CN110078665A - 一种内质网靶向的检测次氯酸的荧光探针和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种内质网靶向的检测次氯酸的荧光探针，其化学结构式为：。本荧光探针的响应速度快、灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性，可以实现对细胞内次氯酸的快速准确检测。本发明的探针在研究生物细胞内次氯酸对生理及病理过程的影响具有广阔的应用前景。

Description

一种内质网靶向的检测次氯酸的荧光探针和应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测次氯酸的荧光探针及其应用。

背景技术

作为真核细胞最大的细胞器，内质网（ER）负责细胞的基本代谢功能，参与蛋白质折叠和二硫键形成，钙稳态和脂质生物合成过程。次氯酸（HClO）是生物体内重要的活性氧（ROS）之一，由H₂O₂和Cl^-在髓过氧化物酶（MPO）的催化作用下产生，在人类免疫功能系统中扮演着重要的角色。然而，HOCl的异常积累会引起氧化应激，导致组织损伤和一系列疾病，如肝损伤、动脉硬化、癌症、心血管疾病和炎症性疾病。由于缺乏用于追踪生物体内质网中内源性HOCl的有效探针，内质网中HOCl水平的变化引起的生理和病理机制尚不明确。因此，开发一种靶向ER中的HOCl特异性探针至关重要。

目前为止，可用于检测次氯酸的方法主要有碘量滴定法、化学发光法、极谱法和比色法等。然而这些方法一般不能实现对生命系统中的HClO的原位检测。与上述方法相比，荧光探针由于其具有分析灵敏度高、响应速度快、低损伤及可视化检测等独特优点，被视为生物研究的理想工具。近年来，用于检测生命系统中次氯酸的荧光探针得到了快速发展。这类探针大部分基于罗丹明与荧光素的开关环机制或引入肟、甲氧基苯酚等HClO识别位点。此外，还报道了一些可以靶向溶酶体或线粒体用于检测HClO的荧光探针。据我们所知，定位内质网成像内源性HClO变化的小分子荧光探针还很少被开发。因此，设计与开发一种用于准确监测内质网中HClO水平的特异性荧光探针，对于更深层次理解HClO的发病机制具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种内质网靶向用于检测细胞内次氯酸的荧光探针，响应速度快、选择性好。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内次氯酸的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种内质网靶向的检测次氯酸的荧光探针，简称ER-NTE，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

上述检测生物体内次氯酸的荧光探针的制备方法为：

（1）4-溴-1，8-萘二甲酸酐和Boc-乙二胺于乙醇中加热反应，反应结束后将反应液过滤，固体干燥，得到化合物1：；

（2）化合物1和CF₃COOH于二氯甲烷中反应，结束后在去除溶剂，以CH₂Cl₂:CH₃OH=20:1v/v为淋洗液过硅胶柱纯化，得到化合物2：；

（3）0-4℃，三乙胺存在下，化合物2和4-甲基苯磺酰氯于二氯甲烷反应，反应结束后反应液过滤，固体干燥，得到化合物3：；

（4）将化合物3、N-羟基邻苯二甲酰亚胺和碳酸钾于二甲亚砜回流反应，反应结束后混合液加入2-3体积倍的冷水，用HClO₄调pH至沉淀析出，抽滤后的固体以CH₂Cl₂:CH₃OH=20:1v/v为淋洗液过硅胶柱纯化，得到化合物4：；

（5）N,N-二异丙基乙胺存在下，化合物4和二甲氨基硫代甲酰氯于二氯甲烷中在室温下搅拌反应，反应结束后反应液以CH₂Cl₂:CH₃OH=30:1v/v为淋洗液过硅胶柱纯化，得荧光探针。

一种上述荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中次氯酸试剂中的应用。

本发明的机理如下：

本发明使用二甲氨基硫代甲酸酯作为次氯酸识别位点，并将对甲苯磺酰胺用作内质网靶向基团嵌入萘酰亚胺荧光团中，作为检测细胞内质网中次氯酸的特异性探针。在HClO存在的环境下，从HClO分解出的氯离子（Cl⁺）通过亲电加成反应使二甲氨基硫代甲酸酯裂解成羟基。由于羟基（-OH）的给电子能力强于酯（-OCOR）的电子给予能力，酯转化为羟基赋予萘酰亚胺荧光团以典型的“推-拉”结构，即分子内电荷转移（ICT）效应。因而通过检测荧光信号变化来测定细胞内的HClO。

本发明具有以下优点：

本发明提供的内质网靶向用于检测细胞内次氯酸的荧光探针可经化学合成获得，合成方法简单易行，原料廉价易得，制备成本低。本荧光探针具有高选择性，检测过程中不受其他组分的干扰。本荧光探针的响应速度快、灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性，可以实现对细胞内次氯酸的快速准确检测。本发明的探针在研究生物细胞内次氯酸对生理及病理过程的影响具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是荧光探针的¹H NMR图谱；

图2是荧光探针在不同浓度NaClO条件下的荧光光谱；

图3是荧光探针与NaClO浓度的线性关系；

图4是荧光探针与NaClO反应的动力学；

图5是荧光探针对不同物质的选择性；

图6是荧光探针在活细胞中的成像应用。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针的合成

（1）取4-溴-1，8-萘二甲酸酐（5mmol）于乙醇中加热搅拌至全溶后，将溶于乙醇的Boc-乙二胺（5mmol）滴加至上述反应液中继续搅拌，反应4h后将产物进行过滤、干燥，得到化合物1：

；

（2）将化合物1（2mmol）溶于二氯甲烷中，在常温下搅拌，并逐滴加入2mL溶于二氯甲烷的CF₃COOH，反应2h后旋干溶剂，粗产物用CH₂Cl₂:MeOH=20:1的洗脱液通过柱层析纯化，得到化合物2：

；

（3）将化合物2（1mmol）溶于二氯甲烷中，加入几滴三乙胺使溶液保持在碱性环境，在冰浴条件下滴加溶于二氯甲烷的4-甲基苯磺酰氯，搅拌反应2h，反应液过滤、干燥，得到白色粉末，即化合物3：

；

（4）将化合物3(0.25mmol)，N-羟基邻苯二甲酰亚胺（0.3mmol），碳酸钾（0.38mmol）溶于2mLDMSO中，于120℃下加热回流搅拌5h，将反应混合液倒入5mL冷水中，用HClO₄调PH至沉淀析出，在真空下减压浓缩，固体用CH₂Cl₂:MeOH=20:1为淋洗液通过柱层析纯化，得到黄色固体，即化合物4：

；

（5）取化合物4（82 mg，0.2 mmol），二甲氨基硫代甲酰氯（123 mg，1.0 mmol）加入无水二氯甲烷（10.0mL）中。随后，将N，N-二异丙基乙胺（200μL）加入到上述反应溶液中，并在室温下搅拌至反应完成。以CH₂Cl₂:MeOH=30:1v/v为淋洗剂通过柱层析，得到荧光探针：

；

其¹H NMR图谱如图1。

实施例2 荧光探针对不同浓度NaClO的响应

将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，用PBS稀释成5 μM探针缓冲溶液（含20%乙醇，pH 7.4）。取22份上述探针溶液，加入NaClO溶液使其浓度分别为：0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，96，100，105μM，然后进行荧光检测（λ_Ex = 460 nm）；计算各体系中相对荧光强度；该探针对不同浓度NaClO的响应如图2所示：最大荧光强度峰值为555 nm，随着NaClO溶液浓度的提高荧光强度逐渐增强。以NaClO浓度分别为0、5、10、15、20、25、30 μM时检测物浓度为横坐标，以555 nm处相对应荧光强度（I₅₅₅）为纵坐标，得图3，可知I₅₅₅处的荧光强度与检测物浓度呈线性相关，随着浓度的增大荧光强度增强。

实施例3 荧光探针与NaClO反应的动力学

将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，用PBS稀释成5 μM探针缓冲溶液（含20%乙醇，pH 7.4）。取适量上述探针溶液，加入浓度为50 μM 的NaClO溶液，进行动力学检测（λ_Ex =460 nm），每隔30 s检测一次，检测12.5 min。该探针对NaClO的动力学响应如图4所示：555nm处的荧光强度以时间依赖性方式逐渐增加，在4 min时荧光信号基本稳定。说明本探针反应迅速，可作为实时检测活细胞中NaClO的荧光探针。

实施例4 荧光探针对不同离子的选择性

将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，用PBS稀释成5 μM探针缓冲溶液（含20%乙醇，pH 7.4）。取21份体积为4mL的上述探针溶液，分别加入10 μL浓度为40 mM的不同物质的PBS溶液，然后进行荧光扫描（λ_Ex = 460 nm），计算各体系中相对荧光强度；以555 nm处相对应荧光强度（I_555nm）为纵坐标，得到探针对不同物质的响应柱状图，如图5所示，其中，1-21分别为空白、Ag⁺、Al³⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Cys、F^-、Fe³⁺、葡萄糖、GSH、H₂O₂、Hcy、I^-、K⁺、Mg²⁺、MnO₂、Ni²⁺、VC、Zn²⁺、NaClO。可知，荧光探针仅对加入NaClO的溶液有响应，抗干扰性强。

实施例5 荧光探针在活细胞中的成像应用

将2份HepG2细胞放置于含有10%胎牛血清（FBS）的培养基（DMEM）中，在含5% CO₂的湿润环境下于37 ℃培养48 h。用微量进样器吸取实施例1中制备的荧光探针母液于含有HepG2细胞的培养基中，使探针浓度为10 μM继续在培养箱中培养20 min。之后用PBS冲洗2遍，然后分别与等量的PBS溶液、100 μM次氯酸钠溶液、一起孵育10 min，在激发波长为405 nm下于DAPI、FITC、TRITC通道进行荧光成像，结果如图6所示。活HepG2细胞与ER-Nap（10μM）一起孵育，观察到相对较弱的绿光，表明没有外源性NaClO刺激，HepG2细胞中HClO浓度相对较低。在向HepG2细胞添加100 μM的外源NaClO后，在FITC通道观察到明显的绿光，表明ER-NTE能够实现活细胞内HClO的可视化检测。

Claims (3)

1.一种内质网靶向的检测次氯酸的荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）4-溴-1，8-萘二甲酸酐和Boc-乙二胺于乙醇中加热反应，反应结束后将反应液过滤，固体干燥，得到化合物1：；

（2）化合物1和CF₃COOH于二氯甲烷中反应，结束后在去除溶剂，以CH₂Cl₂:CH₃OH=20:1v/v为淋洗液过硅胶柱纯化，得到化合物2：；

（3）0-4℃，三乙胺存在下，化合物2和4-甲基苯磺酰氯于二氯甲烷反应，反应结束后反应液过滤，固体干燥，得到化合物3：；

（4）将化合物3、N-羟基邻苯二甲酰亚胺和碳酸钾于二甲亚砜回流反应，反应结束后混合液加入2-3体积倍的冷水，用HClO₄调pH至沉淀析出，抽滤后的固体以CH₂Cl₂:CH₃OH=20:1v/v为淋洗液过硅胶柱纯化，得到化合物4：；

（5）N,N-二异丙基乙胺存在下，化合物4和二甲氨基硫代甲酰氯于二氯甲烷中在室温下搅拌反应，反应结束后反应液以CH₂Cl₂:CH₃OH=30:1v/v为淋洗液过硅胶柱纯化，得荧光探针。

3.一种如权利要求1所述的荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中次氯酸试剂中的应用。