CN103665329B

CN103665329B - 一种生物素功能化的水溶性共轭聚合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103665329B
Application number: CN201310556359.2A
Authority: CN
Inventors: 刘兴奋; 范曲立; 黄艳琴; 黄维; 蔡小慧
Original assignee: Nanjing Post and Telecommunication University
Current assignee: Nanjing Post and Telecommunication University
Priority date: 2013-11-11
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-11-11
Also published as: CN103665329A

Abstract

一种生物素功能化的水溶性共轭聚合物及其制备方法和应用，聚合物采用先用叔丁氧羰基保护氨基，然后脱保护得到侧链连接氨基的中性聚合物，最后进行离子化和接生物素，得到生物素化的水溶性共轭聚合物。该合成方法简单，而且聚合物侧链的连接基团可进行灵活调控，得到侧链连接不同基团的荧光共轭聚合物。该聚合物是一类具有特异性识别能力和高灵敏的荧光传感材料，可弥补传统的非功能化水溶性共轭聚合物在识别生物分子时由于非特异性吸附的问题而导致的选择性下降的不足。此外，由于生物素－亲和素连接已被广泛应用，故该聚合物有望在化学/生物传感、生物标记等领域得到较好的应用。

Description

一种生物素功能化的水溶性共轭聚合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学/生物传感材料技术领域，具体涉及一种生物素功能化的水溶性共轭聚合物及其制备方法和应用。

背景技术

水溶性共轭聚合物是一类具有共轭π键长链结构的两亲性共轭聚合物，同时具备了传统共轭聚合物优异的光电活性和聚电解质的水溶性特点。与传统的有机小分子相比，共轭聚合物具有很高的摩尔消光系数（10⁶M^-1cm^-1）和荧光量子产率，并且具有“分子导线”功能。共轭聚合物共轭骨架上的电子很容易受外界环境的影响，使其性质对外界的微小变化非常敏感，由此可以实现高灵敏度检测。另一方面，由于共轭聚合物侧链常带有一定的电荷，使其可以与相反电荷的分子之间发生静电结合，为超低浓度靶分子的检测奠定了基础。利用这些特性，将具有特异性识别功能的基团与猝灭剂相连接，通过观察荧光的猝灭或恢复就能简便的实现对多种有机、无机及生物分子的高灵敏检测。自2000年起，诺贝尔奖获得者A.J.Heeger以及G.C.Bazan、Leclerc、Wang、Liu等课题组相继开展了这方面的研究。

目前，应用于化学及生物检测分析领域的水溶性共轭聚合物大多都不含特殊功能基团，主要通过聚合物与蛋白质之间的静电相互作用、疏水作用和氢键等弱相互作用来实现对某些生物分子的检测。由于这些非特异性的弱相互作用也常常存在于非靶蛋白和聚合物之间，因此，使蛋白质检测存在特异性较低、背景信号较强等问题。相比之下，生物功能化的水溶性聚合物，则可以通过受体-配体之间的特异性反应而引起的聚合物光学性质的变化来实现对蛋白质的灵敏检测。

生物素，是一种水溶性B族维生素。生物素-亲和素系统具有亲和力强、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点，已被广泛应用于抗原、抗体、细胞等的定位和检测。生物素功能化的水溶性共轭聚合物可利用侧链的生物素与亲和素的特异性识别能力，将生物素－亲和素系统与共轭聚合物信号放大技术联用，更能成倍的放大目标信号，使检测的灵敏度更高，在作为荧光报告基团用于肿瘤标志物的检测、标记等方面有较好的应用潜力。

发明内容

本发明的目的在于提出一种生物素功能化水溶性共轭聚合物，可用作化学/生物传感材料。

本发明的另一目的在于提供一种上述聚合物的制备方法及应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术手段为：

一种生物素功能化的水溶性共轭聚合物，生物素通过其结构中的羧基与聚合物侧链的氨基之间形成酰胺键的方式挂接在共轭聚合物侧链，其分子结构如下：

其中，聚合度n为大于1的整数；biotin为生物素；Me为甲基。

所述的生物素功能化的水溶性共轭聚合物的合成方法，采用Sonogashira聚合反应，通过先合成叔丁氧羰基保护的聚合物，然后脱保护得到侧链连接氨基的中性聚合物，最后通过氨基与羧基之间的酰胺化反应和季铵化反应合成所述的生物素功能化的水溶性共轭聚合物，具体步骤如下：

（1）二碘苯单体的合成

在氮气气氛下，在250mL圆底烧瓶中加入碳酸钾（5.52g,67.4mmol）、3-溴丙基-氨基甲酸叔丁酯（2.38g,10mmol）和100mL丙酮，60℃回流。然后将1,4-二碘-2,5-苯二酚（1.44g,4mmol）溶于50mL丙酮后加入到烧瓶参与反应，保持回流72小时，冷却至室温。减压脱溶剂后，用100mL三氯甲烷溶解。有机层用去离子水和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，抽滤，减压旋蒸脱溶剂，用层析柱提纯，以（石油醚：乙酸乙酯=8:1，另加1%三乙胺）为洗脱液，正己烷重结晶得白色晶体。

（2）侧链连接叔丁氧羰基的中性聚合物的合成

在避光且氮气保护下，将通过鼓氮气除氧的混合溶剂二异丙胺:甲苯(1:2,15mL)加入25mL二口烧瓶中，瓶中预先装有M1（0.167mg，0.31mmol)、M2(202mg,0.3mmol)、碘苯(13mg,0.064mmol)、Pd(PPh3)4(15mg,0.013mmol)、CuI(3mg,0.016mmol)。混合物在70℃回流24h后，向其中注入碘苯(61mg,0.3mmol)封端，在氮气气氛下继续反应2h后将反应液倾入大量去离子水中，用二氯甲烷萃取三次,合并有机相，无水Na₂SO₄干燥，抽滤后减压脱溶剂到粘稠状，滴入甲醇：水（10:1）的混合溶剂中(300mL)，沉降，抽滤；溶解后再倒入300mL甲醇溶液中沉降两次，抽滤后真空干燥，最后得到黄色纤维状固体。

（3）侧链连接氨基的中性共轭聚合物的合成

将侧链连接叔丁氧羰基的中性共轭聚合物(200mg，0.2mmol(按聚合物重复单元计算))溶解在60mL氯仿中，常温下，将2mL三氟乙酸（TFA）注入上述溶液中，室温反应过夜。减压脱去大部分溶剂，加入2M NaOH至pH为12，加入乙酸乙酯萃取，减压脱溶剂至粘稠状，于石油醚中沉降，得黄色纤维状固体即为侧链连接氨基的中性聚合物。

（4）生物素功能化水溶性共轭聚合物的合成

将步骤3）得到的侧链连接氨基的中性共轭聚合物、EDC、生物素和吡啶按68mg：60mg：60mg：50mL混合，60℃反应过夜，减压蒸馏除去吡啶，加入30mL四氢呋喃，于-78℃下，滴入10mL三甲胺，溶液产生白色沉淀，继续滴加四氢呋喃至沉淀溶解，25℃反应24h，减压脱溶剂后溶于甲醇透析5天，冷冻干燥得黄色蓬松颗粒状固体产物，即为生物素功能化的水溶性共轭聚合物。

所述的生物素功能化的水溶性共轭聚合物的应用，可以用于（链霉）亲和素的特异性检测，肿瘤标志物的荧光标记等方面。例如，通过在生物素功能化的水溶性共轭聚合物中直接加入亲和素，通过观察溶液荧光性质的变化，即可实现对亲和素蛋白的特异性检测。

有益效果：本发明通过脱保护和酰胺化的方法制备生物素功能化的水溶性共轭聚合物，该方法便于对活性较高的氨基进行保护，并对生物素修饰位点进行调控，得到生物素化的水溶性共轭聚合物。本发明材料可弥补传统水溶性共轭聚合物利用生物分子与聚合物之间的静电作用进行检测，导致的特异性不高和灵敏度较低的不足，可提高待检测生物分子的选择性，可用做多功能荧光传感材料。

附图说明

图1.为本发明制备的侧链连接叔丁氧羰基的中性聚合物在甲醇/水体系中的紫外－可见吸收光谱和荧光光谱。

图2.为本发明以生物素功能化的水溶性共轭聚合物为传感材料检测亲和素蛋白和其它非特异性蛋白的荧光光谱图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，但不能以此来限制本发明的范围。

实施例1：

本实施例中3-溴丙基-氨基甲酸叔丁酯、1,4-二碘-2,5-苯二酚、1,6-二溴己烷、Pd(PPh₃)₂Cl₂、1,4-二甲氧基苯、3-溴丙胺氢溴酸盐均购自阿拉丁试剂有限公司。生物素购自上海领潮生物科技有限公司。

芴炔单体M1和二碘苯单体M2的制备方法见下式所示：

1）芴炔单体M1的合成：

参考文献YAN-QIN HUANG,QU-LI FAN,XIAO-MEI LU,CHUN FANG,SHU-JUAN LIU,LI-HUI YU-WEN,LIAN-HUI WANG,WEI HUANG.Cationic,Water-Soluble,Fluorene-Containing Poly(arylene ethynylene)s:Effects of Water Solubility on Aggregation,Photoluminescence Efficiency,and Amplified Fluorescence Quenching in Aqueous Solutions.Journal of Polymer Science:Part A:Polymer Chemistry,2006,44,5778–5794.

2）二碘苯单体M2的合成：

在氮气气氛下，在250mL圆底烧瓶中加入碳酸钾（5.52g,67.4mmol）、3-溴丙基-氨基甲酸叔丁酯（2.38g,10mmol）和100mL丙酮，60℃回流。然后将1,4-二碘-2,5-苯二酚（1.44g,4mmol）溶于50mL丙酮后加入到烧瓶参与反应，保持回流72小时，冷却至室温。减压脱溶剂后，用100mL三氯甲烷溶解。有机层用去离子水和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，抽滤，减压旋蒸脱溶剂，用层析柱提纯，以（石油醚：乙酸乙酯=8:1，另加1%三乙胺）为洗脱液，正己烷重结晶得白色晶体（1.35g，产率为50%）。

3）侧链连接叔丁氧羰基的中性聚合物的合成

侧链连接叔丁氧羰基的中性聚合物的合成步骤如下：在避光且氮气保护条件下，将通过鼓氮气除氧的混合溶剂二异丙胺：甲苯（体积比1:2,15mL）加入25mL二口烧瓶中，瓶中预先装有M1（0.167mg,0.31mmol)、M2(202mg,0.3mmol)、碘苯(13mg,0.064mmol)、Pd(PPh₃)₄(15mg,0.013mmol)、CuI(3mg,0.016mmol)。混合物在70℃回流24h后，向其中注入碘苯（61mg,0.3mmol）封端，在氮气气氛下继续反应2h后将反应液倾入大量（约150mL）去离子水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥，抽滤后减压脱溶剂至粘稠状，滴入甲醇：水（体积比10:1）的混合溶剂中（300mL），沉降，抽滤；溶解后再倒入300mL甲醇溶液中沉降两次，抽滤后真空干燥，最后得到黄色纤维状固体（0.23g，产率为70%）。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm)7.64-7.72(m,2H)，7.40-7.58(m,2H)，7.30-7.38（m,2H），7.11(s,2H)，4.96(s,2H)，4.10-4.22(m,4H)，3.38-3.48(m,4H)，3.24-3.34(m,4H)，3.01-3.09(m,4H)，1.94-2.17(m,8H)，1.53-1.72(m,4H)，1.39(s,18H)，1.04-1.26(m,4H)，0.53-0.70(m,4H)。

4）侧链连接氨基的中性聚合物的合成

将侧链连接叔丁氧羰基的聚合物（200mg，0.2mmol（按聚合物重复单元计算））溶解在60mL氯仿中，常温下，将2mL三氟乙酸（TFA）注入上述溶液中，室温反应过夜。减压脱去大部分溶剂，加入2M NaOH至pH为12，加入乙酸乙酯萃取，减压脱溶剂至粘稠状，于石油醚中沉降，最后得到黄色纤维状固体（79mg，产率66%）。其红外光谱显示：侧链连接叔丁氧羰基的中性聚合物位于1367 cm^-1处的叔丁基的特征峰消失，新出现的1676cm^-1左右的双峰为伯胺面内的弯曲振动。

5）生物素功能化水溶性共轭聚合物的合成

在氮气气氛下，将侧链修饰氨基的聚合物（68mg，约0.11mmol）、EDC（60mg，0.31mmol）、生物素（购自上海领潮生物技术有限公司，其结构如下式所示，）（60mg，0.25mmol）、吡啶50mL加入250mL二口烧瓶中，60℃反应过夜。减压蒸馏除去吡啶，向其中加入30mL四氢呋喃，于-78℃下，将10mL三甲胺滴入其中，溶液中会有白色沉淀产生，继续滴加四氢呋喃将其溶解，滴完后25℃反应24h。减压脱溶剂后溶于甲醇透析5天，冷冻干燥得黄色蓬松颗粒状固体产物（54mg，产率46%），即为生物素功能化的水溶性共轭聚合物，其分子结构如下：

其中，聚合度n≈15；biotin为生物素；Me为甲基。

红外光谱数据显示：3309cm^-1处为O-H和N-H的伸缩振动，2931cm^-1处为-CH，-CH₂的伸缩振动，1707cm^-1为羧基中C=O的伸缩振动，1641cm^-1亦为羧酸上C=O的伸缩振动，由于结构中的大π键的共轭效应使其吸收峰向低波数处移动；1480cm^-1处为Ｎ-Ｈ的剪式振动，1270cm^-1为C-O的伸缩振动，这些特征吸收峰符合生物素的主要官能团。2926cm^-1和2848cm^-1处为-CH、-CH₂的伸缩振动，1617cm^-1新生成的酰胺键中氨基的特征峰，1458cm^-1处为新生成的酰胺键的伸缩振动，这些特征吸收峰表明PFP-NH₂和生物素之间通过PFP-NH₂侧链的氨基和生物素中的羧基生成的酰胺键而连接在一起。

生物素的分子结构式如下：

实施例2：生物素功能化的水溶性共轭聚合物作为荧光传感材料的应用

在本实施例中，我们以生物素功能化的水溶性共轭聚合物为传感材料，实现了对链霉亲和素蛋白的特异性检测。

将1mg PFPNBr-biotin（重复单元的相对分子量约为1000）溶解到1mL检测液中配制得到100μM PFPNBr-biotin母液；然后移取0.1mL母液于离心管中；经过计算分别取相应体积的链霉亲和素（SA）、溶菌酶（Lys）、免疫球蛋白（IgG）、血红蛋白（Hb）、牛血清蛋白（BSA）加入到上述离心管中；37℃反应30min，然后将加入pH7的PBS缓冲液至终体积为1mL。此时，PFPNBr-biotin的浓度为10μM、蛋白的浓度为50nM。最后，在荧光光谱仪上测定其荧光发射光谱，激发波长为413nm，发射波长420nm～700nm。结果见附图2所示，亲和素对聚合物荧光的猝灭效率达75％；而溶菌酶、血红蛋白、牛血清蛋白对聚合物荧光的猝灭效率较小（小于10％）；相反地，免疫球蛋白的加入则会使溶液荧光小幅度增强（约3％）。

作为对照，我们将PFP－NH₂聚合物溶于有机溶剂（四氢呋喃）中，并加入相同浓度的各种蛋白进行检测，发现各种蛋白对聚合物荧光的影响都较小（小于10％），其对亲和素蛋白没有显著的特异性。

可见，生物素功能化的聚合物在对亲和素蛋白（或亲和素修饰的其它生物分子）的检测方面可以显著提高选择性。

Claims

1.一种生物素功能化的水溶性共轭聚合物，其特征在于：生物素通过其结构中的羧基与聚合物侧链的氨基之间形成酰胺键的方式挂接在共轭聚合物侧链，其分子结构如下：

其中，聚合度n为大于1的整数；biotin为生物素；Me为甲基。

2.一种如权利要求1所述的生物素功能化的水溶性共轭聚合物的合成方法，其特征在于包括如下步骤：

1)二碘苯单体的合成

在氮气气氛下，将5.52g碳酸钾、2.38g 3-溴丙基-氨基甲酸叔丁酯加入到100mL丙酮中得溶液A，然后将1.44g 1,4-二碘-2,5-苯二酚溶于50mL丙酮后加入到上述溶液A中参与反应，60℃回流72小时，冷却至室温，减压脱溶剂，用100mL三氯甲烷溶解；然后洗涤，干燥，抽滤，重结晶得白色晶体，即为二碘苯单体；

2)侧链连接叔丁氧羰基的中性共轭聚合物的合成

将芴炔单体、二碘苯单体、碘苯、Pd(PPh₃)₄和CuI按质量比0.167：202：13：15：3混合，在避光且氮气保护下，通入二异丙胺和甲苯的混合溶剂，其中二异丙胺与甲苯的体积比为1:2，然后在70℃下回流反应24h，再注入61mg碘苯封端，在氮气气氛下继续反应2h，所得产物经过萃取、抽滤、沉降、干燥得到侧链连接叔丁氧羰基的中性共轭聚合物；

3)侧链连接氨基的中性共轭聚合物的合成

将步骤2)合成得到的侧链连接叔丁氧羰基的中性共轭聚合物溶解于氯仿中，然后注入三氟乙酸反应过夜，减压除溶剂，以碱调节pH为12，然后乙酸乙酯萃取，减压脱溶剂至粘稠状，于石油醚中沉降，得黄色纤维状固体即为侧链连接氨基的中性聚合物；其中：每100mg侧链连接叔丁氧羰基的中性共轭聚合物需加入30mL氯仿和1mL三氟乙酸；

4)生物素功能化水溶性共轭聚合物的合成

将步骤3)得到的侧链连接氨基的中性共轭聚合物、EDC、生物素和吡啶按68mg：60mg：60mg：50mL混合，60℃反应过夜，减压蒸馏除去吡啶，加入30mL四氢呋喃，于-78℃下，滴入10mL三甲胺，溶液产生白色沉淀，继续滴加四氢呋喃至沉淀溶解，25℃反应24h，减压脱溶剂后溶于甲醇透析5天，冷冻干燥得黄色蓬松颗粒状固体产物，即为生物素功能化的水溶性共轭聚合物。

3.如权利要求1所述的生物素功能化的水溶性共轭聚合物作为荧光传感材料的应用。