JPH05194942A - 蛍光標識用色素、蛍光標識用色素で標識された生物由来物質、及びそれらを含有する試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】６７０〜７８０ｎｍ付近に発振波長をもつ小型
半導体レーザを用いて測定するための、種々の抗原・薬
物の分析やＤＮＡの塩基配列の分析等に有用な試薬を提
供する。 【構成】一般式（Ｉ）で表される蛍光標識用色素、それ
によって標識されたビタミン、ヌクレオチドもしくはタ
ンパク質等の生物由来物質、又はこれらを含有する試
薬。 【化１】（一般式（Ｉ）中、Ａはナフタレン環、アンス
ラセン環等であり、ＭはＡｌ、Ｓｉ、Ｈ₂等であり、Ｒ¹
〜Ｒ⁴はスルホン酸基、アミノ基等であり、ｋ、ｌ、ｍ
及びｎは０〜４の整数であり、Ｙはヒドロキシ基、ハロ
ゲン原子等であり、ｐは０〜２の整数である。）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛍光標識用色素、蛍光
標識用色素で標識された生物由来物質、及びそれらを含
有する試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】フタロシアニン系顔料は、環状共役鎖を
構成する４つの窒素原子によって結合された４個のイソ
インドール部分を有する有機顔料である。これらの顔料
に用いられている化合物としては、フタロシアニン（青
緑）、銅フタロシアニン（青）、塩素置換銅フタロシア
ニン（緑）、スルホン化銅フタロシアニン（緑）等があ
る。フタロシアニン系顔料は、一般に、エナメル、プラ
スチック、リノリウム、インク、壁紙、織物、紙、ゴム
製品などに使用されている。いっぽう、フリーベースフ
タロシアニン、アルミニウム、カドミウム、マグネシウ
ム、シリコン、すず及び亜鉛フタロシアニンが螢光を示
すことが報告された（Ｔｈｅ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎ
ｉｎｅｓ １：１２７、１９８３）。

【０００３】また、フタロシアニン類は種々の免疫分析
に使用できることが種々報告されている（ＵＳ特許第
４，１６０，６４５号公報、ＵＳ特許第４，１９３，９
８３号公報、ＵＳ特許第４，２２０，４５０号公報、Ｕ
Ｓ特許第４，２３３，４０２号公報、ＵＳ特許第４，２
３５，８６９号公報、ＵＳ特許第４，２５６，８３４号
公報、ＵＳ特許第４，２７７，４３７号公報、ＵＳ特許
第４，３１８，７０７号公報、ＵＳ特許第４，４８３，
９２９号公報、ＵＳ特許第４，５４０，６６０号公報、
ＵＳ特許第４，５４０，６７０号公報、ＵＳ特許第４，
５６０，５３４号公報、ＵＳ特許第４，６５０，７７０
号公報、ＵＳ特許第４，６５６，１２９号公報、ＵＳ特
許第４，６５９，６７６号公報）。

【０００４】更に、フタロシアニン類は、化学発光免疫
分析系で触媒として使用されている〔Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．第５６巻、２９６５−２９６８頁
（１９８３）、同第５６巻、２２６７−２２７１頁（１
９８３）、同第５７巻、５８７−５８８頁（１９８
４）、同第５７巻、３００９−３０１０頁（１９８
４）、同第５８巻、１２９９−１３０３頁（１９８
５）〕。原らは、ルミノールと過酸化水素とのあいだの
化学発光反応の触媒として鉄フタロシアニンを用いて、
化学発光のシグナル量から、テストサンプル中の分析対
象を定量している。彼らは鉄及びコバルトのフタロシア
ニン並びに鉄、パラジウム、白金、マンガン及びスズの
ポルフィリン錯体について検討し、鉄フタロシアニンが
最も優れた触媒作用を示し、かつ高感度であることを報
告した。

【０００５】免疫分析で着色物質のほかに螢光物質が広
く利用されているが、さらに、酵素免疫分析において
も、螢光物質は感度を上げることができるので着色物質
よりも好んで使用されるようになってきている。よく知
られた螢光物質−酵素対はアルカリホスファターゼ（al
kaline phosphatase）と４−メチルウムベリフェリルホ
スフェート（4-methylumbelliferyl phosphate）、β−
ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）と４−メチルウ
ムベリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（4-methylum
belliferyl-D-galactopyranoside）、西洋ワサビのパー
オキシダーゼ（horse radish peroxidase）とｐ−ヒド
ロキシフェニル酢酸（p-hydroxyphenyl acetic acid）
等があり、これらの系の検出感度は１０^-15 Ｍである。
しかし検出感度をさらに上げようとしても生成する螢光
体の分析特性には限界がある。

【０００６】最近、螢光量子収率が高く、水に対して高
い溶解性を示すフタロシアニン類を用いた試薬が提案さ
れた（ＷＯ特許第８８／０４７７７号公報、ＷＯ特許第
９０／０２７４７号公報、特開平１−２３３２２２号公
報）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしフタロシアニン
類は、ほぼ等価な骨格をもつ４つの芳香環を有するの
で、水等の極性溶媒中で容易に会合体を形成し、検出感
度が低下する。更に、フタロシアニン類は、そのＱ−バ
ンドの吸収域及び蛍光発光域が波長６５０〜７００ｎｍ
の領域にあり、生体の血液中に存在するヘム等の吸収域
（＜７００ｎｍ）と重なるので、その妨害を受ける欠点
がある。

【０００８】また、放射線光源は今後安価で小型の半導
体レーザ（６７０〜７８０ｎｍ）が主流になると考えら
れるが、６７０〜６９０ｎｍの半導体レーザで励起する
場合に、フタロシアニンは螢光発光領域がこれと同様の
波長域にあるため、照射レーザ光からの散乱光と螢光発
光を区別することが困難であるだけでなく、７００〜７
８０ｎｍの半導体レーザで励起する場合には、フタロシ
アニンは光を吸収できないため励起されず、したがって
検出薬としての役目を果たさない。

【０００９】本発明は、将来主流になると予想される安
価で小型の半導体レーザ（６７０〜７８０ｎｍ）を用い
て測定でき、また水等の極性溶媒中で容易に会合体を形
成しないため高い感度を示し、更に血液中に存在するヘ
ム等の生体内物質に影響されない、抗原・薬物の分析や
あるいはＤＮＡの塩基配列の分析等に有用な試薬又は臨
床検査試薬を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は下記（１）〜
（６）に関する。すなわち、 （１）一般式（Ｉ）

【化３】 〔一般式（Ｉ）中、Ａは、次のいずれかの構造式（化
４）で表される芳香環を示し、

【化４】 Ｍは、Ｈ₂ 、Ａｌ、Ｓｉ、Ｐ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｃｄ、Ｓ
ｃ、Ｍｇ、Ｓｎ又はＺｎを示し、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 及び
Ｒ⁴ は、それぞれ独立に、−ＸＱＷ、−ＱＷ、−Ｗ又は
水素原子を示し、（ここで、Ｘは、酸素原子、窒素原
子、イオウ原子、リン原子、ケイ素原子、セレン原子、
ＣＲ⁵ Ｒ⁶ （ただし、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、それぞれ独立
に、水素原子、アルキル基、アリール基又はアラルキル
基であり、Ｒ⁵ Ｒ⁶ としてカルボニル酸素でもよ
い。）、又はフェニレン基を示し、Ｑは、ＸとＷを結合
する基を示し、Ｗは−ＯＨ、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯ₂ ^- 、−
ＯＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、−ＯＣＨ₂ＣＯ₂ ^- 、−ＰＯ₄ ^2- 、−Ｐ
Ｏ₃ ^- 、−ＳＯ₃ ^- 、−ＳＯ₂ ^-、−ＳＯ₂Ｃｌ、−ＳＯ₄ ^2
- 、−ＮＨ₂ 、−ＮＨＲ⁷ 、−ＮＲ⁸ Ｒ⁹ 又は−Ｎ
（＋）Ｒ¹⁰Ｒ¹¹Ｒ¹²（ただし、Ｒ⁷ 〜Ｒ¹²は、それぞれ
独立にＣ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキル基、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₂のアリール
基又はＣ₆ 〜Ｃ₁₂のアラルキル基である。）を示す。）
ｋ、ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立に０〜４の整数を示
し、Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＲ¹³又は−ＮＲ¹⁴ ₂ （た
だし、Ｒ¹³及びＲ¹⁴は、それぞれ独立に、水素原子、親
水性置換基を有するものであってもよいアルキル基、親
水性置換基を有するものであってもよいアシル基、親水
性置換基を有するものであってもよいシリル基又は親水
性置換基を有するものであってもよいリン原子含有基で
ある。）を示し、ｐは、ＹのＭへの結合数を表わす０〜
２の整数を示す。〕で表される蛍光標識用色素。 （２）上記（１）の蛍光標識用色素を含有する試薬。 （３）上記（１）の蛍光標識用色素で標識された生物由
来物質。 （４）上記（３）の標識された生物由来物質を含有する
試薬。 （５）生物由来物質がビタミン、アルカロイド又はヌク
レオチドである上記（３）の標識された生物由来物質。 （６）生物由来物質がビタミン、アルカロイド又はヌク
レオチドである上記（４）の試薬。

【００１１】本発明の一般式（Ｉ）の化合物において、
Ｒ¹〜Ｒ⁴中のＸ中のＲ⁵ 及びＲ⁶ のアルキル基の具体例
としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ｓｅｃ−
プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｔ−ブ
チル基、ペンチル基、ヘキシル基等があり、アリール基
の例としては、フェニル基、チエニル基、フリル基、ピ
ロリル基、トリル基、アニシル基、４−アミノフェニル
基等があり、アラルキル基としては、べンジル基、２−
フェニルエチル基、１−フェニルエチル基、３−フェニ
ルプロピル基、２−フェニルプロピル基、１−フェニル
プロピル基等がある。

【００１２】また、Ｙ中のＲ¹³及びＲ¹⁴の親水性置換基
を有するものであってもよいアルキル基の具体例として
は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペン
チル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル
基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデ
シル基、オクタデシル基、エイコシル基、ドコシル基等
の直鎖、分枝及び脂環状の基があり、親水性置換基を有
するものであってもよいアシル基の例としては、ホルミ
ル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレ
リル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、オクタノイル
基、ラウリル基、パルミチル基、ステアリル基等があ
り、親水性置換基を有するものであってもよいシリル基
としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、
トリプロピルシリル基、トリブチルシリル基、トリアミ
ルシリル基、トリヘキシルシリル基、ｔ−ブチルジメチ
ルシリル基、ジ（ｔ−ブチル）メチルシリル基、ジメチ
ルフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、トリ
フェニルシリル基等があり、親水性置換基を有するもの
であってもよいリン原子を含む置換基としては、−Ｐ
（＝Ｏ）Ｒ⁷Ｒ⁸、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲ⁹Ｒ¹⁰）₂ 、−Ｐ
Ｒ¹¹ ₂ （ただし、Ｒ⁷〜Ｒ¹¹は、それぞれ独立に、アル
キル基、アリール基、アシル基、シクロアルキル基、ア
ルコキシル基、アリールオキシル基、ポリエーテル基、
ヒドロキシル基又はハロゲン原子を示し、それらは種々
の置換基を持っていてもよい。）等がある。

【００１３】Ｒ¹〜Ｒ⁴中のＱはＸとＷを結合する基で、
Ｃ₁〜Ｃ₈の飽和又は不飽和の直鎖状、分枝状又は環状の
結合基、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレ
ン基、テトラメチレン基、プロピレン基、ビニレン基、
プロペニレン基、シクロプロピレン基、シクロペンチレ
ン基、シクロヘキシレン基等のほか、ポリエーテル、ポ
リアミン、ポリアルコール等の基がある。

【００１４】Ｗ中、Ｒ⁷ 〜Ｒ¹²のＣ₁〜Ｃ₁₀のアルキル
基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、アミル基、ヘキシル基、ヘプチル基、ノニル基、デ
シル基の直鎖状、分枝状及び環状の基があり、Ｃ₆〜Ｃ
₁₂のアリール基としては、フェニル基、トリル基、アニ
シル基、ナフチル基、ビフェニル基等があり、Ｃ₆〜Ｃ
₁₂のアラルキル基としては、ベンジル基、２−フェニル
エチル基、１−フェニルエチル基、３−フェニルプロピ
ル基、２−フェニルプロピル基、１−フェニルプロピル
基等がある。

【００１５】一般式（Ｉ）中、Ｙが−ＯＲ¹³又は−ＮＲ
¹⁴ ₂ （Ｒ¹³及びＲ¹⁴は、アルキル基、アシル基及びシリ
ル基を示す）であり、ｐが１又は２である化合物は、一
般式（Ｉ）中、Ｙが−ＯＨ又は−ＮＨ₂ である化合物
を、相当するアルコール、アシルクロリド、シラノー
ル、クロロシラン、クロロホスフィン、クロロホスファ
イト又はホスフォリルクロリドなどと反応させることに
よって合成できる。

【００１６】一般式（Ｉ）中、Ｙが−ＯＨ又は−ＮＨ₂
であり、ｐが１又は２である化合物は、一般式（Ｉ）
中、Ｙがハロゲン原子であり、ｐが１又は２である化合
物を加水分解又は加アンモニア分解することによって得
ることができる。

【００１７】一般式（Ｉ）中、Ｙがハロゲン原子であり
ｐが１又は２である化合物、及びｐがゼロでＹをもたな
い化合物は、次の２つの経路により合成することができ
る。第１の経路は文献（Zh. Obsch. Khim.、第39巻、25
54-2558頁（1969年））記載の方法に準じて、式（II）

【化５】 で表される化合物と式（ＩＩＩ）

【化６】 〔式（ＩＩＩ）中、Ａは一般式（Ｉ）中と同じ意味を示
す。〕で表される化合物とをクロスカップリングさせる
ことにより、次式（IＶ)

【化７】 〔式（IＶ）中、Ａ、Ｍ及びｐは一般式（Ｉ）中と同じ
意味を示し、Ｙ’は−ＯＨ又は−ＮＨ₂を示す。〕で表
される化合物を得、次にこれに、一般式（Ｉ）におい
て、置換基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³又はＲ⁴を形成しうるようなＲ
¹、Ｒ²、Ｒ³又はＲ⁴部位含有の化学種を反応させて得る
方法である。

【００１８】第２の経路は、文献（Monatsh. Chem., 10
3巻、150-155頁(1972年)及び同105巻、405-418頁(1974
年)）記載の方法を参考にして得られる次式（Ｖ）

【化８】 と前記の式（III）で示される化合物とを、文献（J. A
m. Chem. Soc., 112巻、9640-9641頁(1990年))記載の方
法に準じて反応させることにより式（IＶ）で示される
化合物を得たのち、更に一般式（Ｉ）で表される化合物
を得る方法である。

【００１９】一般式（Ｉ）で表される化合物の例を次の
表１及び表２に示す。

【表１】 表１ 一般式（Ｉ）で表される化合物の例（その１） ──────────────────────────────────── No. Ａ Ｍ−Ｙp Ｒ¹ Ｒ² Ｒ³ Ｒ⁴ ──────────────────────────────────── 1 化9 H₂ SO₃Na SO₃Na SO₃Na SO₃Na 2 〃 〃 〃 〃 〃 − 3 〃 Mg 〃 〃 〃 − 4 〃 AlCl 〃 〃 〃 − 5 〃 Si〔OCH₂CH₂OH〕₂ 〃 〃 〃 − 6 〃 Si〔OC(CH₂OH)₃〕₂ 〃 〃 〃 − 7 化10 AlCl PO₃Na PO₃Na PO₃Na PO₃Na 8 〃 Si〔OCH₂CH(CH₂OH)₂〕₂ SO₃Na SO₃Na SO₃Na SO₃Na 9 化11 〃 〃 〃 〃 〃 10 化12 〃 〃 〃 〃 〃 11 〃 Ge〔OC(CH₂OH)₃〕₂ CO₂Na CO₂Na CO₂Na CO₂Na 12 〃 〃 SCH₂OH SCH₂OH SCH₂OH SCH₂OH 13 化13 〃 − CONH₂ CONH₂ CONH₂ 14 〃 Zn − 〃 〃 〃 15 化9 〃 SC₃H₇ SO₃Na SO₃Na SO₃Na 16 化13 〃 NH₂ 〃 〃 〃 17 化10 〃 SO₃Na NHCO₂Na NHCO₂Na NHCO₂Na 18 化9 〃 化14 化14 化14 化14 19 〃 Al-OH 〃 〃 〃 〃 20 〃 化15 〃 〃 〃 〃 ────────────────────────────────────

【表２】 表２ 一般式（Ｉ）で表される化合物の例（その２） ──────────────────────────────────── No. Ａ Ｍ−Ｙp Ｒ¹ Ｒ² Ｒ³ Ｒ⁴ ──────────────────────────────────── 21 化9 Mg 化14 化14 化14 化14 22 〃 〃 化16 化16 化16 化16 23 〃 〃 化17 SO₃Na SO₃Na SO₃Na 24 〃 〃 化18 化14 化14 化14 25 〃 Zn 化17 化17 化17 化17 26 〃 〃 化18 化18 化18 化18 ──────────────────────────────────── ただし、表１及び表２において、ｋ、ｌ、ｍ及びｎはい
ずれも１であり、化９〜化１８とあるのは次の化学式を
示す。

【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【化１３】

【化１４】

【化１５】

【化１６】

【化１７】−Ｓ−Ｐｈ−ＳＯ₃Ｎａ （ただし、Ｐｈは
ベンゼン環を示す）

【化１８】

【００２０】本発明において用いられる生物由来物質と
しては、動物、植物、微生物（ウイルスを含む）等の生
物から得られるタンパク質・ペプチド、ヌクレオチド、
糖類、脂質、ホルモン、ビタミン、アルカロイド、抗生
物質、それらの複合物等があり、これらは、天然から抽
出したもの、人工的に完全合成したもの、あるい人工的
に半合成したもののいずれであってもよい。

【００２１】タンパク質・ペプチドの具体例としては、
血清アルブミン、ＩｇＧ・ＩｇＡ・ＩｇＭ・ＩｇＤ・Ｉ
ｇＥ等の免疫グロブリン、種々のタンパク質や白血球の
膜抗原に対するモノクローナル抗体、パーオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
等の酵素等が挙げられ、ヌクレオチドの具体例としては
ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、合成ポリヌ
クレオチド、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴ
Ｐ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴ
Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴ
Ｐ、ｄｄＵＴＰ、あるいはそれらの誘導体等が挙げら
れ、糖類の具体例としては、グリコーゲン、デンプン、
マンナン等の多糖類のほかオリゴ糖やグルコース、マン
ノース等の単糖類が挙げられ、脂質としては、ホスファ
チジルコリン、ホスファチジルエタノラミン、脂肪、脂
肪酸等が挙げられ、ホルモンとしてはインシュリン、成
長ホルモン、オキシトシン、バソプレッシン、セクレチ
ン、上皮細胞成長因子、ガストリン、グルカゴン、カル
シトニン等のペプチド性ホルモン、アンドロゲン、エス
トロゲン、ハイドロコーチゾン等のステロイドホルモ
ン、アドレナリン、ノルアドレナリン等のカテコラミン
類等が挙げられ、ビタミンとしてはビタミンＡ、ビタミ
ンＢ₁、Ｂ₂、Ｂ₆、Ｂ₁₂、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢ
Ａ）、ビオチン、葉酸、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタ
ミンＥ等の各種ビタミンが挙げられ、アルカロイドとし
てはモルフィン等のアヘンアルカロイド、アトロピン、
スコポラミン等のトロパンアルカロイド、ビンブラスチ
ン、ビンクリスチン等のインドールアルカロイド、オウ
レン等のイソキノリンアルカロイド等が挙げられ、抗生
物質としては、ペニシリン、セファロスポリン、カナマ
イシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール等が
挙げられる。

【００２２】生物由来物質に蛍光標識用色素を結合させ
るためには、生物由来物質中のアミノ基、水酸基等の官
能基と蛍光標識用色素中のカルボキシル基、スルフォン
基等の官能基を利用して直接、イオン結合的又は共有結
合的に直接結合させるか、あるいは蛍光標識用色素が反
応できるように、生物由来物質の一部に結合基（リンカ
ー）を付加する等の化学修飾を施したのち、反応させれ
ばよい。蛍光標識用色素で標識された生物由来物質はク
ロマトグラフィー、再結晶等の慣用の分離手段により精
製することができる。

【００２３】３個のベンゼン環に加え、Ｑ吸収帯を長波
長へシフトさせる役割をもつ芳香環が縮環したことによ
り、一般式（Ｉ）で表される化合物の吸収及び蛍光発光
波長はフタロシアニン類に比べ長波長域（７００ｎｍ以
上）に移動し、また非対称の分子構造となるため水中で
の会合体の形成が抑制される。そのため、一般式（Ｉ）
で表される化合物を用いれば、血中ヘム等のスペクトル
的妨害因子の影響を免れることができ、しかも検出感度
の高い分析・検査試薬とすることができるので、生体中
の種々の抗原、薬物の分析やあるいはＤＮＡの塩基配列
の分析等に有用に利用できる。

【００２４】

【実施例】以下、実施例により更に具体的に本発明を説
明する。なお、化合物のNo.は表１及び表２の番号に符
合する。 実施例１ 化合物No.4の合成 文献〔Monatsh. Chem., 105巻、405-418頁(1974年)〕記
載の方法を参考にして合成したサブフタロシアニン
(１．２ｇ)及び１，３−ジイミノベンゾ〔ｆ〕イソイン
ドリン（３．２ｇ）を、文献〔J. Am. Chem. Soc., 112
巻、9640-9641頁(1990年)〕記載の方法を参考にして反
応させたのち、キノリン（３００ｍｌ）中、２２０℃で
塩化アルミニウム（３．０ｇ）を反応させ、クロロアル
ミニウムフタロナフタロシアニン（３．６ｇ）を得た。
次に、これをクロロスルホン酸（２０ｍｌ）中、６５℃
で６時間撹拌した。放冷後、内容物を氷水（１ｋｇ）に
注ぎ、固体を濾取し、水、続いてメタノールで洗浄後、
減圧乾燥した。得られた固体（２．９ｇ）に１Ｎ−Ｎａ
ＯＨ（４０ｍｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。反
応物をクロマトグラフィー（展開溶媒：１０重量％ＮＨ
₄ＯＨ／メタノール）により精製し、黒緑色固体（１．
９ｇ）を得た。本固体には、約３個のスルホン酸基が導
入されていることが分かった。

【００２５】実施例２ 化合物No.18の合成 文献〔Monatsh. Chem., 105巻、405-418頁(1974年)〕記
載の方法を参考にして合成したサブフタロシアニン
(１．２ｇ)及び１，３−ジイミノベンゾ〔ｆ〕イソイン
ドリン（３．２ｇ）を、文献〔J. Am. Chem. Soc., 112
巻、9640-9641頁(1990年)〕記載の方法を参考にして反
応させたのち、キノリン（３００ｍｌ）中、２２０℃で
塩化亜鉛（３．０ｇ）を反応させ、亜鉛フタロナフタロ
シアニン（３．４ｇ）を得た。次に、これをクロロスル
ホン酸（２０ｍｌ）中、６５℃で６時間撹拌した。放冷
後、内容物を氷水（１ｋｇ）に注ぎ、固体を濾取し、
水、続いてメタノールで洗浄し、減圧乾燥した。得られ
た固体（２．８ｇ）を無水クエン酸（１０ｇ）とともに
キノリン（３００ｍｌ）中、１８０℃で３時間反応させ
たのち、反応液中のキノリンを減圧下で留去した。固体
をメタノール（２０ｍｌ）でほぐしたのち、トルエン
（１００ｍｌ）で２回、更にｎ−ヘキサンで洗浄し、乾
燥した。水を加えてクエン酸を溶かし、不溶性の固体を
濾取した。この固体を炭酸ナトリウム溶液中に投入し、
３０分撹拌後、濾過して得た濾液を弱酸性にし調整して
析出させた固体を濾取した。この固体を赤外スペクトル
分析の結果、カルボン酸基が多数導入されていることが
分かった。この固体を炭酸ナトリウム溶液に溶かして、
化合物No.18を得た。

【００２６】実施例３ 化合物No.15の合成 １，３−ジイミノベンゾ〔ｆ〕イソインドリン及び塩化
アルミニウムの代わりに、それぞれ６−プロピルチオ-
１，３−ジイミノベンゾ〔ｆ〕イソインドリン及び塩化
亜鉛を用いたほかは、実施例１と同様にして、化合物N
o.15を得た。

【００２７】実施例４ 化合物No.7の合成 １，３−ジイミノベンゾ〔ｆ〕イソインドリン及び塩化
アルミニウムの代わりに、それぞれ下記の化１９

【化１９】 で表される化合物及び四塩化珪素を用いたほかは、実施
例１と同様にして、Ｍ−ＹpがＳｉ（ＯＨ）₂である化合
物を得たのち、キノリン中、２−ヒドロキシメチル−
１，３−プロパンジオールと脱水縮合反応させ、化合物
No.7を得た。

【００２８】実施例５ 化合物No.4のモノ｛Ｎ−（ｐ−
ヒドロキシカルボニルフェニル）スルファモイル｝ジス
ルホン酸ナトリウム塩の合成 実施例１において、１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液でナトリウム
塩とする前のトリスルホン酸（２００ｍｇ）のベンゼン
（２ｍｌ）溶液に、２５℃でオキザリルクロリド（０．
７５ｍｌ）を滴下した。６時間撹拌後、溶媒を除去し、
トリスルホニルクロリド誘導体を黒緑色固体として得
た。一方、炭酸ナトリウム（７５ｍｇ）の水（１．５ｍ
ｌ）溶液に、８０℃で、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢ
Ａ）（４５ｍｇ）を加え、５分間撹拌し、トリスルホニ
ルクロリド誘導体（７２ｍｇ）を加えた。反応液を８０
℃で更に６時間撹拌したのち、溶媒を除去し得た固体を
１０重量％水酸化アンモニウムを含むメタノールで希釈
し、再度濃縮し、アセトンで粉砕して、化合物No.4のモ
ノ｛Ｎ−（ｐ−ヒドロキシカルボニルフェニル）スルフ
ァモイル｝ジスルホン酸ナトリウム塩を得た。

【００２９】実施例６ 化合物No.15のモノ｛Ｎ−（ｐ
−ヒドロキシカルボニルフェニル）スルファモイル｝ジ
スルホン酸ナトリウム塩の合成 実施例３において、１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液でナトリウム
塩にする前のトリスルホン酸を実施例４と同様に処理
し、化合物No.15のモノ｛Ｎ−（ｐ−ヒドロキシカルボ
ニルフェニル）スルファモイル｝ジスルホン酸ナトリウ
ム塩を得た。

【００３０】実施例７ 化合物No.15のモノ〔２−
（２’−アミノエトキシ）エチルアミノスルホニル〕ジ
スルホン酸ナトリウム塩の合成 実施例３において、１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液でナトリウム
塩とする前のトリスルホン酸（７２ｍｇ）のベンゼン
（３ｍｌ）溶液に、２５℃でオキザリルクロリド（１．
０ｍｌ）を滴下した。６時間撹拌後、溶媒を除去し、ト
リスルホニルクロリド誘導体を黒緑色固体として得た。
一方、炭酸ナトリウム（３０ｍｇ）の水（１．２ｍｌ）
溶液に、８０℃で、２，２’−オキシビス（エチルアミ
ン）ハイドロクロリド（２５ｍｇ）を加え、５分間撹拌
し、先に調製したトリスルホニルクロリド誘導体を加え
た。反応液を８０℃で更に１２時間加熱し、化合物No.1
5のモノ〔２−（２’−アミノエトキシ）エチルアミノ
スルホニル〕ジスルホン酸ナトリウム塩を得た。

【００３１】実施例８ アンチモルフィンモノクローナ
ル抗体に対する相対免疫親和性 化合物No.4のモノ｛Ｎ−（ｐ−ヒドロキシカルボニルフ
ェニル）スルファモイル｝ジスルホン酸ナトリウム塩か
ら得られる化合物No.4のモノ｛Ｎ−（ｐ−ヒドロキシカ
ルボニルフェニル）スルファモイル｝ジスルホニルクロ
リド（５０ｍｇ）のトリエチルアミン（０．５ｍｌ）溶
液に、０℃で撹拌しながらクロロギ酸エチル（７ｍｌ）
を加えた。５分間撹拌後、３−（４−アミノブチル）モ
ルフィン（２９ｍｇ）を加え、室温で反応混合物を８時
間撹拌し、化合物No.4のモノ｛Ｎ−（ｐ−ヒドロキシカ
ルボニルフェニル）スルファモイル｝ジスルホニルクロ
リドで標識したモルフィンを得た。

【００３２】モルフィン、アミノモルフィン及びここで
得た標識化モルフィンについて、アンチモルフィンモノ
クロナール抗体に対する相対免疫親和性を、トリチウム
でラベルしたモルフィンとの競争反応を用いて測定し
た。その結果を表３に示す。

【表３】 表３ アンチモルフィンモノクローナル抗体に対する親和性 ────────────────────────────────── 分子種 相対親和性 ────────────────────────────────── モルフィン １ アミノモルフィン １ 標識化モルフィン ０．９ ────────────────────────────────── 表３の結果から分子種の違いによる相対親和性の違いは
ほとんでみられず、モルフィンに化合物No.4を結合させ
てもモルフィンとモノクローナル抗体の反応性はほとん
ど変化がないことが分かる。

【００３３】実施例９ （１）リンカーが結合したオリゴヌクレオチド・プライ
マーの合成 固相ＣＥＤ−フォスフォラミド法を用いた自動ＤＮＡ合
成装置によりプライマー（５’−ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴ
ＣＡＣＧＡＣ−３’）を合成した。合成したプライマー
のリン酸化は、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、３ｍＭ ＡＴＰ、Ｔ₄−ヌクレオチドカイネースを含
む１００μｌの反応液中で３７℃、１時間保温して行っ
た。リン酸化されたプライマーは、ゲル濾過用カラムを
使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分
離し、リン酸化されたプライマーのピークを集め、凍結
乾燥で溶媒を除いた。

【００３４】次に、これを２５０ｍＭの１，２−ジアミ
ノエタン（ｐＨ６．０），２００ｍＭのエチル−３（３
−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド及び１００
ｍＭのＮ−メチルイミダゾール（ｐＨ６．０）を含む反
応液１００μｌ中、２５℃で一晩保温して５’末端のグ
アノシンのリン酸部にリンカー〔ＮＨ₂−（ＣＨ₂)₂−Ｎ
Ｈ−〕を結合させた。

【００３５】（２）化合物No.4で標識されたオリゴヌク
レオチド・プライマーの合成 ５’末端グアノシンのリン酸部にリンカーが結合した上
記(１)のオリゴヌクレオチド・プライマーと実施例１で
得た化合物を０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
３）中で混合し、２５℃で一晩、暗室で保温したのち、
ＨＰＬＣで精製することにより、リンカーを介して化合
物No.4が結合したプライマーを得た。

【００３６】（３）ＤＮＡの塩基配列の分析 既知の塩基配列のＤＮＡをサンプルとし、上記（３）で
得られたリンカーを介して化合物No.4が結合したプライ
マーを用いて、それぞれ４種の塩基でサンガー反応を行
ったのち、それぞれ別々のレーンで電気泳動分離し、７
２０ｎｍの発振波長の半導体レーザーを搭載したＤＮＡ
シークエンサーで分析した。その結果、ＤＮＡの３００
塩基までを９９％の精度で決定できた。

【００３７】

【発明の効果】本発明により、血液中に存在するヘム等
の生体内物質に影響されず、また、将来主流になると予
想される小型の半導体レーザ（６７０〜７８０ｎｍ）を
用いて測定するための、血液中の種々の抗原、薬物の分
析やあるいはＤＮＡの塩基配列の分析等に有用な試薬又
は臨床検査試薬を提供できた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 31/22 １２２ 9015−2Ｊ 33/533 8310−2Ｊ 33/58 Ａ 7055−2Ｊ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式（Ｉ） 【化１】 〔一般式（Ｉ）中、 Ａは、次のいずれかの構造式（化２）で表される芳香環
   を示し、 【化２】 Ｍは、Ｈ₂ 、Ａｌ、Ｓｉ、Ｐ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｃｄ、Ｓ
   ｃ、Ｍｇ、Ｓｎ又はＺｎを示し、 Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 及びＲ⁴ は、それぞれ独立に、−ＸＱ
   Ｗ、−ＱＷ、−Ｗ又は水素原子を示し、（ここで、Ｘ
   は、酸素原子、窒素原子、イオウ原子、リン原子、ケイ
   素原子、セレン原子、ＣＲ⁵ Ｒ⁶ （ただし、Ｒ⁵ 及びＲ
   ⁶ は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリー
   ル基又はアラルキル基であり、Ｒ⁵ Ｒ⁶ としてカルボニ
   ル酸素でもよい。）、又はフェニレン基を示し、 Ｑは、ＸとＷを結合する基を示し、 Ｗは−ＯＨ、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯ₂ ^- 、−ＯＣＨ₂ＣＯ
   ₂Ｈ、−ＯＣＨ₂ＣＯ₂ ^- 、−ＰＯ₄ ^2- 、−ＰＯ₃ ^- 、−Ｓ
   Ｏ₃ ^- 、−ＳＯ₂ ^-、−ＳＯ₂Ｃｌ、−ＳＯ₄ ^{2 -} 、−ＮＨ
   ₂ 、−ＮＨＲ⁷ 、−ＮＲ⁸ Ｒ⁹ 又は−Ｎ（＋）Ｒ¹⁰Ｒ¹¹
   Ｒ¹²（ただし、Ｒ⁷ 〜Ｒ¹²は、それぞれ独立にＣ₁ 〜Ｃ
   ₁₀のアルキル基、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₂のアリール基又はＣ₆ 〜Ｃ
   ₁₂のアラルキル基である。）を示す。）ｋ、ｌ、ｍ及び
   ｎは、それぞれ独立に０〜４の整数を示し、 Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＲ¹³又は−ＮＲ¹⁴ ₂ （ただ
   し、Ｒ¹³及びＲ¹⁴は、それぞれ独立に、水素原子、親水
   性置換基を有するものであってもよいアルキル基、親水
   性置換基を有するものであってもよいアシル基、親水性
   置換基を有するものであってもよいシリル基又は親水性
   置換基を有するものであってもよいリン原子含有基であ
   る。）を示し、 ｐは、ＹのＭへの結合数を表わす０〜２の整数を示
   す。〕で表される蛍光標識用色素。
2. 【請求項２】請求項１記載の蛍光標識用色素を含有する
   試薬。
3. 【請求項３】請求項１記載の蛍光標識用色素で標識され
   た生物由来物質。
4. 【請求項４】請求項３記載の標識された生物由来物質を
   含有する試薬。
5. 【請求項５】生物由来物質がビタミン、アルカロイド又
   はヌクレオチドである請求項３記載の標識された生物由
   来物質。
6. 【請求項６】生物由来物質がビタミン、アルカロイド又
   はヌクレオチドである請求項４記載の試薬。