液中加入828mg亚硝酸钠固体粉末。滴加完毕后，再在冰水浴中反应1小时。然后用氢氧化钠溶液将反应液调成碱性(pH～10)，再用二氯甲烷萃取，干燥蒸除溶剂后得粗产品。经过硅胶柱分离得到中间产物N-3-甲氧基-4-亚硝基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺(2)，为绿色固体。表征数据为：¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：8.50(d，J＝4.7，2H，2×Ar-H)，7.61(t，J＝7.6，2H，2×Ar-H)，7.42(d，J＝7.6，2H，2×Ar-H)，7.18-7.13(m，2H，2×Ar-H)，6.51(d，J＝8.5，1H，Ar-H)，5.97(d，J＝9.6，2H，2×Ar-H)，4.03(s，3H，OCH₃)，3.93(s，4H，2×Ar-CH₂N)，3.66(s，2H，NCH₂CH₂N)，3.00(s，3H，NCH₃)，2.88(t，J＝6.8，2H，NCH₂CH₂N).HRMS(ESI)calcd.for(M+H)⁺392.2008，found392.2081.

氮气保护下，将495.69mg 3-(二乙基氨基)苯酚溶解在6mL 90％异丙醇中加热至80℃。然后将1.17g N-3-甲氧基-4-亚硝基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺(2)、3.0mmol高氯酸溶解在45mL 90％异丙醇中，并将其在1小时内分批加入到上述反应液中，回流1-2小时。反应完后蒸除溶剂后得粗产品，经过硅胶柱分离得到深蓝色固体，即为荧光探针(1)；将反应体系中高氯酸依次替换为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸可得荧光探针(2-6)。

所述近红外荧光探针的结构式如下：

其中，荧光探针1的表征数据为：¹HNMR(400MHz，CD₃OD)：8.44(d，J＝4.8，2H，2×Ar-H)，7.80-7.70(m，3H，3×Ar-H)，7.65(s，1H，Ar-H)，7.51(d，J＝7.8，2H，2×Ar-H)，7.41(dd，J＝9.7，2.4，1H，Ar-H)，7.25-7.17(m，3H，3×Ar-H)，6.94(s，1H，Ar-H)，6.77(d，J＝2.2，1H，Ar-H)，3.91-3.84(m，6H，NCH₂CH₂N，2×Ar-CH₂N)，3.80(q，J＝7.1，4H，2×N-CH₂CH₃)，3.24(s，3H，NCH₃)，2.91(t，J＝6.1，2H，NCH₂CH₂N)，1.37(t，J＝7.1，6H，2×N-CH₂CH₃).HRMS(ESI)calcd.for(M-ClO₄)⁺507.2867，found 507.2867.

其中，荧光探针2的表征数据为：¹HNMR(400MHz，CD₃OD)：8.44(d，J＝4.8，2H，2×Ar-H)，7.80-7.70(m，3H，3×Ar-H)，7.65(s，1H，Ar-H)，7.51(d，J＝7.8，2H，2×Ar-H)，7.41(dd，J＝9.7，2.4，1H，Ar-H)，7.25-7.17(m，3H，3×Ar-H)，6.94(s，1H，Ar-H)，6.77(d，J＝2.2，1H，Ar-H)，3.91-3.84(m，6H，NCH₂CH₂N，2×Ar-CH₂N)，3.80(q，J＝7.1，4H，2×N-CH₂CH₃)，3.24(s，3H，NCH₃)，2.91(t，J＝6.1，2H，NCH₂CH₂N)，1.37(t，J＝7.1，6H，2×N-CH₂CH₃).HRMS(ESI)calcd.for(M-Cl)⁺507.2867，found 507.2867.

其中，荧光探针3的表征数据为：¹HNMR(400MHz，CD₃OD)：8.44(d，J＝4.8，2H，2×Ar-H)，7.80-7.70(m，3H，3×Ar-H)，7.65(s，1H，Ar-H)，7.51(d，J＝7.8，2H，2×Ar-H)，7.41(dd，J＝9.7，2.4，1H，Ar-H)，7.25-7.17(m，3H，3×Ar-H)，6.94(s，1H，Ar-H)，6.77(d，J＝2.2，1H，Ar-H)，3.91-3.84(m，6H，NCH₂CH₂N，2×Ar-CH₂N)，3.80(q，J＝7.1，4H，2×N-CH₂CH₃)，3.24(s，3H，NCH₃)，2.91(t，J＝6.1，2H，NCH₂CH₂N)，1.37(t，J＝7.1，6H，2×N-CH₂CH₃).HRMS(ESI)calcd.for(M-Br)⁺507.2867，found 507.2867.

其中，荧光探针4的表征数据为：¹HNMR(400MHz，CD₃OD)：8.44(d，J＝4.8，2H，2×Ar-H)，7.80-7.70(m，3H，3×Ar-H)，7.65(s，1H，Ar-H)，7.51(d，J＝7.8，2H，2×Ar-H)，7.41(dd，J＝9.7，2.4，1H，Ar-H)，7.25-7.17(m，3H，3×Ar-H)，6.94(s，1H，Ar-H)，6.77(d，J＝2.2，1H，Ar-H)，3.91-3.84(m，6H，NCH₂CH₂N，2×Ar-CH₂N)，3.80(q，J＝7.1，4H，2×N-CH₂CH₃)，3.24(s，3H，NCH₃)，2.91(t，J＝6.1，2H，NCH₂CH₂N)，1.37(t，J＝7.1，6H，2×N-CH₂CH₃).HRMS(ESI)calcd.for(M-I)⁺507.2867，found 507.2867.

其中，荧光探针5的表征数据为：¹HNMR(400MHz，CD₃OD)：8.44(d，J＝4.8，2H，2×Ar-H)，7.80-7.70(m，3H，3×Ar-H)，7.65(s，1H，Ar-H)，7.51(d，J＝7.8，2H，2×Ar-H)，7.41(dd，J＝9.7，2.4，1H，Ar-H)，7.25-7.17(m，3H，3×Ar-H)，6.94(s，1H，Ar-H)，6.77(d，J＝2.2，1H，Ar-H)，3.91-3.84(m，6H，NCH₂CH₂N，2×Ar-CH₂N)，3.80(q，J＝7.1，4H，2×N-CH₂CH₃)，3.24(s，3H，NCH₃)，2.91(t，J＝6.1，2H，NCH₂CH₂N)，1.37(t，J＝7.1，6H，2×N-CH₂CH₃).HRMS(ESI)calcd.for(M-NO₃)⁺507.2867，found 507.2867.

其中，荧光探针6的表征数据为：¹HNMR(400MHz，CD₃OD)：8.44(d，J＝4.8，2H，2×Ar-H)，7.80-7.70(m，3H，3×Ar-H)，7.65(s，1H，Ar-H)，7.51(d，J＝7.8，2H，2×Ar-H)，7.41(dd，J＝9.7，2.4，1H，Ar-H)，7.25-7.17(m，3H，3×Ar-H)，6.94(s，1H，Ar-H)，6.77(d，J＝2.2，1H，Ar-H)，3.91-3.84(m，6H，NCH₂CH₂N，2×Ar-CH₂N)，3.80(q，J＝7.1，4H，2×N-CH₂CH₃)，3.24(s，3H，NCH₃)，2.91(t，J＝6.1，2H，NCH₂CH₂N)，1.37(t，J＝7.1，6H，2×N-CH₂CH₃).HRMS(ESI)calcd.for(M-HSO₄)⁺507.2867，found 507.2867.

实施例二：锌离子近红外荧光探针1(X＝ClO₄)的性能实验。

将合成的荧光探针配成含有1％DMSO的缓冲液母液，然后用缓冲溶液稀释至相应的浓度，对其性能进行测试。

(1)锌离子荧光探针灵敏性分析：

将荧光探针(1)分别加入到不同浓度锌离子的水溶液中，探针浓度为10×10^-6M，由图2可以看出加入锌离子后荧光发射强度逐渐增强，由图2可得图3。由图3可以看出荧光探针的荧光强度与锌离子浓度在1×10^-6M到1×10^-5M范围内成较好的线性关系，从而使得定量检测锌离子浓度成为可能。

(2)锌离子荧光探针选择性分析：

将荧光探针1分别加入到各种金属离子的水溶液中，探针浓度为10×10^-6M，然后应用荧光检测仪测定相应的荧光发射强度，得图4，由图4可以看出Cu²⁺，Ni²⁺使得荧光有一定的猝灭，尽管Hg²⁺，Cd²⁺离子也可以使得荧光增强，但荧光探针对锌离子(Zn²⁺)识别后荧光增强更加明显，而且这三种离子在生物体内竞争的可能性较小。

实施例三：应用上述荧光探针进行活细胞中的荧光成像。

荧光探针对细胞内锌离子的检测见图5，从图中可以看出，荧光探针可排除细胞自发荧光的干扰，可用于生物体系中锌离子的检测及生物活细胞中的锌离子荧光成像。

综上所述，本发明的锌离子近红外荧光探针水溶性，具有较好的灵敏性，检测样品的前处理十分简单，发射波长处在长波长区域，因此可用于生物活细胞中锌离子检测和荧光成像。

应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下，本领域的技术人员应意识到，对本发明的各实施例方案所进行的一定的改变，都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。

Claims

1.一种水相中检测锌离子的近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针的结构式如下所示：

其中，X为卤素、高氯酸根、硝酸根、硫酸氢根。

2.权利要求1所述近红外荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

其中，2-氯甲基吡啶盐酸盐、氢氧化钠、N-3-甲氧基苯基-N-甲基乙二胺、碘化钾的摩尔比为1∶2～3∶0.3～0.5∶1～1.5，水和四氢呋喃的体积比为0.9～1.1∶1；所述相转移催化剂为十六烷基三甲基溴化铵；

(3)以体积浓度80～90％的异丙醇为溶剂，加入3-(二乙基氨基)苯酚，氮气保护下搅拌，加热至70～80℃；分批加入N-3-甲氧基-4-亚硝基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺、体积浓度80～90％异丙醇的无机酸溶液，搅拌、回流反应1～2小时，得到近红外荧光探针；其中，3-(二乙基氨基)苯酚、N-3-甲氧基-4-亚硝基苯基-N-甲基-N’，N’-二(2-亚甲基吡啶)乙二胺、无机酸的摩尔比为1∶1～1.2∶1～1.1。

3.权利要求1所述近红外荧光探针检测生物体外水相中锌离子的应用。

4.权利要求1所述近红外荧光探针在检测离体生物活细胞或离体生物活组织内的锌离子中的应用。

5.权利要求1所述近红外荧光探针在检测生物活细胞或生物活组织内的锌离子中的应用。

6.权利要求1所述近红外荧光探针在离体生物活细胞或离体生物活组织内的荧光成像检测中的应用。

7.权利要求1所述近红外荧光探针在生物活细胞或生物活组织内的荧光成像检测中的应用。