CN107365289B - 一种次氯酸响应型荧光传感材料的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学荧光传感材料技术领域，涉及一种次氯酸响应型荧光传感材料的制备方法和用途。本发明提供一种次氯酸响应型荧光传感材料，所述材料是由6‑羧基香豆素和氨基硫脲作为基础原料，无水甲醇作为溶剂，经亲电取代反应制备荧光化学传感材料。本发明制备的荧光传感材料，水溶性和生物相容性良好，制备的荧光传感材料具有快速响应，能对OCl‑具有灵敏的选择性识别性能，在紫外灯下荧光信号的变化肉眼可见，其他常见阴离子和活性氧物质干扰性小，成功实现了生物细胞中目标离子的成像。

Description

一种次氯酸响应型荧光传感材料的制备方法与应用
技术领域
本发明属于化学荧光传感材料技术领域，涉及一种荧光传感材料的制备方法及应用，主要研究一种次氯酸响应型荧光传感材料的制备方法和用途。
背景技术
次氯酸作为活性氧物质的一种，在许多生命科学中起到重要作用。次氯酸由双氧水和氯离子之间的髓过氧化物酶通过催化反应产生，可保护生命系统免受微生物和病原体的侵袭。而来自吞噬细胞的不可控的次氯酸能引起心血管疾病、炎症和癌症等各种疾病。此外，次氯酸也广泛用作饮用水和游泳池中的安全消毒剂，以及工业应用的漂白剂。严格控制我们日常生活中次氯酸的用量对人体健康至关重要，因为过量的次氯酸能通过氧化应激损伤细胞中的RNA，DNA和蛋白质，并引起严重的疾病。
由于其对人体健康具有重要意义，开发了简便方便的检测次氯酸的方法已成为研究的重要领域。传统的检测方法如色谱法，电化学法以及滴定法通常需要大量的样品和复杂的仪器，这限制了其应用。然而，荧光检测是最有效的方法，因为它的选择性好，灵敏度高，操作简单。曾开发了一些基于次氯酸强氧化性能的荧光传感材料。然而，这些荧光传感材料在低荧光量子产率，不令人满意的检测限，差的水溶性和其他活性氧物质的干扰方面已经具有一些缺点。因此，开发新的荧光传感材料至关重要。使用香豆素作为荧光团，是因为其具有良好的水溶性和高荧光量子产率，能很好的克服上述缺点。
因此，利用次氯酸能将酰肼选择性氧化成酰亚胺的反应机理，设计并合成了香豆素和酰肼的次氯酸选择性荧光传感材料。其合成用于选择性检测次氯酸，具有快速响应的能力。该荧光传感材料的水溶性和生物相容性良好，可以实现在水溶液介质中对目标离子进行检测应用，也为生物细胞中目标离子的成像分析提供了前提。
发明内容
本发明旨在克服传统检测技术的限制，目的在于提供一种次氯酸响应型荧光传感材料及其制备方法和用途，本发明涉及的传感材料能够很好的实现生物细胞中痕量OCl-离子的有效检测，具有成本低，合成简单，响应快和检测灵敏度高等特点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种次氯酸响应型荧光传感材料，所述材料是由6-羧基香豆素和氨基硫脲作为基础原料，无水甲醇作为溶剂，经亲电取代反应制备荧光化学传感材料。
本发明还提供一种次氯酸响应型荧光传感材料的制备方法，步骤如下：
(1)称取6-羧基香豆素和氨基硫脲加入三口烧瓶中，加入一定量的无水甲醇溶解；
(2)步骤(1)所得的混合溶液，在一定温度下回流加热反应，待反应结束趁热抽滤，滤液重结晶，抽滤，用与步骤(1)等量的无水甲醇洗三次，得到白色固体，即为次氯酸响应型荧光传感材料。
步骤(1)中，所述6-羧基香豆素、氨基硫脲、无水甲醇的用量比例为0.81-1.19g：0.92-1.84g：5-15mL。
步骤(2)中，所述回流加热反应温度为80-100℃，反应时间为4-6h。
本发明还提供一种次氯酸响应型荧光传感材料用于OCl-选择性识别检测或者生物体活细胞中OCl-成像分析检测的用途。
本发明的有益效果为：
(1)由于香豆素类化合物有较高的荧光量子产率，较大的斯托克斯位移和光学性能易调控等优点，香豆素类衍生物被广泛的用做激光染料、荧光增白剂等，也是分子荧光探针设计中最常用的荧光团之一。本发明采用6-羧基香豆素作为基础原料，羧基是强吸电子基团，在香豆素的6位引入强的吸电子基团，形成共轭结构，香豆素发射出强的荧光。将羧基酰基化后得到了荧光传感材料，显著的提高了6位取代基的吸电子能力，吸收光谱蓝移，荧光显著下降。
(2)本发明制备的荧光传感材料对OCl-具有灵敏的选择性识别性能，检测限低，响应时间快，在紫外灯下荧光信号的变化肉眼可见，其他常见阴离子和活性氧物质干扰性小。
(3)本发明制备的荧光传感材料检测条件更为温和，采用纯水作为检测介质，避免了有机溶剂引入而造成的二次污染，体现出良好的生物相容性。
附图说明
图1为实施例3所制备的次氯酸响应型荧光传感材料的合成过程示意图。
图2为实施例3所制备荧光传感材料的红外光谱图。
图3为实施例3所制备荧光传感材料的1H NMR图，其中溶剂为DMSO-d6。
图4为实施例3所制备荧光传感材料的13C NMR图,其中溶剂为DMSO-d6。
图5为实施例3所制备荧光传感材料的MS图。
图6为实施例3所制备荧光传感材料在不同阴离子和活性氧物质存在时的荧光光谱图。图中的1表示的是本发明制备的荧光传感材料。
图7为实施例3所制备荧光传感材料在不同阴离子和活性氧物质存在时的紫外可见光谱图。图中的1表示的是本发明制备的荧光传感材料。
图8为实施例3所制备荧光传感材料在不同浓度OCl-存在时的荧光光谱图。
图9为实施例3所制备荧光传感材料在不同浓度OCl-存在时的紫外可见光谱图。
图10为实施例3所制备荧光传感材料的荧光强度与OCl-浓度的线性关系图。
图11为实施例3所制备荧光传感材料的吸光度与OCl-浓度的线性关系图。
图12为实施例3所制备荧光传感材料用于生物体活细胞中OCl-的成像图；图中a为加入5μM荧光传感材料和10μM OCl-培养后的细胞在明场下的成像，b为加入5μM荧光传感材料和10μM OCl-培养后的细胞在荧光场下的成像，c为加入5μM荧光传感材料培养后的细胞在明场下的成像，d为加入5μM荧光传感材料培养后的细胞在荧光场下的成像。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：制备次氯酸响应型荧光化学传感材料
称取0.81g 6-羧基香豆素和0.92g氨基硫脲置于圆底烧瓶中，加入5mL无水甲醇溶解，在80℃下加热4h。趁热过滤，滤液重结晶，抽滤，用5mL无水甲醇洗涤三次，得到白色固体。
实施例2：制备次氯酸响应型荧光化学传感材料
称取1.19g 6-羧基香豆素和1.84g氨基硫脲置于圆底烧瓶中，加入15mL无水甲醇溶解，在100℃下加热6h。趁热过滤，滤液重结晶，抽滤，用15mL无水甲醇洗涤三次，得到白色固体。
实施例3：制备次氯酸响应型荧光化学传感材料
称取1g 6-羧基香豆素和1.38g氨基硫脲置于圆底烧瓶中，加入10mL无水甲醇溶解，在90℃下加热5h。趁热过滤，滤液重结晶，抽滤，用10mL无水甲醇洗涤三次，得到白色固体。
如图1所示是次氯酸响应型荧光传感材料的合成过程示意图。
如图2所示是荧光传感材料的红外光谱图。FT-IR(KBr,cm-1):3369,3264,3178,1745,1684,1645,1618,1568,1532,1421,1374,1317,1286,1227,1207,1165,999,802,770,647。通过红外光谱图可以确定荧光传感材料的官能团。
如图3和图4所示分别是荧光传感材料的1H NMR和13C NMR图。1H NMR(DMSO-d6)δ(ppm)8.75(s,1H),8.66(s,2H),7.91(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.73(ddd,J＝8.7,7.4,1.6Hz,1H),7.58(s,1H),7.41(m,2H),7.20(s,1H)。13C NMR(DMSO-d6)δ(ppm)181.58,164.46,157.21,154.89,148.82,134.78,130.64,125.31,118.78,118.41,116.58。通过核磁谱图可以确定荧光传感材料的化学结构。
如图5所示为荧光传感材料(C11H9N3O3S,263.04[M]+)的质谱图，其中265.22为[M+H]+对应的分子量,进一步证实了该荧光传感材料的结构。
实施例4：本发明制备的荧光传感材料对OCl-选择性的检测
将实施例3中制备的荧光传感材料制备成1mM的储备液待用。取2.5mL上述储备液用纯水定容到100mL配制成25μM荧光传感材料溶液。分别移取4mL上述25μM的待用溶液，分别加入50μM浓度的各种不同的阴离子和活性氧物质(F-,Cl-,Br-,I-,CO3 2-,HCO3 -,PO4 2-,HPO4 2-,H2PO4 -,SO4 2-,HSO4 -,ClO4 -,SCN-,NO·,ONOO-,ROO-,·OH和1)，1表示的是本发明制备的荧光传感材料。采用荧光光谱仪分别对各自的荧光光谱进行测定，其中激发波长为370nm。
取100μL探针储备液和20μL各种不同的阴离子和活性氧物质储备液于4mL在纯水溶液中，得到25μM浓度的探针和50μM浓度的各种不同的阴离子和活性氧物质，测量吸光度的变化。
实施例5：本发明制备的荧光传感材料对OCl-灵敏性的检测
移取实施例3中的25μM的待用溶液，分别对OCl-进行荧光和紫外滴定实验，即分别加入0～2当量的OCl-进行灵敏性的检测。本实施例中用到的阴离子和活性氧物质浓度分别为：0.1×10-5M、0.2×10-5M、0.3×10-5M、0.4×10-5M、0.5×10-5M、0.6×10-5M、0.7×10-5M、0.8×10-5M、0.9×10-5M、1.0×10-5M、1.2×10-5M、1.4×10-5M、1.6×10-5M、1.8×10-5M、2.0×10-5M。
荧光滴定实验的荧光发射光谱如图8所示，从图中可以看出，随着OCl-浓度的增加，457nm处的荧光发射峰逐渐增强。
取100μL探针储备液于4mL纯水中，得到25μM浓度的探针，滴定法测得吸光度随OCl-浓度的变化值。紫外可见滴定实验的荧光发射光谱如图9所示，从图中可以看出，荧光传感材料在234nm处显示出强烈的紫外可见吸收带。
图10表明在一定的浓度范围内相应的荧光强度与OCl-离子的浓度呈现良好的线性关系，线性方程的斜率为13.443，根据方程LOD＝3δ/slope(10次空白样的标准偏差δ＝0.26438)计算得最低检出限分别可低达5.9×10-8M。图11表明在一定的浓度范围内相应的吸光度与OCl-离子的浓度呈现良好的线性关系，线性方程的斜率为-0.032，相关系数R2＝0.991。结果表明该荧光传感材料对一定浓度范围内的OCl-可进行定量检测并具有高的灵敏性。
实施例6：本发明制备的荧光传感材料对细胞的成像分析
将RAW264.7巨噬细胞接种到含有10％小牛胎血清的DMEM培养液培养中，在温度为37℃的培养箱中培养24小时。第一组是加入5μM的实施例3制备的荧光传感材料培养30分钟，用HEPES缓冲溶液洗涤三次移除残余的荧光传感材料；第二组是先加入5μM的实施例3制备的荧光传感材料培养30分钟，用HEPES缓冲溶液洗涤三次移除残余的荧光传感材料，再加入10μMOCl-后继续培养30分钟，然后再次用HEPES洗涤细胞三次，采用倒置荧光显微镜对加入OCl-前后的细胞进行成像分析。
荧光传感材料对生物细胞中OCl-的成像结果如图12所示，图12a和图12b分别为加入OCl-培养后的细胞在明场和荧光场下的成像情况。图12c和图12d分别为加入荧光传感材料后细胞在明场和荧光场下的成像情况，图12c表明该传感材料具有低的生理毒性，并没有对生物细胞造成破坏，图12d表明用荧光传感材料培养过的细胞并无荧光。从图中可以看出，细胞中OCl-的存在会引起细胞内部呈现出强的荧光发射。这一结果充分的表明荧光传感材料具有良好的生物膜透过性并已成功进入细胞到内部，同时也证实了荧光传感材料可用于生物体细胞中OCl-荧光成像检测分析。

Claims (5)

1.一种次氯酸响应型荧光传感材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取6-羧基香豆素和氨基硫脲加入三口烧瓶中，加入一定量的无水甲醇溶解；
(2)步骤(1)所得的混合溶液，在一定温度下回流加热反应，待反应结束趁热抽滤，滤液重结晶，抽滤，用与步骤(1)等量的无水甲醇洗三次，得到白色固体，即为次氯酸响应型荧光传感材料，其结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种次氯酸响应型荧光传感材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述6-羧基香豆素、氨基硫脲、无水甲醇的用量比例为0.81-1.19g：0.92-1.84g：5-15mL。
3.根据权利要求1所述的一种次氯酸响应型荧光传感材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述回流加热反应温度为80-100℃，反应时间为4-6h。
4.一种次氯酸响应型荧光传感材料，是通过权利要求1～3任一项所述制备方法制得的。
5.将权利要求4所述的一种次氯酸响应型荧光传感材料用于非治疗目的的OCl-选择性识别检测或者非治疗目的的生物体活细胞中OCl-成像分析检测的用途。
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