CN103435748A - 一种在纯水介质中循环使用的Zn2+探针的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备方法及应用，属于荧光探针领域。本发明提供了一种以三联吡啶聚合物作为受体分子，用于在纯水介质中检测Zn²⁺的荧光探针，且该探针能够循环使用，最大循环次数可达40次。该探针对Zn²⁺具有很好的选择识别能力，对其它的金属离子对其检测几乎没有影响。本发明中Zn²⁺探针在纯水介质中对锌离子的检测极限为1×10^-6mol/L。本发明的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针可用于生物体系中锌离子的检测，生物活细胞和活组织内的锌离子分析检测及荧光成像，临床医学上病变组织中锌离子的检测，以及环境废水中锌离子的检测。

Description

一种在纯水介质中循环使用的Zn2+探针的制备方法及应用

技术领域

本发明属于荧光探针领域，特别涉及一种在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备方法及应用。

背景技术

锌是人体必需的微量元素之一，其在人体生命活动的诸多领域起着重要的作用，例如：锌能提高人体的免疫功能，并能达到抗衰老的作用；锌可作为一种辅助因子调控蛋白质和酶的活性；微量的锌可强化记忆力，延缓脑的衰老；另外，锌还具有神经调节功能，缺锌时可引起神经生长发育受阻，而且会导致性器官发育迟缓，表现为前列腺和精囊发育不全，精子减少，导致性生理机能降低。锌离子的分析测定一般是利用其还原性及锌离子与某些化学试剂发生反应后，通过原子吸收光谱、化学发光法、电化学方法、催化动力学方法以及荧光方法进行分析检测，这些方法不能够对生物体内锌离子进行实时、原位动态检测，而且灵敏度不高、选择性较差、样品的预处理发展，使得其应用受到一定的限制。

近年来发展起来的荧光化学传感器使荧光探针的方法和应用受到了极大关注，其在药物学、药理学、环境科学以及信息科学等领域具有广阔的应用前景。荧光化学传感器，又称荧光探针，主要是依靠荧光信号为检测手段，通过荧光的增强、淬灭或者荧光波长的移动来对物质进行检测分析。荧光探针的检测机理主要是通过探针受体部分对检测成分（包括阴阳离子以及中性分子等）的选择性接纳，然后通过光诱导电子或能量转移（PET）、金属-配体电荷转移（MLCT）、分钟内电荷转移(ICT)以及形成氢键、配位键等作用使得探针受体分子的荧光发生变化，从而达到对外来物质的分析检测。荧光探针由于其选择性好、灵敏度高以及响应时间快等优点，使其在微量检测方面得到了广泛应用。

虽然目前已有大量的锌离子荧光探针报道，但是大部分探针都是在有机溶剂作为介质的情况下工作的，而且这些探针几乎都不能够循环使用，这样的探针不仅成本较高，而且对环境的的危害极大。

发明内容

为了克服现有锌离子荧光探针性能和结构上的不足，本发明的首要目的在于提供一种在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针。本发明的Zn²⁺探针性能优良，且能够在水相进行循环使用。

本发明的另一目的在于提供上述在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在纯水介质中对Zn²⁺进行循环检测的方法。

本发明的再一目的在于提供上述在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针，是由式Ⅰ结构式所示的PAA-TPY聚合物制备获得。

式Ⅰ；

其中，R为

结构单元中的一种，R₁为H,

中的一种，R₂为-H或-CH₃；其中，n和m为反应单体的重复单元数目，三个相互共轭的吡啶环作为Zn²⁺的有效识别位点。

所述的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备方法如下：

（一）将含有不同R基团的可聚合物三联吡啶（vinyl-TPY）单体和含有不同R₁、R₂基团的可聚合丙烯酰胺（AA）单体按1：1～100的摩尔比例加入到聚合物管中，加入有机溶剂完全溶解，然后再加入自由基引发剂，在惰性气体气氛、60～80℃下反应10～72h，再经重沉淀、过滤、提取、干燥、脱溶剂后即得粉末状PAA-TPY聚合物；

（二）为了制备得到可循环利用的Zn²⁺探针材料，将步骤（一）中的PAA-TPY聚合物用低沸点有机溶剂溶解，利用长宽尺寸为1×4cm的石英玻璃片作为基底材料，然后旋涂成膜，成膜厚度为0.1～10μm，烘干后得能够在纯水介质中循环使用的膜材料作为Zn²⁺探针；

步骤（一）中所述的含有不同R基团的可聚合物三联吡啶（vinyl-TPY）单体的结构式如式Ⅱ所示：

式Ⅱ；

其中，R为

结构单元中的一种；

步骤（一）中所述的含有不同R₁、R₂基团的可聚合丙烯酰胺（AA）单体的结构如式Ⅲ所示：

式Ⅲ；

其中，R₁为H,中的一种，R₂为-H或-CH₃。

步骤（一）中所述的有机溶剂为THF、二氯甲烷、三氯甲烷或DMF中的一种，聚合单体总质量与有机溶剂体积的比例为0.1克：1～10mL；

步骤（一）中所述的自由基引发剂为偶氮类或者过氧化物类引发剂，自由基引发剂的质量为vinyl-TPY和AA总质量的0.1～5％；

步骤（二）中所述的低沸点有机溶剂为THF、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种或多种；

步骤（二）中所述的PAA-TPY聚合物与低沸点有机溶剂的比例为0.01g～0.02g：2～3ml；

所述的含有不同R基团的可聚合物三联吡啶（vinyl-TPY）单体的制备方法如下：

（1）将式Ⅱ所示相应的对羟基苯甲醛衍生物10mmol和4-乙烯基苄氯10mmol加入到一100mL单口烧瓶中，用50mL有机溶剂完全溶解，然后加入5～20mmol强碱，室温搅拌2～15小时，反应结束后将所得溶液加入到80～400mL蒸馏水中，得大量沉淀，过滤，分别用适量蒸馏水洗涤3次，真空烘干；将烘干产物用正己烷或环己烷洗涤三次，所得固体烘干，得产物4-(4-乙烯基苄氧基)苯甲醛衍生物；

（2）将步骤（1）所制备的4-(4-乙烯基苄氧基)苯甲醛衍生物10mmol和2-乙酰吡啶20mmol一起加入到带有磁力搅拌的250mL三口瓶中，然后加入40～120mL无水乙醇，超声让反应物完全溶解，随后加入10～30mmol强碱和10～35mmol氨水溶液，室温搅拌3～15小时，反应结束后过滤，所得固体用无水乙醇分三次洗涤，烘干得目标化合物vinyl-TPY，为乳白色固体粉末。

步骤（1）中所述的有机溶剂为THF、DMF、二氯甲烷或者三氯甲烷中的一种；

步骤（1）中所述的强碱为叔丁醇钾、氢氧化钾或氢氧化钠中的一种；

步骤（2）中所述的强碱为叔丁醇钾、氢氧化钾或氢氧化钠中的一种；

步骤（2）中所述的用正己烷或环己烷洗涤三次是为了除去过量的4-乙烯基苄氯；

所述的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在纯水介质中对Zn²⁺进行循环检测的方法，是通过以下步骤实现的：

①将制备好的石英玻璃作为基体的Zn²⁺探针膜材料置于1×4cm的比色皿中，然后加入配制好的1×10^-6～1mol/L的Zn²⁺水溶液，静置1～10min钟后开始测试其荧光发射光谱；

②步骤①完成后，利用蒸馏水将膜材料洗净，然后将洗净的膜材料放置在配制好的1×10^-4～0.1mol/L的EDTA水溶液中浸泡2～15min，取出用蒸馏水洗干净，将洗净的膜探针材料进行荧光测试；

③步骤②荧光测试完成后，加入步骤①中的Zn²⁺水溶液，再次进行荧光测试；依次重复①、②、③步骤，完成膜材料在纯水介质中对Zn²⁺的循环检测。

步骤①中所述的Zn²⁺水溶液配制时所用的无机盐为氯化锌、乙酸锌、硝酸锌或硫酸锌中的一种。

本发明所述在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在纯水介质中对Zn²⁺进行循环检测方法的机理如式Ⅳ所示：

式Ⅳ；

式Ⅳ中，当聚合物PAA-TPY溶液中加入Zn²⁺时，PAA-TPY中的三联吡啶单元与Zn²⁺离子发生配位，形成了PPA-TPY-Zn配合物，从而使PAA-TPY的荧光强度大大增强，并发生红移，由原先位于440nm附近的蓝光发射红移至位于510nm附近的绿光发射；当EDTA加入后，由于EDTA与Zn²⁺的配位能力远大于PAA-TPY与Zn²⁺的配位能力，因此PAA-TPY-Zn失去Zn²⁺返回到最初的PAA-TPY，从而使得Zn²⁺探针具有循环使用的能力，其循环使用次数达10～40次。

本发明的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在制备生物体系中锌离子的检测，生物活细胞和活组织内的锌离子分析检测及荧光成像，临床医学上病变组织中锌离子的检测，以及环境废水中锌离子的检测的试剂中应用。

本发明提供了一种以三联吡啶聚合物作为受体分子，用于在纯水介质中检测Zn²⁺的荧光探针，且该探针能够多次循环使用。该探针对Zn²⁺具有很好的选择识别能力，其它的金属离子对其检测几乎没有影响。本发明中一种在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在纯水介质中对锌离子的检测极限为1×10^-6mol/L，其荧光发射峰范围为440～520nm，表现出了良好的实际应用性。该系列探针分子结构简单且高效，容易推广于实际应用。

本发明设计合成的基于三联吡啶聚合物PAA-TPY的在纯水介质中对Zn²⁺进行识别检测的荧光探针，与前人的工作相比（Li Lin-Bo,Ji Shun-Jun,Lu Wei-Hong.Chinese Journal of Chmeistry,2008,26,417-420；Yin Shouchun,Zhang Jing,FengHaike.Dyes and Pigments,2012,95,174-179；Dmitry S.Kopchuk,Anton M.Prokhorov,Pavel A.Slepukhin,Dmitry N.Kozhevnikov.Tetrahedron Letters,2012,53,6265–6268.），本发明的荧光探针具有如下的优点：该探针在纯水介质中对Zn²⁺进行识别检测，对环境无污染；对Zn²⁺进行检测时，聚合物PAA-TPY的荧光强度大幅度增加且向长波方向移动约80nm；在EDTA的作用下，本发明所涉及的荧光探针能够有效地循环使用，使用次数最高可达10次以上，具有经济环保等特别的优势。综上所述，本发明一种在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在药物学、药理学、环境科学以及信息科学等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例5中F-1探针在日光灯和紫外灯365nm照射下的成像图。

图2是实施例5中F-1探针在纯水介质中与Zn²⁺作用后在紫外灯365nm照射下的成像图。

图3是实施例5中荧光探针F-1加入到各种金属离子水溶液中的发射光谱变化情况图。

图4是实施例5中荧光探针F-1在纯水介质中对Zn²⁺循环检测的荧光发射光谱变化图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本实施方案所用原料为已知化合物，可在市场上购得，或可用本领域已知的方法合成。

实施例1.

所述的含有芳环的可聚合物三联吡啶（vinyl-TPY）单体的制备方法如下：

（1）将式Ⅱ所示的对羟基苯甲醛衍生物10mmol和4-乙烯基苄氯10mmol加入到一100mL单口烧瓶中，用50mL有机溶剂完全溶解，然后加入15mmol强碱，室温搅拌8小时，反应结束后将所得溶液加入到200mL蒸馏水中，得大量沉淀，过滤，分别用适量蒸馏水洗涤3次，真空烘干；为了除去过量的4-乙烯基苄氯，将烘干产物分别用适量的正己烷或环己烷洗涤三次，所得固体烘干，得产物4-(4-乙烯基苄氧基)苯甲醛衍生物；

（2）将步骤（1）所制备的4-(4-乙烯基苄氧基)苯甲醛衍生物10mmol和2-乙酰吡啶20mmol一起加入到带有磁力搅拌的250mL三口瓶中，然后加入100mL无水乙醇，超声让反应物完全溶解，随后加入20mmol氢氧化钾和30mmol氨水溶液，室温搅拌12小时，反应结束后过滤，所得固体用无水乙醇分三次洗涤，烘干得目标化合物vinyl-TPY，为乳白色固体粉末。

实施例2.三联吡啶聚合物PAA-TPY的制备（P1）（n：m=1:100）

将2.5克N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）和0.11克实施例1制备获得的vinyl-TPY加入到聚合管中，然后加入24.5毫克引发剂AIBN(约单体总质量的1%)，用10mL DMF溶解，如果溶解困难，则超声至完全溶解，然后冲放氩气5次，每次约2分钟，最后封管，65℃条件下搅拌反应24小时，所得溶液用5mLDMF稀释，然后逐滴加入到50mL石油醚中重沉淀，重沉淀重复操作三次，过滤得固体粉末，烘干得目标产物P1。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ9.18,8.69,8.32,6.67,4.95,3.96,3.06,2.21,1.78,1.62,1.12.¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ174.5,170.69,162.55,128.553,115.16,88.79,42.28,41.23,36.42,35.13,22.46.P1的化学结构如式Ⅴ所示：

式Ⅴ。

实施例3.三联吡啶聚合物PAA-TPY的制备(P2)（n：m=5:100）

将2.51克NIPAAm和0.50克vinyl-TPY加入到聚合管中，然后加入29.7毫克引发剂AIBN(约单体总质量的1%)，用10mL DMF溶解，如果溶解困难，则超声至完全溶解，然后冲放氩气5次，每次约2分钟，最后封管，65℃条件下搅拌反应24小时，所得溶液用5mL DMF稀释，然后逐滴加入到60mL石油醚中重沉淀，重沉淀重复操作三次，过滤得固体粉末，烘干得目标产物P2。¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ8.70,7.87,7.34,6.92,6.57,5.01,3.95,3.07,2.05,1.76,1.61,1.09.¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ174.43,170.61,162.46,159.55,156.04,148.85,136.76,128.34,123.84,121.21,118.05,114.96,69.67,42.14,22.34.P2的化学结构如式Ⅵ所示：

式Ⅵ。

实施例4.三联吡啶聚合物PAA-TPY的制备(P3)（n：m=10:100）

将2.51克NIPAAm和0.99克vinyl-TPY加入到聚合管中，然后加入38毫克引发剂AIBN(约单体总质量的1%)，用12mL DMF溶解，如果溶解困难，则超声至完全溶解，然后冲放氩气5次，每次约2分钟，最后封管，65℃条件下搅拌反应24小时，所得溶液用6mL DMF稀释，然后逐滴加入到80mL石油醚中重沉淀，重沉淀重复操作三次，过滤得固体粉末，烘干得目标产物P3。¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ9.07,7.99,6.92,6.53,5.03,3.98,1.83,1.11.¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ174.50,170.66,162.51,159.59,156.15,148.92,136.78,128.41,123.68,121.26,118.12,115.01,69.72,41.21,22.43.P3的化学结构如式Ⅶ所示：

式Ⅶ。

实施例5.在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备及Zn²⁺检测

用2mL四氢呋喃将0.01克实施例1中得到的P1完全溶解，然后将其旋涂在石英玻璃片上得到0.5微米厚的聚合物膜（F-1），F-1为透明聚合物膜，在紫外灯365nm照射下呈浅蓝色发射（如图1）。将F-1置于1×4cm的比色皿中，然后加入配制好的1×10^-3mol/L的Zn²⁺水溶液，静置2min钟后开始测试其荧光发射光谱，此时的F-1在紫外灯365nm照射下呈绿光发射（如图2），测试完成后利用蒸馏水将膜材料洗净，然后将洗净的膜材料放置在配制好的1×10^-2mol/L的EDTA水溶液中浸泡5min，取出用蒸馏水洗干净，将洗净的膜探针材料进行荧光测试。荧光测试完成后，再次加入Zn²⁺水溶液并进行荧光测试。依次重复这样的操作，完成膜材料在纯水介质中对Zn²⁺的循环检测。

将荧光探针F-1加入到各种金属离子水溶液中，由图3可以看出F-1对Zn²⁺具有很专一的荧光增强识别效果，加入Zn²⁺后F-1的荧光增强了约6倍，且由未加入Zn²⁺之前的蓝光发射（440nm）红移至绿光发射（510nm），而加入其它金属离子后发射光谱几乎没有变化。

荧光探针F-1在纯水介质中循环利用的荧光发射光谱变化如图4所示，由附图4可知，荧光探针F-1在纯水介质中在EDTA的作用下具有很好的循环利用能力，最大循环次数可达40次。

实施例6.在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备及Zn²⁺检测

用3mL四氢呋喃将0.02克实施例2中得到的P2完全溶解，然后将其旋涂在石英玻璃片上得到约为1微米厚的聚合物膜，将制备好的石英玻璃作为基体的膜置于1×4cm的比色皿中，然后加入配制好的1×10^-4mol/L的Zn²⁺水溶液，静置1min钟后开始测试其荧光发射光谱。测试完成后利用蒸馏水将膜材料洗净，然后将洗净的膜材料放置在配制好的1×10^-3mol/L的EDTA水溶液中浸泡5min，取出用蒸馏水洗干净，将洗净的膜探针材料进行荧光测试。荧光测试完成后，再次加入Zn²⁺水溶液并进行荧光测试。依次重复这样的操作，完成膜材料在纯水介质中对Zn²⁺的循环检测。

实施例7.在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备及Zn²⁺检测

用3mL四氢呋喃将0.01克实施例3中得到的P3完全溶解，然后将其旋涂在石英玻璃片上得到约为0.8微米厚的聚合物膜，将制备好的石英玻璃作为基体的膜置于1×4cm的比色皿中，然后加入配制好的1×10^-5mol/L的Zn²⁺水溶液，静置1min钟后开始测试其荧光发射光谱。测试完成后利用蒸馏水将膜材料洗净，然后将洗净的膜材料放置在配制好的1×10^-3mol/L的EDTA水溶液中浸泡5min，取出用蒸馏水洗干净，将洗净的膜探针材料进行荧光测试。荧光测试完成后，再次加入Zn²⁺水溶液并进行荧光测试。依次重复这样的操作，完成膜材料在纯水介质中对Zn²⁺的循环检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针，其特征在于是由式Ⅰ结构式所示的PAA-TPY聚合物制备获得：

式Ⅰ；

其中，R为

结构单元中的一种，R₁为H,

中的一种，R₂为-H或-CH₃；其中，n和m为反应单体的重复单元数目，三个相互共轭的吡啶环作为Zn²⁺的有效识别位点。

2.权利要求1所述的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备方法，其特征在于制备方法如下：

（一）将含有不同R基团的可聚合物三联吡啶单体和含有不同R₁、R₂基团的可聚合丙烯酰胺单体按1：1～100的摩尔比例加入到聚合物管中，加入有机溶剂完全溶解，然后再加入自由基引发剂，在惰性气体气氛、60～80℃下反应10～72h，再经重沉淀、过滤、提取、干燥、脱溶剂后即得粉末状PAA-TPY聚合物；

（二）为了制备得到可循环利用的Zn²⁺探针材料，将步骤（一）中的PAA-TPY聚合物用低沸点有机溶剂溶解，利用长宽尺寸为1×4cm的石英玻璃片作为基底材料，然后旋涂成膜，成膜厚度为0.1～10μm，烘干后得能够在纯水介质中循环使用的膜材料作为Zn²⁺探针；

步骤（一）中所述的含有不同R基团的可聚合物三联吡啶单体的结构式如式Ⅱ所示：

式Ⅱ；

其中，R为

结构单元中的一种；

步骤（一）中所述的含有不同R₁、R₂基团的可聚合丙烯酰胺单体的结构如式Ⅲ所示：

式Ⅲ；

其中，R₁为H，

中的一种，R₂为-H或-CH₃。

3.根据权利要求2所述的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备方法，其特征在于：

步骤（一）中所述的有机溶剂为THF、二氯甲烷、三氯甲烷或DMF中的一种，聚合单体总质量与有机溶剂体积的比例为0.1克：1～10mL；

步骤（一）中所述的自由基引发剂为偶氮类或者过氧化物类引发剂，自由基引发剂的质量为可聚合物三联吡啶单体和可聚合丙烯酰胺单体总质量的0.1～5％；

步骤（二）中所述的低沸点有机溶剂为THF、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种或多种；

步骤（二）中所述的PAA-TPY聚合物与低沸点有机溶剂的比例为0.01g～0.02g：2～3ml。

4.根据权利要求2所述的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备方法，其特征在于：所述的含有不同R基团的可聚合物三联吡啶单体的制备方法如下：

（1）将式Ⅱ所示相应的对羟基苯甲醛衍生物10mmol和4-乙烯基苄氯10mmol加入到一100mL单口烧瓶中，用50mL有机溶剂完全溶解，然后加入5～20mmol强碱，室温搅拌2～15小时，反应结束后将所得溶液加入到80～400mL蒸馏水中，得大量沉淀，过滤，分别用适量蒸馏水洗涤3次，真空烘干；将烘干产物用正己烷或环己烷洗涤三次，所得固体烘干，得产物4-(4-乙烯基苄氧基)苯甲醛衍生物；

（2）将步骤（1）所制备的4-(4-乙烯基苄氧基)苯甲醛衍生物10mmol和2-乙酰吡啶20mmol一起加入到带有磁力搅拌的250mL三口瓶中，然后加入40～120mL无水乙醇，超声让反应物完全溶解，随后加入10～30mmol强碱和10～35mmol氨水溶液，室温搅拌3～15小时，反应结束后过滤，所得固体用无水乙醇分三次洗涤，烘干得目标化合物含有不同R基团的可聚合物三联吡啶单体，为乳白色固体粉末。

5.根据权利要求4所述的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的有机溶剂为THF、DMF、二氯甲烷或者三氯甲烷中的一种；

步骤（1）中所述的强碱为叔丁醇钾、氢氧化钾或氢氧化钠中的一种；

步骤（2）中所述的强碱为叔丁醇钾、氢氧化钾或氢氧化钠中的一种。

6.权利要求1所述的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在纯水介质中对Zn²⁺进行循环检测的方法，其特征在于是通过以下步骤实现的：

○1将制备好的石英玻璃作为基体的Zn²⁺探针膜材料置于1×4cm的比色皿中，然后加入配制好的1×10^-6～1mol/L的Zn²⁺水溶液，静置1～10min钟后开始测试其荧光发射光谱；

2○步骤○1完成后，利用蒸馏水将膜材料洗净，然后将洗净的膜材料放置在配制好的1×10^-4～0.1mol/L的EDTA水溶液中浸泡2～15min，取出用蒸馏水洗干净，将洗净的膜探针材料进行荧光测试；

3○步骤2○荧光测试完成后，加入步骤○1中的Zn²⁺水溶液，再次进行荧光测试；依次重复○1、2○、3○步骤，完成膜材料在纯水介质中对Zn²⁺的循环检测；

步骤○1中所述的Zn²⁺水溶液配制时所用的无机盐为氯化锌、乙酸锌、硝酸锌或硫酸锌中的一种。

7.根据权利要求6所述的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在纯水介质中对Zn²⁺进行循环检测的方法，其特征在于：在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在纯水介质中对锌离子的检测极限为1×10^-6mol/L，其荧光发射峰范围为440～520nm。

8.根据权利要求6或7所述的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在纯水介质中对Zn²⁺进行循环检测的方法，其特征在于：所述的Zn²⁺探针具有循环使用的能力，其循环使用次数达10～40次。

9.权利要求1所述的在纯水介质中循环使用的Zn²⁺探针在制备生物体系中锌离子的检测，生物活细胞和活组织内的锌离子分析检测及荧光成像，临床医学上病变组织中锌离子的检测，以及环境废水中锌离子的检测的试剂中应用。

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