KR102253839B1 - 표지용 염료 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형광 세기 및 광 안정성이 우수한 표지용 염료 및 키트에 관한 것이다.

Description

표지용 염료 및 이를 포함하는 키트{LABELING DYE AND KIT COMPRISING THE SAME}
본 발명은 형광 세기 및 광 안정성이 우수한 표지용 염료 및 키트에 관한 것이다.
형광은 생명 과학 분야에서 비파괴적으로 생물학적 분자를 추적 또는 분석하는데 가장 일반적으로 사용되는 기법이다.
그린형광단백질(GFP) 등의 자체적으로 발광하는 생체 분자도 존재하지만, 일반적으로는 생체조직이나 세포 및 그 이하 단계의 생체물질을 형광 염료로 염색하거나, 단백질, 핵산 등의 생체 분자에 형광 염료를 표지(labeling)한 후, 형광신호를 검출할 수 있는 광학장비를 동반하여, 다양한 기법으로 영상화한 자료를 얻고 있다.
형광 염료를 적용하기 위해서는, 일반적으로 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 내에 존재할 때 광표백(photo bleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)및 양자효율(quantum efficiency)이 크며, 다양한 pH 조건에서 안정한 것이 바람직하다.
여러 연구분야에서 다양한 형광 염료가 이용되어 오고 있으나, 상술한 조건들을 모두 만족시키는 형광 염료는 상당히 드문 실정이다.
본 발명에 관련된 배경기술로는 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0026245호(2017.03.08. 공개)가 있으며, 상기 문헌에는 페릴렌계 화합물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 형광 염료가 기재되어 있다.
본 발명의 목적은 세기 및 광 안정성이 우수한 표지용 염료를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 표지용 염료를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료가 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112018110369823-pat00001
[화학식 2]
Figure 112018110369823-pat00002
여기서,
X는 CR6R7, S, 또는 O이며,
Q는 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 고리가 치환된 폴리메틴이거나, 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 고리가 치환된 폴리엔이고,
상기 R1 내지 R7은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-CO), 알데하이드, 에스터(-COO), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 카르보닐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌옥사이드, -L-X 작용기, -L-Z 작용기 및 하기의 [화학식 3] 내지 [화학식 5] 중 선택되거나, 상기 R1 내지 R7 중에서 선택되는 두 개 이상이 서로 연결되어 축합고리를 형성하며,
상기 L은 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며,
상기 X는 반응성기이며,
상기 Z는 형광 신호를 발생시키는 형광단이며,
상기 R1 내지 R7 중 적어도 하나 이상은 하기의 [화학식 3] 내지 [화학식 5] 중 선택되는 하나이며,
[화학식 3]
Figure 112018110369823-pat00003
[화학식 4]
Figure 112018110369823-pat00004
[화학식 5]
Figure 112018110369823-pat00005
상기 [화학식 3] 내지 [화학식 5]에서,
L1은 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며,
상기 [화학식 3] 및 [화학식 5]에서 L1은 존재 또는 비존재하며,
L2는 C1-C20 알킬렌, 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 C1-C20 헤테로알킬렌이며,
A는 수소 또는 M+ (M+는 카운터 이온)이며,
R은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시 및 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬로부터 선택되며,
R'은 상기 R1 내지 R7 중 적어도 어느 하나에 결합하는 자리를 나타내며,
상기 R 및 R1 내지 R7 중 적어도 하나 이상은 -L-X 작용기이다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 표지용 염료를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명에 따른 표지용 염료는 형광 세기 및 광 안정성 등과 같은 광 특성이 우수하여 생체 분자를 표지하기 위한 키트 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 및 도 2는 D/P ratio가 유사한 항체 결합체(Antibody conjugates)의 각각의 최대흡수파장 및 최대형광파장을 표준화(Normalization)하여 비교한 그래프이다.
도 3은 [화합물 7], Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Goat Anti-Mouse IgG에 대해, D/P ratio에 따른 상대적인 형광 세기를 비교한 그래프이다.
도 4는 [화합물 7], Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Goat anti-Rabbit IgG에 대해, D/P ratio에 따른 상대적인 형광 세기를 비교한 그래프이다.
도 5는 [화합물 7], Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Goat anti- Human IgG에 대해, D/P ratio에 따른 상대적인 형광 세기를 비교한 그래프이다.
도 6은 Alexa Fluor 647 GAM IgG, 화합물7 GAM IgG, background fluorescence에 대하여, 형광발광을 비교한 그래프이다.
도 7은 [화합물 7], Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Goat Anti-Mouse IgG에 대해, Mouse IgG와 항원항체 형성 후, FLISA를 사용하여, D/P ratio에 따른 상대적인 형광 세기를 비교한 그래프이다.
도 8은 형광 광도의 유동 세포 계측 분석을 나타낸 그래프이다.
도 9는 [화합물 7], Alexa Fluor 647, Cy 5 각각의 광퇴색을 비교한 그래프이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성요소를 지칭한다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 표지용 염료 및 이를 포함하는 키트에 관하여 설명하기로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료가 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112018110369823-pat00006
[화학식 2]
Figure 112018110369823-pat00007
여기서, X는 CR6R7, S, 또는 O이며, Q는 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 고리가 치환된 폴리메틴이거나, 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 고리가 치환된 폴리엔이고,
폴리메틴은 단일 결합과 이중 결합이 교대로 결합하여 홀수 개의 메틴 그룹(methine group)으로 구성된 화합물이고, 폴리엔은 짝수 개의 메틴 그룹으로 구성된 화합물이다.
상기 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 고리가 치환된 폴리메틴 또는 폴리엔 내 임의의 탄소는 적어도 하나의 치환기로 치환될 수 있으며, 인접한 치환기는 서로 연결되어 고리를 형성할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 폴리메틴 또는 폴리엔 내 임의의 탄소에 치환된 치환기는 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-CO), 알데하이드, 에스터(-COO), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 카르보닐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌옥사이드, -L-X 작용기, -L-Z 작용기 및 하기의 [화학식 3] 내지 [화학식 5]로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 폴리메틴 또는 폴리엔 내 존재하는 치환기에 의해 하기와 같은화합물이 특정될 수 있다.
첫째, 폴리메틴 또는 폴리엔 내 인접한 치환기가 서로 연결되어 고리를 형성함으로써 [화합물 2], [화합물 11], [화합물 13], [화합물 17] 및 [화합물 28]로 표시되는 표지용 염료를 형성할 수 있다.
둘째, 폴리메틴 또는 폴리엔 내 치환기와 [화학식 1] 또는 [화학식 2]의 R1 내지 R7 중에서 선택되는 치환기가 서로 연결되어 고리를 형성함으로써 [화합물 20], [화합물 21] 및 [화합물 52]로 표시되는 표지용 염료를 형성 수 있다.
셋째, 상술한 첫째 및 둘째 조건을 모두 만족하여 고리를 형성함으로써 [화합물 22] 내지 [화합물 24], [화합물 27], [화합물 46] 내지 [화합물 51] 및 [화합물 53]으로 표시되는 표지용 염료를 형성할 수 있다.
넷째, 상술한 셋째 조건을 만족함과 동시에 [화학식 1] 또는 [화학식 2]의 R2 내지 R5 중에서 선택되는 두 개 이상이 서로 연결되어 축합고리를 형성함으로써 [화합물 25] 및 [화합물 26]로 표시되는 표지용 염료를 형성할 수 있다.
[화학식 1] 또는 [화학식 2]에서 상기 R1 내지 R7은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-CO), 알데하이드, 에스터(-COO), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 카르보닐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌옥사이드, -L-X 작용기, -L-Z 작용기, 하기의 [화학식 3] 내지 [화학식 5] 중 선택되거나, 상기 R1 내지 R7 중에서 선택되는 두 개 이상이 서로 연결되어 축합고리를 형성할 수 있다.
-L-X 작용기 및 -L-Z 작용기에서, 상기 L은 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이고, 상기 X는 반응성기이며, 상기 Z는 형광 신호를 발생시키는 형광단이다.
본원에서 Ca-Cb 작용기는 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는 작용기를 의미한다. 예를 들어, Ca-Cb 알킬은 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는, 직쇄 알킬 및 분쇄 알킬 등을 포함하는 포화 지방족기를 의미한다. 구체적으로, 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 3-메틸부트-1-일, 3-메틸부트-2-일, 2-메틸부트-2-일, 2,2,2-트리메틸에트-1-일, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸일 수 있다.
또한, 본원에서 알콕시는 -O-(알킬)기와 -O-(비치환된 사이클로알킬)기 둘 다를 의미하는 것으로, 하나 이상의 에터기 및 1 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분쇄 탄화 수소이다. 구체적으로, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, sec-부톡시, n-펜톡시, n-헥속시, 1,2-다이메틸부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부틸옥시, 사이클로펜틸옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.　
또한, 본원에서 할로겐은 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br) 또는 요오도(-I)을 의미하며, 할로알킬은 상술한 할로겐으로 치환된 알킬을 의미한다. 예를 들어, 할로메틸은 메틸의 수소 중 적어도 하나가 할로겐으로 대체된 메틸(-CH2X, -CHX2 또는 -CX3)을 의미한다.
본원발명에서 아르알킬은 아릴이 알킬의 탄소에 치환된 형태의 작용기로서, -(CH2)nAr의 총칭이다. 아르알킬의 예로서, 벤질(-CH2C6H5) 또는 페네틸(-CH2CH2C6H5) 등이 있다.
상기 폴리알킬렌 옥사이드는 폴리머의 특성이 유지되는 한도 내에서 필요에 따라 추가적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 상기 치환은 폴리머의 화학적 또는 생물학적 안정성을 증가 또는 감소시키기 위한 화학적 결합일 수 있다. 구체적인 예로서, 폴리알킬렌 옥사이드 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 하이드록시, 알킬 에터(메틸 에터, 에틸 에터, 프로필 에터 등), 카복실메틸 에터, 카복시에틸 에터, 벤질 에터, 다이벤질메틸렌 에터 또는 다이메틸아민으로 치환될 수 있다.
상기 폴리알킬렌 옥사이드는 알킬 에터로 종결되는 폴리알킬렌 옥사이드(mPEG)일 수 있으며, 예를 들어, -(CH2CH2O)nCH3의 화학식으로 표현될 수 있다. 또한, 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 수소로 종결되는 폴리알킬렌 옥사이드(mPEG)일 수 있으며, 예를 들어, -(CH2CH2O)nH의 화학식으로 표현될 수 있다. 에틸렌 글라이콜 반복 단위의 수에 해당하는 n의 크기에 따라 mPEG의 크기가 달라질 수 있다.
상기 -L-X 작용기에 있어서, 상기 L은 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이고, 상기 X는 카복실(carboxyl), 숙신이미딜 에스터(succinimidyl ester), 설포-숙신이미딜 에스터(sulfo-succinimidyl ester), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 말레이미드(maleimide), 할로아세트아마이드(haloacetamide), 하이드라자이드(hydrazide), 바이닐설폰(vinylsulphone), 다이클로로트리아진(dichlorotriazine), 포스포라미다이트(phosphoramidite), 알킬 할라이드(alkyl halide), 아실 할라이드(acyl halide), 카보하이드라자이드(carbohydrazide), 하이드록실아민(hydroxylamine), 케톤(ketone), 알카인(alkyne), 아자이드(azide), 지방족 및 방향족 아민(amine), 설포테트라플루오로페닐 에스터(sulfotetrafluorophenyl ester), 설포다이클로로페닐 에스터(sulfodichlorophenyl ester), 카보닐 아자이드(carbonyl azide), 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride), 설포닐 플루오라이드(sulfonyl fluoride), 보론산(boronic acid), 이소시아네이트(isocyanate), 할로겐-치환 트리아진(halogen-substituted triazine), 할로겐-치환 피리딘(halogensubstituted pyridine), 할로겐-치환 다이아진(halogen-substituted diazine), 테트라플루오로페닐 에스터(tetrafluorophenyl ester), 이미도 에스터(imido ester), 아지도나이트로페닐(azidonitrophenyl), 글리옥살(glyoxal) 및 알데하이드로부터 선택되는 반응성기일 수 있다.
상기 -L-Z 작용기에 있어서, 상기 L은 -L-X 작용기의 L과 동일한 링커이며, 상기 Z는 형광 신호를 발생시키는 형광단이다.
상기 Z는 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridines)으로 표시되는 구조로부터 선택되는 형광단이거나, [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 구조로부터 선택되는 형광단일 수 있다.
본 발명에 따른 표지용 염료는 전술한 반응성기(X)를 통해 타겟 생체 분자와 결합하여 표지하는 것이 가능할 수 있다. 반응성기(X)는 타겟 생체 분자의 아미노기, 이미노기, 티올기 또는 하이드록실기 등과 같은 작용기와 반응할 수 있는 관능기로서, [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료와 타겟 생체 분자 사이에 아미드 결합, 이미드 결합, 우레탄 결합, 에스터 결합 또는 구아니딘 결합과 같은 공유결합을 형성할 수 있다.
아울러, 반응성기(X)는 링커(L)를 매개로 하여 표지용 염료의 본 골격에 결합됨으로써 생체 분자와 표지용 염료 사이의 입체 장애를 완화할 수 있으며, 이에 따라 복잡한 구조를 가지는 핵산, 단백질, 탄수화물 등과 같은 생체 분자에 대한 표지율을 향상시킬 수 있다.
또한, [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료는 카운터 이온을 더 포함하는 구조를 가질 수 있다. 카운터 이온은 유기 또는 무기 음이온으로서 표지용 염료의 용해도 및 안정성 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 표지용 염료의 카운터 이온의 예로서, 포스포릭산 육플루오라이드 이온, 할로겐 이온, 포스포릭산 이온, 과염소산 이온, 과요오드산 이온, 안티몬 육플루오라이드 이온, 주석산 육플루오라이드 이온, 플루오로보릭산 이온 및 사플루오르 이온 등과 같은 무기산 음이온과 티오시안산 이온, 벤젠설폰산 이온, 나프탈렌설폰산 이온, p-톨루엔설폰산 이온, 알킬설폰산 이온, 벤젠카르복실산 이온, 알킬카르복실산 이온, 삼할로알킬카르복실산 이온, 알킬설폰산 이온, 트라이할로알킬설폰산 이온, 및 니코틴산 이온 등과 같은 유기산 이온이 있다. 또한, 비스페닐디톨, 티오비스페놀 킬레이트 및 비스디올-α-디켄톤 등과 같은 금속 화합물 이온, 소듐 및 포타슘 등과 같은 금속 이온과 4차 암모늄 염도 카운터 이온으로서 선택될 수 있다.
[화학식 1] 또는 [화학식 2]에 있어서, R1은 하기의 [화학식 3] 내지 [화학식 5]로부터 선택되거나, R2 내지 R5 중 적어도 하나 이상은 하기의 [화학식 3] 내지 [화학식 5]로부터 선택되거나, R6 및 R7 중 적어도 하나 이상은 하기의 [화학식 3] 내지 [화학식 5]로부터 선택될 수 있다.
[화학식 3]
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[화학식 4]
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[화학식 5]
Figure 112018110369823-pat00010
[화학식 3] 내지 [화학식 5]에서, L1은 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이다. [화학식 3] 및 [화학식 5]에서 L1은 존재 또는 비존재하고, [화학식 4]에서 L1은 존재한다.
L2는 C1-C20 알킬렌, 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 C1-C20 헤테로알킬렌이다. A는 수소 또는 M+ (M+는 카운터 이온)이다. R은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시 및 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬로부터 선택되며, R'은 상기 R1 내지 R7 중 적어도 어느 하나에 결합하는 자리를 나타내며, 상기 R'은 Q에도 결합할 수 있다.
또한, [화학식 1] 또는 [화학식 2]에서, R 및 R1 내지 R7 중 적어도 하나 이상은 적어도 하나의 -L-X 작용기일 수 있다. 상기 L은 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이고, 상기 X는 반응성기일 수 있다.
R2 내지 R5 중에서 선택되는 두 개 이상은 서로 연결되어 축합고리를 형성할 수 있다.
축합고리는 치환 또는 비치환된 지방족의 축합고리, 치환 또는 비치환된 방향족의 축합고리, N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 치환 또는 비치환된 지방족 헤테로의 축합고리, N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 치환 또는 비치환된 방향족 헤테로의 축합고리, 치환 또는 비치환된 지방족 고리와 방향족 고리의 축합고리, 치환 또는 비치환된 N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 지방족 헤테로고리와 N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 방향족 헤테로고리의 축합고리, 치환 또는 비치환된 탄화수소 고리와 N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 헤테로의 고리와의 축합고리 또는 C60-C84의 치환 또는 비치환된 플러렌일 수 있다.
축합고리는 두 개 또는 그 이상의 고리가 두 개 또는 그 이상의 원자를 공유한 형태의 고리 모양 구조를 의미한다. 지방족의 축합고리로는 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 사이클로헵탄, 사이클로옥탄 및 사이클로헥산디온 등이 있으며, 방향족 축합고리로는 나프탈렌, 안트라센, 페난트릴, 트리페닐렌, 플루오란텐, 파이렌, 페릴렌, 크라이센, 아세나프탈렌, 플루오렌, 또는 테트라센 등이 있다.
또한, 상기 N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 지방족 헤테로 축합고리로는 피페리딘, 테트라하이드로티오피란, 테트라하이드로피란, 디옥산, 피롤리딘, 테트라하이드로퓨란 및 테트라하이드로티오펜 등이 있으며, N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 방향족 헤테로 축합고리로는 퀴놀린, 신놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 프탈라진, 나프티리딘, 페난트롤린, 아크리딘, 카바졸, 디벤조퓨란, 벤조이미다졸, 디벤조티오펜, 벤조티오펜, 벤조퓨란, 벤조티아디아졸, 피리도피리미딘, 피리도피라진, 피라지노피라진, 이소퀴놀린, 인돌, 벤조옥사졸, 벤조티아졸, 벤조카바졸, 벤조티아졸, 또는 페노티아진 등이 있다.
또한, 축합고리의 임의의 탄소는 [화학식 3] 내지 [화학식 5] 중 선택되는 어느 하나와 결합될 수 있다.
또한, 축합고리는 하기의 [화학식 6]과 같이 추가적으로 1개 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 하기 [화학식 6]은 [화학식 1]의 R2 내지 R5 중에서 선택되는 두 개 이상이 서로 연결되어 축합고리를 형성하고, 치환기 R11 내지 R18가 포함된 구조를 나타낸 것이다.
[화학식 6]
Figure 112018110369823-pat00011
여기서, X는 CR6R7, S 또는 O 로부터 선택되며, R11 내지 R18은 [화학식 1] 또는 [화학식 2]에서 표시되는 R1 내지 R5에 대한 정의와 동일하며, R1, R6, R7, R11 내지 R18 중 적어도 하나 이상은 [화학식 3] 내지 [화학식 5] 중 선택되는 하나일 수 있다. [화학식 3] 내지 [화학식 5]에 대한 정의는 상술한 바와 같다.
또한, [화학식 6]에서 인접하는 치환기는 서로 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 방향족고리, N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 지방족 헤테로고리, 또는 N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 방향족 헤테로고리를 형성하거나, 동일 탄소 내의 치환기는 스피로 결합, 카보닐기, 치환 또는 비치환된 이민기 또는 치환 또는 비치환된 알케닐기를 형성할 수 있다.
본원발명에 따른 상기 [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료의 구체적인 예는 다음과 같다.
[화합물 1]
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[화합물 2]
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[화합물 3]
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[화합물 4]
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[화합물 5]
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[화합물 6]
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[화합물 7]
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[화합물 8]
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[화합물 9]
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[화합물 10]
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[화합물 11]
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[화합물 12]
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[화합물 13]
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[화합물 14]
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[화합물 15]
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[화합물 16]
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[화합물 17]
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[화합물 18]
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[화합물 19]
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[화합물 20]
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[화합물 21]
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[화합물 22]
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[화합물 23]
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[화합물 24]
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[화합물 25]
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[화합물 26]
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[화합물 27]
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[화합물 28]
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[화합물 29]
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[화합물 30]
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[화합물 31]
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[화합물 32]
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[화합물 33]
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[화합물 34]
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[화합물 35]
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[화합물 36]
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[화합물 37]
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[화합물 38]
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[화합물 39]
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[화합물 40]
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[화합물 41]
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[화합물 42]
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[화합물 43]
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[화합물 44]
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[화합물 45]
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[화합물 46]
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[화합물 47]
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[화합물 48]
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[화합물 49]
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[화합물 50]
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[화합물 51]
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[화합물 52]
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[화합물 53]
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본 발명에 따른 [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료는 생체 분자와 결합하여 형광 신호를 나타낼 수 있다.
상기 생체 분자는 항체, 지질, 단백질, 펩타이드, 탄수화물 및 핵산(뉴클레오티드 포함)으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
지질의 구체적인 예로는 지방산(fatty acids), 인지질(phospholipids), 리포폴리당류(lipopolysaccharides) 등이 있으며, 탄수화물의 구체적인 예로는 단당류, 이당류, 다당류(예를 들어, 덱스트란)을 포함한다.
상기 생체 분자는 [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료의 임의의 작용기 또는 상기 표지용 염료에 결합된 반응성기와 반응하기 위한 작용기로서, 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하거나 이의 유도체 형태를 가질 수 있다.
또한, 생체 분자는 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하거나 이의 유도체 형태를 가지는 옥시 또는 디옥시 폴리핵산일 수 있다.
아울러, 본 발명의 [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료는 상술한 생체 분자 이외에 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 약물, 호르몬(수용체 리간드 포함), 수용성 비타민, 지용성 비타민, 무기염류, 수용체, 효소 또는 효소 기질, 세포, 세포막, 독소, 미생물 또는 나노 바이오 소재(폴리스타이렌 마이크로스피어 등) 등을 표지하기 위해 사용될 수 있다.
여기서, 수용성 비타민은 비타민 B군, 비타민 C, 판토텐산, 나이아신, 엽산, 비오틴 및 이노시톨 등을 포함하며, 지용성 비타민은 비타민 A, 비타민 E, 비타민 D 및 비타민 K 등을 포함할 수 있다. 또한, 무기염류로는 산칼슘, 제일인산칼슘, 제이인산칼륨, 염화칼륨, 제이인산마그네슘, 탄산수소나트륨, 산화아연, 피로인산제이철, 황산망간 및 요오드칼륨 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서는 상기 표지용 염료를 포함하는 표지용 키트를 제공한다. 필요에 따라, 표지용 키트는 타겟 분자와의 반응을 위한 효소, 용매(완충액 등) 및 기타 시약 등을 더 포함할 수 있다. 용매로는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아미드, 다이클로로메탄, 메탄올, 에탄올 및 아세토나이트릴로부터 선택되는 유기 용매 또는 물 등이 사용될 수 있으며, 용매의 종류에 따라 표지용 염료에 다양한 작용기를 도입함으로써, 용해도를 조절하는 것이 가능하다.
표지용 염료를 이용한 생체 분자의 표지(label) 방법
본 발명의 [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료로 생체 분자를 표지하는 방법으로는 표지된 고체 또는 반고체 상태의 생체 분자의 형광을 측정하는 표지 방법이 가능한 모든 생체 분자의 표지에 적용될 수 있다.
종래의 형광 염료 대신 [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료룰 사용함으로써, 고감도로 화학적으로 안정적이고 조작성이 뛰어난 표지 방법을 제공할 수 있다.
DNA 마이크로어레이법
DNA 마이크로어레이법은 표지해야 할 표적 핵산에 표지용 염료를 반응(즉, 염료가 표적 핵산 내 인터컬레이션)시켜 표지하는데, 이 때 표적 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 가지는 단일사슬의 프로브 핵산을 준비하고, 단일사슬로 변성시킨 표적 핵산과 프로브 핵산을 기판 위에서 혼성화한 후, 형광 염료가 표적 핵산 내로 인터컬레이션되도록 함으로써 형광 신호를 발생시킬 수 있다.
본 표지 방법에서 기판에 고정하는 프로브 핵산으로는, 유전자의 발현을 조사하는 경우, cDNA 등의 cDNA의 라이브러리, 게놈의 라이브러리 또는 모든 게놈을 주형(鑄型)으로 하여 PCR법에 의해 증폭하여 조제한 것을 사용할 수 있다.
또한, 유전자의 변이 등을 조사하는 경우, 표준이 되는 이미 알려진 서열을 근거로 하여, 변이 등에 대응하는 여러가지 올리고뉴클레오티드를 합성한 것을 사용할 수 있다.
프로브 핵산을 기판 위에 고정하는 것은, 핵산의 종류나 기판의 종류에 따라 적당한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, DNA의 전하를 이용하여, 폴리리신 등의 양이온으로 표면처리한 기판에 정전 결합시키는 방법을 이용할 수도 있다.
PCR 법
PCR 법은 표지해야 할 표적 핵산의 염기서열에 상보적인 프로브를 염료로 표지하고, 표적 핵산의 증폭에 앞서 혹은 증폭시킨 후에 표적 핵산과 프로브를 반응시켜, 표적 핵산의 형광을 측정한다.
구체적으로는, 표적 핵산의 신장반응은 효소(DNA 중합효소, RNA 중합효소)에 의해 이루어지며, 이 때 표적 핵산과 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머가 형성한 이중사슬 핵산서열을 효소가 인식하여, 인식한 위치로부터 신장반응이 이루어지고, 목적으로 하는 유전자 영역만을 증폭시킨다.
효소가 합성을 할 때, 뉴클레오티드(dNTP, NTP)를 원료로 하여 합성반응이 이루어진다.
이 때, 통상의 뉴클레오티드(dNTP, NTP)에 염료를 가지는 뉴클레오티드를 임의의 비율로 혼합하면, 그 비율의 염료가 도입된 핵산을 합성할 수 있다. 또한, PCR에 의해 임의의 비율로 아미노기를 가지는 뉴클레오티드를 도입한 후에 표지용 염료를 결합하여, 표지용 염료가 도입된 핵산을 합성할 수도 있다.
효소가 합성을 할 때 뉴클레오티드를 원료로 합성반응이 이루어지는데, 이 때의 뉴클레오티드의 3'의 OH를 H로 바꾼 것을 사용한 경우, 더 이상 핵산의 신장반응이 이루어지지 않고, 그 시점에서 반응이 종료한다. 이 뉴클레오티드, ddNTP (dideoxy nucleotide triphospate)는 터미네이터라고 불린다. 통상의 뉴클레오티드에 터미네이터를 섞어 핵산을 합성하면, 일정한 확률로 터미네이터가 도입되어 반응이 종료하기 때문에, 여러가지 길이의 핵산이 합성된다.
이것을 겔 전기영동에 의해 크기 분리하면, 길이의 순번마다 DNA가 늘어서게 된다. 여기서, 터미네이터의 각 염기의 종류마다 다른 표지용 염료로 표 지해두면, 합성반응의 종점(3' 말단)에는 각 염기에 의존한 경향이 관찰되어, 터미네이터에 표지한 표지용 염료를 기점으로 형광정보를 읽어냄으로써, 그 표적 핵산의 염기서열 정보를 얻을 수 있다. 또한, 터미네이터 대신에 미리 표지용 염료로 표지한 프라이머를 사용하여 표적 핵산과 혼성화할 수도 있다. 또한, 프로브로서 PNA(펩티드 핵산)를 사용할 수도 있다. PNA는 핵산의 기본 골격 구조인 오탄당·인산골격을, 글리신을 단위로 하는 폴리아미드 골격으로 치환한 것으로, 핵산과 많이 닮은 3차원 구조를 가지고, 상보적인 염기서열을 가지는 핵산에 대하여 매우 특이적이며 강력하게 결합한다. 이를 통해, ISH(in-situ hybridization)법 등 기존의 DNA 해석방법 뿐만 아니라, 텔로미어(telomere, 말단소립) PNA 프로브에 응용함으로써, 텔로미어 연구의 시약으로서 사용할 수도 있다.
표지에는 예를 들어, 이중사슬 DNA를, DNA의 염기서열의 전부 또는 일부에 상보적인 염기서열을 가지며 표지용 염료로 표지된 PNA와 접촉시켜 혼성화하고, 그 혼합물을 가열하여 단일사슬 DNA를 생성하며, 혼합물을 천천히 실온까지 냉각하여 PNA-DNA 복합체를 조제하고, 그 형광을 측정함으로써 진행할 수 있다.
상기 예에서는 표적 핵산을 PCR법에 의해 증폭시켜 생성물의 형광을 측정하는 방법에 대하여 설명하였지만, 이 방법에서는 전기영동으로 생성물의 크기를 확인하고, 그 후 형광 강도를 측정함으로써 증폭생성물의 양을 조사할 필요가 있다. 이를 위해, 형광 염료의 에너지 트랜스퍼를 이용하고, PCR법의 생성물에 혼성화시킴으로써 형광이 발생하도록 고안된 프로브를 사용하여, 실시간으로 생성물의 양을 측정할 수도 있다. 예를 들어, 도너와 억셉터를 표지한 DNA를 사용할 수 있다. 구체적인 표지 방법으로는 특정 서열의 핵산의 존재를 확인하는 분자비콘법이나 TaqMan-PCR법이나 사이클링 프로브(cycling probe)법 등을 들 수 있다.
기타 표지 방법
또한, 본 발명의 표지용 염료를 이용하여, 세포 내 신호 전달(signaling) 현상을 관찰할 수도 있다. 내부 신호 전달 또는 이에 따른 세포의 반응에는 다양한 효소 등이 관여하고 있다. 대표적인 신호 전달 현상에서는 특수한 단백질 인산화효소(protein kinase)가 활성화되며, 이에 따라 단백질의 인산화가 유도되어 신호 전달의 개시되는 것으로 알려져 있다. 뉴클레오티드(예를 들어, ATP 또는 ADP)의 결합과 가수분해는 이들의 활성에 중대한 역할을 하고 있으며, 뉴클레오티드 유도체에 표지용 염료를 도입함으로써, 세포 내 신호 전달 현상을 고감도로 관찰할 수 있다.
또한, 본 발명의 표지용 염료를 RNA 간섭작용(RNAi)을 이용한 유전자 발현 현상의 관찰에 이용할 수도 있다. RNAi는 이중사슬 RNA (dsRNA)를 세포에 도입함으로써, 표적 유전자의 mRNA를 분해하여 발현을 억제하는 것으로서, 설계된 dsRNA를 표지용 염료로 표지함으로써 RNAi 현상을 관찰하는 것이 가능하다.
이하에서는 본 발명에 따른 구체적인 표지용 염료의 합성 방법과 실시예 및 비교 실험을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
제조예
1) [화합물 7]의 제조
Figure 112018110369823-pat00065
ammonium 2-aminoethane-1,1-disulfonic acid hydrate 7.7g, 1 (WO 2003/074091 A2) 12.1g, EDC.HCl(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, HCl) 8.0g, HOBt(1-hydroxybenzotriazole) 5.6g를 디메틸폼아마이드(DMF) 77ml에 투입하고 상온에서 24시간 동안 교반시켰다. 이후, 이를 감압 농축시키고 에틸렌 아세테이트로 고체를 석출시켰다. 석출된 고체는 여과하고 진공 건조하여 2를 제조하였다(4.0g, 21.6%).
반응기에 2 (4.0g)와 말론알데하이드 다이아닐라이드 하이드로클로라이드(malonaldehyde dianilide hydrochloride) 1.9g을 투입하고, 아세트산(acetic acid)과 아세트산무수물(acetic anhydride)을 각각 20ml씩 투입한 후 110℃로 환류하여 6시간 교반시켰다. 이 후, 냉각 후 감압 농축시키고 에틸 아세테이트로 고체를 석출시켰다. 석출된 고체를 여과하고 진공 건조시켜 3 (4.6g, 87.1%)을 제조하였다.
반응기에 3 (3.6g), 5 (US 7927830 B2) 2.5g, 트리에틸아민(triethyl amine) 10.8ml, 아세트산 무수물(acetic anhydride) 10.8ml를 투입하고 60℃ 에서 6시간 동안 교반한다. 상온으로 식힌 후 에틸 아세테이트에 드랍와이즈하였다. 석출된 고체를 필터한 후 MPLC 정제하여 화합물 7을 제조하였다(640mg, 9.01%).
2) [화합물 4]의 제조
Figure 112018110369823-pat00066
상기 2의 제조 방법과 동일한 방법으로 제조한 6 및 7(WO 2012/027623 A2)을 사용하여 반응시키고, 역상 크로마토그래피 및 이온교환수지를 이용하여, 화합물 4(WO 2012/027623 A2)를 제조하였다(121mg, 11.9%).
3) [화합물 3]의 제조
Figure 112018110369823-pat00067
화합물4의 제조 방법에서, 2,3,3-트리메틸인돌-5-술폰산 대신 2-메틸-1,3-벤조옥사졸-6-술폰산을 원료로 사용하여 화합물 3을 제조하였다(154mg, 15.4%).
4) [화합물 23]의 제조
Figure 112018110369823-pat00068
8 (US2003-0224391) 269mg, ammonium 2-aminoethane-1,1-disulfonic acid hydrate 200mg, EDC.HCl(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, HCl) 108mg, HOBt(1-hydroxybenzotriazole) 76mg을 디메틸폼아마이드(DMF) 10ml에 투입하고 상온에서 12시간 동안 교반시켰다. 이후, 이를 감압 농축시키고 에틸렌 아세테이트로 고체를 석출시켰다. 석출된 고체에 대해 역상 크로마토그래피를 사용하여 화합물 23을 제조하였다(110mg, 32.4%).
5) [화합물 30]의 제조
Figure 112018110369823-pat00069
상기 2의 제조방법에서 2,3,3-트리메틸인돌-5-술폰산 대신 6-(2,3-디메틸-5-설포-3H-인돌-3-일)헥사노익 에시드를 원료로 사용하여 제조한 9 및 10 (Journal of the American Chemical Society, 137(14), 4759-4765; 2015)을 사용하여 반응시키고(WO 2014/035712 A1), 역상 크로마토그래피 및 이온교환수지를 이용하여, 화합물 30을 제조하였다(57mg, 9.3%).
6) [화합물 5]의 제조
화합물 7의 제조 방법에서, 말론알데하이드 다이아닐라이드 하이드로클로라이드(malonaldehyde dianilide hydrochloride) 대신 N,N-다이페닐포름아미딘(N,N-diphenylformamidine)을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 화합물 5를 제조하였다(308mg, 16.2%).
7) [화합물 10]의 제조
화합물 7의 제조 방법에서, 말론알데하이드 다이아닐라이드 하이드로클로라이드(malonaldehyde dianilide hydrochloride) 대신 glutaconaldehydedianil hydrochloride을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 화합물 10을 제조하였다(57mg, 9.7%).
8) [화합물 6]의 제조
Figure 112018110369823-pat00070
Chem. Eur. J. 2017, 23, 3966 -3978을 참고하여 11, 16을 제조하여 사용하고, 화합물 7의 제조 방법에서, 말론알데하이드 다이아닐라이드 하이드로클로라이드(malonaldehyde dianilide hydrochloride) 대신 N,N-다이페닐포름아미딘(N,N-diphenylformamidine)을, 1,3-프로판설톤(1,3-propane sultone) 대신 1,4-부탄설톤(1,4-butane sultone)을 사용하고 이온교환수지를 이용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 화합물 6을 제조하였다(105mg, 8.3%).
9) [화합물 18]의 제조
1,1,2-trimethyl benzo[e]indole hydrochloride을 사용하여 WO 2003/074091 및 화합물 7의 제조방법과 동일한 방법으로 화합물 18을 합성하였다(200mg, 9.7%).
10) [화합물 11]의 제조
Figure 112018110369823-pat00071
상기 2의 제조 방법과 동일한 방법으로 제조한 18을 사용하여 Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 168 (2004) 53-57와 동일한 방법으로 반응 후 이온교환 수지를 이용하여 화합물 11을 제조하였다(60mg, 27.5%).
11) [화합물 43]의 제조
Figure 112018110369823-pat00072
화합물 7에 N,N,N,N-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트 (1.5eq), 트리에틸아민 (1.5eq),디메틸포름아미드 5mL를 투입하고, 상온에서 교반하였다. 12시간 후, 디에틸에테르를 투입하여, 침전시킨 후, 여과하여 얻어진 고체에 대해 이온교환 및 역상컬럼크로마토그래피로 화합물 43을 정제하였다 (3.7 mg, 76.2 %).
12) [화합물 44]의 제조
Figure 112018110369823-pat00073
화합물 43, 프로파르길아민 (1.5eq), 트리에틸아민(1.5eq), 디메틸포름아미드 4.3mL 를 투입하고, 상온에서 교반하였다. 5시간 후, 디에틸에테르를 투입하여, 침전시킨 후, 여과하여 얻어진 고체에 대해 이온교환 및 역상컬럼크로마토그래피로 화합물 44를 정제하였다(2.7 mg, 81.3 %).
13) [화합물 45]의 제조
Figure 112018110369823-pat00074
화합물 43, N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트 염 (1.5eq), 트리에틸아민(1.5eq), 디메틸포름아미드 4.3mL 를 투입하고, 상온에서 교반하였다. 16시간 후, 디에틸에테르를 투입하여, 침전시킨 후, 여과하여 얻어진 고체에 대해 이온교환 및 역상컬럼크로마토그래피로 화합물 45를 정제하였다(1.9 mg, 67.9 %).
14) [화합물 52]의 제조
Figure 112018110369823-pat00075
19 (KR　2017-008700) 244mg, ammonium 2-aminoethane-1,1-disulfonic acid hydrate 200mg, EDC.HCl(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, HCl) 108mg, HOBt(1-hydroxybenzotriazole) 76mg을 디메틸폼아마이드(DMF) 10ml에 투입하고 상온에서 12시간 동안 교반시켰다. 이후, 이를 감압 농축시키고에틸렌 아세테이트로 고체를 석출시켰다. 석출된 고체에 대해 역상 크로마토그래피를 사용하여 화합물 52를 제조하였다(170mg, 51.3%).
14) 팔로이딘-염료 컨쥬게이트의 제조
DMF(200 μL), 아미노팔로이딘(1 mg)과 화합물 5의 석신이미딜 에스터 유도체(1.5eq)에 N,N-다이아이소프로필에틸아민(3eq)을 추가하고 혼합물을 밤새 실온 교반하였다. 용액은 진공 하에 농축 건조시키고 잔류물은 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 제품은 고정 세포 제조에서의 F-액틴 필라멘트를 효과적으로 염색한다.
15) 아미노덱스트란-염료 컨쥬게이트의 제조
0.1M 중탄산 나트륨(400 μL) 중 평균 13의 아미노기를 갖는 70000 MW 아미노덱스트란 용액에 화합물 43을 첨가하여 약 12의 염료/덱스트란을 수득하였다. 6 시간 후 컨쥬게이트를 물을 용리액으로 하는 SEPHADEX G-50으로 정제하였다.
16) 뉴클레오타이드-염료 컨쥬게이트의 제조
H2O (100 μL) 중 5-(3-아미노알릴)-2-디옥시우리딘 5'-트리포스페이트 용액에 DMF (2 mg, 시그마) 와 트리에틸아민(5 μL) 중의 화합물 1의 석신이미딜 에스터 유도체를 추가하였다. 혼합물은 3 시간 동안 실온에서 교반 후 진공하에 농축건조시켰다. 잔류물은 HPLC로 정제하였다. 생성물 분획물을 동결건조시켜 진한 파랑색 뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 수득하였다.
17) 올리고뉴클레오타이드-염료 컨쥬게이트의 제조
H2O (4 μL)중 5'-amine-변형된 18-베이스 M13 프라이머 시퀀스(100 μg)를 0.1M 붕산나트륨 pH=8.5 완충액(200 μL)중의 화합물 36 (500 μg)의 용액에 추가하였다. 혼합물은 밤새 실온에서 교반하고, 3 볼륨의 차가운 에탄올을 추가하였다. 혼합물을 -20℃로 냉각시키고, 원심 분리하여 상등액을 분리하고, 펠릿은 에탄올로 헹구고 나서 H2O(100 μL)에 용해시킨다. 표지된 올리고뉴클레오타이드는 HPLC로 정제하였다. 원하는 피크를 수집하고 증발시켜 형광성 올리고뉴클레오타이드를 수득하였다.
18) β-갈락토시다아제의 표지
β-갈락토시다아제를 PBS 완충액(200 μL에서 1 mg )에 넣고, DMF (100 μL)중 화합물 45(5 mg)용액으로 처리하였다. 반응성을 보이지 않는 염료는 원심분리하여 제거하였다.
실험예
실험예 1
제조예에서 얻어진 [화합물 7]에 대하여 광물리적 특성을 평가하고, 이를 하기 [표 1]에 나타내었다. 최대 흡수 파장(λabs, max), 최대 형광 파장(λPL, max), 몰 흡광계수(ε at λmax) 및 양자효율(Φ)을 각 용매별로 측정하였다. 측정은 DMSO, 에탄올(EtOH), 메틸렌클로라이드(MC), 물(water) 및 PBS에서 수행되었으며, 측정 결과는 하기의 표 1에 나타내었다.
구분 DMSO EtOH MC Water PBS
λabs, max/
ε at λmax 		656/
201,000		 656/
232,000		 666/
155,000		 650/
227,000		 650/
230,000
λPL, max/
Φ		 685/
0.623		 682/
0.483		 685/
-		 670/
0.261		 669/
0.315
상기 [표 1]에 기재된 바와 같이, 본 발명의 [화합물 7]은 다양한 용매에 용해되어 높은 흡광계수를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
실험예 2
Goat Anti-Mouse IgG를 0.1M sodium bicarbonate buffer로 희석하여 1mg/ml protein solution을 제조한 후 5개의 튜브에 각각 125μl씩 protein solution을 담았다. 제조된 화합물 7을 포함하는 Dye solution (5mg/ml)을 1, 2, 3, 4, 5 μl씩 준비된 튜브에 담고 바로 vortex 시켰다. 이어서, 상온에서 locker에 30분 동안 흔들어 준 후 Amicon centrifuge filter에 반응 용액을 담았다. Centrifuge로 free dye가 제거될 때까지 PBS로 여과시켰다(14000rpm, 10분, 5회).
Amicon tube에 centrifuge filter를 뒤집어 결합한 뒤 여액을 회수한 후(1000rpm, 2분), PBS 1 ml로 희석시킨 다음 UV, PL 및 microplate reader로 fluorescence를 측정하였다.
단백질에 대한 염료의 비율은 하기의 식을 사용하여 결정했다.
Figure 112018110369823-pat00076
Adye : 라벨링한 후 염료의 최대흡수 파장에서의 흡광도
A280 : 280nm에서의 흡광도
Eprot : 280nm에서의 단백질의 몰흡광계수(IgG의 경우 210,000)
Edye : 최대흡수 파장에서의 염료의 몰흡광계수
X : 280nm에서의 흡광도 / 화합물2의 최대흡수 파장에서의 흡광도
도 1 및 도 2는 D/P ratio가 유사한 항체 결합체(Antibody conjugates)의 각각의 최대흡수파장 및 최대형광파장을 표준화(Normalization)하여 비교한 그래프이다.
도 1을 참조하면, [화합물 7]을 라벨링(labeling)한 항체 결합체(Antibody conjugate)가 Alexa Fluor 647, Cy 5를 라벨링한 Conjugate와 최대흡수파장이 유사함을 알 수 있다. 또한, H band로 부터 [화합물 7]이 Alexa Fluor 647, Cy 5 를 라벨링한 Conjugate보다 상대적으로 응집(Aggregation) 정도가 더 작음을 확인할 수 있다.
도 2를 참조하면, [화합물 7]을 라벨링(labeling)한 항체 결합체(Antibody conjugate)가 Alexa Fluor 647, Cy 5를 라벨링한 Conjugate와 최대형광파장이 유사함을 알 수 있다.
도 3은 [화합물 7], Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Goat Anti-Mouse IgG에 대해, D/P ratio에 따른 상대적인 형광 세기를 비교한 그래프이다.
도 3을 참조하면, 화합물 7]을 라벨링한 항체 결합체(Antibody Conjugate)의 경우, D/P ratio 약 5에서 형광세기가 최대임을 알 수 있다. 또한, D/P ratio 3 이상부터 Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Antibody Conjugate 보다 [화합물 7]을 라벨링한 항체 결합체(Antibody Conjugate)가 형광세기가 훨씬 더 큰 것을 확인하였다.
전술한 실험예 2)에서 Goat Anti-Mouse IgG 대신에 Goat anti-Rabbit IgG을 사용하여 동일한 방법으로 실험하였다.
도 4는 [화합물 7], Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Goat anti-Rabbit IgG에 대해, D/P ratio에 따른 상대적인 형광 세기를 비교한 그래프이다.
도 4를 참조하면, [화합물 7]을 라벨링한 항체 결합체(Antibody Conjugate)의 경우, D/P ratio 약 4에서 형광세기가 최대임을 알 수 있다. 또한, Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Antibody Conjugate 보다 [화합물 7]을 라벨링한 항체 결합체(Antibody Conjugate)가 형광세기가 훨씬 더 큰 것을 확인하였다.
전술한 실험예 2)에서 Goat Anti-Mouse IgG 대신에 Goat anti-Human IgG을 사용하여 동일한 방법으로 실험하였다.
도 5는 [화합물 7], Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Goat anti- Human IgG에 대해, D/P ratio에 따른 상대적인 형광 세기를 비교한 그래프이다.
도 5를 참조하면, [화합물 7]을 라벨링한 항체 결합체(Antibody Conjugate)의 경우, D/P ratio 약 8에서 형광세기가 최대임을 알 수 있다. 또한, Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Antibody Conjugate 보다 [화합물 7]을 라벨링한 항체 결합체(Antibody Conjugate)가 형광세기가 더 큰 것을 확인하였다.
도 6은 Alexa Fluor 647 GAM IgG, 화합물 7 GAM IgG, background fluorescence에 대하여, 형광발광을 비교한 그래프로, 실험예 2)에 따른 방법으로 형광을 측정하였다.
도 6을 참조하면, 화합물7 GAM 컨쥬게이트가 Alexa Fluor 647 GAM 컨쥬게이트보다 훨씬 밝은 것을 입증했다.
실험예 3
IgG from Mouse Serum(primary)을 coating buffer에 녹여 10 ug/ml을 제조한 다음 FLISA H/B black corning plate에 100 ㎕씩 well에 나누어 담은 후 Top sealing하여 상온에서 2시간 동안 암실에서 Incubation하였다. 이어서, Washing buffer를 300 ㎕씩 well에 담고 3회 washing하고, blocking buffer를 300 ㎕씩 well에 담고 top sealing 후 암실에서 상온 1시간 동안 incubation하였다. 다음, blocking buffer를 제거 후 washing buffer로 3회 washing하고, Dye가 conjugation된 secondary antibody(10ug/ml)를 100 ㎕씩 담고 Top sealing 후 암실에서 상온1 시간 동안 incubation하였으며, 용액제거 후 washing buffer를 200 ㎕씩 담고 5회 washing하였다. 이어서, 샘플이 담긴 well에 PBS를 100 ㎕씩 담은 후 microplate reader로 fluorescence를 측정하였다.
도 7은 [화합물 7], Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Goat Anti-Mouse IgG에 대해, Mouse IgG와 항원항체 형성 후, FLISA를 사용하여, D/P ratio에 따른 상대적인 형광 세기를 비교한 그래프이다.
도 7을 참조하면, ([화합물 7])을 라벨링한 항체 결합체(Antibody Conjugate)의 경우, D/P ratio 약 4에서 형광세기가 최대임을 알 수 있다. 또한, D/P ratio 3 이상부터 Alexa Fluor 647, Cy 5를 각각 라벨링한 Antibody Conjugate 보다 [화합물 7]을 라벨링한 항체 결합체(Antibody Conjugate)가 형광세기가 훨씬 더 큰 것을 확인하였다.
실험예 4
림프구(Lymphocytes)는 na
Figure 112018110369823-pat00077
ve C57BL/6 mouse (5주령)의 비장(spleen)에서 얻었다. 메탈 스크린 위에 비장을 올려놓은 후 플런저(plunger)로 비장을 mash up하여 0.83% ammonium chloride로 2분간 적혈구(red blood cell)을 용해시켰다. 이후 1% 태아소 혈청(Fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토 마이신(penicillin/streptomycin)이 포함되어 있는 Hyclone??RPMI 1640 (GE Healthcahre life science)에 분산시켜 현탁액(suspension)을 제조하였다.
분리된 림프구는 1 x10^6 세포(cells)당 Biotinylated Anti-mouse CD8 항체(antibody) (biolegend) ratio (1: 400) 로 4℃에서 차광된 상태에서 30분간 염색되었다. 이후, Control Streptavidin-APC (1:1,000), SA-Cy5®(동일비율), SA-Alexa fluor® 647(동일비율), SA-화합물 7(동일비율)로 동일한 조건(4℃, 차광된 상태)에서 30분간 염색되었다. 염색된 세포는 FACS buffer (3% FBS, 0.1 % sodium azide in PBS)에 분산시켜 현탁액(suspension)을 제조하여 유동 세포 계측법(flow cytometry)으로 분석하였다.
도 8은 형광 광도의 유동 세포 계측 분석을 나타낸 그래프이다.
도 8을 참조하면, SA-Cy5®(DOL = 8.78), SA-Alexa fluor® 647(DOL = 6.70), SA-화합물7((DOL = 6.38) 중에서 SA-화합물 7은 SA-Cy5보다 10배 이상 밝았고, SA-Alexa fluor 647 보다 좀 더 밝았으며, SA-화합물7이 가장 밝은 것을 확인할 수 있다.
실험예 5
Cy5®, Alexa Fluor® 647, 화합물 7 각각의 3uM (in PBS buffer, pH 7.4)에 대해 16 시간 동안 지속적으로 빛을 조사하며, UV 스펙트럼을 측정하였다(Lumencor®사제품이용, white source, intensity10%). 초기 Absorbance Intensity를 표준화(Normalizatio)하여 비교하였다.
도 9는 [화합물 7], Alexa Fluor 647, Cy 5 각각의 광퇴색을 비교한 그래프이다.
도 9를 참조하면, 세 dye 모두 시간이 지남에 따라, 초기 흡광도(Absorbance Intensity)가 감소하는 경향을 보였으나, 시간에 따른 흡광도 (Absorbance Intensity) 감소 정도을 비교했을 때, 화합물 7이 Cy5보다 감소 정도가 훨씬 작아 우수하며, Alexa Fluor 647보다 동등이상 수준임을 확인하였다.
실험예 6
제조예에서 얻어진 [화합물 10]에 대하여 광물리적 특성을 평가하고, 이를 하기 [표 2]에 나타내었다. 최대 흡수 파장(λabs, max), 최대 형광 파장(λPL, max) 및 몰 흡광계수(ε at λmax)를 각 용매별로 측정하였다. 측정은 DMSO, 에탄올(EtOH), 메틸렌클로라이드(MC), 물(water) 및 PBS에서 수행되었으며, 측정 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.
구분 DMSO EtOH MC Water PBS
λabs, max/
ε at λmax 		770/
176,000		 758/
205,000		 772/
152,000		 750/
204,000		 750/
202,000
λPL, max 799 789 796 778 778
상기 [표 2]에 기재된 바와 같이, 본 발명의 [화합물 10]은 다양한 용매에 용해되어 높은 흡광계수를 나타낼 뿐만 아니라, 최대 흡수 파장과 최대 형광 파장이 각각 700 nm 이상에서 나타나는 것을 확인할 수 있다.
실험예 7
제조예에서 얻어진 [화합물 46] 내지 [화합물 51]에 대하여 광물리적 특성을 평가하였으며, 평가 결과는 하기의 [표 3]에 나타내었다. 최대 흡수 파장(λabs, max), 최대 형광 파장(λPL, max), 몰 흡광계수(ε at λmax) 및 양자효율(Φ)을 각 용매별로 측정하였다. 측정은 DMSO, 에탄올(EtOH), 메틸렌클로라이드(MC), 물(water) 및 PBS에서 수행되었으며, 측정 결과는 하기의 표 3에 나타내었다.
구분 DMSO EtOH MC Water PBS
화합물 46 λabs, max/
ε at λmax 		572/
132,000		 572/
134,000		 572/
142,000		 562/
140,000		 562/
145,000
λPL, max/
Φ		 589/
-		 588/
-		 584/
-		 576/
-		 576/
-
화합물 47 λabs, max/
ε at λmax 		584/
97,000		 580/
103,000		 584/
102,000		 572/
62,000		 572/
56,000
λPL, max/
Φ		 596/
0.730		 589/
-		 593/
-		 581/
0.784		 581/
0.803
화합물 48 λabs, max/
ε at λmax 		566/
91,000		 564/
91,000		 564/
110,000		 556/
96,000		 556/
98,000
λPL, max/
Φ		 582/
-		 579/
-		 578/
-		 569/
-		 569/
-
화합물 49 λabs, max/
ε at λmax 		534/
63,000		 528/
68,000		 534/
78,000		 522/
67,000		 522/
69,000
λPL, max/
Φ		 552/
-		 546/
-		 548/
-		 538/
-		 538/
-
화합물 50 λabs, max/
ε at λmax 		530/
98,000		 526/
103,000		 532/
118,000		 520/
104,000		 520/
108,000
λPL, max/
Φ		 549/
-		 543/
-		 546/
-		 537/
-		 537/
-
화합물 51 λabs, max/
ε at λmax 		670/
217,000		 666/
228,000		 676/
239,000		 656/
218,000		 656/
226,000
λPL, max/
Φ		 691/
-		 685/
-		 692/
-		 676/
-		 677/
-
상기 [표 3]에 기재된 바와 같이, 본 발명의 [화합물 46] 내지 [화합물 51]은 최대 흡수 파장과 최대 형광 파장이 각각 500 nm 이상에서 나타나는 것을 확인할 수 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (14)

  1. 하기의 [화학식 1] 또는 [화학식 2]로 표시되는 표지용 염료:
    [화학식 1]
    Figure 112021012790994-pat00078

    [화학식 2]
    Figure 112021012790994-pat00079

    상기 [화학식 1] 또는 [화학식 2]에서,
    X는 CR6R7, S, 또는 O이며,
    Q는 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 선택적으로 포함하는 고리가 치환된 폴리메틴이고,
    상기 R1 내지 R7은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-CO), 알데하이드, 에스터(-COO), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 카르보닐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌옥사이드, -L-X 작용기, -L-Z 작용기 및 하기의 [화학식 3] 내지 [화학식 5] 중 선택되거나, 상기 R1 내지 R7 중에서 선택되는 두 개 이상이 서로 연결되어 축합고리를 형성하며,
    상기 L은 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며,
    상기 X는 반응성기이며,
    상기 Z는 형광 신호를 발생시키는 형광단이며,
    상기 R1 내지 R7 중 적어도 하나 이상은 하기의 [화학식 3] 내지 [화학식 5] 중 선택되는 하나이며,
    [화학식 3]
    Figure 112021012790994-pat00080

    [화학식 4]
    Figure 112021012790994-pat00081

    [화학식 5]
    Figure 112021012790994-pat00082

    상기 [화학식 3] 내지 [화학식 5]에서,
    L1은 1 내지 150개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며,
    상기 [화학식 3] 및 [화학식 5]에서 L1은 존재 또는 비존재하며,
    L2는 C1-C20 알킬렌, 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 C1-C20 헤테로알킬렌이며,
    A는 수소 또는 M+ (M+는 카운터 이온)이며,
    R은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시 및 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬로부터 선택되며,
    R'은 상기 R1 내지 R7 중 적어도 어느 하나에 결합하는 자리를 나타내며,
    상기 R 및 R1 내지 R7 중 적어도 하나 이상은 -L-X 작용기인,
    표지용 염료.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R2 내지 R5 중에서 선택되는 두 개 이상이 서로 연결되어 축합고리를 형성하며,
    상기 축합고리는 치환 또는 비치환된 지방족의 축합고리; 치환 또는 비치환된 방향족의 축합고리; N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 치환 또는 비치환된 지방족 헤테로의 축합고리; N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 치환 또는 비치환된 방향족 헤테로의 축합고리; 치환 또는 비치환된 지방족 고리와 방향족 고리의 축합고리; 치환 또는 비치환된 N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 지방족 헤테로고리와 N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 방향족 헤테로고리의 축합고리; 치환 또는 비치환된 탄화수소 고리와 N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 헤테로의 고리와의 축합고리; 또는 C60-C84의 치환 또는 비치환된 플러렌인,
    표지용 염료.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 X는 카복실(carboxyl), 숙신이미딜 에스터(succinimidyl ester), 설포-숙신이미딜 에스터(sulfo-succinimidyl ester), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 말레이미드(maleimide), 할로아세트아마이드(haloacetamide), 하이드라자이드(hydrazide), 바이닐설폰(vinylsulphone), 다이클로로트리아진(dichlorotriazine), 포스포라미다이트(phosphoramidite), 알킬 할라이드(alkyl halide), 아실 할라이드(acyl halide), 카보하이드라자이드(carbohydrazide), 하이드록실아민(hydroxylamine), 케톤(ketone), 알카인(alkyne), 아자이드(azide), 지방족 및 방향족 아민(amine), 설포테트라플루오로페닐 에스터(sulfotetrafluorophenyl ester), 설포다이클로로페닐 에스터(sulfodichlorophenyl ester), 카보닐 아자이드(carbonyl azide), 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride), 설포닐 플루오라이드(sulfonyl fluoride), 보론산(boronic acid), 이소시아네이트(isocyanate), 할로겐-치환 트리아진(halogen-substituted triazine), 할로겐-치환 피리딘(halogensubstituted pyridine), 할로겐-치환 다이아진(halogen-substituted diazine), 테트라플루오로페닐 에스터(tetrafluorophenyl ester), 이미도 에스터(imido ester), 아지도나이트로페닐(azidonitrophenyl), 글리옥살(glyoxal) 및 알데하이드로부터 선택되는 반응성기인,
    표지용 염료.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 Z는 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 카르보피로닌(carbopyronin), 옥사진(oxazine), 잔텐(xanthenes), 티오잔텐(thioxanthene) 및 아크리딘(acridines)으로 표시되는 구조로부터 선택되는 형광단이거나, [화학식 1] 또는 [화학식 2] 로 표시되는 구조로부터 선택되는 형광단인,
    표지용 염료.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 [화학식 3] 내지 [화학식 5]로부터 선택되는,
    표지용 염료.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 R2 내지 R5 중 적어도 하나 이상은 [화학식 3] 내지 [화학식 5]로부터 선택되는,
    표지용 염료.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 R6 및 R7 중 적어도 하나 이상은 [화학식 3] 내지 [화학식 5]로부터 선택되는,
    표지용 염료.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 폴리메틴 내 임의의 탄소는 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카복실, 카복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤(-CO), 알데하이드, 에스터(-COO), 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 카르보닐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌옥사이드, -L-X 작용기, -L-Z 작용기, [화학식 3] 내지 [화학식 5]로부터 선택되는 치환기로 치환된,
    표지용 염료.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 폴리메틴 내 인접한 치환기는 서로 연결되어 고리를 형성하는,
    표지용 염료.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 폴리메틴 내 치환기와 상기 [화학식 1] 또는 [화학식 2]의 R1 내지 R7 중에서 선택되는 치환기가 서로 연결되어 고리를 형성하는,
    표지용 염료.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 폴리메틴 내 인접한 치환기는 서로 연결되어 고리를 형성하며,
    상기 폴리메틴 내 치환기와 상기 [화학식 1] 또는 [화학식 2]의 R1 내지 R7 중에서 선택되는 치환기가 서로 연결되어 고리를 형성하는,
    표지용 염료.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 염료는 항체, 지질, 단백질, 펩타이드, 탄수화물 및 핵산으로부터 선택되는 적어도 하나의 생체 분자를 표지하는,
    표지용 염료.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 염료는 아미노, 설프하이드릴, 카보닐, 하이드록실, 카복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 약물, 호르몬, 수용성 비타민, 지용성 비타민, 무기염류, 수용체, 효소, 효소 기질, 세포, 세포막, 독소, 미생물, 폴리스타이렌 및 마이크로스피어로부터 선택되는 적어도 하나를 표지하는,
    표지용 염료.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 표지용 염료를 포함하는,
    표지용 키트.
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