JP2019512573A - ポリフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンコンジュゲート及び分析物検出方法におけるそれらの使用 - Google Patents

ポリフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンコンジュゲート及び分析物検出方法におけるそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ポリフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンコンジュゲート及び分析物検出方法におけるそれらの使用を提供する。【選択図】図８

Description

関連出願
本出願は、全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１６年８月１９日出願の米国仮特許出願第６２／３７６，９４１号及び２０１６年３月２８日出願の米国仮特許出願第６２／３１３，９７７号の優先権を主張するものである。
分野
本発明は、概して、蛍光ポリマーコンジュゲート及び分析物の検出方法におけるそれらの使用に関する。
蛍光プローブは、分子及び細胞の分析及び分離、ならびに他の材料の検出及び定量化に有用な試薬である。非常に少数の蛍光分子が最適な状況下で検出され得る。Ｂａｒａｋ及びＷｅｂｂは、ＳＩＴカメラを使用して細胞のＬＤＬ受容に関連する５０個未満の蛍光脂質類似体を可視化した（Ｊ．ＣＥＬＬ ＢＩＯＬ．，９０，５９５−６０４（１９８１）（非特許文献１））。フローサイトメトリーを使用して、粒子またはある特定の細胞に関連する１０，０００個未満のフルオレセイン分子を検出することができる（Ｍｕｉｒｈｅａｄ，Ｈｏｒａｎ ａｎｄ Ｐｏｓｔｅ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，３，３３７−３５６（１９８５）（非特許文献２））。蛍光プローブの用途のいくつかの具体的な例には、（１）蛍光フローサイトメトリー技法、蛍光活性化細胞選別技法、及び蛍光顕微鏡技法による細胞混合物中の細胞亜集団の特定及び分離、（２）蛍光免疫アッセイ技法における第２の種（例えば、抗原−抗体反応物）に結合する物質の濃度の決定、（３）蛍光染色技法によるゲル及び他の不溶性支持体中の物質の局在化がある。これらの技法は、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，”ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ”３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２２；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９７８）（非特許文献３）、及びＧｏｌｄｍａｎ，”ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＭＥＴＨＯＤＳ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９６８）（非特許文献４）、及びＴａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．，ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＩＮ ＴＨＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，（１９８６）（非特許文献５）によって説明されている。
上記の目的のために蛍光ポリマーを用いる場合、蛍光ポリマーの選択に対する多くの制約が存在する。１つの制約は、試験用の試料、例えば、血液、尿、脳脊髄液中の多くのリガンド、受容体、及び材料が蛍光を発し、蛍光標識の蛍光の正確な決定を妨害するため、蛍光ポリマーの吸収及び放出特性である。この現象は、自己蛍光またはバックグラウンド蛍光と呼ばれる。別の考慮すべき事項は、蛍光ポリマーをリガンド及び受容体ならびに他の生物学的及び非生物学的材料にコンジュゲートする能力、ならびにかかるコンジュゲーションの蛍光ポリマーへの影響である。多くの場合、別の分子へのコンジュゲーションにより、蛍光ポリマーの蛍光特性の著しい変化がもたらされ得、ある場合には、蛍光ポリマーを著しく破壊し得るか、または蛍光ポリマーの量子効率を著しく低下させ得る。蛍光ポリマーとのコンジュゲーションが標識された分子の機能を不活性化することも可能である。第３の考慮すべき事項は、高感度検出のために高くなくてはならない蛍光ポリマーの量子効率である。第４の考慮すべき事項は、同様に可能な限り大きくなくてはならない蛍光ポリマーの光吸収能力または減衰係数である。蛍光分子が近接近している際に互いに相互作用して自己消光をもたらすかも懸念事項である。さらなる懸念事項は、単独で、または蛍光ポリマーがコンジュゲートした化合物と併せてのいずれかによる、蛍光ポリマーの他の化合物または容器壁への非特異的結合が存在するかである。
上述の方法の適用性及び有用性は、好適な蛍光化合物の可用性と密接に関係している。具体的には、これらのフルオロフォアの励起が生成する自己蛍光が少なく、また、スペクトルの全可視及び近赤外領域が利用され得る場合に異なる波長で蛍光を発する複数の発色団が同時に分析され得るため、４０５ｎｍで強い吸収を有し、かつ大きいストークスシフトで蛍光を発光する蛍光物質が必要とされている。近年、バイオレットレーザー（４０５ｎｍ）は、他のレーザー（例えば、４８８ｎｍのアルゴンレーザー及び６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザー）よりもはるかに大きい発光波長窓を与えるため、商用蛍光器具への設置が増えている。
フィコビリタンパク質は、それらの高い減衰係数及び高い量子収率のため、重要な貢献となっている。これらのフルオロフォア含有タンパク質は、多くのタンパク質に共有結合している場合があり、顕微鏡法及びフローサイトメトリーにおける蛍光抗体アッセイに使用される。しかしながら、フィコビリタンパク質は、それらの生物学的用途を限定する少数の不利点、例えば、（１）フィコビリタンパク質が比較的複雑であり、高度希釈溶液中で解離する傾向がある、（２）それらが非常に不安定であり、照射時に素早く消える、（３）フィコビリタンパク質が４０５ｎｍの非常に弱い吸収を有するという不利点を有する。
明るく蛍光性のポリマーは、高感度での付着材料の検出または位置を可能にする。ある特定のポリフルオレンポリマーは、免疫学的用途のための試薬の標識化としての有用性を実証している（例えば、米国特許第８，１５８，４４４号（特許文献１）、米国特許第８，４５５，６１３号（特許文献２）、米国特許第８，３５４，２３９号（特許文献３）、米国特許第８，３６２，１９３号（特許文献４）、及び米国特許第８，５７５，３０３号（特許文献５）（Ｇａｙｌｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．）、ならびにＷＯ２０１３／１０１９０２（特許文献６）（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．））。ポリフルオレンポリマーの他の生物学的用途が、Ｔｈｏｍａｓ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００７，１０７，１３３９）（非特許文献６）、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１２，１１２，４６８７）（非特許文献７）、及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１１，４０，３５０９）（非特許文献８）によって十分に立証されている。それにもかかわらず、必要とされる主要な中間体が商業的に入手不能であるため、全ての既存の水溶性ポリフルオレンポリマーは、非置換フルオレンに基づいている。置換フルオレンポリマーの生物学的用途を調査する努力がなされていない。非置換ポリフルオレンポリマーは、ある特定の不利点、例えば、（１）既存のポリフルオレンポリマーが可視波長（４００〜８００ｎｍ）のＵＶ端近くの発光波長を有し、（２）既存のポリフルオレンポリマーが自己凝集する（すなわち、積み重なる）非常に強い傾向もあり、これにより、Ｍｉｓｈｒａ，ｅｔ ａｌ．，ＣＨＥＭ．ＲＥＶ．，１００，１９７３（２０００）（非特許文献９）による広範な概説に記載されるように、蛍光量子収率が著しく低下し得、かつ（３）既存のポリフルオレンポリマーがポリマーの直線性及び平面性を著しく低下させる中間単結合を中心とした２つのベンゼン単位の自由回転／振動を被るという不利点を共有することで知られている。この現象は、“ＭＯＤＥＲＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＨＯＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ”，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ５ ａｎｄ ６，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，ＣＡ， ａｕｔｈｏｒｅｄ ｂｙ Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｊ．Ｔｕｒｒｏ（１９９１）（非特許文献１０）に記載の「ベルト緩め効果（ｌｏｏｓｅ ｂｅｌｔ ｅｆｆｅｃｔ）」と呼ばれる。したがって、改善された蛍光特性を有する蛍光ポリマーの必要性が未だ存在する。
米国特許第８，１５８，４４４号 米国特許第８，４５５，６１３号 米国特許第８，３５４，２３９号 米国特許第８，３６２，１９３号 米国特許第８，５７５，３０３号 ＷＯ２０１３／１０１９０２
Ｊ．ＣＥＬＬ ＢＩＯＬ．，９０，５９５−６０４（１９８１） Ｍｕｉｒｈｅａｄ，Ｈｏｒａｎ ａｎｄ Ｐｏｓｔｅ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，３，３３７−３５６（１９８５） Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，"ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ"３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２２；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９７８） Ｇｏｌｄｍａｎ，"ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＭＥＴＨＯＤＳ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９６８） Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．，ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＩＮ ＴＨＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，（１９８６） Ｔｈｏｍａｓ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００７，１０７，１３３９） Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１２，１１２，４６８７） Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１１，４０，３５０９） Ｍｉｓｈｒａ，ｅｔ ａｌ．，ＣＨＥＭ．ＲＥＶ．，１００，１９７３（２０００） "ＭＯＤＥＲＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＨＯＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ"，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ５ ａｎｄ ６，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，ＣＡ， ａｕｔｈｏｒｅｄ ｂｙ Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｊ．Ｔｕｒｒｏ（１９９１）
本発明は、この必要性に対処し、いわゆる「ベルト緩め効果」が２つのベンゼン環の架橋によって排除され得るという発見に基づく。驚くべきことに、フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン系ポリマーが予想外に所望の生物学的特性をもたらしたことが見出された。これらのポリマーコンジュゲートは、（１）高い蛍光量子収率、（２）赤方偏移発光、（３）高い水溶性、（４）高い直線性、（５）高い平面性、（６）第２の色素がポリマーに結合したときの高い蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）効率、及び（７）高い光安定性を有する。
炭素が示されるように番号付けされたコアフルオレン構造が以下に示される。この番号付けは、本明細書全体にわたって採用されている。
Figure 2019512573
フルオレン
フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマー単位の基本構造は、以下の通りである。
Figure 2019512573
フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン
かかるモノマーは、本発明で有用であり、本発明の一態様を定義する。本発明は、少なくとも１つのフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマー単位を含むポリマーにも関する。本発明はさらに、生物学的基質に結合した少なくとも１つのフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマー単位を含むポリマー、及びかかるポリマーを使用する方法に関する。
本開示は、１つ以上のモノマーを含むポリマーであって、１つ以上のモノマーが、
式Ａのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｘが、ポリマー中のモノマーＡ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが６〜１００である）、
式Ｂのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｙが、ポリマー中のモノマーＢ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが０〜９９である）、及び
式Ｃのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｚが、ポリマー中のモノマーＣ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが０〜９９である）
からなる群から選択され、式中、ＸのＹ＋Ｚに対する比率が１超であり、Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が１０超であり、Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、ポリマーが、末端基ＨＧ１及びＨＧ２を含み、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳである、ポリマーを提供する。いくつかの実施形態では、水溶性基は、ＰＥＧ基、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキル基から選択される。生物学的基質（ＢＳ）は、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり得る。リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、それに結合した生物学的基質を欠く。代わりに、特定の実施形態では、生物学的基質を欠く本明細書に記載のポリマーは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、ＳＧ６、ＨＧ１、またはＨＧ２のうちの１つ以上でコンジュゲートされるか、またはさもなければ付加される１つ以上の生物学的基質を含むように修飾され得る。特定の実施形態では、ポリマーがＬ−ＢＳを含む場合、ＢＳのポリマーに対する比率は、０．２〜３である。
本開示は、１つ以上のモノマーを含むポリマーであって、１つ以上のモノマーが、
式Ｄのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｗが、ポリマー中のモノマーＤ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｗが６〜１００である）、
式Ｅのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｘが、ポリマー中のモノマーＥ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが０〜９８である）、
式Ｆのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｙが、ポリマー中のモノマーＦ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが１〜２０であり、フルオロフォア（ＦＰ）が蛍光色素であり、例示の蛍光色素が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、蛍光量子収率が５％を超える）、及び
式Ｇのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｚが、ポリマー中のモノマーＧ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが０〜９８である）
からなる群から選択され、式中、ＷのＸ＋Ｙ＋Ｚに対する比率が１超であり、Ｗ＋Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が１０超であり、ＦＰが、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超えるフルオロフォアまたは蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、ポリマーが、末端基ＨＧ１及びＨＧ２を含み、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳである、ポリマーを提供する。いくつかの実施形態では、水溶性基は、ＰＥＧ基、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキル基から選択される。生物学的基質（ＢＳ）は、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり得る。リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、及びＦＰ基、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、それに結合した生物学的基質を欠く。代わりに、特定の実施形態では、生物学的基質を欠く本明細書に記載のポリマーは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、ＳＧ６、ＳＧ７、ＨＧ１、またはＨＧ２のうちの１つ以上でコンジュゲートされるか、またはさもなければ付加される１つ以上の生物学的基質を含むように修飾され得る。特定の実施形態では、ポリマーがＬ−ＢＳを含む場合、ＢＳのポリマーに対する比率は、０．２〜３である。
本開示は、１つ以上のモノマーを含むポリマーであって、１つ以上のモノマーが、
式Ｈのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｘが、ポリマー中のモノマーＨ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが０〜１００である）、
式Ｉのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｙが、ポリマー中のモノマーＩ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが０〜１００である）、及び
式Ｊのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｚが、ポリマー中のモノマーＪ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが０〜１００である）
からなる群から選択され、式中、Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が１０超であり、Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、ポリマーが、末端基ＨＧ１及びＨＧ２を含み、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳである、ポリマーを提供する。いくつかの実施形態では、水溶性基は、ＰＥＧ基、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキル基から選択される。生物学的基質（ＢＳ）は、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり得る。リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、それに結合した生物学的基質を欠く。代わりに、特定の実施形態では、生物学的基質を欠く本明細書に記載のポリマーは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、ＳＧ６、ＨＧ１、またはＨＧ２のうちの１つ以上でコンジュゲートされるか、またはさもなければ付加される１つ以上の生物学的基質を含むように修飾され得る。特定の実施形態では、ポリマーがＬ−ＢＳを含む場合、ＢＳのポリマーに対する比率は、０．２〜３である。
本開示は、１つ以上のモノマーを含むポリマーであって、１つ以上のモノマーが、
式Ｋのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｗが、ポリマー中のモノマーＫ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｗが０〜１００である）、
式Ｌのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｘが、ポリマー中のモノマーＬ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが０〜１００である）、
式Ｍのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｙが、ポリマー中のモノマーＭ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが１〜２０であり、フルオロフォア（ＦＰ）が蛍光色素であり、例示の蛍光色素が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、蛍光量子収率が５％を超える）、及び
式Ｎのモノマー
Figure 2019512573
（式中、Ｚが、ポリマー中のモノマーＮ単位の数であり、モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが０〜１００である）
からなる群から選択され、式中、Ｗ＋Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が１０超であり、フルオロフォア（ＦＰ）が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超える蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、ポリマーが、末端基ＨＧ１及びＨＧ２を含み、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳである、ポリマーを提供する。いくつかの実施形態では、水溶性基は、ＰＥＧ基、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキル基から選択される。生物学的基質（ＢＳ）は、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり得る。リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、ＦＰ基、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、それに結合した生物学的基質を欠く。代わりに、特定の実施形態では、生物学的基質を欠く本明細書に記載のポリマーは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、ＳＧ６、ＳＧ７、ＨＧ１、またはＨＧ２のうちの１つ以上でコンジュゲートされるか、またはさもなければ付加される１つ以上の生物学的基質を含むように修飾され得る。特定の実施形態では、ポリマーがＬ−ＢＳを含む場合、ＢＳのポリマーに対する比率は、０．２〜３である。
本開示は、式Ｉのポリマーコンジュゲートであって、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＡ、Ｂ、及びＣで表される３つのモノマー単位を含み、
Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｘが６〜１００の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜９９から独立して選択される整数であるが、但し、
（１）生物学的基質が式Ｉ内の１つ以上の位置に存在する場合、ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、
（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
全ての関連態様に従う好ましい実施形態では、モノマー単位Ｂ及びモノマー単位Ｃは、異なるモノマー単位であり、それ故に、同一ではない。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、及びＳＧ６置換基は、残りのＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、またはＳＧ６置換基とは異なる。
全ての関連態様に従う特定の実施形態では、Ａ〜Ｃから選択されるモノマー単位は、（本明細書の他の箇所に記載されるように）任意のモノマー単位順に互いに直接結合している。
特定の実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、アルキルもしくはＰＥＧ基を含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基である。複数のリンカーを含む実施形態の場合、これらのリンカーは、同じであり得るか、または異なり得る。
特定の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は独立して、水素、メチル、またはエチルを表す。具体的な実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は各々、水素を表す。
いくつかの実施形態では、水溶性基は、ＰＥＧ基、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキル基から選択される。したがって、特定の実施形態では、ＳＧ１〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ基、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル基、またはＬ−ＢＳを表す。さらなる実施形態では、ＳＧ１もＳＧ２もいずれもＰＥＧ基であり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
いくつかの実施形態では、生物学的基質（ＢＳ）は、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物である。ポリマーコンジュゲートが１つより多くのＢＳを含む実施形態の場合、各ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物から独立して選択され得る。
特定の実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニル基を表す。
さらなる実施形態では、ｘは、１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数である。特定の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、２０超である。
さらなる実施形態では、ｙ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数である。
さらなる実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１〜２である。
したがって、特定の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は独立して、水素、メチル、またはエチルを表し、ＳＧ１〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル基、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｘは、１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚは、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の実施形態では、本開示は、式Ｉのポリマーコンジュゲートであって、式中、Ｒ１〜Ｒ６が水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２がＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｘが１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
いくつかの実施形態では、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ基、アルキル、カルボキシアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
他の実施形態では、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ基、アルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
いくつかの実施形態では、ＳＧ１及びＳＧ２は独立して、ＰＥＧ６〜ＰＥＧ１８である。
いくつかの実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、３０〜８０である。したがって、これらの実施形態では、必要に応じて、ｘは、１６〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜６４から独立して選択される整数である。特定の実施形態では、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、メチル、カルボキシアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
特定の実施形態では、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、メチル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
したがって、さらなる実施形態では、本開示は、式Ｉのポリマーコンジュゲートであって、式中、Ｒ１〜Ｒ６が水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｘが１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜８０から選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
いくつかの実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、カルボキシアリール、またはＬ−ＢＳを表す。
他の実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、またはＬ−ＢＳを表す。
誤解を避けるために、上述のＲ１〜Ｒ６、ＳＧ１〜ＳＧ６、ＨＧ１、ＨＧ２、Ｌ、及びＢＳの実施形態は、本明細書に記載のポリマーコンジュゲートＩＩ〜ＩＶに準用され、具体的に企図される。それらは、モノマー成分との関連で定義される本発明のポリマーにも適用される。簡潔さのみのために、上述の全ての実施形態が必ずしも以下で繰り返されるわけではない。
したがって、さらなる一態様では、本開示は、式ＩＩのポリマーコンジュゲートであって、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＤ、Ｅ、Ｆ、及びＧで表される４つのモノマー単位を含み、
フルオロフォア（ＦＰ）が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超える蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳ（上で定義されるもの）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、ハロゲン、ボロニル、アルキル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｗが６〜１００の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜９８から独立して選択される整数であり、ｙが１〜２０の整数であるが、但し、
（１）生物学的基質が式ＩＩ内の１つ以上の位置に存在する場合、ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、
（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
全ての関連態様に従う好ましい実施形態では、モノマー単位Ｅ及びモノマー単位Ｇは、異なるモノマー単位であり、それ故に、同一ではない。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、ＳＧ６、及びＳＧ７置換基は、残りのＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、ＳＧ６、またはＳＧ７置換基とは異なる。
全ての関連態様に従う特定の実施形態では、Ｄ〜Ｇから選択されるモノマー単位は、（本明細書の他の箇所に記載されるように）任意のモノマー単位順に互いに直接結合している。
特定の実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ基、もしくはＦＰを含むか、またはアルキル、ＰＥＧ基、もしくはＦＰである。複数のリンカーを含む実施形態の場合、これらのリンカーは、同じであり得るか、または異なり得る。
いくつかの実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール（ｒｈｏｄｏｌ）、シアニン、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンである。ポリマーコンジュゲートが１つより多くのＦＰを含む実施形態の場合、各ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンから独立して選択され得る。
いくつかの実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は独立して、水素、メチル、またはエチルを表す。
いくつかの実施形態では、水溶性基は、ＰＥＧ基、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキル基から選択される。したがって、特定の実施形態では、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
いくつかの実施形態では、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物である。ポリマーコンジュゲートが１つより多くのＢＳを含む実施形態の場合、各ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物から独立して選択され得る。
いくつかの実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表す。
いくつかの実施形態では、ｗは、１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数である。特定の実施形態では、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、２０超である。
さらなる実施形態では、ｘ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数である。
さらなる実施形態では、ｙは、１〜１０の整数である。
さらなる実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１〜２である。
したがって、特定の実施形態では、本開示は、式ＩＩのポリマーコンジュゲートであって、ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、メチル、またはエチルを表し、ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗが１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜８０から選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
いくつかの実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素である。
さらなる実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１である。さらなる実施形態では、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、３０〜８０である。特定の実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率が１の場合、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、３０〜８０である。したがって、これらの実施形態では、必要に応じて、ｗは、１６〜７９の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜６３から独立して選択される整数である。
特定の実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンである。ポリマーコンジュゲートが１つより多くのＦＰを含む実施形態の場合、各ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンから独立して選択され得る。
具体的な実施形態では、ＦＰは、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミングリーン、及びローダミンレッドを含むローダミンである。
他の実施形態では、ＦＰは、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７を含むシアニンである。
特定の実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗは、１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜８０から選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
さらなる実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、３０〜８０である。
さらなる実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、カルボキシアリール、またはＬ−ＢＳを表す。
他の実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、またはＬ−ＢＳを表す。
別の態様では、本開示は、式ＩＩＩのポリマーコンジュゲートであって、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＨ、Ｉ、及びＪで表される３つのモノマー単位を含み、
Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｘ、ｙ、及びｚが各々、０〜１００から独立して選択される整数であるが、但し、
（１）生物学的基質が式ＩＩＩ内の１つ以上の位置に存在する場合、ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
全ての関連態様に従う好ましい実施形態では、モノマー単位Ｈ〜Ｊは、異なるモノマー単位であり、それ故に、同一ではない。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、及びＳＧ６置換基は、残りのＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、またはＳＧ６置換基とは異なる。
全ての関連態様に従う特定の実施形態では、Ｈ〜Ｊから選択されるモノマー単位は、（本明細書の他の箇所に記載されるように）任意のモノマー単位順に互いに直接結合している。
特定の実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、アルキルもしくはＰＥＧ基を含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基である。複数のリンカーを含む実施形態の場合、これらのリンカーは、同じであり得るか、または異なり得る。
いくつかの実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は独立して、水素、メチル、またはエチルを表す。
いくつかの実施形態では、水溶性基は、ＰＥＧ基、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキル基から選択される。したがって、特定の実施形態では、ＳＧ１〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
さらなる実施形態では、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物である。ポリマーコンジュゲートが１つより多くのＢＳを含む実施形態の場合、各ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物から独立して選択され得る。
さらなる実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表す。
さらなる実施形態では、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数である。特定の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、２０超である。
さらなる実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１〜２である。
したがって、特定の実施形態では、本開示は、式ＩＩＩのポリマーコンジュゲートであって、式中、Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、メチル、またはエチルを表し、ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｘ、ｙ、及びｚが、０〜８０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
さらなる実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素である。
さらなる実施形態では、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧである。したがって、特定の実施形態では、ＳＧ１及びＳＧ２がＰＥＧである場合、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
したがって、特定の実施形態では、本開示は、式ＩＩＩのポリマーコンジュゲートであって、式中、Ｒ１〜Ｒ４が水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２がＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｘ、ｙ、及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
さらなる実施形態では、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
他の実施形態では、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
さらなる実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１である。なおさらなる実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、３０〜８０である。
さらなる実施形態では、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、メチル、カルボキシアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
さらなる実施形態では、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、メチル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
さらなる実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはまたはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｘは、１１〜８０から選択される整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
さらなる実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、３０〜８０である。
なおさらなる実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、カルボキシアリール、またはＬ−ＢＳを表す。他の実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、またはＬ−ＢＳを表す。
さらなる一態様では、本開示は、式ＩＶのポリマーコンジュゲートであって、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＫ、Ｌ、Ｍ、及びＮで表される４つのモノマー単位を含み、
フルオロフォア（ＦＰ）が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超える蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳ（上で定義されるもの）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、ハロゲン、ボロニル、アルキル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｗ、ｘ、及びｚが各々、０〜１００から独立して選択される整数であり、
ｙが１〜２０の整数であるが、但し、
（１）生物学的基質が式ＩＶ内の１つ以上の位置に存在する場合、ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
全ての関連態様に従う好ましい実施形態では、モノマー単位Ｋ、Ｌ、及びＮは、異なるモノマー単位であり、それ故に、同一ではない。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、ＳＧ６及びＳＧ７置換基は、残りのＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、ＳＧ４、ＳＧ５、ＳＧ６またはＳＧ７置換基とは異なる。
全ての関連態様に従う特定の実施形態では、Ｋ〜Ｎから選択されるモノマー単位は、（本明細書の他の箇所に記載されるように）任意のモノマー単位順に互いに直接結合している。
特定の実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ基、もしくはＦＰを含むか、またはアルキル、ＰＥＧ基、もしくはＦＰである。複数のリンカーを含む実施形態の場合、これらのリンカーは、同じであり得るか、または異なり得る。
いくつかの実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンである。ポリマーコンジュゲートが１つより多くのＦＰを含む実施形態の場合、各ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンから独立して選択され得る。
さらなる実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は独立して、水素、メチル、またはエチルを表す。
いくつかの実施形態では、水溶性基は、ＰＥＧ基、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキル基から選択される。したがって、特定の実施形態では、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表す。
さらなる実施形態では、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物である。ポリマーコンジュゲートが１つより多くのＢＳを含む実施形態の場合、各ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物から独立して選択され得る。
さらなる実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表す。
さらなる実施形態では、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数である。特定の実施形態では、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、２０超である。
さらなる実施形態では、ｙは、１〜１０の整数である。
なおさらなる実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１〜２である。特定の実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１である。
したがって、特定の実施形態では、本開示は、式ＩＶのポリマーコンジュゲートであって、式中、ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、メチル、またはエチルを表し、ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗ、ｘ、及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
さらなる実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素である。
さらなる実施形態では、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、３０〜８０である。特定の実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率が１の場合、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、３０〜８０である。かかる実施形態では、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数である。
さらなる実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンである。ポリマーコンジュゲートが１つより多くのＦＰを含む実施形態の場合、各ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンから独立して選択され得る。特定の実施形態では、ＦＰは、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミングリーン、及びローダミンレッドを含むローダミンである。いくつかの実施形態では、ＦＰは、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７を含むシアニンである。
したがって、特定の実施形態では、本開示は、式ＩＶのポリマーコンジュゲートであって、ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４が水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗ、ｘ、及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、前記ポリマーコンジュゲートを提供する。
さらなる実施形態では、ＢＳ／ポリマーの比率は、１であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は、３０〜８０である。
さらなる実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、カルボキシアリール、またはＬ−ＢＳを表す。代替の実施形態では、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、またはＬ−ＢＳを表す。
上及び本明細書に記載の特徴及び実施形態は全て、別途文脈が明確にしない限り、組み合わせ可能である。本明細書に記載の式Ｉ〜ＩＶに従うポリマーコンジュゲートに関して明確に列挙される特徴及び実施形態の全ての可能な組み合わせが企図され、関連性のあるモノマー成分との関連で定義される他の式のポリマーコンジュゲート及び本発明のポリマーとの関連で開示されるとみなされるものとする。全ての可能な組み合わせが簡潔さのみのために明確に述べられていないが、これらの組み合わせは、当業者には明白かつ明確に明らかであろう。
さらなる一態様では、本開示は、試料中の分析物を検出する方法であって、
ａ）前記試料を、本発明のポリマーコンジュゲートまたはポリマー、具体的には、本明細書に開示され、かつ本明細書でさらに定義される式Ｉ〜ＩＶのうちのいずれか１つの構造を有するポリマーコンジュゲート、または本明細書に開示され、かつ本明細書でさらに定義されるモノマー成分との関連で定義されるポリマーを含む検出試薬と、前記検出試薬が前記分析物に結合する条件下で組み合わせることと、
ｂ）検出試薬が結合した分析物を蛍光により検出すること
を含む、前記方法を提供する。
本開示は、試料中の分析物を検出する方法であって、
ａ）前記試料を、式Ｉの構造を有するポリマーコンジュゲートを含む検出試薬と、前記検出試薬が前記分析物に結合する条件下で組み合わせることと、
ｂ）検出試薬が結合した分析物を蛍光により検出すること
を含み、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＡ、Ｂ、及びＣで表される３つのモノマー単位を含み、
Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｘが６〜１００の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜９９から独立して選択される整数であるが、但し、
（１）ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、
（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする、前記方法を提供する。
別の態様では、本開示は、試料中の分析物を検出する方法であって、
ａ）前記試料を、式ＩＩの構造を有するポリマーコンジュゲートを含む検出試薬と、前記検出試薬が前記分析物に結合する条件下で組み合わせることと、
ｂ）検出試薬が結合した分析物を蛍光により検出すること
を含み、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＤ、Ｅ、Ｆ、及びＧで表される４つのモノマー単位を含み、
フルオロフォア（ＦＰ）が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超える蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳ（本明細書で定義されるもの）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、ハロゲン、ボロニル、アルキル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｗが６〜１００の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜９８から独立して選択される整数であり、ｙが１〜２０の整数であるが、但し、
（１）ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、
（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする、前記方法を提供する。
別の態様では、本開示は、試料中の分析物を検出する方法であって、
ａ）前記試料を、式ＩＩＩの構造を有するポリマーコンジュゲートを含む検出試薬と、前記検出試薬が前記分析物に結合する条件下で組み合わせることと、
ｂ）検出試薬が結合した分析物を蛍光により検出すること
を含み、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＨ、Ｉ、及びＪで表される３つのモノマー単位を含み、
Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｘ、ｙ、及びｚが各々、０〜１００から独立して選択される整数であるが、但し、
（１）ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする、前記方法をさらに提供する。
さらなる一態様では、本開示は、試料中の分析物を検出する方法であって、
ａ）前記試料を、式ＩＶの構造を有するポリマーコンジュゲートを含む検出試薬と、前記検出試薬が前記分析物に結合する条件下で組み合わせることと、
ｂ）検出試薬が結合した分析物を蛍光により検出すること
を含み、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＫ、Ｌ、Ｍ、及びＮで表される４つのモノマー単位を含み、
フルオロフォア（ＦＰ）が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超える蛍光色素であり、
Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳ（本明細書で定義されるもの）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、ハロゲン、ボロニル、アルキル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｗ、ｘ、及びｚが各々、０〜１００から独立して選択される整数であり、ｙが１〜２０の整数であるが、但し、
（１）ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする、前記方法を提供する。
本発明の全てのポリマーコンジュゲート及びポリマーについて、各モノマーとそのモノマーが含まれるポリマー主鎖との間の結合の位置は、関連モノマー位置から延びる結合として示される。特定の実施形態では、モノマー単位は、互いに直接結合していてもよい。したがって、モノマー単位間の結合に関して、結合が２つのフルオレンモノマー間（例えば、式ＩのモノマーＢとモノマーＣとの間）である場合、その結合は、以下の例に示されるように、一方のモノマーのＣ７と他方のモノマーのＣ２との間である。
Figure 2019512573
結合が２つのフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマー間（例えば、式ＩＩＩのモノマーＨとモノマーＩとの間）である場合、その結合は、以下の例に示されるように、一方のモノマーのＣ２と他方のモノマーのＣ８との間である。
Figure 2019512573
フルオレンモノマーがフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマーに結合される（例えば、式ＩＩのモノマーＤ及びＥ）状況では、ＨＧ１〜ＨＧ２軸に対するモノマー配列の配向に応じて２種類の結合が可能である。一方の配向では、結合は、例えば、以下に示されるように、モノマー配列Ｄ−Ｅ（ＨＧ１末端からＨＧ２末端）における、フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマーのＣ８とフルオレンのＣ７との間で行われる。
Figure 2019512573
同様に、他方の配向では、フルオレンモノマーとフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマーとの間の結合は、例えば、以下の例に示されるように、モノマー配列Ｅ−Ｄ（ＨＧ１末端からＨＧ２末端）における、フルオレンのＣ２とフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンのＣ２との間であろう。
Figure 2019512573
参考までに、本明細書全体にわたって論じられるフルオレンのコア構造及びフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンの基本構造の炭素数は、本出願の要約に提供される。
本明細書に開示されるポリマーコンジュゲートの全ての特定の実施形態は、本発明の方法に準用される。
いくつかの実施形態では、本方法は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶのポリマーコンジュゲート、または本明細書に開示され、かつ本明細書でさらに定義されるモノマー成分との関連で定義されるポリマーの使用を含み、ポリマーコンジュゲートまたはポリマーに存在するＢＳのうちの１つ以上〜最大全てが抗体である。特定の実施形態では、ポリマーコンジュゲートまたはポリマーに存在するＢＳのうちの１つ以上〜最大全てが、抗ジゴキシゲニン抗体である。代替の実施形態では、ポリマーコンジュゲートまたはポリマーに存在するＢＳのうちの１つ以上〜最大全てが、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、ロバ抗マウスＩｇＧ抗体、ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体、ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体、ニワトリ抗マウスＩｇＧ抗体、ニワトリ抗ウサギＩｇＧ抗体、またはニワトリ抗ヒトＩｇＧ抗体から独立して選択される。
なおさらなる実施形態では、本方法は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶのポリマーコンジュゲート、または本明細書に開示され、かつ本明細書でさらに定義されるモノマー成分との関連で定義されるポリマーの使用を含み、ポリマーコンジュゲートまたはポリマーに存在するＢＳのうちの１つ以上〜最大全てが、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンＤＮ、またはアビジンＤ分子から独立して選択される。
なおさらなる実施形態では、本明細書に開示される方法によって検出される分析物は、細胞表面で発現する標的タンパク質である。
本開示、具体的には、特許請求の範囲及び／または項において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の用語は、米国特許法におけるそれに帰する意味を有してもよく、例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味してもよく、「から本質的になること」及び「から本質的になる」等の用語は、米国特許法におけるそれらに帰する意味を有し、例えば、それらは、明確に列挙されていない要素を考慮するが、先行技術に見られる要素または本発明の基本的特性もしくは新規の特性に影響を及ぼす要素を除外することに留意されたい。これら及び他の実施形態が開示されるか、または以下の発明を実施するための形態から明らかであり、それに包含される。
本実施形態の前述及び他の特徴及び利点は、添付の図面と併せて例証的実施形態の以下の発明を実施するための形態からより完全に理解されるであろう。
ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中でのポリフルオレン（破線）及びポリフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン（ＰＦＯ、実線）正規化吸収スペクトル。ＰＦＯは、ポリフルオレン（減衰係数＝２，１００，０００ｃｍ−１Ｍ−１）よりも強い吸収（減衰係数＝３，５００，０００ｃｍ−１Ｍ−１）を有する。ＰＦＯは、ポリフルオレンの吸収波長よりも長い吸収波長も有する。 ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中でのポリフルオレン（破線）及びポリフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン（ＰＦＯ、実線）の正規化蛍光スペクトル。ＰＦＯは、ポリフルオレンの発光波長よりも長い発光波長を有する。 ポリフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンコンジュゲートの典型的な合成（実施例１〜６６を参照のこと）。ＢＳは、生物学的基質である。ｗ、ｘ、ｙ、及びｚは、ポリマーコンジュゲート主鎖内に含まれるモノマー単位の数を表す。ＦＧは、表２に列記されるコンジュゲーションに使用される官能基である。ＦＰは、表１に列記されるフルオロフォアである。Ｌは、リンカーである。 図3-1の説明を参照のこと。 図3-1の説明を参照のこと。 図3-1の説明を参照のこと。 ファロイジンとポリフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンとのコンジュゲートでの細胞Ｆ−アクチン染色（実施例５３を参照のこと）。Ｈｅｌａ細胞をＰＢＳ中３〜４％ホルムアルデヒドで、室温で１０〜３０分間固定した。固定細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎを固定細胞に添加して、コンジュゲート透過性を１０分間にわたって増加させた。細胞をＰＢＳで３回すすいだ。５μＬのＰＦＯ−ファロイジンコンジュゲート溶液（１０μｇ／ｍＬ）を固定細胞に添加した（１００μＬ／ウェル、９６ウェルプレート）。細胞を室温で２０〜９０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回穏やかにすすいで、過剰なファロイジンコンジュゲートを除去した後に、蛍光顕微鏡下で画像化した。 Ｃｙ３．５−ＰＦＯタンデム−ｍＣＤ８ａ抗体コンジュゲートのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＳＥＣ精製（実施例６４及び６５を参照のこと）。第１の溶出ピークを精製生成物として収集し、約１３ｍＬでの大きいＯＤ２８０ピークが遊離抗体である。 Ｓ２００ ＳＥＣ精製後のＣｙ３．５−ＰＦＯタンデム−ｍＣＤ８ａ抗体コンジュゲートのさらなるタンパク質Ｇ親和性精製（実施例６４を参照のこと）。遊離ポリマー、すなわち、ｍＣＤ８ａ抗体にコンジュゲートしていないポリマーを第１の組のカラム体積中に溶出し、コンジュゲートを約１２ｍＬから低ｐＨ条件で溶出した。 ＰＦＯにコンジュゲートし、かつフローサイトメトリーによって分析された抗マウスＣＤ８ａ（クローン５３−６．７）抗体でのマウス脾細胞の染色。単細胞懸濁液を、それぞれ、同じ条件下で、ラット抗マウスＣＤ８ａ（クローン５３−６．７）抗体にコンジュゲートしたＣｙ３．５−ＰＦＯタンデムまたはＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）ＢＶ６０５ラット抗マウスＣＤ８（クローン５３−６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能）で染色した。Ｃｙ３．５−ＰＦＯタンデムとラット抗マウスＣＤ８ａとのコンジュゲーションを実施例６４に記載されるように調製した。細胞懸濁液を２〜８℃で３０分間染色し、１回洗浄し、その後、実施例６７及び６８に記載されるように４０５ｎｍ励起レーザー線及び６０５／４０帯域通過フィルターを使用してフローサイトメトリーによって分析した。Ｃｙ３．５−ＰＦＯタンデムのラット抗マウスＣＤ８ａコンジュゲート（図７、Ｂでラベル付けされたもの）は、ポリフルオレン系ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）ＢＶ６０５ラット抗マウスＣＤ８（図７、Ａでラベル付けされたもの）よりも強いシグナルを示した。 ポリフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧを有するＨｅｌａ細胞中のチューブリンの蛍光画像化（実施例５９を参照のこと）。Ｈｅｌａ細胞を４％ホルムアルデヒドで固定した。マウス抗チューブリンを固定細胞とインキュベートした。一次インキュベーション後、細胞を５体積の染色緩衝液ですすぎ、３〜５分間沈降させた。その後、細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＦＯポリマーコンジュゲートと１０〜５００ｎＭの範囲内の濃度で３０〜６０分間インキュベートした。二次インキュベーション後、細胞を３〜５体積の染色緩衝液ですすぎ、３〜５分間沈降させた。細胞をＯｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡で画像化した。
詳細な説明
必要とされる主要な中間体が商業的に入手不能であるため、全ての既存の水溶性ポリフルオレンポリマーは、非置換フルオレンに基づいている。置換フルオレンポリマーの生物学的用途を調査する努力がなされていない。米国特許第８，５９８，３０６号（Ｍａｒｙ ＭｃＫｉｅｒｎａｎ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｐｉｌｌｏｗ）は、仮説上のフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマーを開示した。しかしながら、このモノマーは、いくつかの理由により本発明に関連しない。（１）．当業者は、Ｍａｒｙ ＭｃＫｉｅｒｎａｎ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｐｉｌｌｏｗによって説明されたモノマーを使用して、有用な生物学的ポリマーを作製することができない。Ｍａｒｙ ＭｃＫｉｅｒｎａｎ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｐｉｌｌｏｗが電子デバイス（例えば、ＯＬＥＤ）用に特別に設計したポリマーは、極めて疎水性である。仮説上のフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマーに由来するポリマーは水不溶性であり、それ故に、常に水性環境を必要とする生物学的系では使用することができない。（２）．仮説上のフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマーさえもＭａｒｙ ＭｃＫｉｅｒｎａｎ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｐｉｌｌｏｗによって開示される方法によって作製することができないことが明らかである。米国特許第８，５９８，３０６号は、ＡｌＣｌ３及びＢＦ３によって触媒された合成法を開示した。これらの条件下で、オキセピン環が破壊されるであろう。（３）．仮説上のフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンポリマーのスペクトル研究も生物学的研究もＭａｒｙ ＭｃＫｉｅｒｎａｎ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｐｉｌｌｏｗによって説明されてない。（４）．少なくとも３つの理由により、Ｍａｒｙ ＭｃＫｉｅｒｎａｎ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｐｉｌｌｏｗの仮説上のフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンポリマーを生物学的基質にコンジュゲートすることは不可能である。（ａ）．Ｍａｒｙ ＭｃＫｉｅｒｎａｎ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｐｉｌｌｏｗの仮説上のポリマーは、生物学的基質に結合するための生物学的に適合性の官能基を欠く。（ｂ）．それらの極めて乏しい水溶性により、仮説上のフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンポリマーに由来するいずれの生物学的コンジュゲートも役に立たなくなるであろう。（ｃ）．全ての生物学的コンジュゲートが水性系中で使用されるため、仮説上のフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンポリマーの凝集により、それらの生物学的用途の調査が不可能になるであろう。
本発明をさらに詳細に説明する前に、本発明が、記載される特定の方法、デバイス、溶液、または装置が当然ながら異なるため、かかる方法、デバイス、溶液、または装置に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定するようには意図されていないことも理解されたい。
別途本明細書で定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。それらの用語の意味及び範囲が明らかであるべきであるが、いずれかの潜在的な曖昧さが生じた場合、本明細書に提供される定義が、いずれの辞書または外部の定義に優先するものとする。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の使用は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「プローブ（ａ ｐｒｏｂｅ）」への言及は、複数のプローブを含むといった具合である。加えて、「２つ」、「３つ」等の特定の複数の言及の使用は、別途文脈が明確に指示しない限り、より大きい数の同じ対象と読むことができる。
「結合した（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、「結合した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」、「コンジュゲートした」、及び「連結した」等の用語は、本明細書で同義に使用され、別途文脈が明確に指示しない限り、直接的および間接的な結合（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）、結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、連結、またはコンジュゲーションを包含する。本明細書で使用されるとき、「ポリマーコンジュゲート」及び「コンジュゲートしたポリマー」という用語は、本明細書で定義される生物学的基質に直接的または間接的に結合（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）、結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、連結、またはコンジュゲートした本発明のポリマーを指す。
本明細書で述べられる全ての出版物は、参考文献が引用される特定の材料及び方法を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で論じられる出版物は、本出願の出願日前に開示されたものとして提供されているにすぎない。本明細書において、本発明が先行発明によりかかる開示に先行する権利を有しないという承認と解釈されるべきではない。
本発明に到達する際に、フルオレンポリマーの生物学的検出用途を調査するために、フルオレンポリマーの様々な化学修飾が試みられた。注目すべきことに、１、２、３、６、７、及び８位での任意の置換が結果として生じるポリマーコンジュゲートの蛍光強度を著しく低下させた。加えて、これらの置換フルオレンポリマーコンジュゲートは、乏しい水溶性も有する。４位及び５位に努力を集中させた。４位及び５位での異なる置換及び異なる架橋の最初の努力により、所望のポリマーは生成されなかった。５、６、及び８員基による４位及び５位でのハロゲン化、アルキル化、アミノ化、ならびに４位及び５位での架橋により、望ましくないフルオレンポリマーコンジュゲートが得られた。しかしながら、フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン系ポリマーコンジュゲートは、予想外に、所望の生物学的特性をもたらした。これらのポリマーコンジュゲートが、以下の有利な特性：
（１）高い蛍光量子収率、
（２）赤方偏移発光、
（３）高い水溶性、
（４）高い直線性、
（５）高い平面性、
（６）第２のフルオロフォアがポリマーに結合したときの高い蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）効率、及び
（７）高い安定性
を有することが見出された。
フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンポリマーが、予想外に、背景技術の項で論じられた問題を緩和し、タンパク質、核酸、及び他のバイオポリマーにコンジュゲートしたときに実質的により蛍光性の蛍光ポリマーコンジュゲートをもたらしたことが発見された。本発明のポリマー−生体分子コンジュゲートの強化された蛍光強度により、より高いアッセイ感度がもたらされる。
さらに、本開示は、典型的には約４０５ｎｍの最大吸光度を呈するポリマーコンジュゲートを提供し、それ故に、これらのポリマーコンジュゲートは、バイオレットレーザーの主要な発光線（４０５ｎｍ）と一致するように選択され得る。本発明のいくつかのポリマーコンジュゲートが非常に長い波長発光を呈するため、それらは、赤外波長に透過性の試料に特に有用である。
本開示は、フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン系ポリマーコンジュゲートを含むポリマーコンジュゲートを提供する。これらの生物学的コンジュゲートは、試料中の分析物またはリガンドの相互作用または存在を見つけるか、または検出するために使用される。本明細書に開示される方法に使用するためのかかるポリマーまたはポリマーコンジュゲートを組み込むキットも企図される。
したがって、本開示は、１）ポリフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン、及び任意に、２）生物学的基質（ＢＳ）を含有するフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン系ポリマーコンジュゲートを含むポリマーコンジュゲートを提供する。本発明のポリマーコンジュゲートは、典型的には、式Ｉの構造を有し、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＡ、Ｂ、及びＣで表される３つのモノマー単位を含み、
Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｘが６〜１００の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜９９から独立して選択される整数であるが、但し、
（１）生物学的基質が式Ｉ内の１つ以上の位置に存在する場合、ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、
（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする。
本明細書で使用されるとき、「アルキル」という用語（単独で、または別の用語（複数可）と組み合わせて）は、典型的には１〜１５個の炭素原子、例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、または１〜４個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖飽和ヒドロカルビル置換基を意味する。「Ｃｎアルキル」基とは、ｎ個の炭素原子を含む脂肪族基を指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子を含む。アルキル基への結合は、炭素原子を介して起こる。かかる置換基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル（分岐または非分岐）、ヘキシル（分岐または非分岐）、ヘプチル（分岐または非分岐）、オクチル（分岐または非分岐）、ノニル（分岐または非分岐）、及びデシル（分岐または非分岐）が挙げられる。「アルキル」という用語は、飽和環式炭化水素置換基が典型的には３〜１４個の炭素環原子を含むことを意味する、シクロアルキル基も含む。シクロアルキルは、典型的には３〜８個の炭素環原子、より典型的には３〜６個の環原子を含む単一炭素環であり得る。シクロアルキル基への結合がシクロアルキル基の環原子を介することが理解される。単一環シクロアルキルの例としては、シクロプロピル（シクロプロパニル）、シクロブチル（シクロブタニル）、シクロペンチル（シクロペンタニル）、シクロヘキシル（シクロヘキサニル）が挙げられる。あるいは、シクロアルキルは、多環式であり得るか、または１つより多くの環を含み得る。多環式シクロアルキルの例としては、架橋、縮合、及びスピロ環式シクロアルキルが挙げられる。スピロ環式シクロアルキルにおいて、１個の原子が２つの異なる環に共通している。スピロ環式シクロアルキルの一例は、スピロペンタニルである。架橋シクロアルキルにおいて、環は、少なくとも２つの共通の非隣接原子を共有する。架橋シクロアルキルの例としては、ビシクロ［２．２．１］ペプタニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エニル、及びアダマンタニルが挙げられる。縮合環シクロアルキル系において、２つの環が１つの共通の結合を共有するように、２つ以上の環が一緒に縮合され得る。二縮合環または三縮合環シクロアルキルの例としては、ナフタレニル、テトラヒドロナフタレニル（テトラリニル）、インデニル、インダニル（ジヒドロインデニル）、アントラセニル、フェナントレニル、及びデカリニルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）」基は、当該技術分野で周知であり、エチレンオキシドモノマー単位で構成される可変鎖長のポリマーであり、そのラジカルは、以下の式：−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨで表され得る。特定の実施形態では、ｎ＝８〜２０である。好ましい実施形態では、ｎ＝１２である。この用語は、分岐状ＰＥＧ、星状ＰＥＧ、及び櫛状ＰＥＧを含み、これらは全て当該技術分野で既知である。本発明で使用するためのＰＥＧ基の具体的な例は、ＰＥＧ６〜ＰＥＧ１８である。
本明細書で使用されるとき、「アリール」という用語（単独で、または別の用語（複数可）と組み合わせて）は、６〜１４個の炭素環原子、または３〜８、３〜６、もしくは５〜６個の炭素環原子を含む芳香族シクロアルキルを意味する。アリールは、単環式または多環式（すなわち、１つより多くの環を含み得る）であり得る。多環式芳香族環の場合、多環式系内の１つのみの環が不飽和でなければならず、残りの環（複数可）は、飽和、部分飽和、または不飽和であり得る。アリール基への結合は、その環に含まれる炭素原子を介して起こる。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、及びテトラヒドロナフチルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール」という用語（単独で、または別の用語（複数可）と組み合わせて）は、環原子のうちの少なくとも１つがヘテロ原子（すなわち、酸素、窒素、または硫黄）であるアリール基を意味する。ヘテロアリールは、単一環、または二縮合もしくは三縮合環であり得る。ヘテロアリール置換基の例としては、６員環置換基、例えば、ピリジル、ピラジル、ピリミジニル、ピリダジニル、及び１，３，５−、１，２，４−、または１，２，３−トリアジニル、５員環置換基、例えば、イミダジル、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、１，２，３−、１，２，４−、１，２，５−、または１，３，４−オキサジアゾリル、及びイソチアゾリル、６／５員縮合環置換基、例えば、ベンゾチオフラニル、ベンズイソキサゾリル、ベンズオキサゾリル、プリニル、ならびに６／６員縮合環、例えば、ベンゾピラニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、及びベンズオキサゾニルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「ＨＧ１」及び「ＨＧ２」は、ポリマーコンジュゲートの末端を表し、それらは独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳ（本明細書で定義されるもの）を表す。
「生物学的基質」は、本明細書の他の箇所で定義される通りである。
本明細書で使用されるとき、「水溶性基」は、親水性官能基を含む。親水性官能基は、ポリマーの水中溶解度を増加または増強するために使用される。本明細書に記載のポリマーは、水性環境での機能性を促進するのに十分な水溶性をポリマーに付与するように、本明細書に記載の１つ以上のモノマーに１つ以上の水溶性基、すなわち、親水性官能基を含む。本明細書に記載のコンジュゲートされた水溶性ポリマーの作製に有用な例示の水溶性基及びコンジュゲートされたポリマーに適用する際の水溶性の概念は、各々参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２００４，１６（２３），ｐｐ．４４６７−４４７６及びＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１０，３９，ｐｐ．２４１１−２４１９に記載されている。「水溶性基」または親水性官能基の具体的な例としては、ＰＥＧ基、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキル基が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、という用語は、「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、塩素、フッ素、臭素、及びヨウ素から選択される基を指す。
本明細書で使用されるとき、「スルホニル」または「スルホ」という用語は、スルホン酸置換基（−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、またはスルホン酸の塩（スルホン酸塩）を意味する。この用語は、スルホニル基のＯＨが別の置換基で置き換えられたスルホン酸基を含む。
同様に、「カルボキシ」とは、カルボン酸置換基またはカルボン酸の塩を意味する。
「ホスホニル」とは、本明細書で使用されるとき、ホスホン酸置換基を意味し、ホスホン酸の塩を含む。この用語は、−Ｐ（Ｏ）（Ｒ１）Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２が各々、アルキル基等の別の置換基であり、Ｒ１及びＲ２が同じであり得るか、または異なり得る）等のホスホニルラジカルも含む。
「ボロニル」とは、本明細書で使用されるとき、ボロン酸を意味し、ボロン酸の塩を含む。この用語は、式−Ｂ（Ｒ）ＯＨ、−Ｂ（Ｒ１）ＯＲ２、または−Ｂ（Ｒ）２（式中、Ｒ１及びＲ２が各々、アルキル基等の別の置換基であり、Ｒ１及びＲ２が同じであり得るか、または異なり得る）のラジカルを含む。
本明細書で使用されるとき、別途指定されない限り、置換基のアルキル部分、例えば、アルキル、アルコキシ、アリールアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム（−Ｎ＋（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）（式中、Ｒ１〜Ｒ３が各々、同じまたは異なるアルキルである））、またはペルフルオロアルキルは、任意に、飽和、不飽和、直鎖状、または分岐状であり、全てのアルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、及びジアルキルアミノ置換基自体が、任意に、カルボキシ、スルホ、アミノ、またはヒドロキシによってさらに置換されている。
本明細書で使用されるとき、「アミノ」という用語は、−ＮＨ２基を指す。アミノ基は、同じであり得るか、または異なり得る１つ以上の置換基で任意に置換され得る（「置換アミノ」）。アミノ基置換基は、アルキル、アリール、及び／またはヘテロシクリル基であり得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキル基を指す。アルコキシ基は、直鎖状、分岐状、または環式飽和もしくは不飽和炭化水素鎖、例えば、メトキシル、エトキシル、プロポキシル、イソプロポキシル、ブトキシル、ｔ−ブトキシル、及びペントキシル等を指し得る。アルコキシ基は、任意に、１つ以上の置換基で任意に置換され得る（「置換アルコキシ」）。
「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨ基を指す。
全ての関連態様に従う特定の実施形態では、Ａ〜Ｃから選択されるモノマー単位は、（本明細書の他の箇所に記載されるように）任意のモノマー単位順に互いに直接結合している。
特定の実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、アルキルもしくはＰＥＧ基を含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基である。複数のリンカーを含む実施形態の場合、これらのリンカーは、同じであり得るか、または異なり得る。
好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は独立して、水素、メチル、またはエチルを表し、ＳＧ１〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｘは、１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｘは、１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｘは、１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘは、１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、スルホニルアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘは、１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、ホスホニルアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘは、１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘは、１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘは、１６〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜６４から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、スルホニルアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘは、１６〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜６４から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、ホスホニルアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘは、１６〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜６４から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘは、１６〜８０の整数であり、ｙ及びｚは各々、０〜６４から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
好ましい一実施形態は、式ＩＩの化合物であり、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＤ、Ｅ、Ｆ、及びＧで表される４つのモノマー単位を含み、
フルオロフォア（ＦＰ）が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超える蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳ（本明細書で定義されるもの）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、ハロゲン、ボロニル、アルキル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｗが６〜１００の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜９８から独立して選択される整数であり、
ｙが１〜２０の整数であるが、但し、
（１）生物学的基質が式ＩＩ内の１つ以上の位置に存在する場合、ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、
（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする。
全ての関連態様に従う特定の実施形態では、Ｄ〜Ｇから選択されるモノマー単位は、（本明細書の他の箇所に記載されるように）任意のモノマー単位順に互いに直接結合している。
特定の実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ基、もしくはＦＰを含むか、またはアルキル、ＰＥＧ基、もしくはＦＰである。複数のリンカーを含む実施形態の場合、これらのリンカーは、同じであり得るか、または異なり得る。
好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６は独立して、水素、メチル、またはエチルを表し、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗは、１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６は独立して、水素、メチル、またはエチルを表し、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗは、１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗは、１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗは、１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗは、１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗは、１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗは、１６〜７９の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜６３から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗは、１６〜７９の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜６３から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、表１から選択される蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗは、１６〜７９の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜６３から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、表１から選択される蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗは、１６〜７９の整数であり、ｘ及びｚは各々、０〜６３から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
好ましい一実施形態は、式ＩＩＩの化合物であり、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＨ、Ｉ、及びＪで表される３つのモノマー単位を含み、
Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｘ、ｙ、及びｚが各々、０〜１００から独立して選択される整数であるが、但し、
（１）生物学的基質が式ＩＩＩ内の１つ以上の位置に存在する場合、ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする。
全ての関連態様に従う特定の実施形態では、Ｈ〜Ｊから選択されるモノマー単位は、（本明細書の他の箇所に記載されるように）任意のモノマー単位順に互いに直接結合している。
特定の実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、アルキルもしくはＰＥＧ基を含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基である。複数のリンカーを含む実施形態の場合、これらのリンカーは、同じであり得るか、または異なり得る。
好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は独立して、水素、メチル、またはエチルを表し、ＳＧ１〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、スルホニルアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、ホスホニルアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、スルホニルアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、ホスホニルアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１及びＳＧ２は、ＰＥＧであり、ＳＧ３〜ＳＧ６は独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ｘ、ｙ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
好ましい一実施形態は、式ＩＶの化合物であり、
Figure 2019512573
式中、ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＫ、Ｌ、Ｍ、及びＮで表される４つのモノマー単位を含み、
フルオロフォア（ＦＰ）が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超える蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳ（本明細書で定義されるもの）を表し、
ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、ハロゲン、ボロニル、アルキル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｗ、ｘ、及びｚが各々、０〜１００から独立して選択される整数であり、ｙが１〜２０の整数であるが、但し、
（１）生物学的基質が式ＩＶ内の１つ以上の位置に存在する場合、ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
ことを条件とする。
全ての関連態様に従う特定の実施形態では、Ｋ〜Ｎから選択されるモノマー単位は、（本明細書の他の箇所に記載されるように）任意のモノマー単位順に互いに直接結合している。
特定の実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、アルキル、ＰＥＧ基、もしくはＦＰを含むか、またはアルキル、ＰＥＧ基、もしくはＦＰである。複数のリンカーを含む実施形態の場合、これらのリンカーは、同じであり得るか、または異なり得る。
式Ｉ〜ＩＶのポリマーコンジュゲートのモノマー単位は、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布している。したがって、これらのモノマー単位は、任意の順にポリマー主鎖全体にわたって見られ得る。特定の実施形態では、これらのモノマー単位は、互いに直接結合していてもよい。換言すると、式Ｉを一例として使用して、ポリマー主鎖がモノマー単位Ａ−Ｂ−Ｃの順（ＨＧ１末端からＨＧ２末端への方向に）で描写されるが、これは、例証目的のみのためであり、このモノマー単位の順は任意の順であり得る。これは、本発明に従うポリマーが、実際には、成分モノマーの順に関して完全にランダムである（例えば、特定の３つのモノマー配列が、実際には、ＨＧ１末端からＨＧ２末端への方向にＡ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｃ−Ｂ、Ｃ−Ｂ−Ａ、Ｃ−Ａ−Ｂ、Ｂ−Ａ−Ｃ、Ｂ−Ｃ−Ａ等であり得る）ためである。
各モノマーとポリマー主鎖との間の結合の位置は、関連モノマー位置から延びる結合として示される。したがって、結合が２つのフルオレンモノマー間（例えば、式ＩのモノマーＢとモノマーＣとの間）である場合、その結合は、一方のモノマーのＣ７と他方のモノマーのＣ２との間である。結合が２つのフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマー間（例えば、式ＩＩＩのモノマーＨとモノマーＩとの間）である場合、その結合は、一方のモノマーのＣ２と他方のモノマーのＣ８との間である。フルオレンモノマーがフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマーに結合される（例えば、式ＩＩのモノマーＤ及びＥ）状況では、ＨＧ１〜ＨＧ２軸に対するモノマー配列の配向に応じて２種類の結合が可能である。一方の配向では、結合は、例えば、モノマー配列Ｄ−Ｅ（ＨＧ１末端からＨＧ２末端）における、フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマーのＣ８とフルオレンのＣ７との間で行われる。同様に、他方の配向では、フルオレンモノマーとフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンモノマーとの間の結合は、例えば、モノマー配列Ｅ−Ｄ（ＨＧ１末端からＨＧ２末端）における、フルオレンのＣ２とフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンのＣ２との間であろう。参考までに、本明細書全体にわたって論じられるフルオレンのコア構造及びフルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピンの基本構造の炭素数は、本出願の要約に提供される。モノマー間の直接結合により、ポリマーコンジュゲートのバイオレットレーザー励起機能性が保存される。
好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４は独立して、水素、メチル、またはエチルを表し、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４は独立して、水素、メチル、またはエチルを表し、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、表１から選択される蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、またはボロニルを表し、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
他の好ましい実施形態では、ＦＰは、表１から選択される蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ４は、水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７は独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２は独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌは、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖を含むか、またはアルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、ＢＳは、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗ、ｘ、及びｚは各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙは、１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０であることを条件とする。
本発明のポリマーに連結したフルオロフォア（ＦＰ）は、典型的には、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が１０％を超える蛍光色素である。それらは、典型的には、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、または他の多環式芳香族から選択される。これらのうちの多くは、いくつかの非限定的な例として表１に選択的に列記されるように市販されている。
（表１）ＰＦＯポリマーに連結し得る典型的なフルオロフォア
Figure 2019512573
Figure 2019512573
Figure 2019512573
Figure 2019512573
Figure 2019512573
Figure 2019512573
Figure 2019512573
本発明の一態様では、アルキルカルボキシは、式Ｖで表され、
−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＷ
式Ｖ
式中、ｎが、１〜２０であり、
Ｗが、水素、アルカリ金属イオン、アンモニウム、または他の生物学的に適合性の対イオンである。
本発明の一態様では、アルキルスルホン酸塩は、式ＶＩで表され、
−（ＣＨ２）ｎＳ（＝Ｏ）２ＯＷ
式ＶＩ
式中、ｎが、２〜１０であり、
Ｗが、水素、アルカリ金属イオン、アンモニウム、または他の生物学的に適合性の対イオンである。
本発明の一態様では、アルキルホスホン酸塩は、式ＶＩＩで表され、
−（ＣＨ２）ｎＰ（＝Ｏ）Ｏ２Ｗ２
式ＶＩＩ
式中、ｎが、２〜１０であり、
Ｗが、水素、アルカリ金属イオン、アンモニウム、または他の生物学的に適合性の対イオンである。
本発明の一態様では、アルキルアンモニウムは、式ＶＩＩＩで表され、
−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ３）Ｘ
式ＶＩＩＩ
式中、ｎが、１〜２０であり、
Ｒが、短いアルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル）であり、
Ｘが、生物学的に適合性のアニオン、例えば、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、またはＩ−である。
本発明の一態様では、リンカーＬは、式ＩＸで表され、
−（ＣＨ２）ｎ−
式ＩＸ
式中、ｎが、１〜２０である。
本発明の一態様では、リンカーＬは、式Ｘで表され、
−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−
式Ｘ
式中、ｎが、２〜２０である。
本発明の化合物の多くの実施形態が、全電子電荷を持つ。かかる電子電荷が存在することが示される場合、それらが、明確に特定されている場合もされていない場合もある適切な対イオンの存在によって平衡化されていることを理解されたい。いくつかの用途に好ましい生物学的に適合性の対イオンは、生物学的用途に有毒ではなく、生体分子に実質的に有害な影響を及ぼさない。本発明の化合物が正に帯電している場合、対イオンは、典型的には、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、アルカンスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、テトラアリールホウ化物、硝酸塩、及び芳香族または脂肪族カルボン酸のアニオンから選択されるが、これらに限定されない。本発明の化合物が負に帯電している場合、対イオンは、典型的には、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン、アンモニウムもしく置換アンモニウム、またはピリジニウムイオンから選択されるが、これらに限定されない。好ましくは、いずれの必要な対イオンも、生物学的に適合性であり、使用時に有毒ではなく、生体分子に実質的に有害な影響を及ぼさない。対イオンは、イオン交換クロマトグラフィーまたは選択的沈殿等の当該技術分野で周知の方法によって容易に変更され得る。
本発明のポリマーコンジュゲートが１つまたは別の特定の電子共鳴構造に描かれていることを理解されたい。主題のポリマーコンジュゲートへの電子電荷がポリマーコンジュゲート自体にわたって非局在化されるため、本発明の全ての態様が、他の許容される共鳴構造で正式に描かれたポリマーコンジュゲートに同等に適用される。
本発明の特定の実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、Ｌ−ＦＰ−ＢＳを包含するために少なくとも１つのＬ−ＢＳを含み、ＢＳは、任意の好適な反応によってポリマーに結合する。本発明によれば、ＢＳは、典型的には、共有結合によりポリマーにコンジュゲートされる。いくつかのかかる周知の反応が、一例として表２に列記される。ある特定の実施形態では、ポリマーをＢＳに結合する共有結合は、リンカー（Ｌ）としての役目を果たす複数の介在原子を含む。リンカーは、いくつかの実施形態では、ＦＰを組み込むことができ、それ故に、Ｌ−ＦＰ−ＢＳをもたらす。ポリマーは、好適な反応性を有する官能基を含み、コンジュゲートされた物質の化学結合をもたらすか、またはそのように修飾された多種多様の生物学的、有機、または無機物質を標識するために使用され得る。
（表２）Ｌ−ＢＳまたはＦＰ−ＢＳの共有結合を調製するための官能基の例
Figure 2019512573
Figure 2019512573
コンジュゲートされる生物学的基質にポリマーを結合するために使用される結合の選択は、典型的には、コンジュゲートされる生物学的基質の官能基及び所望の共有結合の種類または長さに依存する。典型的には有機または無機生物学的基質に存在する官能基の種類には、アミン、アミド、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、ホスホン酸塩、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、ハロゲン化物、エポキシド、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、プリン、ピリミジン、カルボン酸、オレフィン結合、アジド、アルキン、テトラジン、またはこれらの基の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。単一の種類の反応性部位が生物学的基質で利用可能であり得る（多糖に典型的である）か、またはタンパク質に典型的であるように、様々な部位が生じ得る（例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール）。コンジュゲートされた生物学的基質は、同じであり得るか、または異なり得る１つより多くのポリマーコンジュゲートにコンジュゲートされ得るか、またはビオチン等のハプテンによってさらに修飾される生物学的基質にコンジュゲートされ得る。あるいは、複数の基質が単一のポリマーにコンジュゲートされ得る。いくつかの選択性が反応条件を慎重に制御することによって得られ得るが、標識化の選択性は、適切な反応性ポリマーコンジュゲートの選択によって最も良好に得られる。
典型的には、本発明のポリマーは、例えば、置換基または生物学的基質の一部として含まれるアミン、チオール、アルコール、アルデヒド、またはケトンと反応する。好ましくは、本発明のポリマーは、アミン基、チオール官能基、またはクリック可能な基と反応することができる。いくつかの実施形態では、ポリマーの官能基（複数可）は、アクリルアミド、反応性アミン（カダベリンまたはエチレンジアミンを含む）、カルボン酸活性化エステル（典型的には、カルボン酸スクシンイミジルエステル）、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロナート、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ホスホロアミダイト、反応性白金錯体、ハロゲン化スルホニル、テトラジン、アジド、アルキン、またはチオール基である。「反応性白金錯体」とは、具体的には、米国特許第５，５８０，９９０号、同第５，７１４，３２７号、及び米国特許第５，９８５，５６６号に記載のもの等の化学反応性白金錯体を意味する。
ポリマーの官能基（複数可）がアジド、ジアジリニル、アジドアリール、またはソラレン誘導体等の光活性化可能物である場合、ポリマーは、適切な波長の光で照射した後にのみ化学反応性になる。ポリマーの官能基（複数可）がカルボン酸の活性化エステルである場合、反応性ポリマーは、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはハプテンのポリマーコンジュゲートの調製に特に有用である。ポリマーの官能基（複数可）がマレイミドまたはハロアセトアミドである場合、反応性ポリマーは、チオール含有生物学的基質へのコンジュゲーションに特に有用である。ポリマーの官能基（複数可）がヒドラジドである場合、反応性ポリマーは、過ヨウ素酸酸化炭水化物及び糖タンパク質へのコンジュゲーションに特に有用であり、加えて、細胞微量注入のためのアルデヒド固定可能極性トレーサーである。ポリマーの官能基（複数可）がクリック可能である場合、反応性ポリマーは、相補的クリック可能な基質へのコンジュゲーションに特に有用である。好ましくは、ポリマーの官能基（複数可）は、カルボン酸、カルボン酸スクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソチオシアナート、マレイミド基、脂肪族アミン、ペルフルオロベンズアミド、アジドペルフルオロベンズアミド基、またはソラレンである。より好ましくは、ポリマーの官能基（複数可）は、カルボン酸スクシンイミジルエステル、マレイミド、ヨードアセトアミド、または反応性白金錯体である。
上述の特質に基づいて、本発明の適切な反応性ポリマーは、所望のポリマーコンジュゲートの調製のために選択され、それらの有利な特性により、それらが多種多様の用途に有用なものになる。特に有用なポリマーコンジュゲートとしては、とりわけ、生物学的基質が、ペプチド、ヌクレオチド、抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝物、毒素、環境汚染物質、アミノ酸、タンパク質、核酸、核酸ポリマー（オリゴヌクレオチド等）、炭水化物、脂質、またはイオン錯体化部分であるコンジュゲートが挙げられる。あるいは、生物学的基質は、細胞、細胞系、細胞断片、または細胞内粒子（例えば、とりわけ）、ウイルス粒子、細菌粒子、ウイルス成分、生物学的細胞（動物細胞、植物細胞、細菌、酵母、もしくは原生生物等）、または細胞成分である。反応性ポリマーは、典型的には、細胞表面、細胞膜、小器官、または細胞質の官能基を標識する。
典型的には、生物学的基質は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、チラミン、多糖、イオン錯体化部分、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、ポリマー、ポリマー微粒子、生物学的細胞、またはウイルスである。より典型的には、生物学的基質は、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸である。本発明のポリマーコンジュゲートをかかるバイオポリマーにコンジュゲートする場合、蛍光シグナルを増加させるために１分子当たりより多くのポリマーを組み込むことが可能である。ポリマー−抗体コンジュゲートの場合、１つのポリマー／抗体が好ましい。
特定の実施形態では、生物学的基質は、アミノ酸（ホスホン酸塩、炭水化物、もしくはＣ１〜Ｃ２５カルボン酸によって保護または置換されているものを含む）であるか、またはペプチドもしくはタンパク質等のアミノ酸ポリマーである。好ましいペプチドコンジュゲートは、少なくとも５個のアミノ酸、より好ましくは、５〜３６個のアミノ酸を含む。好ましいペプチドとしては、神経ペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質、及びタンパク質キナーゼ基質が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいタンパク質コンジュゲートとしては、酵素、抗体、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、フィコビリタンパク質、及び他の蛍光タンパク質、ホルモン、毒素、ケモカイン、ならびに成長因子が挙げられる。好ましい一態様では、コンジュゲートされたタンパク質は、ポリマー抗体コンジュゲートである。
本発明の一態様では、コンジュゲートされた生物学的基質は、抗体（インタクトな抗体、抗体断片、及び抗体血清等を含む）、アミノ酸、アンギオスタチンもしくはエンドスタチン、アビジンもしくはストレプトアビジン、ビオチン（例えば、アミドビオチン、ビオシチン、デスチオビオチン等）、血液成分タンパク質（例えば、アルブミン、フィブリノゲン、プラスミノーゲン等）、デキストラン、酵素、酵素阻害剤、ＩｇＧ−結合タンパク質（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ等）、蛍光タンパク質（例えば、フィコビリタンパク質、エクオリン、緑色蛍光タンパク質等）、成長因子、ホルモン、レクチン（例えば、コムギ胚芽凝集素、コンコナバリンＡ等）、リポ多糖、金属結合タンパク質（例えば、カルモジュリン等）、微生物もしくはその一部（例えば、細菌、ウイルス、酵母等）、神経ペプチド及び他の生物学的に活性な因子（例えば、デルモルフィン、デルトロピン、エンドモルフィン、エンドルフィン、腫瘍壊死因子等）、非生物学的微粒子（例えば、フェロ流体、金、ポリスチレン等のもの）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド毒素（例えば、アパミン、ブンガロトキシン、ファロイジン等）、リン脂質結合タンパク質（例えば、アネキシン等）、小分子薬物（例えば、メトトレキサート等）、構造タンパク質（例えば、アクチン、フィブロネクチン、ラミニン、微小管関連タンパク質、チューブリン等）、またはチラミドであり得る。
別の態様では、生物学的基質は、本発明のポリマーコンジュゲートの結合、例えば、アルキニル結合（米国特許第５，０４７，５１９号）、アミノアリル結合（米国特許第４，７１１，９５５号）、もしくはヘテロ原子置換リンカー（米国特許第５，６８４，１４２号）、または他の結合のために追加のリンカーまたはスペーサーを有するように修飾されたものを含む、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸ポリマーであり得る。他の実施形態では、コンジュゲートされた生物学的基質は、非環式スペーサーを介してプリンまたはピリミジン塩基をリン酸部分またはポリリン酸部分に結合するヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体である。他の実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、典型的にはヒドロキシル基を介するが、加えて、チオールまたはアミノ基を介してヌクレオチドまたはヌクレオシドの炭水化物部分にコンジュゲートされる（米国特許第５，６５９，０２５号、同第５，６６８，２６８号、同第５，６７９，７８５号）。典型的には、コンジュゲートされたヌクレオチドは、ヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸またはジデオキシヌクレオシド三リン酸である。メチレン部分または窒素もしくは硫黄ヘテロ原子のリン酸またはリン酸部分への組み込みも有用である。非プリン塩基及び非ピリミジン塩基、例えば、７−デアザプリン（米国特許第６，１５０，５１０号）及びかかる塩基を含む核酸も、本発明のポリマーコンジュゲートに結合され得る。脱プリン化核酸と、アミン、ヒドラジド、またはヒドロキシルアミン誘導体との反応によって調製された核酸付加体は、核酸を標識及び検出するさらなる手段、例えば、”Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ：ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ．”Ａｔａｍｎａ Ｈ，Ｃｈｅｕｎｇ Ｉ，Ａｍｅｓ ＢＮ．ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，６８６−６９１（２０００）を提供する。
好ましい核酸ポリマーコンジュゲートは、標識、一本鎖もしくは複数本鎖、天然もしくは合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであるか、またはモルホリン誘導体化リン酸塩等の珍しいリンカーもしくはＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位等のペプチド核酸を組み込む。核酸が合成オリゴヌクレオチドである場合、それは、典型的には５０個未満のヌクレオチド、より典型的には２５個未満のヌクレオチドを含む。ペプチド核酸（ＰＮＡ）のコンジュゲート（Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．米国特許第５，５３９，０８２号）は、それらの一般により速いハイブリダイゼーション速度のため、いくつかの用途に好ましい場合がある。
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドは、代謝物、ポリマーコンジュゲート、ハプテン、またはタンパク質等の特定の標的分子のアプタマーである。換言すれば、オリゴヌクレオチドは、標的分子に優先的に結合するように選択されている。所与の標的分子のアプタマーを調製及びスクリーニングする方法が以前に説明されており、当該技術分野で既知である［例えば、米国特許第５，５６７，５８８号（Ｇｏｌｄ（１９９６））］。
他の実施形態では、生物学的基質は、典型的にはデキストラン、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、デンプン、アガロース、及びセルロース等の多糖である炭水化物である。あるいは、炭水化物は、リポ多糖である多糖である。好ましい多糖コンジュゲートは、デキストラン、または、リポ多糖コンジュゲートである。
イオン錯体化部分を有するコンジュゲートは、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、亜鉛、カリウム、または他の生物学的に重要な金属イオンの指標としての役目を果たす。好ましいイオン錯体化部分は、クラウンエーテル（米国特許第５，４０５，９７５号）、１，２−ビス−（２−アミノフェノキシエタン）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸の誘導体（ＢＡＰＴＡキレート剤、米国特許第５，４５３，５１７号、同第５，５１６，９１１号、及び同第５，０４９，６７３号）、２−カルボキシメトキシアニリン−Ｎ，Ｎ−ジ−酢酸の誘導体（ＡＰＴＲＡキレート剤、ＡＭ．Ｊ．ＰＨＹＳＩＯＬ．，２５６，Ｃ５４０（１９８９））、またはピリジンベース及びフェナントロリンベースの金属イオンキレート剤（米国特許第５，６４８，２７０号）、またはニトリロ三酢酸の誘導体であり、例えば、”Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ， ａ ｕｎｉｑｕｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ”，ＭｃＭａｈａｎ ＳＡ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ ＲＲ，ＡＮＡＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，２３６，１０１−１０６（１９９６）を参照されたい。好ましくは、イオン錯体化部分は、クラウンエーテルキレート剤、ＢＡＰＴＡキレート剤、ＡＰＴＲＡキレート剤、またはニトリロ三酢酸の誘導体である。
本発明の全ての態様に従うある特定の実施形態では、生物学的基質が、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または核酸ポリマー等の生物学的ポリマーである場合、生物学的基質は、任意に本発明の追加のポリマーコンジュゲートである少なくとも第２の蛍光色素コンジュゲートでも標識されて、エネルギー伝達対を形成する。本開示によるエネルギー伝達対は、広範に、それらの間でエネルギーを伝達することができる発色団またはフルオロフォア等の光感受性分子を含む。例えば、ドナー発色団／フルオロフォアは、第１の光波長によってその電子的励起状態に励起され得、その後、例えば、非放射性双極子−双極子結合等を介して、アクセプター発色団／フルオロフォアにエネルギーを伝達することができる。１つの発色団／フルオロフォアが第１の波長のエネルギーを吸収することができ、エネルギーが第２の発色団／フルオロフォアに伝達され、第２の発色団／フルオロフォアからのエネルギー放出が第２の異なる波長で行われる。エネルギー伝達の効率は、２つの発色団／フルオロフォア間の距離に反比例する。ある特定の態様によれば、第１の発色団／フルオロフォアは、本明細書に記載のポリマーの第１のモノマーに位置し得、第２の発色団／フルオロフォアは、本明細書に記載のポリマーの第２のモノマーに位置し得るが、第１の発色団／フルオロフォア及び第２の発色団／フルオロフォアがエネルギー伝達対を構成するのに十分近い。あるいは、第１の発色団／フルオロフォアは、本明細書に記載のポリマーの第１のモノマーに位置し得、第２の発色団／フルオロフォアは、第１の発色団／フルオロフォア及び第２の発色団／フルオロフォアがエネルギー伝達対を構成するのに、すなわち、エネルギーを第１の発色団／フルオロフォアから第２の発色団／フルオロフォアに伝達するのにその系内の第１の発色団／フルオロフォアに十分近い位置に位置し得る。あるいは、エネルギー伝達対の２つのメンバーは、他の分子に結合または縮合する蛍光タンパク質の一部であり得る。蛍光タンパク質の一部が互いに十分に近い場合、それらはフルオロフォアを形成する。
本発明のいくつかの態様では、標識されたコンジュゲートまたは生物学的基質は、酵素基質として機能し、酵素加水分解がエネルギー伝達を妨害する。この様式で、エネルギー伝達対間のエネルギー伝達の妨害及び結果として生じる蛍光の妨害は、酵素基質として標識されたコンジュゲートまたは生物学的基質を有する標的酵素の活性を示す役目を果たす。アミノ酸、ペプチド、タンパク質、チラミン、多糖、イオン錯体化部分、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、ポリマー、ポリマー微粒子、生物学的細胞、またはウイルス等の生物学的基質を分解するか、またはさもなければ妨害するために使用され得る酵素は、当業者に既知である。したがって、例えば、加水分解プローブ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ等）は、ポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ活性に依存して、蛍光ドナー部分の消光を妨害し得る。
本発明の他の実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートを組み込むエネルギー伝達対は、そのヘアピン立体構造における効率的な蛍光消光［いわゆるＴｙａｇｉ，ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１６，４９（１９９８）の「分子ビーコン」］または蛍光エネルギー伝達を呈するオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。生物学的プロセスによる蛍光エネルギー伝達の妨害は、生物学的プロセスの監視に使用され得る。
反応性ポリマーコンジュゲートを使用したポリマーコンジュゲートの調製は、例えば、米国特許第８，１５８，４４４号、米国特許第８，４５５，６１３号、米国特許第８，３５４，２３９号、米国特許第８，３６２，１９３号、及び米国特許第８，５７５，３０３号（Ｇａｙｌｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．）、ならびにＷＯ２０１３／１０１９０２（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．）で十分に立証されている。ポリフルオレンポリマーの他の生物学的用途は、Ｔｈｏｍａｓ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００７，１０７，１３３９）、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１２，１１２，４６８７）、及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１１，４０，３５０９）によって十分に立証されている。コンジュゲートは、典型的には、適切な反応性ポリマー及びコンジュゲートされる生物学的基質を、いずれも可溶性である好適な溶媒中で混合することによって得られる。本発明のポリマーコンジュゲートは、水溶液中で易溶性であり、多くの生物学的材料とのコンジュゲーション反応を容易にする。光活性化される反応性ポリマーコンジュゲートの場合、コンジュゲーションは、反応性ポリマーコンジュゲートを活性化するために反応混合物の照射を必要とする。
反応性ポリマーの合成
本発明の反応性ポリマーの合成は、図３に図解されるある特定の主要な中間体の初期調製に依存する。簡略化のために、可能な置換基のうちのいくつかを除いて全てが水素として示されている。これらの基本構造は、合成中または合成後に任意にさらに置換されて、上で定義される対応するポリマーコンジュゲート置換基が得られる。同等の結果をもたらし得る多くの可能な変形が存在することが認識される。
表２に記載されるもの等の様々な反応性官能基を含むポリマーを合成するための方法は、当該技術分野で十分に立証されている。典型的にはカルボン酸を比較的酸性の「脱離基」に結合することによって合成されるカルボン酸の「活性化エステル」等のアミン反応性ポリマーコンジュゲートが特に有用である。他の好ましいアミン反応性基としては、ＰＣｌ５またはＰＯＣｌ３等のハロゲン化剤を使用してスルホン酸から調製されるハロゲン化スルホニル、シアヌル酸ハロゲン化とアミンとの反応によって調製されるハロトリアジン、ならびにそれぞれ、アミン及びホスゲンまたはチオホスゲンから調製されるイソシアナートまたはイソチオシアナートが挙げられる。アジド、アルキン、及びテトラジンを含むポリマーは、クリック基含有活性化エステルによって修飾された抗体等のクリック基修飾基質へのコンジュゲーションに特に有用である。
アミン及びヒドラジドを含むポリマーは、カルボン酸、アルデヒド、及びケトンへのコンジュゲーションに特に有用である。多くの場合、これらは、カルボン酸の活性化エステルまたはハロゲン化スルホニルとカダベリン等のジアミンまたはヒドラジンとの反応によって合成される。あるいは、芳香族アミンは、一般に、芳香族ニトロ化合物の化学的還元によって合成される。アミン及びヒドラジンは、標準の方法によるチオール反応性ハロアセトアミドまたはマレイミドの合成に特に有用な前駆体である。
用途及び使用方法
一用途では、本発明のポリマーコンジュゲートは、試料が特定または定量され得るように試料を直接染色または標識するために使用される。かかる使用は、インビトロ用途であり得る。例えば、かかるポリマーコンジュゲートは、生物学的標的分析物のアッセイの一部として、生物学的もしくは非生物学的流体中の検出可能なトレーサー要素として、またはポリマーコンジュゲート試料が照射されて腫瘍細胞及び組織を選択的に破壊する腫瘍の光力学的療法の目的のために、または通常一重項酸素の光増感産生による動脈プラークまたは細胞にフォトアブレーションを行うために添加され得る。好ましい一実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、コンジュゲートされた生物学的基質が特異的結合対の相補的メンバーであるリガンドを含む試料を染色するために使用される。本発明に従って有用な代表的な結合対が表３に記載される。
典型的には、試料は、液体源から直接得られるか、あるいは細胞が培養のために導入された固体材料（有機もしくは無機）または成長培地からの洗浄物、または細胞が評価のために入れられた緩衝溶液として得られる。試料が細胞を含む場合、細胞は、任意に、単一の細胞、例えば、微生物、または二次元もしくは三次元層における他の細胞に関連した複数の細胞、例えば、多細胞生物、胚、組織、生検、フィラメント、生物膜等である。
あるいは、試料は、固体、任意に、スメアもしくはスクレープ、または濾過によって液体または蒸気から除去された残余分である。本発明の一態様では、試料は、生物学的流体、例えば、尿、脳脊髄液、血液、リンパ液、組織ホモジネート、間質液、細胞抽出物、粘液、唾液、痰、大便、生理学的分泌物、または他の同様の流体等の分離されているか、または濾過されていない生物学的流体から得られる。あるいは、試料は、環境源、例えば、土壌、水、もしくは空気から、または工業源、例えば、廃棄物流、水源、供給ライン、もしくは生産ロットから採取されるものから得られる。
（表３）代表的な特異的結合対
Figure 2019512573
＊ＩｇＧは、免疫グロブリンである。＊＊ａＤＮＡ及びａＲＮＡは、ハイブリダイゼーションに使用されるアンチセンス（相補的）鎖である。
なお他の実施形態では、試料は、固体または半固体マトリックス上またはその内部に存在し得る。本発明の一態様では、マトリックスは、膜である。別の態様では、マトリックスは、例えば核酸もしくはタンパク質を分離及び特徴付けるために使用される電気泳動ゲルであるか、または、電気泳動ゲルを膜に移動させることによって調製されるブロットである。別の態様では、マトリックスは、シリコンチップまたはスライドガラスであり、目的とする分析物は、アレイ内のシリコンチップまたはスライドガラス上に固定されている（例えば、試料は、マイクロアレイ内のタンパク質または核酸ポリマーを含む）。なお別の態様では、マトリックスは、マイクロウェルプレートまたはマイクロ流体チップであり、試料は、自動化法、典型的には、薬物スクリーニング等の様々なハイスループットスクリーニング法によって分析される。
本発明のポリマーコンジュゲートは、一般に、検出可能な光学的応答をもたらすために選択された条件下で上述の本発明のポリマーコンジュゲートを目的とする試料と組み合わせることによって利用される。「ポリマーコンジュゲート」という用語は、特許請求されるポリマーコンジュゲートの全ての態様を指すために本明細書で使用される。ポリマーコンジュゲートは、典型的には、試料の要素と共有会合もしくは複合体を形成するか、または単に試料もしくは試料の一部の結合内に存在する。次いで、試料は、光学的応答を誘発するように選択された波長で照射される。典型的には、試料の染色は、光学的応答を標準の応答または予期される応答とさらに比較することによって試料の特定の特性を決定するために使用される。
検出可能な光学的応答とは、観察または器具を用いてのいずれかによって検出可能な光シグナルの変化またはその発生を意味する。典型的には、検出可能な応答とは、蛍光の変化、例えば、蛍光、蛍光寿命、蛍光偏光、またはそれらの組み合わせの強度、励起、または発光波長分布の変化である。標準の応答または予期される応答と比較した染色の程度及び／または位置は、試料が所与の特性を有するか、かつ試料が所与の特性をどの程度有するかを示す。
生物学的用途の場合、本発明のポリマーコンジュゲートは、典型的には、当該技術分野で一般に知られている方法に従って調製された水溶性、主に水溶性、または水溶性−混和性溶液中で使用される。ポリマーコンジュゲートの正確な濃度は、実験条件及び所望の結果に依存する。最適濃度は、最小バックグラウンド蛍光で満足な結果が達成されるまで系統的変動によって決定される。
ポリマーコンジュゲートは、最も有利には、生物学的成分を有する試料を染色するために使用される。試料は、成分の異種混合物（インタクトな細胞、細胞抽出物、細菌、ウイルス、小器官、及びそれらの混合物を含む）、または単一成分もしくは成分の同種群（例えば、天然もしくは合成アミノ酸、核酸もしくは炭水化物ポリマー、または脂質膜複合体）を含み得る。これらのポリマーコンジュゲートは、一般に、使用濃度内で生細胞及び他の生物学的成分に非毒性である。
ポリマーコンジュゲートは、ポリマーコンジュゲートと目的とする試料成分との間の接触を促進する任意の方法で試料と組み合わせられる。典型的には、ポリマーコンジュゲートまたはポリマーコンジュゲートを含有する溶液は、単に試料に添加される。本発明のある特定のポリマーコンジュゲートは、生物学的細胞の膜に非透過性である傾向があり、一旦内部に入ると、生存細胞は、典型的には、良好に保持される。電気穿孔、ショック療法、または高細胞外ＡＴＰ等の原形質膜を透過化する処理を使用して、選択されたポリマーコンジュゲートを細胞内に導入することができる。あるいは、選択されたポリマーコンジュゲートは、例えば、圧力微量注入、スクレープ装填、パッチクランプ法、または貪食によって細胞内に物理的に挿入され得る。
脂肪族アミンまたはヒドラジン残基を組み込むポリマーコンジュゲートは、細胞内に微量注入され得、そこで、ポリマーコンジュゲートらがホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド等のアルデヒド固定剤によって適所に固定され得る。この固定可能性により、かかるポリマーコンジュゲートがニューロン追跡等の細胞内用途に有用なものになる。
リン脂質等の脂溶性置換基を有するポリマーコンジュゲートは、例えば、膜構造のプローブとして使用するために、またはリポソーム、リポタンパク質、フィルム、プラスチック、脂溶性ミクロスフェア、もしくは同様の材料内に組み込むために、または追跡するために、脂質集合体内に非共有的に組み込まれる。脂溶性ポリマーコンジュゲートは、膜構造の蛍光プローブとして有用である。
細胞の表面上、細胞膜内、または細胞内区画、例えば、小器官内、または細胞質内の活性部位を標識するためのポリマーコンジュゲートの使用により、試料中のそれらの存在もしくは量、到達性、またはそれらの空間及び時間分布の決定が可能になる。光反応性ポリマーコンジュゲートは、生物学的細胞の外膜の成分を光標識するために、または細胞の光固定可能な極性トレーサーとして同様に使用され得る。
任意に、試料は、染色後に洗浄されて、残留ポリマーコンジュゲート、過剰なポリマーコンジュゲート、または結合していないポリマーコンジュゲートが除去される。試料は、任意に、染色の経過中に、洗浄溶液、透過化及び／または固定溶液、ならびに追加の検出試薬を含有する溶液等の１つ以上の他の溶液と組み合わせられる。追加の検出試薬は、典型的には、特定の細胞成分、細胞内生物学的基質、または細胞条件の存在により、当該技術分野で一般に知られている方法に従って検出可能な応答をもたらす。追加の検出試薬が主題のポリマーコンジュゲートのスペクトル特性とは異なるスペクトル特性を有するか、または主題のポリマーコンジュゲートのスペクトル特性とは異なるスペクトル特性を有する生成物を産出する場合、多色用途が可能である。これは、追加の検出試薬が染色ポリマーコンジュゲートのスペクトル特性とは検出可能に異なるスペクトル特性を有する本発明のポリマーコンジュゲートまたはポリマーコンジュゲート−コンジュゲートである場合に特に有用である。
本発明のポリマーコンジュゲートは、当該技術分野で広く知られている方法、例えば、顕微鏡法及び免疫蛍光アッセイにおける抗体コンジュゲートの使用、ならびに核酸ハイブリダイゼーションアッセイ及び核酸配列決定のためのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用に従って使用される（例えば、米国特許第５，３３２，６６６号（Ｐｒｏｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４））、米国特許第５，１７１，５３４号（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９２））、米国特許第４，９９７，９２８号（Ｈｏｂｂｓ（１９９１））、及びＷＯ出願第９４／０５６８８号（Ｍｅｎｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．））。本発明の複数の独立したポリマーコンジュゲートを含むコンジュゲートは、多色用途に有用である。
染色後または染色中の任意の時点で、試料は、検出可能な光学的応答をもたらすように選択された光波長で照射され、光学的応答を検出するための手段を用いて観察される。本発明のポリマーコンジュゲートの照射に有用な機器としては、手持ち型紫外線ランプ、水銀アークランプ、キセノンランプ、レーザー、及びレーザーダイオードが挙げられるが、これらに限定されない。これらの照射源は、任意に、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、標準もしくは小型蛍光光度計、またはクロマトグラフ検出器内に統合される。本発明の好ましい実施形態は、４０５ｎｍの波長またはそれに近い波長で励起可能なポリマーコンジュゲートである。
光学的応答は、任意に、目視検査によって、または以下のデバイス：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真用フィルム、レーザー走査デバイス、蛍光光度計、光ダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーのうちのいずれかの使用によって、または光電子増倍管等のシグナルを増幅するための手段によって検出される。試料がフローサイトメーターを使用して試験される場合、試料の試験は、任意に、それらの蛍光応答に従って試料の一部を選別することを含む。
本発明の一態様は、上述のように本発明のポリマーコンジュゲートのうちのいずれかを使用して様々なアッセイの実施を容易にする製剤キットである。本発明のキットは、典型的には、コンジュゲートされた生物学的基質が、特異的結合対メンバー、またはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマー、ペプチド、もしくはタンパク質である、本発明の蛍光ポリマーコンジュゲートを含む。他の実施形態では、キットは、コンジュゲートされていないポリマー及びそれにコンジュゲートするための生物学的基質を含む。コンジュゲートした後、作製された蛍光ポリマーコンジュゲートは、本明細書に記載の本発明のポリマーコンジュゲートである。キットは、任意に、典型的には水溶液として存在する１つ以上の緩衝剤をさらに含む。本発明のキットは、任意に、追加の検出試薬、結果として生じる標識された生物学的基質を精製するための精製培地、発光標準物、酵素、酵素阻害剤、有機溶媒、及び／または本発明のアッセイを行うための指示をさらに含む。
本発明の選択されたポリマーコンジュゲートのいくつかの合成戦略の実施例、ならびにそれらの特徴付け、合成前駆体、コンジュゲート、及び使用方法が、以下の実施例に提供される。さらなる修正及び置換が当業者には明らかであろう。以下の実施例は、本発明の実施を例証するために提供されている。それらは、本発明の全範囲を限定または定義するようには意図されていない。本発明が記載される特定の態様に限定されず、それ故に変化することを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の態様のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、限定するようには意図されていないことも理解されたい。値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の別途文脈が明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１までの各介在値、及び任意の他の規定の値またはその規定の値の介在値が本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は独立して、そのより小さい範囲に含まれ、その規定の範囲内の任意の明確に除外される上下限を条件として本発明内に包含される。規定の範囲が上限及び下限の一方または両方を含む場合、それらの含まれた上下限のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法及び材料も本発明の実施または試験で使用され得るが、代表的な例証的方法及び材料がこれから説明される。
実施例１． ３，３’−（２−ブロモ−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−８，１０−ジヒドロ−４Ｈ−フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン−４，４−ジイル）ビス（プロパン−１−オール）（化合物２）の調製
Figure 2019512573
アルゴン下で、ＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液中３−［２−ブロモ−４−（３−ヒドロキシプロピル）−６−ヨード−８，１０−ジヒドロ−４Ｈ−９−オキサシクロヘプタ［ｄｅｆ］フルオレン−４−イル］−プロパン−１−オール（化合物１）（３ｇ、５．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス（ピナコラト）ジボロン（２ｇ、８ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（０．２ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）及び酢酸カリウム（２．２３ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を６０℃で２時間加熱した。室温で、酢酸エチル（２００ｍＬ））を添加し、水（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過した。溶媒を除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）により精製して、薄茶色の発泡体（１．５ｇ、５０％）を得た。
実施例２． （２−ブロモ−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−８，１０−ジヒドロ−４Ｈ−フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン−４，４−ジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ビス（４−メチルベンゼンスルホン酸塩）（化合物３）の調製
Figure 2019512573
室温及びアルゴン下で、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中化合物２（５．８４ｇ、１１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（９．２ｍＬ、６６ｍｍｏｌ）、続いて、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（６．３ｇ、３３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を濃縮した。酢酸エチル（２００ｍＬ））を添加し、水（２００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過した。溶媒を除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）により精製して、白色の固体（５．２ｇ、７０％）を得た。
実施例３． ２−（６−ブロモ−４，４−ジ（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８−イル）−８，１０−ジヒドロ−４Ｈ−フルオレノ［４，５−ｃｄｅ］オキセピン−２−イル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（化合物４）の調製
Figure 2019512573
アルゴン下かつ０℃で、乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）中水素化ナトリウム（０．２４ｇ、５．９５ｍｍｏｌ）の混合物に、ｍＰＥＧ１１アルコール（３．０８ｇ、５．９５ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で１０分後、乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）中化合物３（１ｇ、１．１９ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。混合物を室温で一晩撹拌した。飽和塩化アンモニウム溶液（１００ｍＬ）を添加して溶液をクエンチし、粗生成物をジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を濃縮し、ジクロロメタン／イソプロピルアルコールの勾配でカラムクロマトグラフィーにより精製して、無色の油（１．０ｇ、５５％）を得た。
実施例４． 不斉ＰＦＯポリマー（化合物７）の調製
Figure 2019512573
アルゴン下で、シュレンクフラスコ内のＤＭＦ（６ｍＬ）中化合物４（０．６ｇ、０．４ｍｍｏｌ）及び化合物５（０．０２３ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、水（２Ｍ、４ｍＬ）中Ｋ２ＣＯ３、続いて、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１４ｍｇ、０．０１２ｍｏｌ）を添加した。混合物を３回の凍結ポンプ解凍サイクルにより脱気し、その後、８０℃になるまで１２時間にわたって加熱した。室温で、反応混合物に、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ））中ＥＤＴＡ（１００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。その後、結果として生じた混合物を０．４５μｍカップフィルターに通して濾過した。濾過した溶液を、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏを使用して、２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。その後、結果として生じた希釈物を、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、黄色の繊維状固体（０．４１ｇ）を得た。分子量を、ポリスチレン標準（ＭＷ＝８５，０００、ＭＷ＝１７０，０００、Ｄ＝２．０）に対するＳＥＣ分析によって決定した。室温で、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中化合物６（４１０ｍｇ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を除去し、高真空下で一晩乾燥させて、淡黄色の油を得た。
実施例５． 不斉ＰＦＯポリマースクシンイミジルエステル（化合物８）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、グルタル酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応グルタル酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）の大半が除去されるまで、残渣をエーテルで複数回洗浄した。残渣を冷酸性水（ｐＨ＝５）中に素早く溶解し、エーテルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマースクシンイミジルエステルを得た。
実施例６． 不斉ＰＦＯポリマーマレイミド（化合物９）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を酸性水（ｐＨ＝５）中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーマレイミドを得た。
実施例７． 不斉ＰＦＯポリマージクロロトリアジン（化合物１０）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、シアヌル酸クロリド（１ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応シアヌル酸クロリドの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を冷水（ｐＨ＝６）中に素早く溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマージクロロトリアジンを得た。
実施例８． 不斉ＰＦＯポリマーＤＢＣＯ（化合物１１）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーＤＢＣＯを得た。
実施例９． 不斉ＰＦＯポリマーＴＣＯ（化合物１２）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、ＴＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応ＴＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーＴＣＯを得た。
実施例１０． 不斉ＰＦＯポリマーメチルテトラジン（化合物１３）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、メチルテトラジン−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応メチルテトラジン−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーメチルテトラジンを得た。
実施例１１． 不斉ＰＦＯポリマーアジド（化合物１４）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、アジド−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応アジド−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーアジドを得た。
実施例１２． 不斉ＰＦＯポリマーアルキン（化合物１５）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、アルキニル−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応アルキニル−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーアルキンを得た。
実施例１３． 不斉Ｃｙ３．５標識ＰＦＯポリマー（化合物１６）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、Ｃｙ３．５モノスクシンイミジルエステル（１０ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び２０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例１４． 不斉Ｃｙ３．５標識ＰＦＯポリマーＤＢＣＯ（化合物１７）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーＤＢＣＯを得た。
実施例１５． 不斉Ｃｙ３．５標識ＰＦＯポリマーＴＣＯ（化合物１８）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、ＴＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応ＴＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーＴＣＯを得た。
実施例１６． 不斉Ｃｙ３．５標識ＰＦＯポリマーメチルテトラジン（化合物１９）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、メチルテトラジン−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応メチルテトラジン−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーメチルテトラジンを得た。
実施例１７． 不斉Ｃｙ３．５標識ＰＦＯポリマーアジド（化合物２０）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、アジド−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応アジド−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーアジドを得た。
実施例１８． 不斉Ｃｙ３．５標識ＰＦＯポリマーアルキン（化合物２１）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、アルキニル−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応アルキニル−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーアルキンを得た。
実施例１９． 不斉Ｃｙ３．５標識ＰＦＯポリマースクシンイミジルエステル（化合物２２）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、グルタル酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応グルタル酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）の大半が除去されるまで、残渣をエーテルで複数回洗浄した。残渣を冷水（ｐＨ＝６）中に素早く溶解し、エーテルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマースクシンイミジルエステルを得た。
実施例２０． 不斉Ｃｙ３．５標識ＰＦＯポリマーマレイミド（化合物２３）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水（ｐＨ＝６）中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーマレイミドを得た。
実施例２１． 不斉Ｃｙ３．５標識ＰＦＯポリマージクロロトリアジン（化合物２４）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、シアヌル酸クロリド（１ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応シアヌル酸クロリドの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を冷水（ｐＨ＝６）中に素早く溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマージクロロトリアジンを得た。
実施例２２． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマーＤＢＣＯ（化合物２５）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４ Ｃｙ５モノスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例２３． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマーＴＣＯ（化合物２６）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、ＴＣＯ−ＰＥＧ４ Ｃｙ５モノスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例２４． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマーメチルテトラジン（化合物２７）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物１６（１００ｍｇ）の溶液に、メチルテトラジン−ＰＥＧ４ Ｃｙ５モノスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び２０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例２５． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマーアジド（化合物２８）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物２７（１００ｍｇ）の溶液に、アジド−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例２６． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマー（化合物２９）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、Ｃｙ５モノスクシンイミジルエステル（１０ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例２７． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマースクシンイミジルエステル（化合物３０）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物２９（１００ｍｇ）の溶液に、グルタル酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応グルタル酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）の大半が除去されるまで、残渣をエーテルで複数回洗浄した。残渣を冷水（ｐＨ＝６）中に素早く溶解し、エーテルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマースクシンイミジルエステルを得た。
実施例２８． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマーマレイミド（化合物３１）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物２９（１００ｍｇ）の溶液に、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水（ｐＨ＝６）中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーマレイミドを得た。
実施例２９． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマージクロロトリアジン（化合物３１）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物２９（１００ｍｇ）の溶液に、シアヌル酸クロリド（１ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応シアヌル酸クロリドの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を冷水（ｐＨ＝６）中に素早く溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマージクロロトリアジンを得た。
実施例３０． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマーＤＢＣＯ（化合物３２）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物２９（１００ｍｇ）の溶液に、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーＤＢＣＯを得た。
実施例３１． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマーＴＣＯ（化合物３３）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物２９（１００ｍｇ）の溶液に、ＴＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応ＴＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーＴＣＯを得た。
実施例３２． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマーメチルテトラジン（化合物３４）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物２９（１００ｍｇ）の溶液に、メチルテトラジン−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応メチルテトラジン−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーメチルテトラジンを得た。
実施例３３． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマーアジド（化合物３５）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物２９（１００ｍｇ）の溶液に、アジド−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応アジド−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーアジドを得た。
実施例３４． 不斉Ｃｙ５標識ＰＦＯポリマーアルキン（化合物３６）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物２９（１００ｍｇ）の溶液に、アルキニル−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応アルキニル−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーアルキンを得た。
実施例３５． 不斉ＴＡＭＲＡ標識ＰＦＯポリマー（化合物３７）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、５−ＴＡＭＲＡスクシンイミジルエステル（１０ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例３６． 不斉ＴＡＭＲＡ標識ＰＦＯポリマーＤＢＣＯ（化合物３８）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物３７（１００ｍｇ）の溶液に、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーＤＢＣＯを得た。
実施例３７． 不斉ＴＡＭＲＡ標識ＰＦＯポリマーＴＣＯ（化合物３９）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物３７（１００ｍｇ）の溶液に、ＴＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応ＴＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーＴＣＯを得た。
実施例３８． 不斉ＴＡＭＲＡ標識ＰＦＯポリマーメチルテトラジン（化合物４０）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物３７（１００ｍｇ）の溶液に、メチルテトラジン−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応メチルテトラジン−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーメチルテトラジンを得た。
実施例３９． 不斉ＴＡＭＲＡ標識ＰＦＯポリマーアジド（化合物４１）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物３７（１００ｍｇ）の溶液に、アジド−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応アジド−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーアジドを得た。
実施例４０． 不斉ＴＡＭＲＡ標識ＰＦＯポリマーアルキン（化合物４２）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物３７（１００ｍｇ）の溶液に、アルキニル−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応アルキニル−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーアルキンを得た。
実施例４１． 不斉ＴＡＭＲＡ標識ＰＦＯポリマースクシンイミジルエステル（化合物４３）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物３７（１００ｍｇ）の溶液に、グルタル酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応グルタル酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）の大半が除去されるまで、残渣をエーテルで複数回洗浄した。残渣を冷水（ｐＨ＝６）中に素早く溶解し、エーテルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマースクシンイミジルエステルを得た。
実施例４２． 不斉ＴＡＭＲＡ標識ＰＦＯポリマーマレイミド（化合物４４）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物３７（１００ｍｇ）の溶液に、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水（ｐＨ＝６）中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマーマレイミドを得た。
実施例４３． 不斉ＴＡＭＲＡ標識ＰＦＯポリマージクロロトリアジン（化合物４５）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物３７（１００ｍｇ）の溶液に、シアヌル酸クロリド（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応シアヌル酸クロリドの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を冷水（ｐＨ＝６）中に素早く溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＰＦＯポリマージクロロトリアジンを得た。
実施例４４． 不斉Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ標識ＰＦＯポリマーＤＢＣＯ（化合物４６）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、２−（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）スルホンアミジル−６−（ＴＣＯ−ＰＥＧ４）カルボキサミジル−リジンモノスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例４５． 不斉Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ標識ＰＦＯポリマーＴＣＯ（化合物４７）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、２−（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）スルホンアミジル−６−（ＴＣＯ−ＰＥＧ４）カルボキサミジル−リジンモノスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例４６． Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ標識ＰＦＯポリマーメチルテトラジン（化合物４８）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、２−（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）スルホンアミジル−６−（メチルテトラジン−ＰＥＧ４）カルボキサミド−リジンモノスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例４７． 不斉Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ標識ＰＦＯポリマーアジド（化合物４９）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、２−（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）スルホンアミジル−６−（アジド− ＰＥＧ４）カルボキサミジル−リジンモノスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例４８． 不斉ＴＣＯ官能化ＰＦＯポリマー（化合物５０）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、ＴＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応ＴＣＯ−ＰＥＧ４スクシンイミジルエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉ＴＣＯ官能化ＰＦＯポリマーを得た。
実施例４９． 不斉ＲＯＸ標識ＰＦＯポリマーＴＣＯ（化合物５１）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物５０（１０ｍｇ）の溶液に、６−ＲＯＸスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例５０． 不斉マレイミド官能化ＰＦＯポリマー（化合物５２）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。未反応３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの大半が除去されるまで、残渣を酢酸エチルで複数回洗浄した。残渣を水中に溶解し、酢酸エチルで３回抽出した。水溶液を凍結させ、乾燥させて、所望の不斉マレイミド官能化ＰＦＯポリマーを得た。
実施例５１． 不斉ＲＯＸ標識ＰＦＯポリマーマレイミド（化合物５３）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物５２（１０ｍｇ）の溶液に、６−ＲＯＸスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を０．１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
実施例５２． 不斉Ｃｙ７標識ＰＦＯポリマーマレイミド（化合物５４）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中化合物７（１００ｍｇ）の溶液に、Ｃｙ７モノマレイミド、モノスクシンイミジルエステル（５ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）、及び１０μＬトリエチルアミンのＤＭＦ溶液を１ｍＬ添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、高真空下で濃縮して、ＤＭＦを除去した。残渣を水中に溶解し、３０，０００ｋＤの分子量カットオフ膜を備えた接線流濾過システムを使用して、溶出物中に０．１ｍｇ／ｍＬ未満のポリマーが存在するまで、２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中で透析した。溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、所望の青色の繊維状固体を得た。
本発明の選択されたポリマーのいくつかの合成戦略の上記の実施例、ならびにそれらの特徴付け、合成前駆体、コンジュゲート、及び使用方法が、例証のために実施例に提供される。それらのさらなる修正及び置換が当業者には明らかである。例えば、本発明のポリマーにコンジュゲートされた第２のフルオロフォア（上述の実施例におけるＣｙ３．５、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ等）は、表１に列記される市販の色素で容易に置き換えられて、ポリマーが異なる所望のスペクトル特性を有するようにすることができる。加えて、本発明のポリマーは、表２に列記される異なる反応性官能基対でさらに官能化され得る。周知のクリック可能な基は、化学に基づく双直交コンジュゲーションのために本発明のポリマーにも添加され得る（Ｐ．Ａｇａｒｗａｌ ａｎｄ Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１５，２６，１７６−１９２、Ｋ．Ｌａｎｇ ａｎｄ Ｊ．Ｃｈｉｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１４，１１４，４７６４−４８０６、Ｍ．Ｄ．Ｂｅｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，４８，６５７１−６５８４を参照のこと）。ポリマー官能化のためのいくつかの他の代替方法が文献に記載されている（米国特許第８，１５８，４４４号、米国特許第８，４５５，６１３号、米国特許第８，３５４，２３９号、米国特許第８，３６２，１９３号、及び米国特許第８，５７５，３０３号（Ｇａｙｌｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．）、ならびにＷＯ２０１３／１０１９０２（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ）も参照のこと）。
実施例５３． ファロイジン−ＰＦＯポリマーコンジュゲート（化合物５５）の調製
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中アミノファロイジン（１ｍｇ、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）及びスクシンイミジルエステル誘導体化合物８（１０ｍｇ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５μＬ）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌した。この溶液に、５ｍＬのＥｔＯＡｃを添加した。固体を遠心分離によって収集した。粗生成物を、水で溶出するＳＥＰＨＡＤＥＸ ＬＨ−２０、続いて、分取ＨＰＬＣで精製して、純粋なファロイジンコンジュゲートを得た。
実施例５４． Ｆ−アクチンフィラメントのファロイジン−ＰＦＯポリマーコンジュゲートでの染色
アクチンは、ほぼ全ての真核細胞に見られる球状のおよそ４２ｋＤａのタンパク質である。これは、藻及びヒトと同様に多様性のある種において２０％以下異なる最も高度に保存されたタンパク質のうちの１つでもある。ファロイジン−ＰＦＯポリマーコンジュゲートは、Ｆ−アクチンに選択的に結合する。ナノモル濃度で使用する場合、ファロイジン−ＰＦＯポリマーコンジュゲート（化合物５５）を、ホルムアルデヒド固定及び透過化組織切片、細胞培養物、または無細胞実験におけるＦ−アクチンの標識、特定、及び定量に使用することができる。細胞をホルムアルデヒドで固定し、ファロイジン−ＰＦＯポリマーコンジュゲートのＤＭＳＯストック溶液を添加した後にインキュベートした。細胞をＰＢＳで２〜３回穏やかにすすいで、過剰なファロイジンコンジュゲートを除去した。細胞をプレーティングし、密封し、蛍光顕微鏡で画像化した（図４を参照のこと）。他のファロイジン−ＰＦＯポリマーコンジュゲートを同様に使用して、異なる蛍光色でＦ−アクチンフィラメントを染色することができる。
実施例５５． アミノデキストラン−ＰＦＯポリマーコンジュゲートの調製
アミノデキストラン−色素コンジュゲートを、一例として７０，０００ＭＷを使用して説明した以下のように調製した。アミノデキストラン（５０ｍｇ）を平均１３個のアミノ基で誘導体化した。アミノデキストラン（５０ｍｇ）を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３中に１０ｍｇ／ｍＬで溶解した。化合物８を添加して、約１０〜１５のＰＦＯポリマー／デキストラン比を得た。６〜１２時間後、結果として生じたコンジュゲートをイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。コンジュゲーション混合物を低塩緩衝液［５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝５．０）］中ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に装填し、室温で１０分間インキュベートし、試料の装填を３回繰り返して、最大結合を得た。装填後、培地を低塩緩衝液で洗浄し、上昇ｐＨ及びイオン強度［１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）＋１．０ＭのＮａＣｌ緩衝液／メタノール］の勾配で流した。
実施例５６． ＰＦＯポリマー標識ミクロスフェアの調製
ミクロスフェアを、いくつかの周知のプロトコルのうちのいずれかを使用して本発明のＰＦＯポリマー色素で標識することができる。アミノ、カルボキシル、またはアルデヒド等の官能基を表面上に有するように化学的に修飾されたミクロスフェアを、表面基を表２に列記される対応する反応性色素と共有結合的にコンジュゲートすることによって表面標識することができる。例えば、アミン修飾ミクロスフェアは、化合物８または２２等のスクシンイミジルエステルを介して本発明の色素に容易にコンジュゲートした。
実施例５７． ヌクレオチド−ＰＦＯポリマーコンジュゲートの調製
本発明のＰＦＯポリマー色素にコンジュゲートされたヌクレオチドは、Ｍ．Ｎｉｍｍａｋａｙａｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０００，２８，５１８−５２２、Ｍｕｈｌｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ １９９０，３７１，９５３−９６５、及びＧｉａｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９，９３，１９１−１９６に記載の手順等の周知の公開された手順に従って当業者によって容易に調製され得る。１００μＬの水中２ｍｇの５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に、１００μＬのＤＭＦ及び５μＬのトリエチルアミン中化合物８または２２（５ｍｇ）を添加した。３時間後、溶液を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣにより精製する。生成物画分を凍結乾燥させて、蛍光ヌクレオチドコンジュゲートを得た。あるいは、デオキシウリジン５’−三リン酸の蛍光色素−コンジュゲートを、５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン ５’−三リン酸から調製するか、またはチオール化ヌクレオチドまたはチオリン酸ヌクレオチドを本発明のチオール−反応性ＰＦＯポリマー色素（マレイミド化合物９または２３等）で処理することによって調製した。
実施例５８． オリゴヌクレオチド−ＰＦＯポリマー色素コンジュゲートの調製
５’−アミンで修飾された１８塩基Ｍ１３プライマー配列（約１００μｇ）を４μＬの水中に溶解した。これに、１００μＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）中１ｍｇの化合物８または２２を添加した。１６時間後、１０μＬの５Ｍ ＮａＣｌ及び３体積の冷エタノールを添加した。混合物を−２０℃に冷却し、遠心分離し、上清をデカントし、ペレットをエタノールですすぎ、その後、ペレットを１００μＬの水中に溶解した。標識オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製した。所望のピークを収集し、蒸発させて、蛍光オリゴヌクレオチド−色素コンジュゲートを得た。
実施例５９． ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＦＯポリマー色素コンジュゲートの調製
ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＡＭ）を１０ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．２）緩衝液中に溶解して、５ｍｇ／ｍＬの溶液にした。ＧＡＭタンパク質水溶液に、化合物８または２２（２０当量）のＤＭＦ溶液を添加した。溶液を室温で３時間回転させ、反応混合物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルター（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）に移して、ＤＭＦを除去した。タンパク質を、ＰＢＳ緩衝液を用いて初期体積中で回収した。
陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、遊離ポリマーを除去した。コンジュゲーション混合物を低塩緩衝液［５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝５．０）］中ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に装填し、室温で１０分間インキュベートし、試料の装填を３回繰り返して、最大結合を得た。装填後、培地を低塩緩衝液でベースラインまで洗浄して（４１４ｎｍでの吸光度が０．０１未満になるまで）、全ての遊離ポリマーを除去した。陽イオン交換樹脂上に保持されたＰＦＯポリマー色素−ＧＡＭコンジュゲートを、高塩リン酸緩衝液［１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）＋１．０ＭのＮａＣｌ緩衝液／メタノール、９０／１０］を用いてｐＨ及びイオン強度の両方を上昇させることによって放出した。タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇ親和性樹脂を使用して、同等の結果を有する遊離ポリマーを除去することもできる。ＨｉＴｒａｐ タンパク質Ｇ ＨＰ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で予め平衡化し、ＳＥＣ精製生成物を１ｍｇ／ｍＬ未満で緩徐に注入し、３０分間インキュベートして結合させた。カラムを１０カラム体積超の１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄して、非結合ポリマー材料を洗い流している間に、溶出液の吸収を２８０ｎｍ及び４１４ｎｍで監視して、全ての過剰な材料が除去されたことを確認した。コンジュゲートを、カラムを４カラム体積の０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．３）で洗浄することによって溶出した。溶出した画分を合わせ、１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を使用してｐＨを中性に戻し調整した。遊離ポリマーを除去した後、コンジュゲート溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルター（ＭＷＣＯ＝３０ｋＤ）で濃縮し、サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装填して、コンジュゲート及びコンジュゲートされていない抗体を分離した。カラムをＰＢＳ緩衝液で平衡化し、ＰＦＯポリマー−抗体コンジュゲートを溶出した後に、抗体を遊離した。
効率的に標識するために、置換度（ＤＯＳ）は、大半の抗体の場合、１モルの抗体に対して１〜３モルのＰＦＯポリマー色素であるものとする。生物学的基質のポリマーに対する比率（ＢＳ／ポリマー）は、生物学的基質による置換度を表す。例えば、ポリマーを使用して生物学的基質を標識する場合、非標識遊離ポリマーが存在する場合がある。したがって、平均置換度は、１未満であり得る。当該技術分野で周知のように、最適ＤＯＳは、標識される抗体の特性に依存する。最適標識ＤＯＳは、ＤＯＳ範囲にわたって一連の色素−コンジュゲートを調製し、所望のシグナル／バックグラウンドを比較することによって実験的に決定される。ある場合には、より高いＤＯＳが明るいシグナルを提供し得る一方で、他の場合には、より高いＤＯＳは、標識される抗体の親和性を低下させ得る。
実施例６０． ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＰＦＯポリマー色素コンジュゲートの調製
ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＧＡＲ）を１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ＝８．６）中に溶解して、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。ＧＡＲ溶液に、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−スルホ−ＮＨＳエステル（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ溶液、３当量）を添加した。混合物を管回転器上で、室温で１〜２時間回転させ、Ｐ−６−ＤＧゲル媒体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を充填した脱塩カラムで精製して、遊離メチルテトラジン−ＰＥＧ４−スルホ−ＮＨＳエステルを除去した。メチルテトラジン修飾ＧＡＲをＰＢＳ中で回収した。修飾ＧＡＲ溶液を化合物１３（４ｍｇ／ｍＬ、５当量）のＰＢＳストック溶液と混合した。混合した溶液を室温で１〜３時間回転させた。結果として生じた溶液を陽イオン交換カラムに装填し、これを、非反応性遊離ポリマーを除去するために使用した。ＰＦＯポリマー−ＧＡＲ溶液を実施例５９に記載されるように精製した。純粋な所望のＰＦＯポリマー−ＧＡＲコンジュゲートをプールし、組み合わせ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルター（ＭＷＣＯ＝３０ｋＤ）で所望の濃度に濃縮した。
実施例６１． ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＰＦＯポリマー色素コンジュゲートの調製
ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＳＡＭ）を、ＭＥＡ、ＤＴＴ、またはＴＣＥＰで還元した（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６，４６３−４６９）。還元したＧＡＭを５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．０）中に溶解して、５ｍｇ／ｍＬの溶液にした。ＳＡＭタンパク質水溶液に、化合物９または２３（１０当量）のＤＭＦ溶液を添加した。溶液を室温で３時間回転させ、反応混合物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルター（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）に移して、ＤＭＦを除去した。タンパク質を、ＰＢＳ緩衝液を用いて初期体積中で回収した。ＰＦＯポリマー−ＳＡＭ溶液を実施例５９に記載されるように精製した。純粋な所望のＰＦＯポリマー−ＳＡＭコンジュゲートをプールし、組み合わせ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルター（ＭＷＣＯ＝３０ｋＤ）で所望の試験濃度に濃縮した。
実施例６２． ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＦＯポリマー色素コンジュゲートの調製
ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＧＡＨ）を１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ＝８．６）中に溶解して、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。ＧＡＨ溶液に、アジド−ＰＥＧ４−スルホ−ＮＨＳエステル（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ溶液、３当量）を添加した。混合物を管回転器上で、室温で１〜２時間回転させ、Ｐ−６−ＤＧゲル媒体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を充填した脱塩カラムで精製して、遊離アジド−ＰＥＧ４−スルホ−ＮＨＳエステルを除去した。アジド修飾ＧＡＨをＰＢＳ中で回収した。修飾ＧＡＨ溶液を化合物１１（４ｍｇ／ｍＬ、５当量）のＰＢＳストック溶液と混合した。混合した溶液を室温で１〜３時間回転させた。結果として生じた溶液を陽イオン交換カラムに装填し、これを、非反応性遊離ポリマーを除去するために使用した。ＰＦＯポリマー−ＧＡＨ溶液を実施例５９に記載されるように精製した。純粋な所望のＰＦＯポリマー−ＧＡＨコンジュゲートをプールし、組み合わせ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルター（ＭＷＣＯ＝３０ｋＤ）で所望の濃度に濃縮した。
実施例６３． ロバ抗マウスＩｇＧ−ＰＦＯポリマー色素コンジュゲートの調製
ロバ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＭ）を１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ＝８．６）中に溶解して、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。ＤＡＭ溶液に、アジド−ＰＥＧ４−スルホ−ＮＨＳエステル（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ溶液、３当量）を添加した。混合物を管回転器上で、室温で１〜２時間回転させ、Ｐ−６−ＤＧゲル媒体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を充填した脱塩カラムで精製して、遊離アジド−ＰＥＧ４−スルホ−ＮＨＳエステルを除去した。アジド修飾ＤＡＭをＰＢＳ中で回収した。修飾ＤＡＭ溶液を化合物１７（４ｍｇ／ｍＬ、５当量）のＰＢＳストック溶液と混合した。混合した溶液を室温で１〜３時間回転させた。結果として生じた溶液を陽イオン交換カラムに装填し、これを、非反応性遊離ポリマーを除去するために使用した。ＰＦＯポリマー−ＤＡＭ溶液を実施例５９に記載されるように精製した。純粋な所望のＰＦＯポリマー−ＤＡＭコンジュゲートをプールし、組み合わせ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルター（ＭＷＣＯ＝３０ｋＤ）で所望の濃度に濃縮した。
実施例６４． 抗ＣＤ８抗体のＰＦＯポリマー色素コンジュゲートの調製
ＰＦＯポリマー色素−ＣＤ抗体コンジュゲートを、抗マウスＣＤ８ａ（クローン５３−６．７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ヒトＣＤ８ａ（クローンＳＫ１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に特異的な抗体を使用して調製し、これらは各々、別個の調製で、実施例５９〜６３に記載の比率と類似した色素とタンパク質との比率の範囲にわたって化合物８、９、１１、及び１２にコンジュゲートされたものであった。抗体−ポリマーコンジュゲートを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＮＧＣ ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により遊離抗体から精製した。最初に、コンジュゲートを１５ｋ ｒｐｍで５分間回転させて、いずれの沈殿または架橋コンジュゲートもペレット化した。その後、上清を１．５ｖ／ｖ％未満でＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に注入し、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて１．０ｍＬ／分で溶出した。各ＰＦＯポリマー−抗体コンジュゲーションについて、抗体−ポリマーコンジュゲート及び任意の遊離ポリマーを含んだ２８０ｎｍでの第１の溶出ピークを収集し、いずれのその後のピークも切り捨てた。
過剰なポリマーをコンジュゲート溶液から除去しなければならなかった場合、タンパク質Ｇ親和性精製を使用して、コンジュゲートを遊離ポリマーから分離した。ＨｉＴｒａｐ タンパク質Ｇ ＨＰ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で予め平衡化し、ＳＥＣ精製生成物を１ｍｇ／ｍＬ未満で緩徐に注入し、１０分間インキュベートして結合させた。カラムを１０カラム体積超の１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄して、非結合ポリマー材料を洗い流している間に、２８０ｎｍ及び４１４ｎｍでの溶出液の吸収を監視して、全ての過剰な材料が除去されたことを確認した。コンジュゲートを、カラムを４カラム体積の０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．３）で洗浄することによって溶出した。溶出した画分を合わせ、１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を使用してｐＨを中性に戻し調整した。その後、最終精製生成物を、１０ｍＭのリン酸塩、０．５ＭのＮａＣｌ、０．０９％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．４）を有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０ｋ分子量の遠心分離濃縮器内で４回緩衝液交換し、使える状態になるまで、０．１ｍｇ／ｍＬの抗体濃度で、４℃で保管した。各抗体について、３つの色素の各々の最適なＰＦＯポリマー色素とタンパク質との比率は、極めて類似していた。概して、各最適な色素とタンパク質との比率を、標識される各特異的抗体について実験的に（通例の最適化によって）決定した。
実施例６５． 抗ＣＤ８抗体のＰＦＯポリマータンデム色素コンジュゲートの調製
ＰＦＯポリマー色素−ＣＤ抗体コンジュゲートを、抗マウスＣＤ８ａ（クローン５３−６．７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ヒトＣＤ８ａ（クローンＳＫ１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に特異的な抗体を使用して調製し、これらは各々、別個の調製で、実施例５９〜６３に記載の色素とタンパク質との比率の範囲にわたって化合物１７、１８、２２、２３、２５、３２、３６、及び３８にコンジュゲートされたものであった。抗体−ポリマーコンジュゲートを実施例６４に記載されるように精製した。
実施例６６． ストレプトアビジン−ＰＦＯポリマーコンジュゲートの調製
ストレプトアビジンを１０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．２）中に溶解して、１ｍｇ／ｍＬの溶液にした。ストレプトアビジンタンパク質水溶液に、化合物８または２２（２０当量）のＤＭＦ溶液を添加した。溶液を室温で３時間振盪し、反応物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルター（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）に移して、ＤＭＦを除去した。タンパク質を、ＰＢＳ緩衝液を用いて所期体積中で回収した。陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、遊離ポリマーを除去した。コンジュゲーション混合物を低塩緩衝液［５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝５．０）］中ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に装填し、室温で１０分間インキュベートし、試料の装填を３回繰り返して、最大結合を得た。装填後、培地を低塩緩衝液でベースラインまで洗浄して（４１４ｎｍでの吸光度が０．０１未満になるまで）、全ての遊離ポリマーを除去した。陽イオン交換樹脂上に保持されたＰＦＯポリマー色素−ストレプトアビジンコンジュゲートを、高塩リン酸緩衝液［１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）＋１．０ＭのＮａＣｌ緩衝液／メタノール、９０／１０］を用いてｐＨ及びイオン強度の両方を上昇させることによって放出した。溶出した画分を合わせ、所望の濃度に濃縮した。
実施例６７． フローサイトメトリーで使用するためのＰＦＯポリマーコンジュゲート
本発明のＰＦＯポリマー色素にコンジュゲートされた分析物特異的抗体（すなわち、標識抗体）は、フローサイトメトリーによる（例えば、全血試料中の）血球の分析に有用である。標識抗体を使用して細胞タンパク質を染色し、フローサイトメーターを使用して標識細胞を検出した。ＰＦＯポリマーバイオコンジュゲートを、フローサイトメーター上でＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって定義される染色指標によって評価した。例えば、Ｈ．Ｍａｅｋｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｔｒｏｔｔｅｒ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ：”Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００９を参照されたい。染色指標は、ポリマーの輝度、非特異的結合の尺度を報告する。フローサイトメトリーは、目的とする特定の表現型または分析物の細胞を特定のミクロスフェア上で測定する方法を提供する。これは、一次抗体の直接標識によって、またはシグナル増幅が所望される場合、二次抗体もしくはアビジン−ポリマーコンジュゲートとのアビジン−ビオチン複合体化によって行われ得る。目的とする細胞を十分な量で取り込み、沈降させ、ＤＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３中で洗浄し、その後、ＰＦＯポリマーコンジュゲートの染色緩衝液中に再懸濁した。
一次インキュベーションの場合、細胞を、陰性非特異的結合基準としての役目を果たす陰性細胞である目的とする抗原に特異的な一次コンジュゲート（例えば、実施例６４及び６５におけるＰＦＯポリマー−ＣＤ８抗体）とインキュベートした。対照集団または確立された市販のコンジュゲートを陽性対照として使用した。一次抗体−ポリマーコンジュゲートを体積希釈物１０〜５００ｎＭの濃度で３０分間インキュベートした。
二次抗体標識の場合、目的とする抗原に対する非標識一次抗体を１〜５０μｇ／ｍＬまたは他の滴定量でインキュベートした。一次インキュベーション後、細胞を５体積の染色緩衝液ですすぎ、３〜５分間沈降させた。種反応性二次ＰＦＯポリマーコンジュゲート（例えば、実施例５９〜６３）を体積希釈物１０〜５００ｎＭの濃度で３０〜６０分間インキュベートした。二次インキュベーション後、細胞を３〜５体積の染色緩衝液ですすぎ、３〜５分間沈降させた。細胞を試験のためにＤＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム中に再懸濁させた。
ストレプトアビジン−ポリマーコンジュゲート標識の場合、細胞を、非標識一次抗体の代わりに、二次抗体標識について上で詳細されるように、目的とするマーカーに対するビオチン化一次抗体とインキュベートした。一次洗浄後、細胞を再懸濁させ、ストレプトアビジン−ポリマーコンジュゲート（実施例６６）と体積希釈物１〜１００ｎＭで３０分間インキュベートした。二次インキュベーション後、細胞を５体積の染色緩衝液ですすぎ、３〜５分間沈降させた。細胞を試験のために再懸濁させた。さらなるシグナル増幅が所望された場合、細胞を、非標識一次抗体とインキュベートし、その後、種反応性ビオチン化二次抗体とインキュベートした後に、ストレプトアビジンコンジュゲートとインキュベーションすることもあり得た。
実施例６８． 血液試料を分析するためのＰＦＯポリマー−抗ＣＤ８コンジュゲート
細胞染色を、本質的に実施例６７に記載されるように調製した。ＰＦＯポリマー−ＣＤ８抗体コンジュゲートを使用して、全血試料中のリンパ球を分析した。全血試料（１００μＬ）（好ましくは、ＥＤＴＡ中で収集したもの）を、典型的には、抗体−ＰＦＯポリマー色素コンジュゲートで、１〜２０μｇ／血液ｍＬの色素−コンジュゲート濃度で、暗所で３０〜６０分間染色した。染色後、適切な量の細胞溶解溶液を細胞試料に添加した。処理した試料をボルテックスミキサー上で中速で混合し、その後、室温で１０分間インキュベートした。試料を２００〜５００ｇで５分間遠心分離し、上清をデカントする。試料を２回洗浄し（２ｍＬの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ洗浄緩衝液中に再懸濁、混合、遠心分離）、洗浄緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリー分析を行うまで４℃で維持した。
血液試料の分析を、フローサイトメーターを使用して行った。染色細胞の試料のフローサイトメトリー分析を製造業者のプロトコルに従って行い、データを、当該分野で周知の標準の技法を使用して分析して、目的とする細胞集団の蛍光強度中央値を得た。フロー試験を、フロー施設職員によって較正粒子でのサイトメーターの日常較正から決定された電圧設定を使用して行った。前方散乱対側方散乱によるリンパ球特異的ゲーティングを、バックグラウンド対照として非染色細胞試料上で行った。標準二重項ゲーティングを、前方散乱及び側方散乱の両方の面積対幅プロファイルに対して行った。単一色のみの場合、補正を必要としなかった。全ての前方散乱及び側方散乱パラメータのデータを収集し、ＢＤの標準Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅチャネルを使用して蛍光測定を行った。ＰＦＯ−抗体コンジュゲートデータは、４０５ｎｍのバイオレットレーザーでの励起及び６０５／４０ ＢＰフィルターを利用した（図７を参照のこと）。
使用される特定の抗体コンジュゲートならびに使用される特定の反応成分及び特定の反応条件が得られる結果に影響を与え得ることが理解される。緩衝液または溶解溶液等の好ましい反応成分、ならびに染色時間及び温度を含む反応条件を決定するために、通例の実験が行われるべきである。アッセイ条件のかかる通例の最適化は、免疫染色ベースのアッセイの分野における標準慣行である。
[本発明1001]
式Ｉのポリマーコンジュゲートであって、
Figure 2019512573
式中、前記ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＡ、Ｂ、及びＣで表される3つのモノマー単位を含み、
Ｒ1〜Ｒ6が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）を表し、
ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｘが6〜100の整数であり、ｙ及びｚが各々、0〜99から独立して選択される整数であるが、但し、
（1）ＢＳ／ポリマーの比率が0．2〜3であり、
（2）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、
（3）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が10超である
ことを条件とする、前記ポリマーコンジュゲート。
[本発明1002]
モノマー単位Ｂ及びモノマー単位Ｃが異なる、本発明1001のポリマーコンジュゲート。
[本発明1003]
前記モノマー単位が互いに直接結合している、本発明1001または1002のポリマーコンジュゲート。
[本発明1004]
前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、1，2，3−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、2−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルまたはＰＥＧ基を含む、本発明1001〜1003のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1005]
（ｉ）Ｒ1〜Ｒ6が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
（ｉｉ）ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
（ｉｉｉ）Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
（ｉｖ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
（ｖ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
（ｖｉ）ｘが11〜80の整数であり、ｙ及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、（3）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、本発明1001〜1004のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1006]
（ｉ）Ｒ1〜Ｒ6が水素であり、かつ／または
（ｉｉ）ＳＧ1及びＳＧ2がＰＥＧであり、かつ／または
（ｉｉｉ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1001〜1005のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1007]
（ｉ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
（ｉｉ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキルもしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1001〜1006のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1008]
アルキルがメチル基である、本発明1007のポリマーコンジュゲート。
[本発明1009]
Ｒ1〜Ｒ6が水素であり、ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｘが16〜80の整数であり、ｙ及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、（3）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、本発明1001のポリマーコンジュゲート。
[本発明1010]
ＳＧ1及びＳＧ2が独立して、ＰＥＧ6〜ＰＥＧ18である、本発明1001〜1009のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1011]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｘが16〜80の整数であり、ｙ及びｚが各々、0〜64から独立して選択される整数であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1001〜1010のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1012]
（ｉ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
（ｉｉ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1001〜1011のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1013]
式ＩＩのポリマーコンジュゲートであって、
Figure 2019512573
式中、前記ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＤ、Ｅ、Ｆ、及びＧで表される4つのモノマー単位を含み、
フルオロフォア（ＦＰ）が、450ｎｍを超える吸収極大及び500ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が5％を超える蛍光色素であり、Ｒ1〜Ｒ6が独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、ハロゲン、ボロニル、アルキル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｗが6〜100の整数であり、ｘ及びｚが各々、0〜98から独立して選択される整数であり、ｙが1〜20の整数であるが、但し、
（1）ＢＳ／ポリマーの比率が0．2〜3であり、
（2）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、
（3）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が10超である
ことを条件とする、前記ポリマーコンジュゲート。
[本発明1014]
モノマー単位Ｅ及びモノマー単位Ｇが異なる、本発明1013のポリマーコンジュゲート。
[本発明1015]
前記モノマー単位が互いに直接結合している、本発明1013または1014のポリマーコンジュゲート。
[本発明1016]
前記リンカー（Ｌ）が、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、1，2，3−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、2−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、またはＦＰを含む、本発明1013〜1015のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1017]
（ａ）ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール（ｒｈｏｄｏｌ）、シアニン、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、もしくはフタロシアニンであり、かつ／または
（ｂ）Ｒ1〜Ｒ6が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
（ｃ）ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
（ｄ）Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
（ｅ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
（ｆ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
（ｇ）ｗが11〜80の整数であり、ｘ及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であり、ｙが1〜10の整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、（3）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、
本発明1013または1016のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1018]
Ｒ1〜Ｒ6が水素である、本発明1013〜1017のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1019]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｗが16〜79の整数であり、ｘ及びｚが各々、0〜63から独立して選択される整数であり、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1013〜1018のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1020]
ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ1〜Ｒ6が水素であり、ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗが11〜80の整数であり、ｘ及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であり、ｙが1〜10の整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、（3）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、本発明1013のポリマーコンジュゲート。
[本発明1021]
ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンである、本発明1013〜1020のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1022]
（ａ）ＦＰがローダミンであるか、または
（ｂ）ＦＰがシアニンである、
本発明1021のポリマーコンジュゲート。
[本発明1023]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1013〜1022のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1024]
（ａ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
（ｂ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1013〜1023のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1025]
式ＩＩＩのポリマーコンジュゲートであって、
Figure 2019512573
式中、前記ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＨ、Ｉ、及びＪで表される3つのモノマー単位を含み、
Ｒ1〜Ｒ4が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）を表し、
ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、ｘ、ｙ、及びｚが各々、0〜100から独立して選択される整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が0．2〜3であり、（2）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が10超であることを条件とする、前記ポリマーコンジュゲート。
[本発明1026]
モノマー単位Ｈ、Ｉ、及びＪが異なる、本発明1025のポリマーコンジュゲート。
[本発明1027]
前記モノマー単位が互いに直接結合している、本発明1025または1026のポリマーコンジュゲート。
[本発明1028]
前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、1，2，3−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、2−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルまたはＰＥＧ基を含む、本発明1025〜1027のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1029]
（ａ）Ｒ1〜Ｒ4が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
（ｂ）ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
（ｃ）Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
（ｄ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
（ｅ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
（ｆ）ｘ、ｙ、及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、
本発明1025〜1028のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1030]
（ａ）Ｒ1〜Ｒ4が水素であり、かつ／または
（ｂ）ＳＧ1及びＳＧ2がＰＥＧであり、かつ／または
（ｃ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1025〜1029のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1031]
（ａ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
（ｂ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1025〜1030のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1032]
アルキルがメチル基である、本発明1031のポリマーコンジュゲート。
[本発明1033]
Ｒ1〜Ｒ4が水素であり、ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはまたはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、または炭水化物であり、ｘが11〜80の整数であり、ｙ及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、（3）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、本発明1025のポリマーコンジュゲート。
[本発明1034]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1025〜1033のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1035]
（ａ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
（ｂ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1025〜1034のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1036]
式ＩＶのポリマーコンジュゲートであって、
Figure 2019512573
式中、前記ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＫ、Ｌ、Ｍ、及びＮで表される4つのモノマー単位を含み、
フルオロフォア（ＦＰ）が、450ｎｍを超える吸収極大及び500ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が5％を超える蛍光色素であり、Ｒ1〜Ｒ4が独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、ハロゲン、ボロニル、アルキル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
ｗ、ｘ、及びｚが各々、0〜100から独立して選択される整数であり、ｙが1〜20の整数であるが、但し、
（1）ＢＳ／ポリマーの比率が0．2〜3であり、
（2）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が10超である
ことを条件とする、前記ポリマーコンジュゲート。
[本発明1037]
モノマー単位Ｋ、Ｌ、及びＮが異なる、本発明1036のポリマーコンジュゲート。
[本発明1038]
前記モノマー単位が互いに直接結合している、本発明1036または1037のポリマーコンジュゲート。
[本発明1039]
前記リンカー（Ｌ）が、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、1，2，3−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、2−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、またはＦＰを含む、本発明1036〜1038のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1040]
（ａ）ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、もしくはフタロシアニンであり、かつ／または
（ｂ）Ｒ1〜Ｒ4が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
（ｃ）ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
（ｄ）Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
（ｅ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
（ｆ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
（ｇ）ｗ、ｘ、及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であり、ｙが1〜10の整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、
本発明1036〜1039のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1041]
Ｒ1〜Ｒ4が水素である、本発明1036〜1040のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1042]
ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ1〜Ｒ4が水素であり、ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、またはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、または炭水化物であり、ｗ、ｘ、及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であり、ｙが1〜10の整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、本発明1036〜1041のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1043]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1036〜1042のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1044]
ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンである、本発明1036〜1043のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1045]
ＦＰが、
（ａ）ローダミンであるか、または
（ｂ）シアニンである、
本発明1044のポリマーコンジュゲート。
[本発明1046]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1036〜1045のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1047]
（ａ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
（ｂ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、本発明1036〜1046のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1048]
試料中の分析物を検出する方法であって、
ａ）前記試料を、本発明1001〜1047のいずれかのポリマーコンジュゲートを含む検出試薬と、前記検出試薬が前記分析物に結合する条件下で組み合わせることと、
ｂ）前記検出試薬が結合した分析物を蛍光により検出すること
を含む、前記方法。
[本発明1049]
ＢＳが抗体である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
ＢＳが抗ジゴキシゲニン抗体である、本発明1049の方法。
[本発明1051]
ＢＳが、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、ロバ抗マウスＩｇＧ抗体、ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体、ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体、ニワトリ抗マウスＩｇＧ抗体、ニワトリ抗ウサギＩｇＧ抗体、またはニワトリ抗ヒトＩｇＧ抗体である、本発明1049の方法。
[本発明1052]
ＢＳが、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンＤＮ、またはアビジンＤ部分である、本発明1048の方法。
[本発明1053]
前記分析物が、細胞表面で発現する標的タンパク質である、本発明1048〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
1つ以上のモノマーを含むポリマーであって、前記1つ以上のモノマーが、
式Ａのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｘが、前記ポリマー中のモノマーＡ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが6〜100である、式Ａのモノマー、
式Ｂのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｙが、前記ポリマー中のモノマーＢ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが0〜99である、式Ｂのモノマー、及び
式Ｃのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｚが、前記ポリマー中のモノマーＣ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが0〜99である、式Ｃのモノマー
からなる群から選択され、
式中、Ｒ1〜Ｒ6が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、
ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、
前記ポリマーが、末端基ＨＧ1及びＨＧ2を含み、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳであり、
ＸのＹ＋Ｚに対する比率が1超であり、
Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が10超である、
前記ポリマー。
[本発明1055]
前記ポリマーがＬ−ＢＳを含み、ＢＳのポリマーに対する比率が0．2〜3である、本発明1054のポリマー。
[本発明1056]
モノマー単位Ｂ及びモノマー単位Ｃが異なる、本発明1054または1055のポリマー。
[本発明1057]
前記モノマー単位が互いに直接結合している、本発明1054〜1056のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1058]
前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、1，2，3−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、2−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルもしくはＰＥＧ基を含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基である、本発明1054〜1057のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1059]
（ｉ）Ｒ1〜Ｒ6が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
（ｉｉ）ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
（ｉｉｉ）Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
（ｉｖ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
（ｖ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
（ｖｉ）ｘが11〜80の整数であり、ｙ及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、（3）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、
本発明1054〜1058のいずれかのポリマー。
[本発明1060]
（ｉ）Ｒ1〜Ｒ6が水素であり、かつ／または
（ｉｉ）ＳＧ1及びＳＧ2がＰＥＧであり、かつ／または
（ｉｉｉ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1054〜1059のいずれかのポリマー。
[本発明1061]
（ｉ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
（ｉｉ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキルもしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1054〜1060のいずれかのポリマー。
[本発明1062]
アルキルがメチル基である、本発明1061のポリマー。
[本発明1063]
Ｒ1〜Ｒ6が水素であり、ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｘが16〜80の整数であり、ｙ及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、（3）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、本発明1054のポリマーコンジュゲート。
[本発明1064]
ＳＧ1及びＳＧ2が独立して、ＰＥＧ6〜ＰＥＧ18である、本発明1054〜1063のいずれかのポリマー。
[本発明1065]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｘが16〜80の整数であり、ｙ及びｚが各々、0〜64から独立して選択される整数であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1054〜1064のいずれかのポリマー。
[本発明1066]
（ｉ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
（ｉｉ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1054〜1065のいずれかのポリマー。
[本発明1067]
1つ以上のモノマーを含むポリマーであって、前記1つ以上のモノマーが、
式Ｄのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｗが、前記ポリマー中のモノマーＤ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｗが6〜100である、式Ｄのモノマー、
式Ｅのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｘが、前記ポリマー中のモノマーＥ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが0〜98である、式Ｅのモノマー、
式Ｆのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｙが、前記ポリマー中のモノマーＦ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが1〜20である、式Ｆのモノマー、及び
式Ｇのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｚが、前記ポリマー中のモノマーＧ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが0〜98である、式Ｇのモノマー
からなる群から選択され、
式中、Ｒ1〜Ｒ6が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、
ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、
前記ポリマーが、末端基ＨＧ1及びＨＧ2を含み、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳであり、
ＷのＸ＋Ｙ＋Ｚに対する比率が1超であり、
Ｗ＋Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が10超であり、
ＦＰが、450ｎｍを超える吸収極大及び500ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が5％を超えるフルオロフォアまたは蛍光色素である、
前記ポリマー。
[本発明1068]
前記ポリマーがＬ−ＢＳを含み、ＢＳのポリマーに対する比率が0．2〜3である、本発明1067のポリマー。
[本発明1069]
モノマー単位Ｅ及びモノマー単位Ｇが異なる、本発明1067または1068のポリマー。
[本発明1070]
前記モノマー単位が互いに直接結合している、本発明1067〜1069のいずれかのポリマー。
[本発明1071]
前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、1，2，3−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、2−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルもしくはＰＥＧ基もしくはＦＰを含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基もしくはＦＰである、本発明1067〜1070のいずれかのポリマー。
[本発明1072]
（ａ）ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、もしくはフタロシアニンであり、かつ／または
（ｂ）Ｒ1〜Ｒ6が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
（ｃ）ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
（ｄ）Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
（ｅ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
（ｆ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
（ｇ）ｗが11〜80の整数であり、ｘ及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であり、ｙが1〜10の整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、（3）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、
本発明1067〜1071のいずれかのポリマー。
[本発明1073]
Ｒ1〜Ｒ6が水素である、本発明1067〜1072のいずれかのポリマー。
[本発明1074]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｗが16〜79の整数であり、ｘ及びｚが各々、0〜63から独立して選択される整数であり、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1067〜1073のいずれかのポリマー。
[本発明1075]
ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ1〜Ｒ6が水素であり、ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗが11〜80の整数であり、ｘ及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であり、ｙが1〜10の整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、（3）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、本発明1067のポリマーコンジュゲート。
[本発明1076]
ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンである、本発明1067〜1075のいずれかのポリマー。
[本発明1077]
（ａ）ＦＰがローダミンであるか、または
（ｂ）ＦＰがシアニンである、
本発明1075のポリマー。
[本発明1078]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1067〜1077のいずれかのポリマー。
[本発明1079]
（ａ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
（ｂ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1067〜1078のいずれかのポリマー。
[本発明1080]
1つ以上のモノマーを含むポリマーであって、前記1つ以上のモノマーが、
式Ｈのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｘが、前記ポリマー中のモノマーＨ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが0〜100である、式Ｈのモノマー、
式Ｉのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｙが、前記ポリマー中のモノマーＩ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが0〜100である、式Ｉのモノマー、及び
式Ｊのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｚが、前記ポリマー中のモノマーＪ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが0〜100である、式Ｊのモノマー
からなる群から選択され、
式中、Ｒ1〜Ｒ4が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、
ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、
前記ポリマーが、末端基ＨＧ1及びＨＧ2を含み、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳであり、
Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が10超である、
前記ポリマー。
[本発明1081]
前記ポリマーがＬ−ＢＳを含み、ＢＳのポリマーに対する比率が0．2〜3である、本発明1080のポリマー。
[本発明1082]
モノマー単位Ｈ、Ｉ、及びＪが異なる、本発明1080または1081のポリマー。
[本発明1083]
前記モノマー単位が互いに直接結合している、本発明1080〜1082のいずれかのポリマー。
[本発明1084]
前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、1，2，3−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、2−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルもしくはＰＥＧ基を含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基である、本発明1080〜1083のいずれかのポリマー。
[本発明1085]
（ａ）Ｒ1〜Ｒ4が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
（ｂ）ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
（ｃ）Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
（ｄ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
（ｅ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
（ｆ）ｘ、ｙ、及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、
本発明1080〜1084のいずれかのポリマー。
[本発明1086]
（ａ）Ｒ1〜Ｒ4が水素であり、かつ／または
（ｂ）ＳＧ1及びＳＧ2がＰＥＧであり、かつ／または
（ｃ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1080〜1085のいずれかのポリマー。
[本発明1087]
（ａ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
（ｂ）ＳＧ3〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1080〜1086のいずれかのポリマー。
[本発明1088]
アルキルがメチル基である、本発明1087のポリマー。
[本発明1089]
Ｒ1〜Ｒ4が水素であり、ＳＧ1〜ＳＧ6が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはまたはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、または炭水化物であり、ｘが11〜80の整数であり、ｙ及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が1超であり、（3）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、本発明1080のポリマー。
[本発明1090]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1080〜1089のいずれかのポリマー。
[本発明1091]
（ａ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
（ｂ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1080〜1090のいずれかのポリマー。
[本発明1092]
1つ以上のモノマーを含むポリマーであって、前記1つ以上のモノマーが、
式Ｋのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｗが、前記ポリマー中のモノマーＫ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｗが0〜100である、式Ｋのモノマー、
式Ｌのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｘが、前記ポリマー中のモノマーＬ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが0〜100である、式Ｌのモノマー、
式Ｃのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｙが、前記ポリマー中のモノマーＭ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが1〜20である、式Ｃのモノマー、及び
式Ｎのモノマー
Figure 2019512573
であって、
式中、Ｚが、前記ポリマー中のモノマーＮ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが0〜100である、式Ｎのモノマー
からなる群から選択され、
式中、Ｒ1〜Ｒ4が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、
ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、
前記ポリマーが、末端基ＨＧ1及びＨＧ2を含み、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳであり、
Ｗ＋Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が10超であり、
フルオロフォア（ＦＰ）が、450ｎｍを超える吸収極大及び500ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が5％を超える蛍光色素である、
前記ポリマー。
[本発明1093]
前記ポリマーがＬ−ＢＳを含み、ＢＳのポリマーに対する比率が0．2〜3である、本発明1092のポリマー。
[本発明1094]
モノマー単位Ｋ、Ｌ、及びＮが異なる、本発明1092または1093のポリマー。
[本発明1095]
前記モノマー単位が互いに直接結合している、本発明1092〜1094のいずれかのポリマー。
[本発明1096]
前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、1，2，3−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、2−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルもしくはＰＥＧ基もしくはＦＰ基を含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基もしくはＦＰ基である、本発明1092〜1095のいずれかのポリマー。
[本発明1097]
（ａ）ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、もしくはフタロシアニンであり、かつ／または
（ｂ）Ｒ1〜Ｒ4が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
（ｃ）ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
（ｄ）Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
（ｅ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
（ｆ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
（ｇ）ｗ、ｘ、及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であり、ｙが1〜10の整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、
本発明1092〜1096のいずれかのポリマー。
[本発明1098]
Ｒ1〜Ｒ4が水素である、本発明1092〜1097のいずれかのポリマー。
[本発明1099]
ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ1〜Ｒ4が水素であり、ＳＧ1〜ＳＧ7が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、またはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、または炭水化物であり、ｗ、ｘ、及びｚが各々、0〜80から独立して選択される整数であり、ｙが1〜10の整数であるが、但し、（1）ＢＳ／ポリマーの比率が1〜2であり、（2）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が20超であることを条件とする、本発明1092〜1098のいずれかのポリマー。
[本発明1100]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1092〜1099のいずれかのポリマー。
[本発明1101]
ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンである、本発明1092〜1100のいずれかのポリマー。
[本発明1102]
ＦＰが、
（ａ）ローダミンであるか、または
（ｂ）シアニンである、
本発明1101のポリマーコンジュゲート。
[本発明1103]
ＢＳ／ポリマーの比率が1であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が30〜80である、本発明1092〜1102のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1104]
（ａ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
（ｂ）ＨＧ1及びＨＧ2が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
本発明1092〜1103のいずれかのポリマーコンジュゲート。
[本発明1105]
試料中の分析物を検出する方法であって、
ａ）前記試料を、本発明1054〜1104のいずれかのポリマーを含む検出試薬と、前記検出試薬が前記分析物に結合する条件下で組み合わせることと、
ｂ）前記検出試薬が結合した分析物を蛍光により検出すること
を含む、前記方法。
[本発明1106]
ＢＳが抗体である、本発明1105の方法。
[本発明1107]
ＢＳが抗ジゴキシゲニン抗体である、本発明1106の方法。
[本発明1108]
ＢＳが、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、ロバ抗マウスＩｇＧ抗体、ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体、ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体、ニワトリ抗マウスＩｇＧ抗体、ニワトリ抗ウサギＩｇＧ抗体、またはニワトリ抗ヒトＩｇＧ抗体である、本発明1106の方法。
[本発明1109]
ＢＳが、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンＤＮ、またはアビジンＤ部分である、本発明1105の方法。
[本発明1110]
前記分析物が、細胞表面で発現する標的タンパク質である、本発明1105〜1109のいずれかの方法。
本開示、具体的には、特許請求の範囲及び／または項において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の用語は、米国特許法におけるそれに帰する意味を有してもよく、例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味してもよく、「から本質的になること」及び「から本質的になる」等の用語は、米国特許法におけるそれらに帰する意味を有し、例えば、それらは、明確に列挙されていない要素を考慮するが、先行技術に見られる要素または本発明の基本的特性もしくは新規の特性に影響を及ぼす要素を除外することに留意されたい。これら及び他の実施形態が開示されるか、または以下の発明を実施するための形態から明らかであり、それに包含される。

Claims (110)

  1. 式Ｉのポリマーコンジュゲートであって、
    Figure 2019512573
    式中、前記ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＡ、Ｂ、及びＣで表される３つのモノマー単位を含み、
    Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）を表し、
    ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
    ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
    ｘが６〜１００の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜９９から独立して選択される整数であるが、但し、
    （１）ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
    （２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、
    （３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
    ことを条件とする、前記ポリマーコンジュゲート。
  2. モノマー単位Ｂ及びモノマー単位Ｃが異なる、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
  3. 前記モノマー単位が互いに直接結合している、請求項１または２に記載のポリマーコンジュゲート。
  4. 前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルまたはＰＥＧ基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  5. （ｉ）Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
    （ｉｉ）ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
    （ｉｉｉ）Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
    （ｉｖ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
    （ｖ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
    （ｖｉ）ｘが１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  6. （ｉ）Ｒ１〜Ｒ６が水素であり、かつ／または
    （ｉｉ）ＳＧ１及びＳＧ２がＰＥＧであり、かつ／または
    （ｉｉｉ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  7. （ｉ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
    （ｉｉ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキルもしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  8. アルキルがメチル基である、請求項７に記載のポリマーコンジュゲート。
  9. Ｒ１〜Ｒ６が水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｘが１６〜８０の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
  10. ＳＧ１及びＳＧ２が独立して、ＰＥＧ６〜ＰＥＧ１８である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  11. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｘが１６〜８０の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜６４から独立して選択される整数であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  12. （ｉ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
    （ｉｉ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  13. 式ＩＩのポリマーコンジュゲートであって、
    Figure 2019512573
    式中、前記ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＤ、Ｅ、Ｆ、及びＧで表される４つのモノマー単位を含み、
    フルオロフォア（ＦＰ）が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超える蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
    ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、
    ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、ハロゲン、ボロニル、アルキル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
    ｗが６〜１００の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜９８から独立して選択される整数であり、ｙが１〜２０の整数であるが、但し、
    （１）ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
    （２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、
    （３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
    ことを条件とする、前記ポリマーコンジュゲート。
  14. モノマー単位Ｅ及びモノマー単位Ｇが異なる、請求項１３に記載のポリマーコンジュゲート。
  15. 前記モノマー単位が互いに直接結合している、請求項１３または１４に記載のポリマーコンジュゲート。
  16. 前記リンカー（Ｌ）が、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、またはＦＰを含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  17. （ａ）ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール（ｒｈｏｄｏｌ）、シアニン、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、もしくはフタロシアニンであり、かつ／または
    （ｂ）Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
    （ｃ）ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
    （ｄ）Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
    （ｅ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
    （ｆ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
    （ｇ）ｗが１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、
    請求項１３または１６のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  18. Ｒ１〜Ｒ６が水素である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  19. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｗが１６〜７９の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜６３から独立して選択される整数であり、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  20. ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６が水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗが１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、請求項１３に記載のポリマーコンジュゲート。
  21. ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンである、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  22. （ａ）ＦＰがローダミンであるか、または
    （ｂ）ＦＰがシアニンである、
    請求項２１に記載のポリマーコンジュゲート。
  23. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  24. （ａ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
    （ｂ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項１３〜２３のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  25. 式ＩＩＩのポリマーコンジュゲートであって、
    Figure 2019512573
    式中、前記ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＨ、Ｉ、及びＪで表される３つのモノマー単位を含み、
    Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）を表し、
    ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲンもしくはボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、ｘ、ｙ、及びｚが各々、０〜１００から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超であることを条件とする、前記ポリマーコンジュゲート。
  26. モノマー単位Ｈ、Ｉ、及びＪが異なる、請求項２５に記載のポリマーコンジュゲート。
  27. 前記モノマー単位が互いに直接結合している、請求項２５または２６に記載のポリマーコンジュゲート。
  28. 前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルまたはＰＥＧ基を含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  29. （ａ）Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
    （ｂ）ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
    （ｃ）Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
    （ｄ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
    （ｅ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
    （ｆ）ｘ、ｙ、及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、
    請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  30. （ａ）Ｒ１〜Ｒ４が水素であり、かつ／または
    （ｂ）ＳＧ１及びＳＧ２がＰＥＧであり、かつ／または
    （ｃ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  31. （ａ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
    （ｂ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  32. アルキルがメチル基である、請求項３１に記載のポリマーコンジュゲート。
  33. Ｒ１〜Ｒ４が水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはまたはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、または炭水化物であり、ｘが１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、請求項２５に記載のポリマーコンジュゲート。
  34. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  35. （ａ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
    （ｂ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  36. 式ＩＶのポリマーコンジュゲートであって、
    Figure 2019512573
    式中、前記ポリマーコンジュゲートが、ポリマー主鎖に沿ってランダムに分布したＫ、Ｌ、Ｍ、及びＮで表される４つのモノマー単位を含み、
    フルオロフォア（ＦＰ）が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超える蛍光色素であり、Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
    ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、ハロゲン、ボロニル、アルキル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳを表し、
    ｗ、ｘ、及びｚが各々、０〜１００から独立して選択される整数であり、ｙが１〜２０の整数であるが、但し、
    （１）ＢＳ／ポリマーの比率が０．２〜３であり、
    （２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１０超である
    ことを条件とする、前記ポリマーコンジュゲート。
  37. モノマー単位Ｋ、Ｌ、及びＮが異なる、請求項３６に記載のポリマーコンジュゲート。
  38. 前記モノマー単位が互いに直接結合している、請求項３６または３７に記載のポリマーコンジュゲート。
  39. 前記リンカー（Ｌ）が、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、またはＦＰを含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  40. （ａ）ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、もしくはフタロシアニンであり、かつ／または
    （ｂ）Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
    （ｃ）ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
    （ｄ）Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
    （ｅ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
    （ｆ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
    （ｇ）ｗ、ｘ、及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、
    請求項３６〜３９のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  41. Ｒ１〜Ｒ４が水素である、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  42. ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４が水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、またはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、または炭水化物であり、ｗ、ｘ、及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  43. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  44. ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンである、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  45. ＦＰが、
    （ａ）ローダミンであるか、または
    （ｂ）シアニンである、
    請求項４４に記載のポリマーコンジュゲート。
  46. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  47. （ａ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
    （ｂ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  48. 試料中の分析物を検出する方法であって、
    ａ）前記試料を、請求項１〜４７のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲートを含む検出試薬と、前記検出試薬が前記分析物に結合する条件下で組み合わせることと、
    ｂ）前記検出試薬が結合した分析物を蛍光により検出すること
    を含む、前記方法。
  49. ＢＳが抗体である、請求項４８に記載の方法。
  50. ＢＳが抗ジゴキシゲニン抗体である、請求項４９に記載の方法。
  51. ＢＳが、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、ロバ抗マウスＩｇＧ抗体、ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体、ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体、ニワトリ抗マウスＩｇＧ抗体、ニワトリ抗ウサギＩｇＧ抗体、またはニワトリ抗ヒトＩｇＧ抗体である、請求項４９に記載の方法。
  52. ＢＳが、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンＤＮ、またはアビジンＤ部分である、請求項４８に記載の方法。
  53. 前記分析物が、細胞表面で発現する標的タンパク質である、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. １つ以上のモノマーを含むポリマーであって、前記１つ以上のモノマーが、
    式Ａのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｘが、前記ポリマー中のモノマーＡ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが６〜１００である、式Ａのモノマー、
    式Ｂのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｙが、前記ポリマー中のモノマーＢ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが０〜９９である、式Ｂのモノマー、及び
    式Ｃのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｚが、前記ポリマー中のモノマーＣ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが０〜９９である、式Ｃのモノマー
    からなる群から選択され、
    式中、Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、
    ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、
    前記ポリマーが、末端基ＨＧ１及びＨＧ２を含み、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳであり、
    ＸのＹ＋Ｚに対する比率が１超であり、
    Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が１０超である、
    前記ポリマー。
  55. 前記ポリマーがＬ−ＢＳを含み、ＢＳのポリマーに対する比率が０．２〜３である、請求項５４に記載のポリマー。
  56. モノマー単位Ｂ及びモノマー単位Ｃが異なる、請求項５４または５５に記載のポリマー。
  57. 前記モノマー単位が互いに直接結合している、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  58. 前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルもしくはＰＥＧ基を含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基である、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  59. （ｉ）Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
    （ｉｉ）ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
    （ｉｉｉ）Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
    （ｉｖ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
    （ｖ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
    （ｖｉ）ｘが１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、
    請求項５４〜５８のいずれか一項に記載のポリマー。
  60. （ｉ）Ｒ１〜Ｒ６が水素であり、かつ／または
    （ｉｉ）ＳＧ１及びＳＧ２がＰＥＧであり、かつ／または
    （ｉｉｉ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項５４〜５９のいずれか一項に記載のポリマー。
  61. （ｉ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
    （ｉｉ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキルもしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項５４〜６０のいずれか一項に記載のポリマー。
  62. アルキルがメチル基である、請求項６１に記載のポリマー。
  63. Ｒ１〜Ｒ６が水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｘが１６〜８０の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、請求項５４に記載のポリマーコンジュゲート。
  64. ＳＧ１及びＳＧ２が独立して、ＰＥＧ６〜ＰＥＧ１８である、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載のポリマー。
  65. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｘが１６〜８０の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜６４から独立して選択される整数であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項５４〜６４のいずれか一項に記載のポリマー。
  66. （ｉ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
    （ｉｉ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項５４〜６５のいずれか一項に記載のポリマー。
  67. １つ以上のモノマーを含むポリマーであって、前記１つ以上のモノマーが、
    式Ｄのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｗが、前記ポリマー中のモノマーＤ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｗが６〜１００である、式Ｄのモノマー、
    式Ｅのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｘが、前記ポリマー中のモノマーＥ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが０〜９８である、式Ｅのモノマー、
    式Ｆのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｙが、前記ポリマー中のモノマーＦ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが１〜２０である、式Ｆのモノマー、及び
    式Ｇのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｚが、前記ポリマー中のモノマーＧ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが０〜９８である、式Ｇのモノマー
    からなる群から選択され、
    式中、Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、
    ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、
    前記ポリマーが、末端基ＨＧ１及びＨＧ２を含み、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳであり、
    ＷのＸ＋Ｙ＋Ｚに対する比率が１超であり、
    Ｗ＋Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が１０超であり、
    ＦＰが、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超えるフルオロフォアまたは蛍光色素である、
    前記ポリマー。
  68. 前記ポリマーがＬ−ＢＳを含み、ＢＳのポリマーに対する比率が０．２〜３である、請求項６７に記載のポリマー。
  69. モノマー単位Ｅ及びモノマー単位Ｇが異なる、請求項６７または６８に記載のポリマー。
  70. 前記モノマー単位が互いに直接結合している、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載のポリマー。
  71. 前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルもしくはＰＥＧ基もしくはＦＰを含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基もしくはＦＰである、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載のポリマー。
  72. （ａ）ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、もしくはフタロシアニンであり、かつ／または
    （ｂ）Ｒ１〜Ｒ６が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
    （ｃ）ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
    （ｄ）Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
    （ｅ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
    （ｆ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
    （ｇ）ｗが１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、
    請求項６７〜７１のいずれか一項に記載のポリマー。
  73. Ｒ１〜Ｒ６が水素である、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載のポリマー。
  74. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｗが１６〜７９の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜６３から独立して選択される整数であり、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載のポリマー。
  75. ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ６が水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、または炭水化物であり、ｗが１１〜８０の整数であり、ｘ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ／（ｘ＋ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、請求項６７に記載のポリマーコンジュゲート。
  76. ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンである、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のポリマー。
  77. （ａ）ＦＰがローダミンであるか、または
    （ｂ）ＦＰがシアニンである、
    請求項７５に記載のポリマー。
  78. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項６７〜７７のいずれか一項に記載のポリマー。
  79. （ａ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
    （ｂ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項６７〜７８のいずれか一項に記載のポリマー。
  80. １つ以上のモノマーを含むポリマーであって、前記１つ以上のモノマーが、
    式Ｈのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｘが、前記ポリマー中のモノマーＨ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが０〜１００である、式Ｈのモノマー、
    式Ｉのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｙが、前記ポリマー中のモノマーＩ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが０〜１００である、式Ｉのモノマー、及び
    式Ｊのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｚが、前記ポリマー中のモノマーＪ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが０〜１００である、式Ｊのモノマー
    からなる群から選択され、
    式中、Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、
    ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、
    前記ポリマーが、末端基ＨＧ１及びＨＧ２を含み、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳであり、
    Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が１０超である、
    前記ポリマー。
  81. 前記ポリマーがＬ−ＢＳを含み、ＢＳのポリマーに対する比率が０．２〜３である、請求項８０に記載のポリマー。
  82. モノマー単位Ｈ、Ｉ、及びＪが異なる、請求項８０または８１に記載のポリマー。
  83. 前記モノマー単位が互いに直接結合している、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載のポリマー。
  84. 前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルもしくはＰＥＧ基を含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基である、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載のポリマー。
  85. （ａ）Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
    （ｂ）ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
    （ｃ）Ｌが、アルキル鎖もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
    （ｄ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
    （ｅ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
    （ｆ）ｘ、ｙ、及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、
    請求項８０〜８４のいずれか一項に記載のポリマー。
  86. （ａ）Ｒ１〜Ｒ４が水素であり、かつ／または
    （ｂ）ＳＧ１及びＳＧ２がＰＥＧであり、かつ／または
    （ｃ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項８０〜８５のいずれか一項に記載のポリマー。
  87. （ａ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
    （ｂ）ＳＧ３〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項８０〜８６のいずれか一項に記載のポリマー。
  88. アルキルがメチル基である、請求項８７に記載のポリマー。
  89. Ｒ１〜Ｒ４が水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ６が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはまたはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖またはＰＥＧ鎖を含み、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、または炭水化物であり、ｘが１１〜８０の整数であり、ｙ及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｘ／（ｙ＋ｚ）の比率が１超であり、（３）ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、請求項８０に記載のポリマー。
  90. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項８０〜８９のいずれか一項に記載のポリマー。
  91. （ａ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
    （ｂ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項８０〜９０のいずれか一項に記載のポリマー。
  92. １つ以上のモノマーを含むポリマーであって、前記１つ以上のモノマーが、
    式Ｋのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｗが、前記ポリマー中のモノマーＫ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｗが０〜１００である、式Ｋのモノマー、
    式Ｌのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｘが、前記ポリマー中のモノマーＬ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｘが０〜１００である、式Ｌのモノマー、
    式Ｃのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｙが、前記ポリマー中のモノマーＭ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｙが１〜２０である、式Ｃのモノマー、及び
    式Ｎのモノマー
    Figure 2019512573
    であって、
    式中、Ｚが、前記ポリマー中のモノマーＮ単位の数であり、前記モノマー単位が、連続的または非連続的であり、Ｚが０〜１００である、式Ｎのモノマー
    からなる群から選択され、
    式中、Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、アルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アリール、ヘテロアリール基、またはリンカーを介してコンジュゲートされた生物学的基質（Ｌ−ＢＳ）であり、
    ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、アルキル、水溶性基、またはＬ−ＢＳであり、
    前記ポリマーが、末端基ＨＧ１及びＨＧ２を含み、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アルキル、ハロゲン、ボロニル、アリール、ヘテロアリール基、またはＬ−ＢＳであり、
    Ｗ＋Ｘ＋Ｙ＋Ｚの合計が１０超であり、
    フルオロフォア（ＦＰ）が、４５０ｎｍを超える吸収極大及び５００ｎｍを超える発光極大を有し、かつ蛍光量子収率が５％を超える蛍光色素である、
    前記ポリマー。
  93. 前記ポリマーがＬ−ＢＳを含み、ＢＳのポリマーに対する比率が０．２〜３である、請求項９２に記載のポリマー。
  94. モノマー単位Ｋ、Ｌ、及びＮが異なる、請求項９２または９３に記載のポリマー。
  95. 前記モノマー単位が互いに直接結合している、請求項９２〜９４のいずれか一項に記載のポリマー。
  96. 前記リンカーが、アルキル、ＰＥＧ、ＦＰ、カルボキサミド、チオエーテル、エステル、イミン、ヒドラジン、オキシム、アルキルアミン、エーテル、アリールアミン、ボロン酸エステル、Ｎ−アシル尿素もしくは無水物、白金錯体、アミノトリアジン、トリアジニルエーテル、アミジン、尿素、ウレタン、チオ尿素、亜リン酸エステル、シリルエーテル、スルホンアミド、スルホン酸エステル、１，２，３−トリアゾール、ピラダジン、チアゾリジン、２−ジフェニルホスホニル−ベンゾアミド、イソオキサゾール、またはスクシンイミド基を含み、好ましくは、前記リンカーが、アルキルもしくはＰＥＧ基もしくはＦＰ基を含むか、またはアルキルもしくはＰＥＧ基もしくはＦＰ基である、請求項９２〜９５のいずれか一項に記載のポリマー。
  97. （ａ）ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、もしくはフタロシアニンであり、かつ／または
    （ｂ）Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素、メチル、もしくはエチルを表し、かつ／または
    （ｃ）ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、アミノアルキル、もしくはＬ−ＢＳを表し、かつ／または
    （ｄ）Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、もしくはＰＥＧ鎖であり、かつ／または
    （ｅ）ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、もしくは炭水化物であり、かつ／または
    （ｆ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、もしくはボロニルを表し、かつ／または
    （ｇ）ｗ、ｘ、及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、
    請求項９２〜９６のいずれか一項に記載のポリマー。
  98. Ｒ１〜Ｒ４が水素である、請求項９２〜９７のいずれか一項に記載のポリマー。
  99. ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、ロドール、シアニン、ボディピー、スクアライン、クマリン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ポルフィリン、またはフタロシアニンであり、Ｒ１〜Ｒ４が水素であり、ＳＧ１〜ＳＧ７が独立して、ＰＥＧ、アルキル、カルボキシアルキル、スルホニルアルキル、ホスホニルアルキル、またはアミノアルキルを表し、ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、アリール、ハロゲン、ボロニル、またはＬ−ＢＳを表し、ここで、Ｌが、アルキル鎖、ＦＰ、またはＰＥＧ鎖であり、ＢＳが、抗体、ペプチド、タンパク質、オリゴ、核酸、または炭水化物であり、ｗ、ｘ、及びｚが各々、０〜８０から独立して選択される整数であり、ｙが１〜１０の整数であるが、但し、（１）ＢＳ／ポリマーの比率が１〜２であり、（２）ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が２０超であることを条件とする、請求項９２〜９８のいずれか一項に記載のポリマー。
  100. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項９２〜９９のいずれか一項に記載のポリマー。
  101. ＦＰが、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、ボディピー、スクアライン、ペリレンジイミド、またはフタロシアニンである、請求項９２〜１００のいずれか一項に記載のポリマー。
  102. ＦＰが、
    （ａ）ローダミンであるか、または
    （ｂ）シアニンである、
    請求項１０１に記載のポリマーコンジュゲート。
  103. ＢＳ／ポリマーの比率が１であり、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が３０〜８０である、請求項９２〜１０２のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  104. （ａ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、水素、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表すか、または
    （ｂ）ＨＧ１及びＨＧ２が独立して、ハロゲン、ボロニル、カルボキシアリール、もしくはＬ−ＢＳを表す、
    請求項９２〜１０３のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  105. 試料中の分析物を検出する方法であって、
    ａ）前記試料を、請求項５４〜１０４のいずれか一項に記載のポリマーを含む検出試薬と、前記検出試薬が前記分析物に結合する条件下で組み合わせることと、
    ｂ）前記検出試薬が結合した分析物を蛍光により検出すること
    を含む、前記方法。
  106. ＢＳが抗体である、請求項１０５に記載の方法。
  107. ＢＳが抗ジゴキシゲニン抗体である、請求項１０６に記載の方法。
  108. ＢＳが、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、ロバ抗マウスＩｇＧ抗体、ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体、ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体、ニワトリ抗マウスＩｇＧ抗体、ニワトリ抗ウサギＩｇＧ抗体、またはニワトリ抗ヒトＩｇＧ抗体である、請求項１０６に記載の方法。
  109. ＢＳが、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンＤＮ、またはアビジンＤ部分である、請求項１０５に記載の方法。
  110. 前記分析物が、細胞表面で発現する標的タンパク質である、請求項１０５〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
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