CN114836202A - 一种基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针在检测牛血清白蛋白中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针在检测牛血清白蛋白中的应用。本发明合成了外围带有阳离子的AIE型荧光探针TPE‑ON‑CHO、TPE‑ON‑C6，用于对牛血清白蛋白BSA的荧光检测及其生物应用，TPE‑ON‑CHO和TPE‑ON‑C6可以通过静电吸引作用与带有负电荷的BSA相结合，对不同的生物大分子及阴离子表现出不同的荧光现象，实现了对BSA的选择性检测，在2‑10 ug/mLBSA的浓度范围内都存在较好的线性关系，实现对BSA的定量检测，检测明敏度高。并能够选择性的靶向线粒体染色，显示较好的细胞成像效果，因此TPE‑ON‑CHO和TPE‑ON‑C6荧光探针有望作为特异性和高效性的线粒体靶向示踪剂。

Description

一种基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针在检测牛血清白蛋 白中的应用
技术领域
本发明涉及一种基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针在检测牛血清白蛋白中的应用，属于生物检测领域。
背景技术
近年来，由于蛋白质在生命过程中的重要作用及其与生命起源、进化和代谢的密切关系，蛋白质结构的改变会极大地改变其生理功能，从而导致一系列疾病，如病毒性疾病、II型糖尿病和帕金森氏病（PD）等，因此设计各种用来高效检测蛋白质的生物传感器具有重要的意义。至于蛋白质的分析物，血清白蛋白就具备许多生理功能，在维持血压、平衡营养、结合和转运多种物质等方面拥有极其重要的作用。特别是牛血清白蛋白（BSA）是一种生物相容性蛋白，具有多种生理功能，在生理pH下（等电点为4.7）具有表面负电荷的特性，并且其具有与人血清白蛋白（HSA）结构上的同源性，在众多生化研究中被用作模型蛋白，一直是这一组中研究最广泛的蛋白质之一。此外，牛血清白蛋白还可被用作研究蛋白质大分子与两亲性化合物相互作用的测试蛋白质。因此，开发更加高效灵敏的BSA检测和定量方法极其重要。
荧光法以其快速、低成本、灵敏度高和选择性好的检测过程而引起研究者们极大的兴趣。然而，自从荧光法发展以来，大多数传统荧光探针的一个不受欢迎的问题是染料的聚集引起的荧光猝灭效应（ACQ），即荧光团在高浓度下的荧光减弱，一直是伴随着荧光测试而产生的负面效应。幸运的是，2001年，唐本忠院士发现了一个值得注意的现象-聚集诱导发射（AIE），它解决了传统荧光分子应用受限的ACQ问题。鉴于AIE分子这种特殊的荧光行为，各种新型AIE生物传感器应运而生。AIE型化合物在生物成像研究、细胞过程监测和蛋白质传感器等方面发挥重要作用，不同聚集状态下的发射差异可用作蛋白质变化的衡量标准。更重要的是，AIE分子对于微环境的变化极其敏感，其机制作用通常是限制分子内运动，特别适合监测蛋白质构象变化的进程。此外，水溶性是AIEgens应用于各种生物学研究的先决条件，增加AIE材料的水溶性，对于它们在生物体系中的应用至关重要。根据文献报道，通过在AIE分子中引入阳离子和阴离子、水溶性生物基团进行修饰，从而可以改善其水溶性，利于生物检测研究。因此，开发一种使用AIE染料制造水溶性、生物相容性和低细胞毒性聚集体的简单方法将促进此类荧光剂在生物系统中的应用。
另外，阳离子型AIE荧光分子还可以进行细胞成像的应用，因此可将AIE基团进行阳离子修饰，作为靶向基团的荧光探针对线粒体进行荧光标记和跟踪。迄今为止，研究者们已经开发了多种类型的荧光探针用来线粒体成像。对于带有的阳离子基团可供选择的有几种，如三苯基膦阳离子和吡啶鎓阳离子等，它们可以作为线粒体靶向基团来获得一系列阳离子型AIE荧光探针。其中，吡啶盐基团具有简单的结构，与AIE基团结合之后，不仅使其分子的水溶性增强，而且赋予其阳离子结构，当它们被引入生物系统时，发射不会被猝灭，而是会诱导聚集增强，从而促进分子的检测。同时，吡啶鎓阳离子也是目前使用广泛的线粒体靶向基团之一，可以预期其作为线粒体特异探针的优异性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针在检测牛血清白蛋白中的应用。
一、基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针的制备
将邻甲酰苯磺酸钠或己烷磺酸钠与一维组装体TPE-ON溶于去离子水中，室温下反应10~15 h，用CH2Cl2溶液萃取有机相，干燥，过滤，旋蒸得到的产物TPE-ON-CHO 或TPE-ON-C6。所述邻甲酰苯磺酸钠或己烷磺酸钠与一维组装体TPE-ON的摩尔比为1:1~1:2。
二、基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针的结构与性质
1、TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6的EDS能谱测定
为了证明TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6的元素组分组成，进一步测试了EDS能谱。TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6的分子式分别为C59H65N2O10S2和C58H73N2O8S2。如图10所示，在元素分布图可以看出，TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6中含有C、O、N和S元素。与分子式中含有的各种元素相一致，从而进一步辅助证明了TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6的成功制备。
2、TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的AIE特性
四苯乙烯是一类非常著名的荧光团，它们具有典型的AIE性质。四苯基乙烯等AIE荧光团因其独特的发射特性而受到越来越多的关注。与传统荧光团相比，AIE荧光团在溶液状态下表现较弱的发射，当处于聚集态时，分子内旋转受限，从而表现出优异的荧光特性。因此，TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6应该具有明显的AIE特性，接下来通过不同的方法来验证它们的AIE效应。
（1）不良溶剂中的AIE效应
由于吡啶盐基团的存在，赋予了荧光分子水溶性，并能够溶解于强极性溶剂中。TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6的良溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（DMF），不良溶剂为甲基叔丁基醚（MTBE），接下来我们测试了在不同甲基叔丁基醚含量下TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在两者混合溶剂体系中的发光行为。分别配制了DMF: MTBE (V: V) = 9: 1，8: 2，6: 4，5: 5，4: 6，3: 7，2: 8，1: 9的混合溶液，超声，进行荧光测试。
如图11为不同含量MTBE的TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的荧光光谱及变化趋势图。当不良溶剂体积分数含量在从0%到80%时，荧光强度较弱且基本保持稳定状态；当大于80%时，荧光强度逐渐增强，这归因于不良溶剂MTBE的加入，溶解度降低，诱导分子聚集体的形成，使分子内旋转受限，从而引起荧光明显增强的趋势，从插入的荧光图片同样可以看出荧光增强现象。这些结果表示，TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6都具有典型的AIE性质。
（2）不同浓度中的AIE效应
对于TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6的AIE性质，接下来我们研究了不同浓度对荧光发射强度的变化，如图12(a,b)所示，随着荧光探针浓度的增加，荧光强度增强，这归因于浓度的增大，使聚集程度增加，分子内旋转受限，从而引起荧光增强，此现象表明该化合物具有典型的AIE特性。如图所示，TPE-ON-CHO(图12(a, b))和TPE-ON-C6(图12(c, d))呈现出相同的变化规律，从插入的荧光图片也可以看出荧光增强现象，进一步证明了两种荧光分子均具有典型的AIE特性。
（3）粘度引起的AIE效应
为了进一步探讨AIE特性，我们选择了粘稠溶剂进行实验。甘油是一种高黏性的溶剂，可以与水完全互溶，也可以和DMF互溶。因此，我们选择了甘油/水与甘油/DMF混合体系进行AIE测试。
对于荧光分子TPE-ON-CHO(图13(a, b))和TPE-ON-C6(图13(c, d))，选择甘油/DMF混合体系做进一步的研究。如图所示，当甘油含量低于60%时，化合物的荧光强度变化较小，当甘油含量超过60%时，化合物的荧光强度相应提高，此现象归因于甘油含量的增加，粘度增大，分子内旋转受限，从而引起荧光增强。从插入的荧光图片也可以看出荧光增强现象，这些结果说明TPE-ON-CHO与TPE-ON-C6具有典型的AIE性质。
3、TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的光学性质
为了进一步了解TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的光学性质，测试了浓度为1×10-4 M的溶液中的激发和发射光谱。由图14可知，TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的激发波长分别为359 nm和357 nm。发射波长分别为482 nm和482 nm。
接下来我们测试了和TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6在不同溶剂中的光学性质。表1和表2分别为TPE-ON-CHO与TPE-ON-C6在不同溶剂中的紫外最大吸收，激发和发射及其荧光量子产率的测试。由表可知，TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在不同溶剂中具有不同的最大吸收波长，不同的激发和发射，并且荧光强度和荧光量子产率也不同，可以看出荧光分子在水中的荧光强度较大，并且都拥有较高的荧光量子产率。同时，可以看出TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在不同的溶剂中都具有较大的Stokes位移，背景干扰较小，此优势有助于克服荧光成像中激发的干扰，使荧光探针可以更好的进行生物成像应用。
表1 TPE-ON-CHO在不同溶剂中的光学性质
Figure 129602DEST_PATH_IMAGE001
表2 TPE-ON-C6在不同溶剂中的光学性质
Figure 580918DEST_PATH_IMAGE002
荧光寿命的测量是用标准的时间相关单光子计数方法进行的。激发光是便携式二极管激光器（EPL-375，Edinburgh Instruments），将激光束引导到样品中，并在相应样品的发射最大值处检测荧光。激发和发射的带宽< 2 nm。图15和表3为TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的荧光寿命。由图表可以看出，荧光寿命均为ns级，TPE-ON的平均荧光寿命为3.81 ns ，TPE-ON-CHO的平均荧光寿命为4.45 ns，TPE-ON-C6的平均荧光寿命为4.19 ns。
表3 TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的荧光寿命
Figure 221109DEST_PATH_IMAGE003
4、 pH的测试
细胞内的pH值是一个与细胞行为和病理相关的重要参数，pH值对所有生命形式都极其重要。由于荧光探针的应用环境一般相对复杂，在不同的生理过程中存在pH变化，而pH值的改变往往会影响荧光探针的荧光信号，从而降低荧光检测的准确性，因此，对于荧光探针分子的pH值测定至关重要。我们在缓冲溶液中测试了荧光探针TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在不同pH值的荧光光谱。
如图16所示，是两种荧光分子溶液的荧光强度变化较弱，化合物TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在2-11的宽pH范围内保持稳定，表明TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6基本不受溶剂体系pH的影响。为了考虑后期的生物应用，最终选择pH=7.4作为后续测试。这些结果进一步表明探针TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6对生物学研究具有很大的潜力。
5、Zeta电位的测试
通过Zeta电位测试，吡啶盐修饰的TPE衍生物都带有一定程度的正电荷（如图17），根据文献报道，DNA，透明质酸，肝素，硫酸软骨素等都带有负电荷。同时，BSA的等电点约为4.7，当pH大于等电点时，BSA也带有大量的负电荷，因此，带正电荷的三种荧光分子可能与带有负电荷的不同物质有着不同程度的响应。接下来我们测试了两种荧光分子与BSA作用前后的Zeta电位的变化情况。
如图17所示，当只有牛血清白蛋白时，Zeta电位值为-7.4 mV，当只有荧光分子TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6时，其Zeta电位值分别为+15 mV、+19 mV，两者均带有正电荷。当TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6中加入BSA作用以后，TPE-ON-CHO-BSA、TPE-ON-C6-BSA的Zeta电位值分别降低到-1 mV、+2.5 mV，其Zeta电位值介于两者探针与BSA之间，这是由于带正电荷的荧光分子可能与带有负电荷BSA发生静电吸引作用。其中，TPE-ON-CHO与BSA作用之后和TPE-ON-CHO-BSA的Zeta电位值相差较大，可能是反应程度较小引起的，通过后文荧光测试也证明了此现象。基于静电吸引TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6与BSA反应的机理如图18。
总之，两种荧光分子都带有一定的正电荷，不仅可以与BSA之间发生静电吸引作用，实现对BSA的检测，而且基于正电荷的优势，可以进行生物应用。
三、基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针对牛清蛋白的检测
1、牛血清白蛋白检测的灵敏度
通过优化条件后，我们进一步研究了TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6对BSA检测的灵敏度，向含有TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的PBS缓冲溶液中加入不同浓度的BSA，测试了它们的荧光光谱。
图19是在TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6中加入BSA之后形成的混合溶液的荧光光谱。如图所示，由于两种探针中都含有两个吡啶盐阳离子，赋予了良好的水溶性，因此表现出微弱的荧光。当加入BSA时，TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6荧光分子被BSA捕获，所带的正电荷与BSA表面所带的负电荷产生了强烈的静电吸引作用，BSA的结合位置阻止了分子内运动，引起荧光强度增强，表明TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6对BSA具有一定的检测效果。接下来研究了在缓冲溶液中不同BSA浓度与荧光增强之间的关系，通过作图得到了一条具有逐渐上升趋势的曲线。通过对数据拟合发现，TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在BSA 2-10 ug/mL的浓度范围内都存在线性相关，线性方程分别为y=699.239+13.120x，其相关系数为0.997；y=251.461+19.351x，其相关系数为0.990，这一结果说明在该浓度下，TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6可以作为BSA的荧光探针。TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6对BSA的检出限分别为1.28 µg/mL、1.31 µg/mL。通过与相关文献对比，两种探针具有较低的检出限，可以实现对BSA的定量检测，并且由于其诱导荧光增强，可以将其进行生物成像应用。
2、牛血清白蛋白检测的选择性
基于对以上两种荧光分子TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6与BSA之间相互作用的了解，接下来我们在相同条件下测试了TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6对一系列其他带有负电荷的物质硫酸软骨素（CS）、透明质酸（HA）、肝素（Hep）、鲑鱼精DNA1、鲱鱼精DNA2以及各类阴离子的荧光变化情况，以研究TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6对BSA检测的选择性。
图20为TPE-ON-CHO中加入不同梯度浓度的生物大分子及阴离子所得到的荧光光谱，由图可知，当CS、Hep、HA、鲑鱼精DNA1、鲱鱼精DNA2被加入到TPE-ON-CHO中时，荧光强度变化较小。当各类阴离子：BH4 -、CO3 2-、HPO4 2-、SO3 2-、HPO3 2-、NO3 -、S2-、HCO3 -、H2PO4 -、MoO4 2-、CH3COO-、NO2 -、C6H7O6 -、SO4 2-、WO4 2-、C2O4 2–加入到TPE-ON-CHO的溶液中时几乎没有明显的荧光变化，说明TPE-ON-CHO对阴离子也没有响应。随着BSA浓度的增大，荧光强度呈现出增强的趋势，并且在相同测试条件下100 ug/mL BSA加入到TPE-ON-CHO 溶液时，荧光强度增强约为1.9倍，远大于其余所测物质，证明TPE-ON-CHO可以对BSA进行选择性检测。
图21是TPE-ON-C6中加入不同梯度浓度的生物大分子及阴离子所得到的荧光光谱。由图可知，当HA、鲱鱼精DNA2被加入到TPE-ON-C6中时，荧光强度没有明显的变化。当Hep加入其中时，荧光强度轻微的增加。当CS、鲑鱼精DNA1加入其中时，荧光强度有轻微的减弱。当各类阴离子：BH4 -、CO3 2-、HPO4 2-、SO3 2-、HPO3 2-、NO3 -、S2-、HCO3 -、H2PO4 -、MoO4 2-、CH3COO-、NO2 -、C6H7O6 -、SO4 2-、WO4 2-、C2O4 2–加入到TPE-ON-C6的溶液中，荧光强度基本没有变化，说明TPE-ON-C6对阴离子没有响应(图21(i, j))。随着BSA的浓度的增大，荧光强度也逐渐增强，并且当100 ug/mL BSA加入到TPE-ON-CHO溶液时(图21(g, h))，荧光强度增强约3.6倍左右，证明TPE-ON-C6可以对BSA进行选择性检测。
3、细胞毒性测试
为了扩大探针的适用性，我们接下来通过荧光显微镜评估了TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6进入活细胞的能力。首先采用MTT方法检测了两种荧光分子的细胞毒性，选取HeLa、MKN-45、GES细胞作为细胞模型，将10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL不同浓度的TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6溶液加入各种细胞中进行孵育24 h。由图22可见，细胞存活率都保持在90 %以上，即使在添加100 μg/mL样品后，它们仍呈现较高的细胞存活率，这将有利于在生物相关体系中的应用。
4、 细胞成像
基于四苯乙烯（TPE）的AIEgens是螺旋桨形状的流行分子。四苯乙烯及其衍生物由于其简单的设计和多种修饰，被认为是一种很有前途的细胞内细胞器生物成像分子。根据文献报道，与三苯基鏻、吡啶、季铵偶联的阳离子AIE基团被用于线粒体特异性荧光探针。由于线粒体在活细胞中具有负的静电势可以吸引带有阳离子基团的探针。为了使荧光探针对线粒体选择性靶向，我们设计对荧光分子表面修饰功能性基团吡啶基，赋予了其阳离子特性，通过Zeta电位证明了荧光分子的正电性，因此可以发生静电相互作用，选择性的靶向线粒体进行荧光标记和染色。实验中选用HeLa细胞、MKN-45细胞、GES细胞作为线粒体追踪的模型，在相同条件下孵育对TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在各种细胞中不同时间及其加入BSA前后的细胞成像效果进行了研究，同时与Mito-Tracker Green (100 nM)进行共染色定位测试，通过荧光显微镜及其激光共聚焦荧光显微镜进行细胞成像的观察。
首先，我们使用共聚焦荧光显微镜在HeLa细胞和MKN-45细胞中将TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6与商用染料Mito-Tracker Green进行了共定位测试。由图23(a)可知，在HeLa细胞中，收集的两种荧光分子在蓝色通道显示强的荧光信号，在合并的图像中，与商用染料Mito-Tracker Green的绿色荧光显示出较好的重叠效果。TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在MKN-45细胞中的成像结果与HeLa细胞成像结果相同，这表明其与商业染料Mito-Tracker Green位于细胞的同一位置，显示出较好的共定位效果，这些结果有力地证明TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6靶向性地定位于线粒体细胞器，可作为特异性和高效性的线粒体示踪剂。
同时，对TPE-ON-CHO与TPE-ON-C6也进行了细胞成像实验，图24是TPE-ON-CHO在HeLa和MKN-45细胞中的成像。图25是TPE-ON-C6在HeLa、MKN-45细胞中的成像。由图可知，荧光分子都表现出较好的成像效果，表明TPE-ON-CHO与TPE-ON-C6也成功地进入了细胞，并选择性的靶向线粒体染色，由于线粒体在活细胞中表现出负的静电势，静电吸引作用有助于探针与线粒体的结合，并触发荧光开启。接下来我们进一步研究了加入BSA处理前后的荧光信号变化情况，如图所示，两种探针都可以很好的进入活细胞中，被BSA处理前后都显示较好的成像效果，因此，阳离子型荧光分子在活细胞荧光成像方面显示出独特的能力，可能在不久的将来成为生物诊断和生物医学研究不可或缺的工具。
5、斑马鱼成像
此外，还研究了在3日龄斑马鱼中加入TPE-ON-CHO(图26(a))、TPE-ON-C6(图26(b))的成像效果。斑马鱼本身没有荧光，当加入TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6孵育30 min时呈现相对较弱的荧光。孵育1h时，观察到荧光信号增强。斑马鱼成像的实验结果与细胞成像一致，表明TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6可以进入斑马鱼体内进行成像。
本发明的有益效果：
（1）本发明合成了外围带有阳离子的AIE型荧光探针TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6，系统研究了对BSA的荧光检测及其生物应用。对BSA检测机制为静电吸引作用。由于吡啶盐的存在，使得两种荧光探针都具有正电荷，因此可以通过静电吸引作用与带有负电荷的BSA相结合，阻止了分子内运动，诱导荧光增强，实现了对BSA的检测。
（2）TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6对不同的生物大分子及阴离子表现出不同的荧光现象。两种荧光探针对CS、HA、Hep和DNA以及阴离子响应较弱，而对BSA具有较好的选择性。当在溶液中加入不同浓度的BSA时，荧光强度表现为不同程度的增强，在2-10 ug/mLBSA的浓度范围内都存在较好的线性关系，实现对BSA的定量检测，对BSA的检出限分别为1.28 µg/mL、1.31 µg/mL，检测灵敏度高。
Figure 966781DEST_PATH_IMAGE004
（3）TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6具有典型的AIE特性，大的Stokes位移，低的细胞毒性，这些优势使其可以进行细胞成像。同时，由于活细胞中线粒体负的膜电位，使TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6荧光探针顺利进入细胞，选择性的靶向线粒体染色，随着孵育时间增加，荧光逐渐增强，并且加入BSA处理前后都显示较好的成像效果。因此，TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6荧光探针有望作为特异性和高效性的线粒体靶向示踪剂。此外，斑马鱼实验也显示出很好的成像效果，表明两种荧光分子可以实现体内成像。
附图说明
图1 TPE-ON的核磁氢谱；
图2 TPE-ON的核磁碳谱；
图3 TPE-ON的质谱；
图4 TPE-ON-CHO的核磁氢谱；
图5 TPE-ON-CHO的核磁碳谱；
图6 TPE-ON-CHO的质谱；
图7 TPE-ON-C6的核磁氢谱；
图8 TPE-ON-C6的核磁碳谱；
图9 TPE-ON-C6的质谱；
图10TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的EDS谱图；
图11（a, c）不同体积分数MTBE的TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6溶液的荧光发射光谱；（b, d）不同的体积分数MTBE的TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6溶液的荧光强度的点线图；图12（a,c）TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6溶液在不同浓度下的荧光发射光谱；（b, d）TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6溶液在不同浓度下的荧光强度变化的点线图；
图13(a, c) TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在不同体积分数Gly的混合溶液的荧光发射光谱；（b,d）TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在不同体积分数Gly的混合溶液相应的荧光强度的点线图
图14 (a, b) 化合物TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的荧光激发和发射光谱图；
图15 TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的荧光寿命；
图16 (a, c) TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的溶液在不同pH下的荧光光谱；(b, d)点线图；
图17 (a) TPE-ON-CHO；(b)TPE-ON-C6的Zeta电位图；
图18TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6与BSA反应的机理图；
图19 (a, c) TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的溶液在不同BSA浓度下的荧光光谱；(b,d) TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6在不同BSA浓度下的线性关系图；
图20 (a-f) TPE-ON-CHO与生物分子在不同浓度下作用的荧光光谱；(g, h) TPE-ON-CHO与生物分子在不同浓度下作用的点线图和对比柱状图；(i, j) TPE-ON-CHO与不同阴离子作用的荧光光谱和对比柱状图；
图21 (a-f) TPE-ON-C6与生物分子在不同浓度下作用的荧光光谱；(g, h) TPE-ON-C6与生物分子在不同浓度下作用的点线图和对比柱状图；(i, j) TPE-ON-C6与不同阴离子作用的荧光光谱和对比柱状图；
图22(a)TPE-ON-CHO；(b)TPE-ON-C6在不同浓度下处理24 h后HeLa、MKN-45和GES三种细胞的毒性测试；
图23 (a) 荧光探针TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6和商业染料Mito-Tracker Green在HeLa细胞中的共定位成像；(b) 荧光探针TPE-ON-CHO、TPE-ON-C6和商业染料Mito-TrackerGreen在MKN-45细胞中的共定位成像；
图24 (a, b) 用TPE-ON-CHO染色不同时间的Hela、MKN-45细胞的荧光显微镜图像；(c, d) TPE-ON-CHO加入BSA前后Hela和MKN-45细胞荧光显微镜图像；
图25 (a, b) 用TPE-ON-C6染色不同时间的Hela和MKN-45细胞的荧光显微镜图像；(c, d) TPE-ON-C6加入BSA前后Hela和MKN-45细胞的荧光显微镜图像；
图26 (a) TPE-ON-CHO；(b)TPE-ON-C6染色不同时间的斑马鱼的荧光显微镜图像。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的制备和对BSA的检测作进一步详细的说明。
本发明所用试剂如下表：
Figure 830963DEST_PATH_IMAGE005
本发明所用仪器如下表：
Figure 769575DEST_PATH_IMAGE006
实施例1 TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的制备
（1）TPE-2OH的合成
将4-羟基二苯甲酮（5.94 g，1 mmol），锌粉（10.35 g，0.5 mmol）和150 mL无水THF加入500 mL三颈圆底烧瓶中，使其处于氮气保护氛围和搅拌状态，抽真空循环三次，在冰浴条件下将8.4 mL TiCl4 滴加到反应体系，搅拌30 min后，将反应装置转移到油锅，升温至70 ℃回流，反应24 h后冷却至室温，将10 % K2CO3溶液打入反应体系淬灭反应。粗产物用硅胶铺垫的砂芯漏斗真空抽滤，萃取，干燥，柱层析分离提纯，得到淡黄色固体，即为产物TPE-2OH，产率74 %。
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.27 (s, 2H), 7.12-7.00 (m, 6H), 6.96-6.88(m, 4H), 6.70 (dd, J = 22.3, 8.3 Hz, 4H), 6.52-6.44 (m, 4H).
13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 156.16 (d, J = 2.9 Hz), 144.51 (d, J =19.4 Hz), 139.60 (d, J = 3.1 Hz), 134.65 (d, J = 19.1 Hz), 132.35 (d, J = 7.9Hz), 131.22 (d, J = 6.8 Hz), 128.22 (d, J = 32.5 Hz), 128.05, 126.52, 115.08(d, J = 6.1 Hz).
ESI-MS: m/z calcd for C26H20O2 [M]+, 364.1463; found 364.1458.
（2）TPE-2Br的合成
将1,8-二溴辛烷（1.262 g，4 mmol）与无水K2CO3（0.321 g，1.5 mmol）和20 mL的乙腈溶液加入到三颈圆底烧瓶，使其处于氮气保护氛围和搅拌状态，升温至82 ℃，在回流状态下，将TPE-2OH（0.423 g，2 mmol）溶于10 mL乙腈中，用注射器打入反应体系，反应24 h后冷却至室温，过滤K2CO3固体，将滤液干燥，减压蒸馏溶剂，然后通过柱层析分离提纯，得到淡黄色油状产物，即为TPE-2Br，产率62 %。
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.10 (td, J = 5.4, 5.0, 2.6 Hz, 4H),7.08-6.97 (m, 6H), 6.96-6.85 (m, 4H), 6.67-6.57 (m, 4H), 3.92-3.82 (m, 4H),3.41 (td, J = 6.8, 1.7 Hz, 4H), 1.85 (ddt, J = 9.2, 7.0, 4.4 Hz, 4H), 1.73(q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.43 (s, 7H), 1.39-1.31 (m, 9H).
13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 157.48, 144.32 (d, J = 11.0 Hz),139.61 (d, J = 1.7 Hz), 136.23 (d, J = 9.6 Hz), 132.48 (d, J = 4.1 Hz),131.40 (d, J = 4.0 Hz), 127.57 (d, J = 16.8 Hz), 126.11, 113.55 (d, J = 13.9Hz), 67.69 (d, J = 4.4 Hz), 33.96, 32.77, 29.69, 29.23 (dd, J = 10.6, 3.4Hz), 28.67 (d, J = 1.8 Hz), 28.08, 25.97 (d, J = 3.4 Hz).
ESI-MS: m/z calcd for C42H50O2Br2 [M]+, 744.2178; found 744.2169.
（3）TPE-ON的合成
将20 mL无水吡啶、TPE-2Br（1.02 g，1.4 mmol）和40 mL无水氯仿加入到250 mL三颈圆底烧瓶中，使其处于氮气保护氛围和搅拌状态，抽真空循环三次，加热回流24 h后冷却至室温，以甲基叔丁基醚溶剂作为沉淀剂，将反应液多次沉淀离心，得到淡黄色油状产物，即为TPE-ON，产率63 %。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.19-9.13 (m, 4H), 8.66-8.56 (m, 2H),8.19-8.11 (m, 4H), 7.15-7.03 (m, 6H), 6.97-6.88 (m, 4H), 6.81 (ddd, J = 15.3,8.2, 3.6 Hz, 4H), 6.64 (ddd, J = 15.9, 8.6, 3.2 Hz, 4H), 4.63 (tq, J = 7.1,3.2 Hz, 4H), 3.82 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.91 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.62 (q, J =7.4, 6.9 Hz, 4H), 1.34 (s, 4H), 1.28 (s, 12H).
13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 157.46, 144.33, 139.59, 136.18,132.47,131.37(d, J = 4.0 Hz), 127.54 (d, J = 17.0 Hz), 126.08, 113.49, 77.42-75.71 (m),67.69, 33.94, 32.76, 29.45-27.10 (m), 25.94.
ESI-MS: m/z calcd for C52H60O2N2Br2Cl [M+Cl]+, 937.2710; found 937.2732.
（4）TPE-ON-CHO的合成
将邻甲酰苯磺酸钠和TPE-ON加入到50 mL的圆底烧瓶中，用10 mL的去离子水溶解，室温下反应12 h，用CH2Cl2溶液多次萃取有机相，干燥，过滤，旋蒸得到的淡黄色油状产物，即为TPE-ON-CHO，产率56 %。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.87 (t, J = 3.4 Hz, 2H), 9.11 (d, J =5.8 Hz, 4H), 8.58 (dt, J = 8.2, 4.8 Hz, 2H), 8.14 (q, J = 5.8, 4.8 Hz, 4H),7.81 (dd, J = 7.6, 2.9 Hz, 2H), 7.74 (dd, J = 7.4, 3.1 Hz, 2H), 7.59 (td, J =7.4, 2.8 Hz, 2H), 7.47 (td, J = 7.6, 3.0 Hz, 2H), 7.15-7.03 (m, 6H), 6.99-6.87 (m, 4H), 6.87-6.75 (m, 4H), 6.71-6.59 (m, 4H), 4.59 (q, J = 7.0, 6.2 Hz,4H), 3.82 (h, J = 6.2 Hz, 4H), 1.88 (p, J = 7.3, 6.8 Hz, 4H), 1.62 (dt, J =13.4, 6.8 Hz, 4H), 1.33 (s, 3H), 1.26 (s, 13H).
13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 193.81, 157.14, 150.13, 145.96, 144.85,144.02, 139.69, 135.74, 133.42, 132.97,132.14, 131.27, 129.95, 129.37,128.45, 127.38, 126.59, 114.36, 67.38, 61.27, 31.19, 29.26, 28.14.
ESI-MS: m/z calcd for C66H70O10N2S2Cl [M+Cl]+, 1149.4160; found1149.4185.
（5）TPE-ON-C6的合成
将己烷磺酸钠和TPE-ON加入到50mL的圆底烧瓶中，用10 mL的去离子水溶解，室温下反应12 h，用CH2Cl2溶液多次萃取有机相，干燥，过滤，旋蒸得到的淡黄色油状产物，即为TPE-ON-C6，产率48 %。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.12-9.05 (m, 4H), 8.59 (t, J = 7.0 Hz,2H), 8.15 (d, J = 7.0 Hz, 4H), 7.10 (ht, J = 8.3, 5.5, 3.4 Hz, 6H), 6.99-6.88(m, 4H), 6.87-6.76 (m, 4H), 6.71-6.59 (m, 4H), 4.59 (d, J = 7.1 Hz, 4H), 3.84(s, 4H), 2.40-2.29 (m, 4H), 1.90 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 1.63 (s, 4H), 1.56-1.48(m, 4H), 1.36 (s, 4H), 1.28 (s, 16H), 1.22 (d, J = 6.5 Hz, 8H), 0.83 (dp, J =9.2, 3.9, 3.1 Hz, 6H).
13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 157.52, 157.50, 145.92, 145.26, 144.27,144.20, 139.70, 136.01, 135.94, 132.34, 132.32, 131.17, 131.15, 129.10,128.54, 128.22, 128.13, 126.74, 126.70, 114.14, 114.06, 67.66, 67.63, 65.45,61.15, 52.08, 31.62, 31.16, 30.44, 29.12, 29.09, 28.98, 28.95, 28.77, 28.76,28.60, 25.87, 25.85, 25.79, 25.60, 22.44, 19.09, 14.37.
ESI-MS: m/z calcd for C64H87O8N2S2 [M]+, 1075.5859; found 1075.5900.
TPE-ON-CHO和TPE-ON-C6的合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
实施例2 荧光探针TPE-ON-CHO对BSA的检测
在荧光探针2 mLTPE-ON-CHO的PBS缓冲溶液中（1×10-4 mol/L，pH=7.2~7.4）中，分别加入2 mL牛血清白蛋白BSA、硫酸软骨素CS、肝素Hep、透明质酸HA、鲑鱼精DNA1、鲱鱼精DNA2、BH4 -、CO3 2-、HPO4 2-、SO3 2-、HPO3 2-、NO3 -、S2-、HCO3 -、H2PO4 -、MoO4 2-、CH3COO-、NO2 -、C6H7O6 -、SO4 2-、WO4 2-、C2O4 2–的缓冲溶液中（0.01 mol/L，pH=7.2~7.4），若TPE-ON-CHO荧光强度显著增强，说明加入的是牛血清白蛋白BSA，若TPE-ON-CHO荧光强度没有发生明显变化，说明加入的是其他生物大分子或阴离子。
实施例3 荧光探针TPE-ON-C6对BSA的检测
在荧光探针2 mLTPE-ON-C6的PBS缓冲溶液（2×10-5 mol/L，pH=7.2~7.4）中，分别加入2 mL牛血清白蛋白BSA、硫酸软骨素CS、肝素Hep、透明质酸HA、鲑鱼精DNA1、鲱鱼精DNA2、BH4 -、CO3 2-、HPO4 2-、SO3 2-、HPO3 2-、NO3 -、S2-、HCO3 -、H2PO4 -、MoO4 2-、CH3COO-、NO2 -、C6H7O6 -、SO4 2-、WO4 2-、C2O4 2–的PBS缓冲溶液(0.01 mol/L，pH=7.2~7.4)，若TPE-ON-C6荧光强度显著增强，说明加入的是牛血清白蛋白BSA，若TPE-ON-C6荧光强度没有发生明显变化，说明加入的是其他生物大分子或阴离子。

Claims (5)

1.一种基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针在检测牛血清白蛋白中的应用，其特征在于：所述基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针的制备方法为，将邻甲酰苯磺酸钠或己烷磺酸钠与一维组装体TPE-ON溶于去离子水中，室温下反应10~15 h，用CH2Cl2溶液萃取有机相，干燥，过滤，旋蒸得到的荧光探针TPE-ON-CHO 或TPE-ON-C6。
2.如权利要求1所述的一种基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针在检测牛血清白蛋白中的应用，其特征在于：在荧光探针TPE-ON-CHO 或TPE-ON-C6的PBS缓冲溶液中，分别加入牛血清白蛋白BSA、硫酸软骨素CS、肝素Hep、透明质酸HA、鲑鱼精DNA1、鲱鱼精DNA2、BH4 -、CO3 2-、HPO4 2-、SO3 2-、HPO3 2-、NO3 -、S2-、HCO3 -、H2PO4 -、MoO4 2-、CH3COO-、NO2 -、C6H7O6 -、SO4 2-、WO4 2-、C2O4 2–的PBS缓冲溶液，只有牛血清白蛋白BSA的加入能使TPE-ON-CHO 或TPE-ON-C6的PBS缓冲溶液的荧光强度显著增强。
3.如权利要求1所述的一种基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针在检测牛血清白蛋白中的应用，其特征在于：所述邻甲酰苯磺酸钠或己烷磺酸钠与一维组装体TPE-ON的摩尔比为1:1~1:2。
4.一种基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针在细胞成像中的应用，其特征在于：所述基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针的制备方法为，将邻甲酰苯磺酸钠或己烷磺酸钠与一维组装体TPE-ON溶于去离子水中，室温下反应10~15 h，用CH2Cl2溶液萃取有机相，干燥，过滤，旋蒸得到的荧光探针TPE-ON-CHO 或TPE-ON-C6。
5.如权利要求4所述的一种基于TPE的Bola型两亲性AIE荧光探针在细胞成像中的应用，其特征在于：所述邻甲酰苯磺酸钠或己烷磺酸钠与一维组装体TPE-ON的摩尔比为1:1~1:2。
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