CN112209871A - 一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针及其制备方法与应用。本发明基于光诱导电子转移（PET）机理，设计合成了以四苯乙烯（TPE）为荧光团的一种新型TPE‑3N荧光探针。TPE‑3N在常见的金属离子中对Zn2+具有良好的选择性。TPE‑3N对pH不敏感，可以在相当宽的范围内识别Zn2+。细胞毒性测试结果表明，细胞的成活率在85%以上，表明该分子具有生物低毒性，可应用细胞中检测锌离子，TPE‑3N能够很好的进入细胞中，并且加入锌离子后荧光增强且在细胞中的成像效果较好。该分子作为一种优良的AIE荧光探针，有望用于生物体中实现对体内游离的锌离子检测。

Description

一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针及其制备，本发明同时涉及该锌离子荧光探针在识别锌离子和细胞显影中的应用，属于分析检测和生物成像领域。
背景技术
近些年来，随着现代科学技术的大力发展，荧光识别方法由于灵敏度高，选择性好，操作简便，成本低，分辨高和可实现活体内快速原位在线检测等被广泛研究。荧光探针在受到分析物或者微环境的影响时会直接引起其荧光性质的发生变化，进而让科学家获得环境中的某一特性或者存在的某种识别物质的特殊信号，是一种联系微观环境和宏观世界的有力的工具手段。现在荧光分子探针的已经应用到环境监测，离子和小分子检测，生物成像，医学诊疗等重要领域。
锌是在人体中富集第二的过渡金属元素，相关研究表明锌参与并主动调控很多的生理和化学过程。同时，锌离子还与很多生物的病理变化过程密切地相关，如急性癫痫、缺血性中风和阿尔兹海默症等。近年来，分析和检测细胞血液中的锌离子成为了研究的热点。但存在细胞中的锌离子由于不能表现出任何波谱或磁信号普通的光谱分析方法都不能用于检测该金属离子。而荧光探针体系，可以在一个比较宽的浓度范围内对其实现定量检测，这对进一步了解锌离子在生物体系内的作用具有重要意义。
近年来，吡啶类衍生物作为荧光分子探针中的识别基团得到了广泛关注，特别是二（2-吡啶甲基）氨（DPA）被经常用于对锌离子识别的荧光探针中，对锌离子有较好的选择性。在过去的几十年间，锌离子探针的研究引起了很多研究者的关注，同时也开发出了很多锌离子探针。然而，目前生物体内优良成像的锌离子探针的还相对较少。常规有机发光体在稀溶液中具有较高的荧光性，但在分子聚集时通常会减弱或被淬灭，这在很大程度上限制了其应用。随着AIE现象机理的逐渐揭示，越来越多的具有 AIE特性的化合物被合成，由于AIE 分子拥有高固态发光效率，广泛的应用于分析检测和生物成像领域。近期唐本忠院士课题组合成了含三联吡啶的四苯基乙烯（TPE）），该分子在溶液状态下发光较弱，但在不良溶剂下的固态的薄膜中的高效发光，表现出聚集诱导发射（AIE）现象（Hong Y N, Wang ZK, Tang B Z. Fluorogenic Zn(II) and Chromogenic Fe(II) Sensors Based onTerpyridine-Substituted Tetraphenylethenes with Aggregation-Induced EmissionCharacteristics[J]. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2011, 3(9): 3411-3418）。当与不同的金属离子时作用时，对锌离子有独特的响应特性， 加 Zn2+后有效地将发射颜色改变为黄色，这证明了三联吡啶的四苯基乙烯（TPE） 对锌离子具有独特的识别特性。目前基于AIE分子锌离子探针的应用相关文献的报道较少，因此对新型 AIE 离子探针研究与应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针及其制备；
本发明的另一个目的是提供该锌离子荧光探针在识别锌离子和细胞显影中的应用。
一、基于四苯乙烯的锌离子荧光探针及其制备
本发明基于四苯乙烯的锌离子荧光探针，其分子式为 C66H74N6O2，结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明基于四苯乙烯的锌离子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）TPE-2OH的制备：将4-羟基二苯甲酮和锌粉溶于无水四氢呋喃中，在氮气保护下，于冰水浴中加入TiCl4，搅拌25~35min，再于65~75℃下回流反应20~24h；反应结束后冷却至室温，加入 K2CO3 溶液淬灭反应，用 CH2Cl2 萃取，旋蒸除去有机层，粗产物经硅胶柱纯化，真空干燥，得产物1,4-二羟基四苯基乙烯TPE-2OH。其中，4-羟基二苯甲酮与锌粉的摩尔比为1.5:1~2.5:1；4-羟基二苯甲酮与TiCl4的摩尔比为1:20~1:30。TPE-2OH的核磁氢谱和碳谱如图1、图2。
（2）TPE-2Br的制备：将1,8-二溴辛烷、无水K2CO3和TPE-2OH溶于乙腈中，氮气保护下，于80~85℃下搅拌回流20~24h；反应结束后冷却至室温，用 CH2Cl2溶解过滤，将滤液旋干后通过柱色谱法分离提纯，得到1,4-二溴辛烷基四苯乙烯醚TPE-2Br。其中，TPE-2OH与1,8-二溴辛烷的摩尔比为1:1~1:3；TPE-2OH与无水K2CO3的摩尔比为1:1~1.5:1。TPE-2Br的核磁氢谱和碳谱如图3、图4。
（3）TPE-3N的制备：将TPE-2Br、二甲基吡啶胺、K2CO3溶于乙腈中，氮气保护下，于80~85℃搅拌回流10~12h，冷却至室温，旋蒸干燥，柱层析分离纯化，再加甲基叔丁基醚沉淀，干燥，得到棕色油状的TPE-3N。其中，TPE-2Br与二甲基吡啶胺的摩尔比为1:1~1:2；TPE-2Br与K2CO3的摩尔比为1:2~1:5。TPE-3N的核磁氢谱和碳谱如图5、图6。
TPE-3N的合成路线如下：
Figure 334713DEST_PATH_IMAGE002
。
二、基于四苯乙烯的锌离子荧光探针的特性
1、TPE-3N的溶剂效应
TPE-3N 可溶于不同的溶剂中，为了下步实验我们对几种常用的溶剂进行了筛选。我们选择了常用的试剂丙酮，DMF，DMSO，甲醇，乙腈和乙酸作为不良溶剂进行光谱测试。由于该化合物是典型的 AIE 分子，在溶液中的荧光较弱，我们在选择溶剂时选择不良溶剂与水的混合溶液，不良溶剂与水的体积比为1:1进行测试。
如图 7 所示，在相同的外界条件下，乙酸作为溶剂时荧光强度最弱，荧光值为1000 左右，而且在波长 390 nm 时出现了一个荧光值为 700 左右包峰，峰形较宽，不可做最佳溶剂选择。对于甲醇作为溶剂而言，荧光强度最大，达到 2200 左右，但在波长为220nm左右有个小的肩峰，峰形较宽，也不是作为最佳溶剂的选择。通过对比我们可发现，DMSO 作为溶剂时，荧光强度较强，而且峰形最好，所以下面的实验选择 DMSO:H2O=1:1 作为混合溶剂进行实验。
2、TPE-3N的AIE特性
AIE 机制已被合理化为限制分子内运动（RIM）。当 AIE 活性发光剂分子分散时，包括旋转和振动在内的主动分子内运动会耗散激发态能量，加剧了非辐射衰减。聚集后，将激活RIM 过程，从而阻止激发能的无辐射消耗并填充辐射衰减通道。基于 TPE 为典型的 AIE分子，下面我们进行了对 TPE-3N 的 AIE 特性的探究。我们首先对该分子在不良溶剂与水混合体系中的AIE 效应进行测试，用DMSO和水的混合体系进行测试，所测光谱是在溶液配制后经过超声 5 min 后立刻测试。如图8所示，当含水量低于40%时，溶液荧光很弱。当含水量达到 60%，分子开始发生聚集，出现较强的荧光发射，随着含水量继续增加，荧光强度不断增强，这主要是由于分子运动受限造成的。由此可知化合物 TPE-3N 具有典型的AIE特性。
我们对不同浓度的TPE-3N溶液的 AIE 效应进行了测试。如图9所示，TPE-3N的DMSO 溶液的浓度为 0.1~1 mM 时，TPE-3N 的荧光很弱，而当其浓度 由 1 mM 逐渐增大时，荧光强度也随之增强并具有很强的荧光，激发和发射波长分别为 355 nm和470nm。随着浓度的增大，TPE-3N 内会发生聚集，而此时荧光显著增强表明该化合物具有典型的AIE特性。
3、pH对TPE-3N荧光性能的影响
在生物体系或其它微环境中，都会有一个相对稳定的 pH，当微环境受到干扰时，会引起 pH 发生不同程度的变化。所以，探针分子在一个相当宽的 pH 范围发生变化，荧光强度不受或少受干扰是研究金属离子荧光分子探针荧光性质的一个重要方面。为此我们测试了在不同 pH 下TPE-3N 的荧光性能。对于TPE-3N的DMSO/H2O（v/v=1:1）的混合溶液（1×10- 5M），用不同浓度的HCl 和NaOH调节溶液的酸碱性（加入量小于待测体积的1%），测其 pH 值在 3~10 范围内的荧光光谱。如图 10所示，TPE-3N 在 pH为 3~10范围内荧光强度在 600左右，保持稳定状态。由此表明，TPE-3N 的荧光强度在不易受 pH 的影响。这种对 pH 不敏感性能够适应生命体中某种生理刺激所引起的 pH 的变化。
三、TPE-3N 对Zn2+的选择性识别
1、TPE-3N 对 Zn2+的选择性
为了避免其它金属盐引起的pH的变化导致探针的荧光强度发生变化，识别实验在100mM的tris-HCl，pH=7.4的缓冲溶液中进行。在TPE-3N的DMSO/tris-HCL缓冲溶液（DMSO/tris-HCL缓冲溶液=1:1，v/v，pH=7.4，c=1×10-5M）中，分别加入K+、Fe3+、Mn2+、Ni+、Cr3+、Cd2+、Ca2+、Hg2+、Cu2+、Ag+、Pd2+、Co2+和 Zn2+（c=1×10-3M）的水溶液，测TPE-3N荧光强度的变化。
如图11所示，未加入任何金属离子时TPE-3N在475 nm处几乎没有发射峰，当加入相同浓度的金属离子后，只有Zn2+可以使TPE-3N在475 nm处的荧光强度显著增强，其他金属离子的加入不能使TPE-3N的荧光强度发生明显变化，因此，该TPE-3N能够单一选择性荧光识别Zn2+。
2、不同浓度的 Zn2+对 TPE-3N 荧光性能的影响
鉴于 TPE-3N 中的二甲基吡啶胺基团对锌离子有着很强的识别能力，一般可达到纳摩尔级或者时更低。因此，我们研究了TPE-3N的DMSO/ tris-HCL缓冲溶液（DMSO/ tris-HCL缓冲溶液=1:1，v/v，pH=7.4，C=1×10-5M）中加入不同浓度的锌离子对荧光性能的影响。图12为TPE-3N 在不同浓度锌离子溶液中的荧光光谱图。如图所示 ，不加Zn2+时 TPE-3N 最大吸收波长为 355 nm，最大发射波长为 470 nm。随着锌离子的浓度逐渐增加，荧光强度也随之增强。当锌离子浓度为 10 nM时， TPE-3N 的最大吸收波长 350 nm，最大发射波长为 475nm，荧光强度与不加锌离子相比，增加了2倍左右。显示出TPE-3N的良好的灵敏性。
3、TPE-3N和TPE-3N-Zn2+的元素组成
为了确定锌离子配位前后TPE-3N的所含元素，进行了能谱 EDS 的测定。如图 13所示，TPE-3N 中含 C，N，O 元素；TPE-3N配位锌离子后的TPE-3N-Zn2+中含 C，N，O，Zn 元素。如表1 所示，通过分析得知，在 TPE-3N 中 C 含量为 58.4%，O 含量 33.0%，N 含量为 8.6%。配位锌离子后，TPE-3N-Zn2+中C 含量 为42.3%，O 含量为 27.4%，N 含量为9.9%，Zn 含量为20.4%。实验结果表明，化合物 TPE-3N和 Zn(II)配位的质量分数达到 20.4 %，说明该TPE-3N 和 Zn(II)的配位能力较强。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
4、TPE-3N的识别机理
为了进一步探究TPE-3N 在与锌离子作用机理，我们观察了TPE-3N 和 TPE-3N-Zn2+的SEM 图像，以研究由AIE 效应引起的形貌变化。如图14所示，TPE- 3N-Zn2+的 SEM 图像聚集形态呈梭形， TPE-3N 的 SEM 图像聚集形态成小球形。这是因为TPE-3N 分子中的主客体均为疏水基团，在水中自组装成小球状。TPE-3N中含N 杂环的客体对Zn2+的配位能力很强，TPE-3N与Zn2+配位后使得TPE-3N两端的张力增大，中间的 AIE 荧光团聚集状态发生改变，形貌呈梭形。
四、TPE-3N的细胞毒性测试及细胞荧光成像
细胞毒性的评估在细胞成像中至关重要。为了研究 TPE-3N的细胞毒性，选取宫颈癌细胞 HeLa 细胞作为细胞模型，将其在不同浓度（0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）的 TPE-3N 溶液中孵育 48 h 后，通过 MTT 实验对探针的细胞毒性进行评价。由图 15可知，HeLa 细胞在不同浓度的 TPE-3N 溶液中孵化后，细胞的存活率均达到85%以上，实验结果表明TPE-3N毒性较低，具有较好的生物相容性，适合于癌细胞荧光成像。
基于 TPE-3N 优异的 AIE 发光特性和低细胞毒性，我们进行了TPE-3N 加锌前后的细胞荧光成像研究及对比。如图16所示，TPE-3N加锌前后均能在细胞中检测到的荧光信号，在355nm波长的激发下能够产生蓝光。对比加锌前后的细胞成像效果，我们发现加锌后的细胞中的荧光信号较强，具有明亮的蓝光，这是由于 TPE-3N 分子中的二（2-吡啶甲基）氨（DPA）提供了三个氮原子，是很好的 Zn2+配体，对锌离子有很好的亲和性，当加入锌离子之后 TPE-3N 与锌离子选择性络合，使得 TPE-3N 分子两端基团聚集更加紧密，因此，荧光强度增加。这种点亮式的荧光探针可以更好的在生物成像中发挥优势。
综上所述，本发明基于光诱导电子转移（PET）机理，设计合成了以四苯乙烯（TPE）为荧光团的一种新型 TPE-3N 荧光探针。TPE-3N 在常见的金属离子中对 Zn2+具有良好的选择性。TPE-3N 对 pH 不敏感，可以在相当宽的范围内识别 Zn2+。细胞毒性测试结果表明，细胞的成活率在 85%以上，表明该分子具有生物低毒性，可应用细胞中检测锌离子，TPE-3N能够很好的进入细胞中，并且加入锌离子后荧光增强且在细胞中的成像效果较好。该分子作为一种优良的 AIE 荧光探针，有望用于生物体中实现对体内游离的锌离子检测。
附图说明
图1为TPE-2OH的核磁氢谱图。
图2为TPE-2OH的核磁碳谱图。
图3为TPE-2Br的核磁氢谱图。
图4为TPE-2Br的核磁碳谱图。
图5为TPE-3N的核磁氢谱图。
图6为TPE-3N的核磁氢谱图。
图7为TPE-3N 在不同溶剂中荧光光谱图。
图8为TPE-3N 在不同体积分数水中荧光光谱图（a）和荧光强度的变化趋势图（b）。
图9为不同浓度的TPE-3N溶液的荧光光谱（a）和TPE-3N荧光强度随浓度变化曲线图（b）。
图 10为TPE-3N 在不同pH 值下荧光光谱图。
图11为TPE-3N 对不同离子的响应荧光光谱图（a）和荧光强度对比柱状图（b）。
图12为TPE-3N 在不同浓度锌离子溶液中的荧光光谱图。
图13为TPE-3N 和 TPE-3N-Zn2+的EDS 分析谱图。
图 14为TPE-3N 和TPE-3N-Zn2+的 SEM 图。
图15为TPE-3N的细胞毒性测试。
图16为TPE-3N 与 TPE-3N-Zn2+细胞成像。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明基于四苯乙烯的锌离子荧光探针及其制备方法与应用作进一步说明。
实施例1 基于四苯乙烯的锌离子荧光探针的制备
（1）TPE-2OH的制备：将 4-羟基二苯甲酮（1.98 g，1 mmol）溶于 100 mL 无水四氢呋喃中，加入锌粉（3.45 g，0.5 mmol），抽真空通入氮气置换三次使整个反应过程在氮气氛围下进行，随后在冰水浴条件下缓慢的逐滴的加入 TiCl4（2.8mL），搅拌 30 min 后，将整个真空状态下的装置移到油浴锅中，在70℃下回流反应 24 小时，随后将反应冷却至室温，在剧烈搅拌下加入 K2CO3 水溶液（20 mL，10%）进行淬灭反应。用 CH2Cl2 萃取分离出有机相，合并有机相用无水 Na2SO4 干燥。通过旋转蒸发有机层，所得到的粗产物通过硅胶柱纯化，洗脱剂乙酸乙酯与石油醚的体积比为 1:8，再对其进行真空干燥得到产物，产率为 74.5%。
1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 7.13 – 7.09 (m, 6H), 7.03 (dd, J =7.9, 1.8 Hz, 4H), 6.91 – 6.88 (m, 4H), 6.57 (d, J = 8.6 Hz, 4H).
13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 153.87, 143.99, 139.63, 136.59, 132.68,127.63, 127.53, 126.19, 114.59.
（2）TPE-2Br的制备：取 1,8-二溴辛烷（1.087g，4mmol））和无水 K2CO3（0.138g，1.5mmol）加入到 300mL的乙腈溶液中。对体系抽真空通入氮气反复三个循环，加热搅拌，回流中用注射器缓慢的加入溶于乙腈（40mL）的 TPE-2OH（0.364g，2mmol）溶液，将混合物在82 ℃下进行搅拌 24h。冷却至室温后，用 CH2Cl2溶解过滤除去里面的 K2CO3固体，滤饼用丙酮洗涤 3次，用 MgSO4干燥，再合并滤液，将滤液旋干后通过柱色谱法分离提纯。得到纯的 TPE-2Br，产率 49％。
1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 7.09 – 7.05 (m, 6H), 7.05 – 7.02 (m,4H),6.88 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.60 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 3.89 – 3.86 (m, 4H),3.42 – 3.40 (m,4H), 1.85 (dtd, J = 14.6, 7.0, 3.4 Hz, 8H), 1.34 (dtd, J =10.2, 5.6, 5.1, 2.4 Hz, 16H).
13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 157.46 , 132.47 , 127.59 , 127.48 ,126.08 ,113.58 , 113.49 , 67.69 , 33.94 , 32.76 , 29.26 , 29.23 , 28.64 ,28.06 , 25.94 .
（3）TPE-3N的制备：将TPE-2Br（0.747g，1 mmol）溶于100mL乙腈中，加入二甲基吡啶胺（0.36 mL，2mmol）和碳酸钾（0.552g，4mmol）），氮气保护下，与70℃搅拌回流12h，冷却至室温，旋蒸的棕红色油状液体，进行后处里采用柱层析法除去不反应的原料，再用甲醇加三乙胺过柱子，将样品通过用甲基叔丁基醚沉淀，进一步除杂，将上清液旋出，干燥。得到棕色油状物的化合物TPE-3N，产率为54%。
1HNMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.55(d,J=4.6Hz,5H),8.50(d,J=4.8Hz,2H),7.77 – 7.68 (m, 1H), 7.64 (t, J = 7.6 Hz, 7H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.35(d, J= 7.8 Hz, 5H), 7.25 (s, 2H), 7.20 – 7.12 (m, 6H), 7.14 – 6.96 (m, 6H),6.89 (dd, J =23.5, 8.6 Hz, 2H), 4.02 (s, 8H), 3.80 (d, J = 3.5 Hz, 4H), 2.57– 2.47 (m, 2H), 2.24 –2.16 (m, 1H), 2.05 – 1.95 (m, 1H), 1.84 – 0.75 (m,24H).
13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 158.59 , 149.29 , 148.90 , 136.55 ,136.30 ,132.46 , 122.83 , 122.36 , 122.14 , 121.83 , 60.45 , 54.26 , 29.29 ,27.18 , 26.98 .
实施例2 TPE-3N 对 Zn2+的选择性
在100μLTPE-3N的DMSO/tris-HCL缓冲溶液（DMSO/tris-HCL缓冲溶液=1:1，v/v，pH=7.4，c=1×10-5M）中，分别加入1mL K+、Fe3+、Mn2+、Ni+、Cr3+、Cd2+、Ca2+、Hg2+、Cu2+、Ag+、Pd2+、Co2+和 Zn2+（c=1×10-3M）的水溶液，若TPE-3N的荧光强度显著增强，则加入的是Zn2+，若TPE-3N的荧光强度没有发生明显变化，则加入的是其他金属离子。
实施例 3 细胞毒性测试
首先选取对数期生长的HeLa细胞接种到含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃下恒温培养24小时。依次在每个孔中加入不同浓度的TPE-3N（0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、25μg/mL、50 μg/mL、100μg/mL）100μL，然后在37℃含有5%CO2的恒温箱中孵育，48小时后用吸掉所有的培养液，之后用PBS缓冲溶液（100mM，pH=7.4）清洗三次。向每个孔中加入100μL 细胞培养液后继续加入MTT溶液，孵育4h。加入100μL的DMSO 来溶解甲瓒晶体，在酶标仪中测量吸光值。如图15，HeLa 细胞在不同浓度的 TPE-3N 溶液中孵化后，细胞的存活率均达到85 %以上，实验结果表明TPE-3N毒性较低，具有较好的生物相容性，适合于癌细胞荧光成像。
实施例4 细胞荧光成像
HeLa 细胞在DMEM培养基上用10%胎牛血清培养。成像实验前一天，细胞种在24 孔板中。第二天加入10 μM的TPE-3N，并在 37℃和 5% CO2 条件下孵化12 h，同样条件下，先加入10 μM的TPE-3N 溶液孵化6 h，之后加入10 μM的锌离子孵化6 h。之后用PBS 冲洗三遍后做荧光成像实验、并对比没加锌的成像效果，为了比较加锌离子和没加之前的成像效果，所有显微镜成像设置一致。如图16所示，TPE-3N加锌前后均能在细胞中检测到的的荧光信号，在355nm波长的激发下能够产生蓝光。对比加锌前后的细胞成像效果，我们发现加锌后的细胞中的荧光信号较强，具有明亮的蓝光。

Claims (10)

1.一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针，其结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.如权利要求1所述一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）TPE-2OH的制备：将4-羟基二苯甲酮和锌粉溶于无水四氢呋喃中，在氮气保护下，于冰水浴中加入TiCl4，搅拌25~35min，再于65~75℃下回流反应20~24h；反应结束后冷却至室温，加入 K2CO3 溶液淬灭反应，用 CH2Cl2 萃取，旋蒸除去有机层，粗产物经硅胶柱纯化，真空干燥，得产物1,4-二羟基四苯基乙烯TPE-2OH；
（2）TPE-2Br的制备：将1,8-二溴辛烷、无水K2CO3和TPE-2OH溶于乙腈中，氮气保护下，于80~85℃下搅拌回流20~24h；反应结束后冷却至室温，用 CH2Cl2溶解过滤，将滤液旋干后通过柱色谱法分离提纯，得到1,4-二溴辛烷基四苯乙烯醚TPE-2Br；
（3）TPE-3N的制备：将TPE-2Br、二甲基吡啶胺、K2CO3溶于乙腈中，氮气保护下，于80~85℃搅拌回流10~12h，冷却至室温，旋蒸干燥，柱层析分离纯化，再加甲基叔丁基醚沉淀，干燥，得到棕色油状的TPE-3N。
3.如权利要求2所述一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，4-羟基二苯甲酮与锌粉的摩尔比为1.5:1~2.5:1；4-羟基二苯甲酮与TiCl4的摩尔比为1:20~1:30。
4.如权利要求2所述一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，TPE-2OH与1,8-二溴辛烷的摩尔比为1:1~1:3。
5.如权利要求2所述一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，TPE-2OH与无水K2CO3的摩尔比为1:1~1.5:1。
6.如权利要求2所述一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，TPE-2Br与二甲基吡啶胺的摩尔比为1:1~1:2。
7.如权利要求2所述一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，TPE-2Br与K2CO3的摩尔比为1:2~1:5。
8.如权利要求1所述一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针用于识别锌离子。
9.如权利要求8所述一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针用于识别锌离子，其特征在于：在TPE-3N的DMSO/ tris-HCL缓冲溶液中，分别加入K+、Fe3+、Mn2+、Ni+、Cr3+、Cd2+、Ca2+、Hg2 +、Cu2+、Ag+、Pd2+、Co2+和 Zn2+的水溶液，只有Zn2+可以使TPE-3N的的荧光强度显著增强，其他金属离子的加入不能使TPE-3N的荧光强度发生明显变化；DMSO/ tris-HCL缓冲溶液中，DMSO与tris-HCL缓冲溶液的体积比为1:1。
10.如权利要求1所述一种基于四苯乙烯的锌离子荧光探针在细胞显影中的应用。
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