KR20070069125A - 형광표지로서의 치환된 아자포르피린 - Google Patents

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KR20070069125A
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월터 비. 댄들리커
마오 린 수
윌리엄 피. 쥬니어. 머피
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헤레스 한요르그
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Abstract

본 발명은 마커 성분, 형광 표지, 올리고뉴클레오티드, 혼성화 분석법, 및 이들을 이용일측역분석법, 그리고 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 하나가 분자표면의 일측에 위치하는 두개의 수용성 그룹이 결합되며, 정전하(net charge)를 조절하여 용매 민감도 및 비특이적 결합의 문제점을 감소시키거나 제거할 수 있는 형광 부위를 포함하는, 탐지가능하도록 표지된 마커 성분이 제공된다.
마커 성분, 형광 표지, 올리고뉴클레오티드, 혼성화 분석법

Description

형광표지로서의 치환된 아자포르피린{Substituted Azaporphyrins as Fluorescence Labels}
본 출원은 일반적으로 형광촬영법(fluorography), 형광측정법 및 형광탐침에 관한 것이다.
본 명세서에 인용된 간행물들과 참고문헌들은 참조문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 발명의 배경에 대한 이하의 설명은 발명의 이해를 도모하는 것이며, 발명의 선행기술을 개시하거나 구성하는 것은 아니다.
프로피린(prophyrin), 프탈로시아닌(phthalocyanine) 및 다른 아자포르피린(azaporphyrin) 및 거대고리(macrocycle)를 가지는 다른 방향족 질소의 근적외선 흡광과 방출은 한 기간 동안 이들 화합물들을 형광표지로서 사용하는데 매력적인 후보로 만들어 왔다.
특히, 프탈로시아닌(phthalocyanine)은 그들의 강한 근적외선 흡광(몰 흡광 계수 약 20,000), 그들의 높은 양자 수득량 및 일반적인 메탈로프탈로시아닌 염료의 변색에 대한 저항성 때문에, 형광표지로 이용하려는 많은 노력이 있어 왔다. 그러나, 이에 따르는 초기의 노력들은 집합체(aggregate)에 직면하여 축적(stacking)에 의해 결합하고, 또한 다양한 다른 분자 표면에 대해 강하게 결합(비특이적 결합)하는 비정상적인 프탈로시아닌의 강한 경향성에 의해, 완전히 만족스런 생산물을 만들지 못하였다.
분자 내에 축적되는 결과 때문에, 치환되지 않은 프탈로시아닌은 유기 용매와 수용성 용매 모두에서 매우 낮은 용해도를 가지게 된다. 잘 알려져 있듯이, 축적하려는 경향성(tendency to stack)은 술폰염(sulfonate)과 등의 하전기(charged group)의 도입으로 감소시킬 수 있는 반면, 이러한 치환기를 지닌 프탈로시아닌은 물과 전해질 수용액에서 높은 용해도를 지니고, 비특이적으로 결합하려는 경향이 오래 지속되었다. 형광표지에 대한 많은 과학적 관심은 조직 절편, 세포, 세포 단편, 당단백질 및 지질단백질을 포함하는 단백질, 펩타이드, 올리고당 및 다당류, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드, 지질 등 생물학적 물질들의 응용에 집중되었다. 이러한 물질을 포함하는 형광시험에서 비특이적으로 결합하려는 경향은 관심을 갖는 특이적 상호작용을 부분적으로 억제(masking)함으로써 방해받을 수도 있다. 축적하려는 경향성 뿐만 아니라, 비특이적 결합은 프탈로시아닌 염료를 하나 또는 그 이상의 폴리옥시하이디오카르빌(polyoxyhydyocarbyl) 기, 통상적으로 메톡시로 종결되는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG)에 연결시킴으로써 치료용 약물에 대한 시험 시에 무시할 정도로의 수준으로 낮출 수 있다. 동시에, 이러한기의 부착은 바람직한 흡광 및 방출 특성을 보존하였다. 동일한 기술은 다른 다양한 종류의 근적외선 염료에 대하여 효과적이었다(참조: 미합중국 특허 제 5,403,928호).
또한, 중요한 진보는 면역분석법에 관련된 요인들을 측정하는 능력에서 이루어졌다. 예를 들어, 참조문헌으로 본 명세서에 포함되고, 모든 도면을 포함하는 "전이상태 발광시험 기구(Transient State Luminescence Assay Apparatus)"라는 명칭의 댄들리커(Dandliker) 등의 미합중국 특허 제 5,302,349호에 기술된 기술을 이용하여 성분의 결합(bound) 및 유리(free)형태의 농도를 균질시험 형식으로 측정이 가능하게 하여, 결합 및 유리형태의 분리가 필요없도록 한다.
형광표지 및 데이타분석 영역에서의 의미있고 유망한 개선에도 불구하고, 필수적인 장점은 지니고 있지만 제조가 쉽고 화학적 안정성까지 지닌 추가적인 염료에 대한 당업계의 필요성은 여전히 남아 있다. 다른 사람에 의한 밀접하게 관련된 선행기술은 미합중국 특허 제 5,135,717, 5,346,670 및 5,494,793호에서 찾을 수 있다.
본 발명
본 발명은 일부 프탈로시아닌의 경우 형광탐침을 제조하는데 유용한 형광염료로 전환될 수 있다는 발견과 응용으로서 특정되고 기술될 수 있다. 이것은 단지 소수의 원자를 지닌 축 리간드(axial ligand)를 수반하는 적절한 금속원자를 프탈로시아닌에 제공하고, 고리치환(ring substitution)에 의해 일반적으로 음성인 이온성 전기 전하를 제공함으로써 달성할 수 있다. 이러한 변화는 분자의 축적(대면응집(face to face aggregation) 및 같은 신호의 전기 전하를 지니고 있는 다른 분 자 표면에의 비특이적 결합을 대부분 제거하였다.
발명의 요약
본 발명은 두 개의 작은 잔기가 분자 평면의 어느 한쪽에 있고 전체 분자의 정전하가 충분히 크다면, -OH 등의 매우 작은 잔기도 평면 분자의 비특이적 결합 및 축적에 대한 효율적인 보호효과를 나타낸다는 예상치 못한 결과에 기초한다.
따라서, 본 발명의 한 가지 측면은, 프탈로시아닌 및 다른 형광염료를 폴리옥시하이드로카르빌기에 결합시킴으로서 야기되는 바람직한 효과가, 염료에의 정전하가 충분히 크다면, 두 개의 매우 작은 축의 리간드(-OH 등)에 의해 야기될 수 있다. 대부분의 환경에서, 생리적 pH 범위에서 단백질과 DNA를 포함하는 대부분의 생물학적 물질이 음성 정전하를 지니기 때문에 이러한 정전하는 바람직하게는 음성이다. 따라서, 본 발명자들은 항체를 표지하기 위해 사용하였을 때, 일부 술폰화 디하이드록시실리콘디카르복시프탈로시아닌, 특히 La Jolla Blue-3(LJB-3)는 높은 활성과 특이성을 지닌 공액체(conjugate)를 형성함을 알아내었다. LJB-3는 축의 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 지닌 염료/형광체(dye/fluorophore)보다 제조가 훨씬 쉽고, 부가적으로 LJB-3는 화학적으로 더욱 안정적이다. 도 1은 LJB-3의 예상되는 구조를 보여 준다. 술폰기의 위치는 정해지지 않았고, 아마도 다른 미치환된 벤젠고리의 하나에 위치할 것이다. LJB-3에 대한 정밀한 적외선 흡광 최대량은 679 nm에서이다.
형광체(형광 부분)의 작용은 완전한 형광탐침에서가 아닌 유리 염료의 측정에 의해 부분적으로 평가할 수 있다. 이러한 종류의 시험에서 의미가 있는 파라미터는 형광체가 다른 이온강도, 특정 이온 또는 혈청에 존재하는 생분자에 노출되었을 때, 일반적으로 변화하는 형광도(fluorescent intensity)와 편광/이방성(polarization/anisotrophy)을 포함한다. 이러한 효과는 "용매효과(solvent effects)"로 추정할 수 있고, 축적 상태를 변화시키는 형광체 또는 형광 분자와 용매의 성분들(비특이적 결합, NSB) 사이의 상호작용에서의 변화에 의해 나타날 수 있다.
본 발명의 염료구조와 형광탐침에 대한 표지로서 프탈로시아닌(Pc's)을 이용하려는 이전의 시도의 구조 간 차이는 유리 염료를 혈청에 가하고, 그 결과의 편광 또는 이방성을 측정하는 NSB에 대한 시험형식에 의해 평가할 수 있다. 결합시 분자량의 증가가 회전 브라운 운동의 감소가 되기 때문에 비특이적 결합이 일어난다면 편광의 증가가 나타날 것이다.
표 1에서, 하나의 염료에 대한 실행은 형광도의 변화(I), 및/또는 표를 통해 수평적으로 진행함에 따른 편광의 변화(mp, milli polarization units)에 의해 판단할 수 있다. "완전한(perfect)" 형광표지는 용매의 성분에 관계 없이 이러한 파라미터 각각에 대하여 같은 값을 지닐 것이다.
글리세롤에서의 것과 정상적인 사람 혈청에서의 양상 비교는 혈청이 존재할 때 NSB에 의한 잠재적 편광 변화의 손실을 측정할 수 있도록 함으로써 유익하다. 다섯 가지 염료에 대하여, 글리세롤 편광과 정상적인 사람 혈청에서의 편광의 차이 값은 다음과 같다: 60.4, 73.6, 103, 12, 61 및 44.1. 이러한 차이는 중심 원자(central atom)로서 규소의 극적이고 유익한 효과를 보여주며, 기의 최선의 선택으로 LJB-3을 지적하였다. 글리세롤의 세기를 정상인 사람 혈청에서의 세기로 나눈 비율 또한 암시적인데, 표에서의 이러한 값은 1.46, 1.27, 1.51, 2.91, 4.82, 0.42인데, 이는 알루미늄보다 규소가 훨씬 우월함과 LJB-3의 높은 실행성(performance)을 보여주었다.
그외에도, LJB-3는 카르복실 그룹과 술폰산염 두 가지를 모두 지니고 있고, 다양한 방법에 의해 "활성화(activated)"되어 생리적 pH와 주변 온도에서 표지될 생체분자의 잔기(주로, 아미노기)와 자발적으로 공유결합하는 구조로 전환될 수 있다. 본 발명자들은 항체, 카보닐 디이미다졸, 숙신이미딜테트라메틸유로니움 테트라플로오로보레이트(STUT)의 표지에 두 가지 다른 활성화제를 사용하였다. 본 발명자들은 후자의 시약이 사용의 용이함과 결과의 재현성 모두에서 바람직하다는 것을 알게 되었다. 이 점은 STUT를 이용하였을 때, 중간체인 염료의 NHS 에스테르(ester)의 높은 안정성 때문이다. 아울러, STUT를 이용한 활성화에 가장 좋은 용매는 DMSO이다. DMF도 사용할 수 있지만, 아마도 미량의 아민이 생성되는 것은 회피할 수 없을 것이다.
주어진 응용에 대한 형광체의 적합성에 대한 가장 확실한 시험은 염료를 완전한 탐침에 결합시켜서 탐침을 시험하는 것이다. 유리 염료에 대한 혈청 시험은 유용한 지침이지만, 특정 탐침에 대한 시험을 완전하게 대체할 수는 없다.
표 2 및 3은 ANA(anti-nuclear antibody)에 대한 탐침으로서 LJB-3을 표지한 항-사람 IgG를 이용한 설명적인 결과를 보여준다. 실행의 질은 음성(정상) 대조군으로부터의 신호를 양성 시료의 신호와 비교한 비율인 FIU(양성/음성) 또는 FIU(+/-)값으로 측정할 수 있다. 7 또는 그 이상의 값이 유용하였다. 이 표에서의 데이타는 기술이 전개됨에 따라 얻어졌다. 일상적인 사용 시, FIU(+/-)의 높은 값은 동일한 결과를 예상할 수 있다.
도 1은 디하이드록시실리콘디카르복시프탈로시아닌 모노술폰산, La Jolla Blue-3(LJB-3)의 화학구조식을 나타낸다.
일반적 토의
본 발명은 두 개의 작은 잔기가 분자 평면의 어느 한쪽에 있고 전체 분자의 정전하가 충분히 크다면, -OH 등의 매우 작은 잔기도 평면 분자의 비특이적 결합 및 축적에 대한 효율적인 보호효과를 나타낸다는 예상치 못한 결과에 기초한다.
따라서, 본 발명의 한 가지 측면은, 프탈로시아닌 및 다른 형광염료를 폴리옥시하이드로카르빌기에 결합시킴으로서 야기되는 바람직한 효과가, 염료에의 정전하가 충분히 크다면, 두 개의 매우 작은 축의 리간드(-OH 등)에 의해 야기될 수 있다. 대부분의 환경에서, 생리적 pH 범위에서 단백질과 DNA를 포함하는 대부분의 생물학적 물질이 음성 정전하를 지니기 때문에, 이러한 정전하는 바람직하게는 음성이다. 따라서, 본 발명자들은 항체를 표지하기 위해 사용하였을 때, 일부 술폰화 디하이드록시실리콘디카르복시프탈로시아닌(특히, La Jolla Blue-3(LJB-3, 표 1))는 PEG-접합된 비술폰화 염료로서 혈청 단백질에 대한 거의 낮은 비특이적 결합을 가진다는 것을 발견하였다.
그 외에도, 하나의 장점이 PEG에 의한 미셀(micelle) 형성이 없을 때 나타났다. 10-4M의 염료 농도에서 PEG 처리한 염료는 약 30킬로달톤 또는 그 이상의 분자량을 지닌 분자의 통과를 억제하도록 만든 막에서 위와 같은 거대분자와 같은 행동이 제한되었다. 또한, 작은 분자로부터 거대분자를 분리하도록 하는 젤 투과 크로마토그래피에서 염료는 빈 공간(void volume)을 이동하였다. 대조적으로, LJB-3는 이러한 분자량을 지닌 분자에 대하여 예상한 대로 움직였다.
형광 편광 및 강도의 변화에 의해 측정되는 비-특이적 결합과 관련하여, 예를 들어 염료를 사람의 희석혈청 LJB-3에 노출시켰을 때, PEG 결합한 염료와 마찬가지 양상을 나타낸다. 이와 관련하여, 자체의 음전하가 술폰화되지 않은 디하이드록시디카르복시실리콘프탈로시아닌이 상당한 비특이적 결합을 보여준다는 점을 고려할 때, 비특이적 결합을 감소시키는데 상당한 영향을 주었다는 점에 주목하는 것이 매우 중요하다.
하이드록시알루미늄프탈로시아닌트리술포네이트는 이온강도에 대한 강한 민감도와 강한 비특이적 결합력을 보여준다. 프탈로시아닌 분자는 분자 평면의 양 측면에서 축 리간드를 지니고 있으며, -OH 기는 정전하가 충분히 높을 때, 사실상 비특이적 결합을 제거할 정도로 충분히 크다.
본 발명의 다른 장점은 -OH 또는 다른 작은 수용성 축 리간드를 고 전하로 같이 처리한 염료는 분자가 표지되어 있고, (예를 들어 단백질, 올리고뉴클레오티드) 자체가 음성으로 대전되어 있음에도 불구하고, 표지 반응에서 화학적으로 매우 반응성이 컸다. 이는 합텐 및 다른 작은 분자의 표지가 일반적으로 쉽게 진행되지만, PEG 리간드가 거대분자의 표지를 방해할 수 있음을 제안한다.
본 발명은 하이드록시알루미늄프탈로시아닌트리술폰염의 강한 비특이적 결합의 측면과 일반적으로 더 작은 음성 정전하를 지닌 디하이드록시디카르복시실리콘프탈로시아닌이 알루미늄 염료에 비해 더 강한 비특이적 결합을 보여준다는 점으로부터 예상할 수 있다. 본 발명은 부분적으로 정반대의 효과를 나타내는 결과에 기초하였다. 또한, -OCH3, -O-CH2OH,-Cl, -Br,-F 등의 다른 작은 축 리간드의 효과는 유용할 수 있다. -OPO3H2-의 행동도 중요하며, 붕산염 및 술폰염 등의 다른 잠재적으로 유용한 리간드를 제안한다.
거대고리(macrocycle)를 함유하는 많은 다른 질소화합물을 유사한 결과를 지닌 그룹 14의 원자로 금속화시켰다. 이러한 거대고리는 유도체와 포피린(porphyrin), 아자포르피린(azaporphyrin), 코롤(corrole), 사피린(sapphyrin), 펜타피린(pentaphyrin), 포피신(porphycene) 및 pi 전자 체계(pi electron system)를 극도로 이탈시키는 다른 거대고리를 포함한다. 거대고리가 많은 바람직한 특성을 지닌다는 사실에서, 특히 바람직한 부류의 거대고리는 아자포르피린 유도체와 구조적 변이체를 구성한다. 아자포르피린 유도체는 모노, 디, 트리아자포르피린 및 프로피라진 유도체를 포함한다. 이러한 거대고리 중 하나는 선택적으로 융합된 원형 고리를 지닐 수 있다. 이러한 아자포르피린 유도체 및 변이체는 그들의 옥사(oxa-), 티아(thia-), 아자(aza-) 구조적 변이체 뿐만 아니라, 프탈로시아닌, 벤조트리아자포르피린, 네프탈로로닌 및 그 유도체를 포함한다. 특정 비-거대고리 원형 구조는, 예를 들어, 크산텐(xanthene) 유도체들은 상기 열거된 종류의 필요한 형광특성을 지닐 수도 있다(참조: Daltrozzo et al., 미합중국 특허 제 6,552,199호, Apr. 22, 2003).
본 발명은 또한 이러한 생성물을 이용하는 마커 성분들, 형광탐침, 자연적 치료용 약물과 합성 치료용 약물, 항원, 합텐, 항체, 올리고뉴클레오티드, 혼성화 실험, 면역분석법과 이러한 결과를 만드는 방법에 관련되어 있다. 본 발명에 따르면, 축이 중심 금속원자에 의해 형성된 복합에의 8면체 구조에 의해 정해져서 용매 민감성 및 비특이적 결합의 문제를 감소시키거나 제거하는 둘 또는 그 이상의 수용성 리간드에 연결된 형광체 부분을 구성하는 탐지가능한 표지된 마커 성분들이 제공된다.
분석법에서 이러한 탐지가능한 표지 또는 마커 성분들의 이용은 이러한 표지가 혈청 등의 생물학적 물질이 있거나 없는 조건에서 형광방출의 유사하고 수직인 조성물의 같은 강도를 나타낸다는 측면에서 편리하다. 따라서, 이러한 표지를 이용한 실험 방법들은 분석물, 목적하는 분석물 또는 생물학적 유체 및 조직 시료나 배양세포 등의 생물학적 표면에서의 유사물의 낮은 농도를 탐지할 수 있다. "분석물(analyte)"이라는 용어는 수용체가 자연적으로 존재하거나 공통적인 항원요소 위치나 수용체에 최소한으로 공유하는 또는 모노 또는 폴리항원 요소인, 항원의 또는 부착요소의, 단일 또는 다수의 화합물을 제조할 수 있는 실험에서의 화합물 또는 측정할 수 있는 화합물을 의미한다. "목적하는 분석물(target analyte)"이라는 용어는 수용체가 자연적으로 존재하거나 공통적인 항원요소 위치 또는 수용체의 최소한을 공유하는 모노, 폴리항원요소의, 항원의, 부착요소의, 단일 또는 다수의 화합물을 제조할 수 있는 화합물을 이용한 실험에서의 화합물 또는 측정하는 화합물을 의미한다. 목적하는 분석물의 "유사체(analog)"이라는 용어는, 목적하는 분석물과 수용체에 대한 결합을 경쟁하는 화합물을 의미한다. "수용체(receptor)"라는 용어는 목적하는 분석물 및 그의 유사체를 특이적으로 인식하거나 목적하는 분석물 및 그의 유사체에 의해 인식되는 분자 복합체를 의미한다. 예를 들어, 항체는 항원에 대한 수용체가 될 수 있다.
이러한 마커 성분들은 분석물, 항원, 항체 또는 다른 분자를 표지하는 표지로서 이용할 수 있다. 이러한 마커 성분들은 선택적으로 기능화하여 마커 성분들을 분석물, 항원, 항체 또는 다른 분자에 연결시키는 링커를 포함한다. 이러한 목적에 부합하는 다양한 링커의 팔은 아래에 기술하였다. Kricka, J. J.; Ligand Binder Assay; Labels and Analytical Strategies; pages 1551; Marcel Dekker, Inc., New York, NY (1985). 마커 성분들은 분석물, 항원, 항체 또는 통상적인 기술을 이용하는 다른 분자에 연결시켰다.
본 발명의 한가지 측면에 따르면, 본 발명은 (1) 발광성이고 상당히 평면인 분자구조, 바람직하게는 최소 약 550 nm의 여기파장을 지닌 형광영역 (2) 거기에 둘 또는 그 이상의 작은 수용성 축 리간드가 연결되고 (3) 충분히 큰 음성 정전하를 지닌 것으로 구성하는 탐지 가능한 표지된 마커 성분들을 제공한다. 바람직한 형광체, 작은 수용성 축 리간드 및 두 가지의 연결은 본 명세서에 상세하게 기술하였다. 아울러, 축 리간드의 효율성 및 환원성 용매 민감도와 비특이적 결합의 정전하를 설명하는 증거를 제공한다.
"용매 민감도(solvent sensitivity)"이라는 용어는 사용시 용매 체계에 의존하는 분자의 형광 활동, 대부분 유기용매(DMF 등)와 비교했을 때 수용액의 형광 양상의 차이점에 관련되는 변화를 의미한다. DMF 등의 유기용매에서 높은 형광도를 나타내는 많은 형광체는 수용액에서 감소된 형광도를 나타낸다. 형광도는 시료 농도와 여기 방사성의 강도에 관련되어 있다. 특정 염료의 형광도는 환경적 요소뿐만 아니라, 그것의 특징적인 광 흡광율(소멸 계수) 및 형광 양자 효율성에 관련될 수 있다. 이러한 마커 성분들은 또한 그들의 발산성 또는 꺼지지 않는 수명에 접근하는 증가된 붕괴 시간을 나타낸다. 본 발명자들은 일반적으로 여기된 분자의 농도에 대하여 초기의 농도로부터 그 값까지 생존시간을 감소시키기 위해 경과해야만 하는 시간을 지정할 때 "붕괴시간(decay time)"이라는 용어를 이용하였다. 예를 들어, Demos, J.N., 여기 상태 생존시간 측정 등 생존에 관련된 용어의 이용은 다양하였다. Academic Press, New York(1983), Pages 10, 35, 44, 158.
형광체의 진행은 완전한 형광탐침에 있는 게 아니라 유리 염료에 대한 측정에 통해 부분적으로 측정할 수 있다. 이러한 종류의 시험에서 의미있는 요소는 형광체가 다른 이온강도, 혈액 혈청에 있는 특별한 이온이나 생분자에 노출되었을 때 통상적으로 바뀌는 형광도와 편광/이방성이다. 이러한 효과는 "용매효과(solvent effect)"라고 추정하며, 집합체의 상태를 변화시키는 형광체 분자간 또는 용매 조성물과 형광체 분자 사이의 상호작용의 변화에 의해 나타날 수 있다(비특이적 결합, NSB).
본 발명의 염료구조와 형광탐침으로 이용하는 표지로서 프탈로시아닌(Pc's)를 이용하려는 기존의 시도에 대한 구조 사이의 차이점은 유리 염료를 혈청에 첨가하여 그 결과적인 편광 또는 이방성을 측정하는 NSB에 대한 상기의 모델에 의해 고려할 수 있다. 편광의 증가는 결합시 분자량 증가가 회전성 브라운 운동의 속도를 감소시키기 때문에 비특이적 결합이 생기면 나타난다. 표 1에서, 한 가지 염료의 실행성과는 표를 가로질러 수평적으로 진행함에 따라 형광도(I), 편광의 변화(mp, milli-polarization units)를 통해서 평가할 수 있다. "완전한(perfect)" 형광표지는 용매 조성에 관계 없이 이러한 매개변수 각각에 대하여 같은 수치를 가질 것이다.
글리세롤에서의 양상에 대한 정상적인 사람의 혈청에서의 양상 비교는 이 비교가 혈청이 있을 때 NSB에 의한 잠재적 편광 변화의 손실 측정을 제공하기 때문에 유익하였다. 다섯 가지의 염료에 대하여, 글리세롤에서의 편광과 정상적인 사람의 혈청에서의 편광 사이의 차이점에 대한 값은 아래와 같다: 60.4, 73.6, 103, 12, 61, 44.1 . 이러한 차이는 중심 원자로서 규소의 상당히 유익한 효과를 보여주었고 또한 LJB-3를 그룹 내의 최선의 선택으로 지정하였다. 글리세롤의 강도를 정상적인 사람의 혈청에서의 강도로 나눈 비율 또한 암시적이다. 표에 나와 있는 값은 1.46, 1.27, 1.51, 2.91, 4.82, 0.42인데, 이는 알루미늄에 비해 규소의 현저한 우월성과 LJB-3의 높은 실행성과를 보여주고 있다(도 1에 나타낸 구조). 또한, LJB-3는 카르복실 그룹과 술폰염 그룹을 모두 가지고, 다양한 방법, 예를 들어, 표지하려는 생분자에 대해 생리적 pH's와 기(주로 아미노 그룹)를 지닌 주위 온도에서 자발적으로 반응하여 공유 결합하려는 구조로 변화하는 것을 통해 "활성화(activated)"될 수 있다. 본 발명자들은 카보닐 디이미다졸 및 STUT를 통한 항체의 표지에 대하여 두 가지 다른 활성화제를 이용하였다. 본 발명자들은 후자 시약이 다루기 용이하고 결과의 재현성에서 더 바람직하다는 것을 찾아내었다. 부가적으로, STUT를 이용한 활성화에 가장 적합한 용매는 DMSO이다. DMF도 이용할 수 있지만 무시할 수 없는 미량의 아민이 생성될 수 있다.
실험적 결과
주어진 응용에 형광체의 적합성에 대한 가장 결정적인 시험은 염료를 완전한 탐침에 결합시켜서 그 탐침을 시험하는 것이다. 유리 염료에 대한 상기의 혈청 시험은 유용한 지침이지만, 특정 탐침에 대하여 만든 시험을 완전하게 대체할 수는 없다.
표 2와 3은 ANA(anti-nuclear antibodies)에 대한 탐침으로서 항-사람 IgG를 표지하는 LJB-3를 이용한 설명적 결과를 나타내었다. 실행성과의 질은 FIU(양성/음성) (또는 [+/-]) 수치, 예를 들어 음성(정상) 대조군의 신호와 비교했을 때 양성 시료의 신호의 비율에 의해 측정할 수 있다. 7 또는 그 이상의 수치가 유용하다. 이 표들에서의 데이타는 기술이 발달함에 따라 수득하였다. 일상적인 사용에서는 높은 수치의 FIU(+/-)가 동일한 결과로 예상되었다.
용매 조성물의 변형에 대한 치환된 프탈로시아닌의 민감도에 의한 형광도(I) 및 형광(mp)의 변화측정
형광체 TD 완충액 I mp BBS I mp 태아 혈청 I mp 정상인의 혈청 I mp 글리세롤 I mp
Si Pc 술폰염 1762 -1.5 1040 0 867 69.7 1133 82.6 1657 143
Si Pc 트리/ 테트라술폰염 2337 -1.0 1411 3.9 1080 2.6 1420 13.1 1798 86.7
Si 디카르복시Pc 모노술폰염 (LJB-3) 1230 -0.3 741 2.0 716 38.7 896 95.7 1351 199
Al Pc 트리술폰염 1108 1.7 520 3.4 533 60.7 1086 224 3155 236
Al Pc 테트라술폰염 370 5.9 165 5.0 170 40.3 259 141 1249 202
디포스페이토 Si디카르복시프탈로시아닌 1069 6.7 1078 2.4 1020 64.9 1083 60.9 454 105
약어: mp:103 (편광); TDX 완충액: 형광 편광 시험에서 상용적인 완충액; Pc: 프탈로시아닌; BBS: 붕산염 완충 식염수(0.25 M NaCl, 0.0232 M 붕산 및 0.00179 M 테트라붕산 나트륨. pH는 최종적으로 1 M NaOH를 이용해 8.0+/-0.05에 맞추었다. 혈청을 시험했을 때, 전체 혈청의 25 ul를 1 ml PBS(이미 염료를 첨가한 20 ul를 지니고 있는)에 가하였다. 다양한 형광체의 상대적인 농도가 알려지지 않아서, 형광도의 비교가 수평방향으로 진행하였을 때에만 유의하다는 점에 주목해야 한다. 수용액에서 LJB-3를 다루는데 있어서, BBS에 대한 다른 선택은 0.70M 붕산 33.1 ml, 0.50M K2B4O7 4 ml 및 물을 혼합하여 1 리터로 맞추고, pH를 8.1로 만든 붕산염으로 완충된 KCl (BBKCl)이다.
형광 측정: 전이상태 편광 형광계에서 측정하였다(FAST-1, Hyperion, Inc. Miami. FL)
환자의 항-핵성 혈청 항체(antinuclear serum antibodies, ANA)에 대한 LJ-B-3로 표지한 염소의 항-사람 IgG의 결합 특이성 A: 염료의 제조: 카르보닐 디이미다졸에 의해 활성화된 LJB-3(1)
Lot# n moles LJB-3 생산물에서 염료/단백질(몰 비) FIU(2) (+/-)
211-45-70 J(3) 70 4.1 11.7
211-49-70 D(3) 70 3.4 2.4
211-45-100 J 211-49-100 D 100 100 2.0 11.8 15 2.1 11.9
211-45-140 J 211-51J 140 140 3.1 6.3 9.2 7.1
(1) 각 표지에서 단백질 1mg(코마시에블루에 의함)
(2) FIU: ANA 시험에서 관찰한 형광도의 비율
; 대조의 측정: 시료/음성 대조군
(3) 두 가지 다른 항체의 제조: D 와 J
B: 염료의 제조: STUT*에 의해 활성화된 LJB-3
ID 표지 항체 염료/단백질(몰비) FIU 양성/음성
6th 참조 5.60 14.04
211-184 3.44 5.86
211-186 3.44 5.86
211-187 1.16 5.06
211-190E 2.09 8.87
6th 참조 5.60 14.30
211-191 0.95 13.54
211-192 2.65 6.48
* 숙신이미딜테트라메틸로늄 테트라플루오로붕산염 (STUT)
상세한 배경과 범주
이러한 마커 성분들(marker components)은 형광탐침에 함입시키기 위한 형광표지로서 유용하다. "형광탐침(fluorescent probe)"란 용어는 목적하는 물질의 존재를 확인하거나, 정량하기 위한 형광면역분석법 등의 시험에 이용하는 분석물, 항원, 합텐, 항체 및 다른 분자에 링커의 팔(linker arm)을 통해 연결하거나, 직접적으로 연결 또는 결합한 형광체 부분(fluorophore moiety)을 포함하는 마커 성분을 의미한다. 이러한 마커 성분들 중의 일부는 인광성 표지(phosphorescent label)로서 유용하다. 본 발명의 성분들은 생체조건의 영상화제(imaging agent)에 대한 마커로서, 또한 생체조건의 암 치료제에 대한 표지로서 유용하다.
이러한 마커 성분들은 생물학적 유체의 시료를 이용한 시험에서 특별히 유용한데, 이러한 용도에 바람직한 것은 다른 시료성분들의 주위 형광의 방해가 최소화되는 근적외선의 여기 또는 방출 파장을 지니는 형광체(fluorophore)이다. 여기파장이 500nm 이하일 때, 혈청 등의 일부 시료는 플라빈, 플라빈 단백질, NADH 등으로부터 상당한 방해 배경형광(interference background fluorescence)을 나타낸다.
형광 편광 면역분석법(fluorescence polarization immunoassay) 등의 일부 응용에 있어서, 바람직한 형광체는 결합된 형태일 때, 바람직하게는 관찰가능한 편광에 대한 이론적 최대값의 10%보다 더 큰 형광 편광도를 나타내었다. "결합한(bound)"이라는 용어는 결합 상호작용이 분자와 분자의 특별한 결합상대(binding partner) 사이에 형성되어 있는 상태를 의미한다. 형광전이상 시험(fluorescent transient state assay) 등의 일부 응용에 있어서, 바람직한 형광체는 또한 1 내지 5×100억분의 1초의 범위에서, 바람직하게는 5 내지 20×100억분의 1초 범위로 측정되는 형광 붕괴시간(decay time)으로 특정화될 수 있다. 인광 표지 등의 다른 응용에 있어서는, 훨씬 더 긴 붕괴 시간을 지닌 형광체를 이용할 수 있다.
바람직한 작은 가용성(solubilizing) 축 리간드는 -OH, -O-t-butyl (유기용매가 있을 때만 유용), -OCH2OH, -OCH2CH2OH, -OCH2CHOHCH2OH, -OCH2CH2-OCH2CH20H, -OCH2CH2-CH2-O-CH2-CH2CH20H, -OPO3H2, -OB(CH)2, Cl, Br, F를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 형광체 부위는 두 가지 작은 가용성 축 리간드와 배위결합할 수 있는 중심 원자에 배위된, 대체로 평면이고 톱니형(multidentate)인 거대고리 리간드를 지니고 있다. 형광결합 시험에 마커 성분으로 이용하기 위해서, 적절한 중심 원자는 두 축 리간드와 배위결합할 수 있고, 3중 상태(triplet state)로의 전이에 의해 과도한 형광의 소거(fluorescence quenching)를 야기시키기에 충분한 원자수를 지니지 않아야 한다. 중심 원자에 대한 바람직한 원자들은 실리콘, 게르마늄, 및 주석이고, 특히 바람직한 것은 실리콘과 게르마늄이다.
본 발명의 이러한 탐지가능한 표지 또는 마커 성분들을 면역분석법에 이용하였을 경우의 장점은, 이러한 표지가 혈청 등의 생물학적 유체가 있거나 없는 조건하에서 형광방출(fluorescence emission)의 평행 및 수직 성분들이 대체로 같은 강도를 지니고 있다는 점이다. 따라서, 이러한 표지를 이용한 시험방법은 생물학적 유체 내의 목적하는 분석물의 저농도를 감지할 수 있다.
본 발명의 방법들은 미합중국 특허 제 5,323,008호(형광 탐지시스템, Fluorescent Detection System)에 개시된 향상된 형광 탐지시스템에 특히 적합하다.
형광표지를 이용한 경쟁적 저해시험에서, 본 발명은 하나는 충분한 음성 정전하를 지닌 평면 분자구조의 일측에 위치하고, 특이적으로 목표 구조를 인식하고 수용체에 결합하거나 순수 상태인 형광탐침의 양을 결정할 수 있는 수용체를 지닌 혼합물에 접촉하고 있는 두개의 작은 가용성 축 리간드에 결합한 발광성의 대체로 평편한 분자구조를 포함하는 형광체 부분으로 구성된 탐지 가능하도록 표지된 마커 성분들을 포함하는 형광탐침에 연결된, 알려진 양의 목적하는 분석물 또는 그의 유사체를 목적하는 분석물을 함유하는 것으로 추측되는 시료에 접촉시킴으로써 목적하는 분석물의 양을 결정하는 방법을 제공한다. 미지시료에서의 분석물의 양은 빈 시료와 목적하는 분석물의 알려진 양을 포함하는 시료를 측정함으로써 추론할 수 있다.
다른 측면에 의하면, 본 발명은 하기의 각 단계를 포함하는 "샌드위치(sandwich)" 또는 "두 영역(two-site)" 면역분석법을 실행하는 방법을 제공한다:
(a) 목적하는 분석물을 함유하는 것으로 여겨지는 시료를, 목적하는 분석물을 특이적으로 인식하여 목적하는 분석물과 첫 번째 수용체의 복합체를 형성하며, 하나는 충분히 높은 음성 정전하와 함께 평면 분자구조의 일측에 위치한 두 개의 작은 가용성 축 리간드에 결합한 발광성이며 대체로 평편한 분자구조를 가지는 형광체 부분을 지닌 형광탐침으로 표지된 첫 번째 분석물과 접촉시키는 단계;
(b) 전기 복합체를, 목적하는 분석물이나 첫 번째 수용체를 특이적으로 인식할 수 있는 두 번째 수용체에 접촉시켜, 두 번째 수용체가 고체 운반체에 결합하여 첫 번째 표지된 수용체, 목적하는 분석물 및 고체 운반체에 결합한 두 번째 수용체의 복합체를 형성하는 단계; 및,
(c) 고체 운반체와 연관된 첫 번째 수용체의 양이나, 또는 미반응의 표지된 첫 번째 수용체의 양을 측정하는 단계.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 분석법은 미지 시료에서 측정한 표지된 첫 번째 수용체의 양을, 목적하는 분석물이 없는 대조군 시료에서 측정한 첫 번째 수용체의 양 또는 양이 알려진 목적하는 분석물을 포함하는 시료에서 측정한 표지된 첫 번째 수용체의 양을 연관시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상호간 방해없이 독립적인 분석물에 의해 인식할 수 있는 두 가지 다른 수용체에 대한 목적하는 분석물의 측정에 유용한 샌드위치-형태 형광 면역분석법(sandwich-type fluorescent immunoassay method)을 제공한다. 각각의 수용체는 다른 염료로 표지하는데, 예를 들면, 하나의 수용체는 각각 680nm와 690nm의 최대 흡광 및 방출 파장을 지닌 첫 번째 염료로 표지하고, 다른 수용체는 각각 695nm와 705nm의 최대 흡광 및 방출 파장을 지닌 두 번째 염료로 표지한다. 분석물의 탐지(detection)와 정량(quantification)은 안정(steady) 상태나 전이(transient) 상태에서 측정할 수 있다. 어떠한 경우든 주어진 예에서 여기는 680nm이고, 탐지는 705nm에서 행하여진다. 이러한 분석법은 에너지 전달에 기초한 것이고, 그 분석이 균일하다는 장점이 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 마커와 탐침은 균질한 혼합물과, 스펙트럼의 근적외선 영역에서 전이상태, 편광 형광수단에 의해 모니터링하는 측정법에서 가장 편리하게 이용할 수 있다. 이러한 조합은 다수로 용이하게 실행할 수 있고 수치로 나타내는 측정결과를 제공하도록 용이하게 자동화될 수 있는 매우 신속한 절차를 가능하게 한다. 이러한 분석법은 근적외선 파장(낮은 우연적 형광, low adventitious fluorescence) 및 전이상(transient state) 기술(레일리 산란(Rayleigh scattering) 및 라만(Raman scattering) 산란을 방지한다)에 의해 제공되는 낮은 배경방해(background interference) 때문에 정밀함과 정확성을 제고되는 고유한 특징을 지니고 있다.
본 발명은 혈청, 혈장, 전혈, 소변 및 온전한(intact) 세포를 포함하는 생물학적 유체에 대일측역분석법을 제공하는데, 후자는 예를 들어 형광 현미경측정법에 대해서 현탁액 형태 또는 고체 표면에 위치시킨다. 일반적으로, 전혈에 대한 측정의 경우, 스테로일-리소레시틴, 팔미토일-리소레시틴 또는 미리스토일 리소레시틴 등 용해제(lysing agent)에 의한 분석 이전에 적혈구를 용해시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 의하면, 목적하는 분석물은 약물이거나 또는 약물의 대사물이다. 약물은 스테로이드, 호르몬, 항생제, 면역 억제제, 항 천식제, 항 종양제, 항부정맥약(antiarrhythimic), 항경련제, 관절염치료제, 항우울제, 또는 심장 배당체일 수 있다. 이러한 약물들의 실예는 디곡신(digoxin), 디지톡신(digitoxin), 테오필린(theophylline), 페노바비탈(phenobarbital), 티록신(thyroxine), N-아세틸프로카인아미드(N-acetylprocainamide), 프리미돈(primidone), 아미카신(amikacin), 젠타마이신(gentamycin), 네틸미신(netilmicin), 토브라마이신(tobramycin), 카바마제핀(carbamazepine), 에토숙시미드(ethosuximide), 밸프로인산(valproic acid), 디소피라미드(disopyramide), 리도카인(lidocaine), 프로카인아미드(procainamide), 퀴니딘(quinidine), 메토트렉세이트(methotrexate), 아미트리프틸린(amitriptyline), 몰트리프틸린(mortriptyline), 이미프라민(imipramine), 데시프라민(desipramine), 반코마이신(vancomycin), 사이클로스포린(cyclosporine)을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 목적하는 분석물은 펩타이드이거나 그의 단편이다. 이러한 펩타이드는 예를 들어 황체형성 호르몬, 여포자극 호르몬, 사람의 만성 성선자극호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 엔지오텐신 I, 엔지오텐신 II, 프로락틴, 인슐린, 암배항원 등의 종양 마커 또는 풍진 바이러스 등의 바이러스를 포함한다. 본 발명은 약 10-5M에서 약 10-13M의 농도, 특히 10-9M에서 10-12M인 농도범위의 목적하는 분석물을 측정하는 방법을 제공한다. 이러한 측정은 시료 또는 수용체 제제(receptor preparation)에서의 형광의 양 및 형광방출강도에 대하여 모두 매우 민감하다. 일반적으로, 파장을 근적외선으로 이동시키고 전이상태 탐지를 이용하는 것이 유익하지만, 분석법을 개발하는 동안 각 시료내에 존재하는 불순물에 차이가 있으므로 최적화되어야 한다.
본 발명의 주된 목적은 크게 증대된 신뢰도와 편이성을 가지는 향상된 형광에 기초한 분석법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 수 분 이내에 빠르고 정확히 측정하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 하나의 목적은 극도로 낮은 형광표지 또는 마커의 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 전혈(whole blood)과 같은 변형되지 않은 생물학적 시료를 이용할 수 있고, 상대적으로 저비용의 빠르고 정확한 임상 설계에 유용한 방법을 제공하는 것이다. 이러한 본 발명의 목적들은 1) 형광마커의 광학특성의 최적화, 2) 탐지방식의 높은 민감도와 안정성, 3) 레일리 분산 및 라만 분산을 제거하는 전이상태 탐지의 이용, 4) 분리하는 단계를 제거하고 단순한 혼합물을 측정하는 균일한 분석법을 만드는 것, 5) 기구와 시료의 크기를 소형화하는 것에 의해 가장 바람직하게 실현될 수 있다.
본 발명은 또한 가용성 축 리간드의 반응형(reactive form)을 형광체 부분(fluorophore moiety)과 반응시킴으로써 마커 성분을 합성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 특이 결합쌍 또는 유사체의 목적하는 분석물에 연결된 본 발명의 마커 성분을 지니는 형광탐침을 제공한다. "특이 결합쌍(specific binding pair)"이란 용어는 분자들 중 하나는 다른 분자(또는 다른 분자를 포함하는 분자 복합체)의 특정 공간 및 극성 구성을 특이적으로 인식하고 결합하는 표면(surface) 또는 빈 공간(cavity)을 지니는 두 가지 다른 분자(또는 조성물)을 의미한다.
본 발명의 형광염료는 DNA 기술과 연구의 여러 영역에 대한 응용이 가능하다. 일반적 방법에서, 이러한 응용은 단일가닥 DNA 서열이 과정 또는 시험에서 자체의 활성을 추적 및 시각화될 수 있도록 표지되어야 한다. 예를 들어, DNA 서열분석을 위한 생거(Sanger)의 방법에서, 프라이머 분자(주형의 3‘ 말단의 짧은 부분에 대하여 상보적인 짧은 DNA 서열)은 말단을 표지한다(상기 프라이머의 5’ 말단). 4 가지 뉴클레오티드 삼인산염과 DNA 중합효소는 주형의 5‘ 말단 방향으로 프라이머 서열의 3’ 말단을 확장시켜서 주형에 상보적인 새로운 사슬을 만들어 낸다. 반응이 오래 진행되기 전에, 반응 혼합물은 네 가지 동일한 부분으로 나누어서, 무작위로 사슬확장을 정지시키기 위해 각 부분을 개별적으로 네 가지(A,T,G,C) 디디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 처리하고 사용된 디디옥시뉴클레오티드트리포스페이트에 포함되어 있는 같은 염기(A,T,G,C)에서 종료하는 다양한 길이의 새로운 서열의 혼합물을 만들어 낸다. 다양한 길이의 새로운 사슬을 지닌 이러한 혼합물을 사슬 길이에 따라 분리하는 PAGE 전기영동에 의해 분리하고, "블롯팅(blotting)"에 의해 니트로셀룰로오스 막에 옮겨진 서던 블롯(Southern blot)에 의해 띠 모양이 영상화되었다.
서던블롯을 이용하는 다른 예에서, DNA는 일반적으로 높은 pH에 의해 변성하여 단일-가닥이 된다. 이러한 상태에서, 본 발명의 형광표지를 수반하는 상보적 탐침을 이용한 혼성화는 서던 블롯으로부터 영상화하기 위한 높은 민감도와 특이성을 부여하기 위한 수단들을 제공한다.
DNA 지문채취법(DNA fingerprinting)은 점차 중요성이 증가할 것으로 예상하는 또 다른 분야이다. 지문채취법에 따르면, 시험 탐침(test probe, 표지된 단일가닥 서열)은 확인하기 위해 시료로부터 제한효소로 절단한 서던 블롯에서의 단일가닥 물질을 이용하여 혼성화한다. 이러한 방법을 응용하면. 형광표지는 시각적 감지와 조합된 높은 민감도를 제공한다.
본 발명의 형광염료의 특성은 DNA의 미세한 양에 대하여 완전히 새로운 형태의 분석법을 제공한다. 이러한 분석법은 수치적 측정결과를 나타내는 전이상태 형광편광(TSFP, transient state fluorescence polarization)을 이용한다. 이러한 분석법의 두드러진 장점은 분리가 필요없는 혼합물에서 간단히 마이크로리터 수준에서의 측정이 가능하다는 것이다. DNA를 탐지하여 확인하는 통상적인 분석은 다음과 같이 진행한다:
1. 탐지하려는 DNA를 포함하는 시료를 수집한다.
2. PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 시료를 증폭시킨다.
3. 본 발명의 형광염료로 표지된 단일가닥의 DNA를 증폭 혼합물에 가하여 시간에 따라(아마도 수분) TSPF를 수행한다. 표지된 DNA 탐침에 상보적인 DNA가 시험 시료에 존재한다면, 혼성화가 일어나서 시간이 지남에 따라 편광이 증가할 것이다.
본 발명은 또한 신규한 염료-올리고뉴클레오티드 접합체 및 염료-올리고뉴클레오티드를 합성하고 이용하는 방법을 제공한다. 이러한 접합체 또는 탐침을 이용하는 방법들은 핵산 혼성화, 핵산증폭 및 핵산서열 분석방법을 포함한다. 염료-올리고뉴클레오티드 접합체의 염료 부분은 본 발명의 형광마커이다. 이러한 마커는 DNA 또는 RNA에 대한 결합에 대하여 다양한 기능성 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 기능적 잔기는 카르복실, 아미노 및 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS 에스테르)를 포함한다.
"올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"라는 용어는 뉴클레오티드 잔기의 상대적으로 짧은 사슬을 의미한다. 통상적으로, 본 발명에 이용한 올리고뉴클레오티드는 5 내지 50개 뉴클레오티드 길이를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용한 올리고뉴클레오티드 탐침은 핵산서열에 대해 혼성화하는 DNA, RNA, 다른 종류의 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 핵산서열은 자연 발생적인 염기인 사이토신, 아데닌, 구아닌, 티민 및 우라실 뿐만 아니라, 염기 유사체를 포함한다. 염기 유사체는 하이포크산틴, 2,6-디아미노퓨린 및 8-아즈구아닌을 포함한다. 탐침은 이중가닥이거나 단일가닥 형태일 수 있지만, 바람직하게는 단일가닥 형태이다. 탐침은 직접 합성, 중합효소에 의해 매개되는 확장반응 또는 클로닝 또는 다른 유용한 방법을 통해 제조한다. "연결된(linked)"의 의미는 두 가지 일부분에 연결된 중간체 분자에 의해 화합적으로 결합된 것을 의미한다.
마커에 대한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 연결은 예를 들어 아마이드(amide), 에스테르(ester), 하이드라존(hydrazone, 세미카바존(semicarbazone), 티오세미카바존(thiosemicarbazone), 유레아(urea), 티오유레아(thiourea) 결합을 형성하는 축합반응을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 링커의 말단은 아미노 그룹(바람직하게는, 1차)이다. 다른 링커들의 말단은 카르복실 그룹이다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 특정한 염료에 연결시킨 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법이 제공된다. 본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 방법은 평면분자구조의 어느 한쪽에 위치하고 두 가지 응집 및 비특이적 결합을 억제하는 충분히 부가적인 음성 전하를 포함하여 접합체를 형성하고 반응하지 않은 염료 또는 반응하지 않은 올리고뉴클레오티드나 폴리뉴크레오티드로부터 단계 (a)에서 형성한 접합체를 분리하는 하나의 리간드, 두 가지 작은 가용성 축 리간드에 연결시킨 형광이 충분한 평면 분자구조를 포함하는 형광 일부분을 구성하는 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르 또는 탐지가능한 표지된 마커 조성을 포함하는 아미노 그룹에서 종료하는 부착된 링커를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 반응하는 (a)단계를 포함한다. 올리고뉴클레오티드에 링커를 부착하는 것은 디아민 또는 아미노 알콜을 이용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 탐지가능한 표지된 마커 성분들은 격자형(caged) 디카르복시 실리콘 프탈로시아닌 염료를 포함한다.
선택적으로, 다음의 각 단계를 포함하는 방법에 의해 염료-접합한 올리고뉴클레오티드(dye-conjugated oligonucleotide)를 제조할 수 있다: 마커 성분들을 하이드록시벤토트리아졸과 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재하에 카보디이미드와 반응시켜 접합체를 형성하는 단계; 및, 반응 혼합물의 다른 성분들로부터 접합체 산물을 분리하는 단계.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 균질 용액에서 상술한 목적하는 핵산서열을 혼성화시킬 수 있는 본 발명의 상술한 올리고뉴클레오티드의 형광마커로 표지한 올리고뉴클레오티드와 시료 핵산을 접촉시키고, 전이상태(또는 안정상태)의 편광화된 형광에 의해 이러한 혼성화의 존재 및 양을 탐지하는 단계를 포함하는, 시료에서의 목적하는 핵산서열을 탐지하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 목적하는 핵산이 핵산 증폭의 산물인 목적하는 핵산의 탐지 또는 정량방법을 제공한다. 핵산 증폭방법은 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), 3SR(self-sustained sequence replication) 및 주형에 기초하는 증폭시스템(template-based amplification system, TAS)을 포함한다.
본 발명의 방법들은 일반론이 언급되는 스터드홀름(Studholme) 등의 미합중국 특허 제 5,323,008호 "형광계 탐지시스템(Fluorometer Detection System)"에 기술된 바와 같이, 시간과 연관된 전이상 탐지시스템을 이용하였을 때 특별히 유용하다. 이러한 방식은 시료의 시간-의존성 편광의 직접적인 측정을 허용하는 전이상 탐지(transient state detection)로서 특징지워 진다. 이 방식은 매우 높은 주파수(예를 들어, MHz 속도)에서 변조할 수 있는 레이저 다이오드를 이용하고 높은 출력을 나타낸다. 통상적으로 레이저 "온(on)" 시간은 대략 2-3 ×10-9초이다. 용액내의 광자는 단일 광자 집계(single photon counting mode)에서 작동하는 광증폭기 튜브(photomultiplier tube)를 이용하여 탐지한다. 레이저 파동시간(laser pulse time)과 비교했을 때 광자현상(photon event)의 상대적 시간과 함께 광자현상을 결정하였다. 개개의 광자현상 시간을 저장함으로써 시간의 함수로써 광자 빈도(frequency of photon)의 막대그래프가 만들어졌다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 핵산 증폭 과정의 동역학을 감지하고, 목적 시료에서의 핵산을 정량하는 방법을 제공한다. 예를 들어, PCR증폭을 하는 동안, 캡핑되고(capped) 본 발명의 형광염료로 표지된 올리고뉴클레오드로 구성된 탐침은 PCR 반응에 직접적으로 가해질 수 있다. "캡핑된(Capped)"이라는 용어는 3‘말단이 디디옥시뉴클레오티드트리포스테이드와 반응했다는 것을 의미한다. 형광의 시간 의존성에 대한 전이상태의 탐지는 형광이 진행됨에 따라 반응을 추적하는데 이용할 수 있다.
각 냉각상(cooling phase)에서, 혼성화는 증폭된 산물에 동력학적으로 진행될 수 있다. 증폭된 산물의 농도가 증가함에 따라, 증폭된 산물과 탐침의 조합속도(rate of combination)가 증가하고, 증폭된 산물의 농도를 정량하였다. 이러한 정보는 주기수(number of cycle)와 함께, 증폭 이전에 시료 내에 본래 존재하는 DNA의 양을 정량하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 하나의 형광계(fluorometer)의 디자인, 변형 또는 개변에 폭넓게 응용되는 것이다. 이러한 응용성의 범주는 특별한 형태의 장비의 아래 예에 잘 설명하였다. 비-흡광형 매질(non-absorbing media)에서, 입사각이 임계각보다 크다면 낮은 굴절률의 두 번째 매질 B에 의해 둘러싸인 광 파동(light wave) 투과 매질 A는 매질 A의 경계에서 전체적인 내부 반사(internal reflection)를 일으킨다. 그러나, 전체적으로 반사된 광의 전자기장(electromagnetic field)은 단거리 경계를 관통하고, A와 B 사이의 경계면 근처에 위치하는 형광분자의 여기 등 물리적 효과를 나타낼 수 있다.
이러한 효과는 특이반응이 매질 A의 표면에 고정된 분자와 함께, 상기 분자에 형광의 여기가 일어날 수 있는 유일한 위치인 경계면에서 일어나는 균질적이고 형광에 기초한 분석(fluorescence-based assay)을 가능하게 한다. 단순한 유리 또는 플라스틱 판은 입사광(incident light)에 대한 광학적 도파관(optical waveguide)으로서 및 표면의 알려진 위치에 미리 증착된 특이적 수용체를 위한 운반체(carrier)로서의 역할을 수행한다. 이러한 방법론은 "섬광 형광면역분석법(evanescent light fluoroimmunoassay)"이라 명명되었다(참조: Herron et al., 미합중국 특허 제 5,512,492호).
유익하게도, 본 발명은 통상적으로 스펙트럼의 근적외선 영역에서의 방출을 지닌 근자외선 여기영역(near UV excitation region)을 가지는 N-함유 거대고리(N-containing macrocycle, 아래 열거한 부류들)에 기초한 형광염료를 이용하는 매우 큰 스트로크의 이동(Strokes' shift)의 특징을 포함한다. 이러한 염료는 안정상태(steady state) 또는 전이상태(transient state)에서의 면역/수용체 분석에 응용할 수 있다. 여기원(excitation source)은 수은 아크, 질소 레이저 및 질소 레이저 펌프 염료 레이저를 포함한다. 선택적으로, 이러한 같은 염료는 다이오드와 적외선이 같이 있을 때 여기될 수 있는데, 파동성 여기(pulased excitation)와 전이상태의 탐지를 포함하는 좋은 결과를 나타낸다. 여기원의 선택은 문제의 염료에 대한 흡광대의 위치, 바람직한 형태의 여기 및 탐지, 안정상태 또는 전이상태와 공간 요건에 의존한다.
"섬광 형광면역분석법(evanescent light fluoroimmunoassay)"에 대한 화학과 기구 설계에서의 이러한 특징은 높은 신호수준(signal level)과 함께 매우 낮은 배경(background)을 이끌어 내고, 따라서 높은 시험 민감도(assay sensitivity)를 부여하게 된다.
상술한 발명의 요약은 제한되지 않고, 본 발명의 다른 특징과 장점들은 바람직한 실시예에 대한 아래의 설명과 청구범위로부터 명백해질 것이다.
바람직한 마커 성분들의 흡광 및 편광 양상
두 가지 작은 가용성 축 리간드에 연결된 중심원자(예를 들어, 실리콘)를 포함하는 마커 성분들은 전이상태 형광(transient state fluorescence)의 측정에 의해 특성화될 수 있다. 이러한 측정에서 여기 파동(exciting pulse)의 편광 방향에 대하여 각각 평행 또는 수직인 두 성분들의 강도는 마커 성분의 붕괴시간(decay time)의 3배에 걸친 시간동안 모니터링할 수 있다. 이러한 커브는 소멸계수(extinction coefficient), 양자수율(quantum yield), 붕괴시간(decay time) 및 편광상태(state of polarization)를 반영하고, 마커 성분의 화학적 및 물리적 조건에 대한 민감도를 제공한다. 예를 들어, 여기 상태가 불활화되거나 삼중 상태(triplet state)로 전환되면, 전체적 강도는 낮아지고 붕괴시간은 짧아진다. 분자의 회전성 브라운 운동(rotary brownian motion)이 점도의 증가 또는 큰 분자에의 결합에 의해 바뀐다면, 수직성분에 대해 평행한 강도의 비율이 증가한다.
본 발명에 따르는 일부 마커 성분들은 실험적 오차 5% 내에서 같은 강도, 붕괴시간 및 SAP(살린 아자이드 인산염(saline azide phosphate), 수용성 중성 완충용액)에서와 같이 DMF(유기용매)에서의 편광을 나타낸다. 이러한 특성은 어느 정도까지 다른 마커 성분제제(marker component preparation)에 의해 공유된다. 본 발명의 특유하고 중요한 특성은 형광의 편광성분의 강도, 붕괴시간 또는 상대적인 크기에 대한 혈청의 의미있는 측정효과의 결여에 의해 입증되는 혈청성분에 대한 민감도(결합의 결여)이다. 이러한 특성은 생물학적 물질을 이용한 분석 등에 이용되는 마커 성분들에 대하여 중요하다.
바람직한 마커 성분들의 제조
본 발명의 바람직한 마커 성분들을 제조하는 한가지 방법에 따라, 축 리간드로서 하이드록시 또는 할라이드 그룹을 포함하는 적당한 형광체 부분을 일반적인 반응식에 의해 리간드 교환반응에서 가용성 부위의 활성형과 반응시켰다.
Mcl -- CA --(X)2 + 2(SM) Mcl - CA - (SM)2 + 2X
상기 식에서,
Mcl은 거대고리 리간드를, CA는 중심 원자를, X는 치환한 리간드를, SM은 가용성 부위를 각각 나타낸다. 이러한 반응은 간단히, 바람직하게는 용매 내에서 수행할 수 있다. 적절한 용매로는 퀴놀린, THF, DMF, 이미다졸(열거한 용매 중의 하나에 용해시켰을 경우) 등을 포함한다. 적절한 반응온도는 거대고리 출발물질과 가용성 그룹의 성질에 따라 다를 수 있다. 반응은 일반적으로 2분에서 24시간 내에 완결된다. 반응 혼합물은 통상적으로 환류액 또는 모래욕(sand bath) 등의 수단에 의해 가열될 수 있다. 편리하게는, 반응은 주위의 압력상태에서 실행할 수도 있다. 이러한 반응은 동시에 축 리간드로서 연결된 하나의 폴리옥시하이드로카르빌 그룹을 포함한 2 단계로 일어난다고 믿고 있다.
형광 면역분석법에서 형광표지로서 이용할 경우, 이러한 마커 성분들은 특이결합쌍("표지된 결합상대(labeled binding partner)")의 하나 또는 이러한 멤버의 유사체에 연결될 수 있다. "결합상대(binding partner)"라는 용어는 특이적으로 인식하거나 특별한 분자 또는 분자 복합체에 의해 인식되는 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 마커 성분들은 직접적으로 부착(attach)되거나 거기에 접합(conjugate)되거나 링커의 팔을 통해 부착 또는 접합될 수 있다.
유용성
본 발명의 마커 성분들은 형광탐침에 대한 형광표지로서, 형광 결합시험, 생체적 조건의 영상화 및 생체적 조건의 종양치료에 유용하다.
이러한 마커 성분들은 형광 편광 면역분석법을 포함하는 통상적인 형광 결합시험에서 형광표지로서 유익하게 이용된다. 그렇게 이용되었을 때, 이러한 마커 성분들은 특이 결합쌍의 한 멤버("표지된 결합상대(labeled binding partner)") 또는 이러한 멤버의 유사체에 연결될 수 있다. 마커 성분들은 직접적으로 부착 또는 거기에서 접합하고, 링커의 팔(linker arm)을 통해 부착 또는 접합된다.
이러한 표지된 결합상대는 다양한 구성을 포함하는 분석물 또는 분석물 결합상대에 대한 경쟁을 포함하는 분석(표지된 분석물 또는 분석물-유사체가 이용되는 경우)에 유용하며, 동질적 또는 이질적 분석법에 유용하다.
혈청 성분들 및 다른 생물학적 거대분자에 대하여 비특이적으로 결합되지 않으면서, 수용액에서의 집적으로부터 자유롭고 용매 민감성(감지할 수 있는 집적이 없다고 알려주는)이 없다는 관점에서, 이러한 마커는 혈청 등의 생물학적 유체를 포함하는 시료에서 분석물을 탐지하는 분석법에 특히 적합하다. 따라서, 이러한 마커 성분들은 혈청 성분에 의한 비특이적 결합이 심각하게 분석의 민감도를 훼손하여 정확성과 정밀성에 영향을 주는 용액에서의 분석물을 탐지하기 위한 형광탐침의 표지로서 이용할 수 있다.
선택적으로, 이러한 마커 성분들은 생체조건에서의 영상화(imaging)에 대한 작용제로서 이용될 수 있다. 영상화제(imaging agent)로서 이용되는 경우, 이러한 마커 성분들은 특이 결합쌍의 한 가지에 접합되어 표지된 결합상대가 된다. 표지된 결합상대는 동물에 도입된다. 특이 결합상태의 다른 멤버가 존재한다면, 표지된 결합상대가 거기에 결합할 것이고 마커 성분들에 의해 만들어진 신호는 측정할 수 있으며 그 위치도 확인할 수 있다.
이러한 마커 성분들은 생체조건에서의 종양치료에 이용할 수도 있다. 예를 들어, 광역학 치료(photodynamic therapy)는 감광제(photosensitizing agent)로서 마커 성분들을 이용한다. 마커 성분들(형광표지)은 종양세포의 성분을 특이적으로 인식하여 결합하는 결합상대에 접합된다.
본 발명은 핵산 탐침 및 탐침을 제조하고 이용하는 방법을 제공한다. 신규한 핵산 탐침을 이용하는 방법은 현재까지 알려지거나 추후에 개발될 다양한 핵산 혼성화 서열분석(nucleic acid hybridization sequencing) 기술과 현재까지 알려지거나 추후에 개발될 다양한 핵산증폭(nucleic acid amplification) 기술을 포함한다. 본 발명의 탐침(본 명세서에서는 또한 ‘공액체’라고도 함)과 방법은 균질한 혼성화 분석법에서 1 펨토(10-15)의 민감도를 달성할 수 있다; 이러한 민감도는 현재의 이질적 혼성화 측정(heterogeneous hybridization measurement) 기술에 의한 민감도와 동등한 수준이다. 그러나, 상술한 바와 같이 현재의 이질적 분석법은 분석에 많은 단계를 필요로 하고, 오염증대의 위험과 분석을 수행하는데 요구되는 시간이 증가하는 단점이 있다. 따라서, 본 발명의 조성물과 방법들의 다른 장점들은 본 명세서에 제공되는 실시예를 검토하면, 당업자들은 명백히 알 수 있을 것이다.
본 발명을 이해하는데 도움을 주고자, 이하의 실시예들은 일련의 실험에 대한 결과를 기술하였다. 본 발명에 관련된 이하의 실시예들은, 물론 본 명세서에 기술하고 청구한 후에 본 명세서에서의 발명의 범주 내에 속할 것으로 여겨지고 당업계의 숙련된 자의 예측하에 현재 알고 있고 추후에 개발될, 본 발명과 본 발명의 변형들을 제한하는 것으로 추론해서는 안된다.
실시예 1: 1,2,4,5-테트라시아노벤젠으로부터 테트라디이미노파이로멜리산의
합성
TCNB 20.0g(0.112몰)을 3목 1L플라스크에 넣고, 진공상태에서 1시간 정도 건조시켰다. 플라스크에 저속의 높은 토크 값을 갖는 테플론 날개 젓개, 암모니아 에서 거품이 일거나 액체를 가할 경우를 위한 인입구, 및 수냉각기(water cooled condenser)를 장착하였다. 상기 장치 전체에 질소를 통과시켜준 다음, 메탄올 400ml를 가하고 상온에서 젓개를 작동시키면 천천히 암모니아 거품이 생기기 시작하였다.
암모니아는 매우 효율적으로 흡광되었으며, 몇 분후에 현탁액은 투명하고 엷은 연두색 용액이 되었다. 지속적으로 암모니아를 넣어주면서 몇 분이 경과한 후에 용액은 혼탁해지고 온도가 조금 상승하였다. 암모니아를 넣기 시작한지 40분이 지나면, 반응 혼합물은 젓기가 어려워졌고, 계속 젓개를 돌려주고 암모니아를 넣어주면서 200ml의 메탄올을 추가로 가하였다. 이 시점에서도 암모니아는 역시 매우 효율적으로 흡광되었으며, 이는 현탁액의 표면에서 공기방울이 보이지 않는 것으로 증명되었다. 100분 후에 젓개가 잘 돌아가게 하기 위해 175ml의 메탄올을 추가로 가하는 것이 필요하였다. 125분 후에는 냉각기 출구에서 많은 양의 암모니아가 발생하기 시작하였으며, 그후에도 240분간 반응 혼합물을 계속 젓개를 돌려주고 가열 및 암모니아를 넣어주면서 45℃ 중탕에 넣어 두었다. 이를 냉각시킨 다음, 반응 혼합물을 4℃에 24시간 방치하였다. 그런 다음, 고체를 Whatman 42번 여과지를 깐 감압장치로 걸러내어 진공에서 건조시켰다. 수득량은 23.2g(0.109몰)이다.
실시예 2: 비스염화(2,3 디프탈시아노, 2,3 디카르복시프탈로시아니노실리콘
(IV)의 합성
30.0g(0.207몰)의 디이미노이소인돌린과 10.5g(0.050몰)의 테트라디이미노파이로멜리산디이미드를 함께 분쇄하여, 1L 3목 플라스크에 넣어 진공상태에서 하룻밤 동안 건조시켰다. 이 플라스크에 테플론 날개달린 혼합기, 격막, 온도계, 실리카겔 건조관이 달린 환류냉각기를 장착시켰다. 교반된 반응물이 들어 있는 장치에 젓개를 돌리면서 건조 질소를 통과시켜 주고, 질소가 흐르는 상태에서 600ml의 퀴놀린을 가하여 30분간 혼합하였다. 그 결과, 균질한 유액상태의 현탁액이 생성되었다. 이어, 5분 동안 60ml의 테트라클로라이드실리콘(silicon tetrachloride)을 격막을 통해서 천천히 가해주었다. 색상이 어두워진 용액을 15분간 가열교반하지 않고 방치하였다.
그런 다음, 계속 교반하면서 195℃로 예열한 기름중탕내에 플라스크를 플라스크내의 내용물이 잠길 수 있을 정도의 깊이로 담궈 주었다. 5분이 경과하면, 중탕의 온도가 175℃로 떨어지고, 그 후 15분간 185-190℃로 온도를 복귀시키고, 이 온도를 그 후에도 60분간 유지하였다. 반응 혼합물을 중탕에서 꺼내어 15분간 냉각되도록 방치하여 두었다. 반응하지 않고 남은 테트라클로라이드실리콘을 젖은 pH 시험지로 냉각기 출구에서 검출하고, 이를 제거하기 위해 질소를 통과시키기 시작하였다. 약 45분간 통과시킨 다음, 중탕은 100℃가 되며 온도를 천천히 올려 130℃가 되게 해주어 테트라클로라이드실리콘의 제거가 원활하도록 해주었으며, 70분이 경과하여 오직 퀴놀린 증기만 나게 되면 상기 테스트로 제거가 끝났는지의 여부를 확인하였다.
이어, 중탕을 치우고 반응혼합물이 80℃로 냉각되면, 424ml의 물과 424ml의 진한 염산의 혼합물을 가해주었다. 열이 발생하였고, 최종 생성 혼합물은 산성이 되었다. 반응 생성물을 상온에서 하룻밤 방치하여 두었다. 다음날 424ml의 물과 424ml의 진한 염산을 교반하면서 추가로 가해주고 상온에서 하룻밤 방치하였다.
반응혼합물을 흡인여과기(Buchner funnel, 24cm여과지)로 걸러내고, 물로 세척하여 후드에서 건조시켰다. 젖어 있는 필터 케이크를 1L 아세톤에 넣어 교반하고 여과하였다. 세척된 물질을 후드에서 2일 동안 건조시켰다. 건조된 물질(50g)을 아세톤에서 모르타르와 함께 분쇄하고, 이 혼합물을 교반하고 여과하여 진공 건조시키면, 47.9g의 미세하게 분화된 고체가 생성되었다.
실시예 3: 비스-클로로(2,3-디카르복시프탈로시아니노)실리콘(IV),
(디카르복시디클로로 염료)의 가수분해
진한 황산 98ml을 플라스크 목의 젖음을 방지하기 위해, 긴 자루 깔때기(long stem funnel)를 이용하여 250ml의 둥근 바닥 플라스크에 가하였다. 자석교반을 하면서, 16.3g의 디카르복시디클로로 염료를 더 짧은 자루를 지닌 깔때기를 통해 적은 량씩 가하였다. 더 많은 고체 덩어리를 가하기 전에 염료가 확산되도록 대략 1시간이 넘는 시간에 걸쳐 가하였다. 건조 튜브를 플라스크에 부착시키고, 혼합물을 유탕(oil bath)에서 가열시켜서 50℃에서 24시간 동안 유지하였다.
반응 플라스크를 유탕으로부터 제거하고 얼음에서 냉각시켰다. 물 75ml을 적은 량씩 주의하면서 냉각하지 않은 상태로 가하고, 혼합물을 유탕에서 80℃로 20 시간 동안 교반하면서 가열시켰다. 냉각시킨 다음, 혼합물을 1 리터의 비이커내 얼음 속에 붓고 교반시켰다.
혼합물을 상온, 2000 x g에서 30분간 원심분리하였다. 침전물을 물250ml에 현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 이러한 세척을 한번 더 반복하고, 침전물을 모아서 300ml의 1M K2CO3에서 현탁시켰다. 혼합물을 시계접시(watch glass)로 덮은 비이커에서 교반시키면서 가열하였다. 10분이 지나서 온도가 90℃가 되면, 추가적으로 50분간 가열하여 93℃로 유지시켰다. 아직까지 뜨거운 동안, 혼합물을 진한 염산으로 산화시켜 상온에서 2일간 냉각시키고 방치하였다.
그런 다음, 고체를 Whatman #42 여과지를 장착한 11cm짜리 뷰흐너(Buncher) 깔때기를 이용하여 1시간동안 여과하여 모았다. 고체를 3×100ml의 물로 깔때기에서 세척하고, 후드내에서 공기건조시켰다. 이후에, 고체를 15회 분쇄하여, P2O5와 KOH에서 진공건조시켰다. 수득량은 13.3g(87%)였다.
실시예 4: 실리카 흡착 크로마토그래피에 의한 비스-하이드록시(2,3-디카복
시프탈로시아니노)실리콘 IV(디카르복시 염료)의 정제
실시예 3에서 제조한 천연의 디카르복시 염료 3.0g을 2%(v/v) 에틸디이소프로필 아민(DIEA)을 포함하는 100ml 메탄올을 가한 250ml의 유리병에 넣고 혼합물을 30분간 교반하였다. 그런 다음, 43g 실리카(EM Science)를 가하여 혼합물을 직접 혼합하여, 어두운 색의 반죽 형태를 만들었다. 20분 간 2% DIEA를 포함한 100ml 메탄올을 추가로 가한 다음, 유리병을 수 분간 뒤집어서 내용물을 20분간 교반하였다. 메탄올과 DIEA에 에탄올을 가하는 용매 특성의 조정은 추출한 염료의 조성물을 바꾸어서 단일 성분의 추출을 가능하게 하였다. 그런 다음, 고체를 감압조건하에서 소결한 유리 깔때기(미세 다공성, 6.5cm 직경)에서 여과하였다. 과량의 메탄올 손실을 막기 위해서, 부분적으로 비운 탱크에 연결시킴으로서 감압을 유지하였다. 하룻밤 동안 여과한 후, 잔류물을 약 30시간이 소요되는 2×50ml의 메탄올+DIEA로 세척하였다. 여과물(230ml)을 회전 증발기에서 거의 건조되도록 농축시켰다. 잔류물을 14ml의 메탄올+DIEA에서 용해시키고, 용액을 동등하게 나누어서 두 개의 40ml 원뿔형 원심분리 튜브에 넣었다.
각각 튜브의 내용물을 200 ul의 진한 염산으로 산화시키고, 물을 튜브를 거의 채울 정도로 가하였다. 내용물을 뒤집어서 혼합하고 수 분간 교반한 다음, 650×g에서 30분간 원심분리하였다. 갈색의 상층 액체는 버리고 침전물을 0.01M KCl로 세 번 세척하였다. 침전물을 100ml 둥근 바닥 플라스크로 옮겨 혼합물을 회전증발에 의해 건조시키고, H2SO4와 KOH에서 진공상태를 유지하였다. 건조물의 무게는 304mg이었다(정제한 디카르복시 염료).
실시예 5: 클로로술폰산에 의한 정제 디카르복시 염료의 술폰화
정제 디카르복시 염료(실시예 4) 161mg을 무게를 재서 자성 교반기가 장착된 50ml 긴 목, 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 상온에서 3.4ml의 ClSO3H을 질소조건하에서 가하였다. 질소 풍선을 갖춘 작은 공기 농축기를 부착하여 플라스크와 내용물을 유탕 내에서 110℃로, 3.7시간 동안 가열하고, 마이크로리터의 시료를 시험을 위해 회수하였다. 이후에 가열은 110℃에서 3.3 시간동안 지속하고, 그 시점에 가열을 중단하여 2차 시료를 수득하였다. 두 시료에 얼음을 가하고 각각을 물로 희석하여 390mg로 만들었다. 2 ml의 1M NaHCO3를 각 시료에 가하고, 2ml의 중성 완충액으로 10ul의 시료를 희석하여 각각의 흡광도를 측정하였다. 두 시료에 대하여 최대 흡광도(Amax)는 690nm에서 나타났고, 3.7시간, 시료해석 0.650과 7시간, 시료해석0.490이었는데, 이는 지난 3.3시간 가열하는 동안 염료의 약 25% 파괴를 의미한다. 선택적으로, ClSO3H 내에서 70℃, 36시간 동안 정제 디카르복시 염료를 가열함으로써 술폰화하였다.
주요한 반응 혼합물은 비이커 속의 얼음에 소량 가하고, 차가워진 혼합물을 700×g에서 30분간 원심분리하고, 희미한 색깔의 상층 액체는 버렸다. 침전물을 30ml 얼음 냉각한 물에서 현탁시키고, 물과 함께 엘렌메이어(Erlenmenyer) 플라스크에 옮겨, 약 40ml 1M KHCO3를 이용하여 염기화시키고 하룻밤 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 비이커로 옮겨, 진한 염산으로 산화시켜서 상온에서 6시간 동안 교반하고, 상온에서 48시간 동안 저장하였다.
혼합물을 700×g에서 원심분리하여 유색의 상등액은 보존하고, 침전물은 1M NaHCO3에서 용해시켜 2시간 동안 교반하였다. 암녹색 용액을 Sep Pak(2g 크기, Rainin 25)로 통과시키고, 산화 후의 여과물은 원심분리한 상등액에 합하였으며, 전체 부피는 400ml였다. 암청색 산성 용액은 Sep Pak에 흡착시켜 3N HCl로 컬럼을 세척한 후, 메탄올로 용해시켜 분리하였다. 메탄올과 3N HCl로 세척한 SepPak은 지속적으로 사용할 수 있다. 염료를 포함하는 메탄올 용출물을 회전 증발기로 건조시키고, H2SO4와 KOH에서 진공건조시켰다. 수득량은 158mg이다. 실리카 크로마토그래피에 의한 물질의 정제 결과, La Jolla Blue-3(LJB-3)을 수득하였다.
결과는 표 1과 2에 나타내었고, 형광도와 편광 측정에 의해 평가한 세 가지 염료의 비특이적 결합과 용매 민감도로서 특성화하였다. 강도의 관점에서 바람직한 특성은 높은 형광량(fluorescence output)과 함께 용매의 성분에 관계없이 일정하다. 한편, 편광은 저점도의 매질에서 낮아야 하고, 글리세롤 등의 점성 용매에서 가급적 높아야 한다.
표 1은 알루미늄프탈로시아닌트리술폰염으로부터의 형광도가 용매에 매우 민감하다는 것을 보여 준다. 비교를 위하여, 디하이드록시 실리콘 프탈로시아닌트리술폰염은 완충액, 혈청이 첨가된 완충용액 또는 글리세롤을 첨가한 완충용액에서 같은 형광량을 가지는 상당히 향상된 진행을 나타내었다. 이러한 향상의 일부는 자체적으로 혈청과 용매에 대하여 알루미늄 화합물보다 덜 민감한 디하이드록시-디카르복시-실리콘-프탈로시아닌(술폰염 그룹이 없다)과 비교하여 술폰화에 의해 나 타날 수 있다.
표 2는 좀 더 강하게 중심의 규소 원자의 단순한 존재가 중심 원자로서 알루미늄과 비교하였을 때 환경에 대한 민감도를 낮춘다는 점을 의미한다. "보호기(protecting group)"가 차후 분자평면의 각 측면에 존재하기 때문에, 이러한 차이는 대부분 규소가 두 개의 축 리간드를 갖고 있어서 용매효과로부터 염료의 평면구조를 "보호(protect)"할 수 있다는 사실에 의해 야기된다. 알루미늄의 경우, 단지 하나의 축 리간드가 있어서 분자평면의 한 측면은 용매효과에 접근하기기 용이하다. 도 2에서 이러한 상호작용의 결과는 염료를 글리세롤에 가함으로써(회전운동이 거의 멈출 때, 분극화의 적절한 제한을 의미하는) 야기되는 최대에 가까운 알루미늄 염료의 분극화(polarization)의 큰 증가로서 아주 명백히 나타났다.
본 발명에 관련되는 상술한 예시적인 응용은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 추론해서는 안된다. 현재 알려졌거나 이후에 개발될, 당업계의 숙련된 자들의 범위에 속하는 이러한 발명의 변화는 이하에서 청구한 바와 같이 본 본 명세서에 언급된 모든 특허와 간행물들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서의 숙련된 자의 수준을 나타낸다. 모든 특허와 간행물들은 각 개별 간행물이 명확하고 개별적으로 참조문헌으로 포함된다는 것을 나타나는 정도로 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
본 명세서에 서술적으로 적절하게 기재된 본 발명은, 본 명세서에 개시되지 않는 어떠한 요소나 요소들, 제한이나 제한들에 국한되지 않고 실시될 수 있을 것이다. 따라서, 예를 들면, 본 명세서에서 "포함하는(comprising)", "필수적으로 구성된(consisting essentially of)" 및 "구성된(consisting of)"이라는 각 용어는 서로 다른 두 용어와 대체될 수 있을 것이다. 본 명세서에 사용된 용어와 표현은 이에 제한되는 것이 아닌 오로지 설명하기 위해 사용되는 것이고, 그들이 제시되고 기술된 특징 또는 일부의 어떤 상당 어구의 용어와 표현을 제외하도록 사용하는 의도는 아니지만, 다양한 변경은 청구된 본 발명의 범주 내에서 가능하다는 것을 의미한다. 따라서, 비록 본 발명이 바람직한 실시태양 및 선택적인 특성에 의해 명확하게 기재되어 있다고 하더라도, 본 명세서에 개시된 개념의 변경과 변화는 당해 기술분야의 숙련된 자에 의하여 재해석되고, 이러한 변경과 변화는 첨부된 청구항에 의하여 정의된 바와 같이 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 인정된다.

Claims (18)

  1. 중심 금속원자를 갖는 거대고리 형광리간드:
    상기 중심 금속원자는 상기 거대고리의 어느 일측에 두개의 알콕시, 할라이드, 히드록시, 붕산염, 황산염 또는 인산염으로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 축 리간드를 갖고; 및,
    상기 거대고리는 하나 또는 그 이상의 벤조기, 상기 벤조기에 부착되는 치환기로서 두개의 오르토 카르복시기 또는 카르복시기가 아닌 수성용액에서 pH 5 또는 그 이상에서 음전하로 대전되는 하나의 다른 그룹과 함께 부착되는 하나의 카르복시기, 및 상기 거대고리의 어느 다른 가능한 위치에 부착되는 치환기로서 카르복시기가 아닌 수성용액에서 pH 5 또는 그 이상에서 음전하로 대전되는 하나 또는 그 이상의 다른 그룹을 갖는다.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 거대고리는 프탈로시아닌이고, 중심 금속원자는 Si 또는 Ge이며, 축 리간드는 히드록시기이고, 고리의 치환기는 하나의 고리에 위치한 두개의 오로토 카르복시기 및 다른 고리에 위치한 하나의 설포기인 것을 특징으로 하는
    거대고리 형광리간드.
  3. 자체의 정전하(net charge)를 조절하고 다른 분자와 결합하기에 충분하도록, 대체로 평편한 부위의 치환기와 함께, 평편한 부위의 일측에 위치한 두개의 수용성 그룹이 결합된, 발광성의 대체로 평편한 부위를 포함하는 마커 성분.
  4. 제 3항에 있어서,
    발광성의 대체로 평편한 부위는 1 내지 4개의 벤조기를 갖는 트리아자포르피린인 것을 특징으로 하는
    마커 성분.
  5. 제 3항에 있어서,
    발광성의 대체로 평편한 부위는 1 내지 4개의 벤조기를 갖는 다이아자포르피린인 것을 특징으로 하는
    마커 성분.
  6. 제 3항에 있어서,
    발광성의 대체로 평편한 부위는 1 내지 4개의 벤조기를 갖는 모노아자포르피 린인 것을 특징으로 하는
    마커 성분.
  7. 항원, 합텐, 항체, 올리고펩티드 또는 올리고뉴클레오티드인 생체고분자, 또는 천연 또는 합성된 치료제와 결합된, 제 4항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 한 항에 개시된 형광 부위를 포함하는 형광탐침.
  8. 전이상태 형광 편광/이방성(anisotropy)의 측정에 의한 분석에 이용하기 위한 형광도, 편광 및 붕괴시간의 특성을 갖는 제 7항의 형광 탐침.
  9. 자체의 정전하(net charge)를 조절하고 다른 분자와 결합하기에 충분하도록, 대체로 평편한 부위의 치환기와 함께, 평편한 부위의 일측에 위치한 두개의 수용성 그룹이 결합된, 발광성의 대체로 평편한 부위로 구성된 마커 성분.
  10. 중심 금속원자를 갖는 거대고리 형광리간드:
    상기 중심 금속원자는 상기 거대고리의 어느 일측에 두개의 알콕시, 할라이 드, 히드록시, 붕산염, 황산염 또는 인산염으로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 축 리간드를 갖고; 및,
    상기 거대고리는 연결이 가능하고 정전하를 제거하는 치환기를 운반하는 하나 또는 그 이상의 벤조기를 갖는 모노아자포르피린이다.
  11. 중심 금속원자를 갖는 거대고리 형광리간드:
    상기 중심 금속원자는 상기 거대고리의 어느 일측에 두개의 알콕시, 할라이드, 히드록시, 붕산염, 황산염 또는 인산염으로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 축 리간드를 갖고; 및,
    상기 거대고리는 연결이 불가능하고 정전하를 제거하는 치환기를 갖는 코린(corrin), 사피린(sapphyrin), 포르피센(porphycene) 또는 나프탈로시아닌(naphthalocyanine) 유도체이다.
  12. 중심 금속원자를 갖는 거대고리 형광리간드:
    상기 중심 금속원자는 상기 거대고리의 어느 일측에 두개의 알콕시, 할라이드, 히드록시, 붕산염, 황산염 또는 인산염으로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 축 리간드를 갖고; 및,
    상기 거대고리는 연결이 가능하고 정전하를 제거하는 치환기를 갖는 27-페닐 테트라벤조트리아자포르피린(27-phenyltetrabenzotriazaporphyrin) 또는 27-(p-메틸페닐)테트라벤조트리아자포르피린(27-(p-methylphenyl) tetrabenzotriazaporphyrin) 유도체이다.
  13. 본 명세서에 기재된 형광 마커 또는 형광 탐침을 이용하는 형광분석법.
  14. 본 명세서에 기재된 형광 마커 또는 탐침을 이용하는 핵산 혼성화를 포함하는 균질혼합측정법(homogeneous mix and read assay).
  15. 형광부위가 (1) 퀴노이드 염료, (2) 인단트렌(indanthrene) 염료, (3)1,4-디아미노안트라퀴논-2,3-디카복사미드(1,4-diaminoanthraquinone-2,3-dicarboxamide), (4) 테트라아미노안트라퀴논(tetraaminoanthraquinone), (5) 아진(azine) 염료, (6) 피릴륨(pyrylium) 또는 티오피릴륨(thiopyrylium) 염료 및 (7) 나프토퀴논 메티드(naphthoquinone methide)로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 마커 성분.
  16. 하기 각 단계를 포함하는, 비특이적인 결합과 축적에 대하여 평면분자를 효과적으로 보호하는 방법:
    (a) 적어도 두개의 작은 축 리간드를 제공하는 단계;
    (b) 상기 리간드의 하나 또는 그 이상을 분자에 의해 정의되는 분자면의 반대 측에 위치시키는 단계;
    (c) 상기 보호가 되기에 충분한 전체 분자의 정전하를 확보하는 단계.
  17. 제 16항에 있어서,
    축 리간드는 -OH로 구성되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    리간드는 -OH, -O-t-butyl, -OCH2OH, -OCH2CH2OH, -OCH2CHOHCH2OH, -OCH2CH2-OCH2CH2OH, -OCH2CH2-CH2-O-CH2-CH2CH2OH, -OPO3H2, -OB(CH)2, Cl, Br 및 F를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    방법.
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