JP2002506518A

JP2002506518A - 化学発光エネルギー移動共役物、および結合アッセイでの標識としてのそれらの使用

Info

Publication number: JP2002506518A
Application number: JP50042099A
Authority: JP
Inventors: ジャン，キンピン; キ，ジュン; ナトラジャン，アナンド; シャープ，デイビッド; バーマン，マルクス; ヒルフィカー，ロルフ; シュミッド，エリカ; セン，ポール; トーメン，フリッズ; ワルドナー，エイドリアン; アルダー，アレックス; ロー，セイ−ジョン
Original assignee: バイエルコーポレイション
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 2002-02-26
Also published as: ATE249628T1; EP0988551B1; US6165800A; WO1998054574A3; EP0988551A2; AU7347298A; WO1998054574A2; DE69818044D1; DE69818044T2; ES2206927T3

Abstract

(57)【要約】アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム化合物と発光団との間で分子内エネルギー移動共役物(ETC)を形成することによって、新規な種類の化学発光アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム化合物が開示される。親の多置換アリールアクリジニウムエステル(DMAE)およびベンズアクリジニウムエステル(LEAE)の間の発光スペクトル重なりをさらに低下させるかまたはなくすために、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウムエステルの発光波長を伸長する方法が、開示される。これらのETCは、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウムの独特の所望の特性を保持しており、これには、非常に短時間での完全な光放射、単相の発光スペクトル、誘発機構の簡潔性、目的の生体分子を標識してトレーサーを形成する能力、および良好な安定性が挙げられる。さらに、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム化合物の発光スペクトルの範囲は、今ここで、ETC分子の一体化部分として発光団を選択することにより、随意に長いリープ(leap)でシフトできる。スペーサーを介して発光団に共有結合されたアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分を含有する化学発光標識共役物が開示され、該部分は、目的の生体分子にさらに共役されており、ここで、該スペーサーは、該部分から発生した励起種が該発光団にエネルギーを効率的に移動させるのに適当な長さであり、その結果、その発光団のスペクトル領域において、光の放射が生じる。その共役物を用いる結合アッセイ、該共役物を包含する試験キットおよびこの共役物を調製する方法もまた、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】化学発光エネルギー移動共役物、および結合アッセイでの標識としてのそれらの使用発明の背景本発明は、発光団と共有結合した化学発光アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム誘導体を含有する新規エネルギー移動共役物(ETC)または標識化剤に関する。本発明はまた、ETCの１種であって、化学発光アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム誘導体の発光波長範囲と明瞭に区別されるかまたは最小程度に重なった発光波長範囲を有するものに関する。本発明は、さらに、試料中の分析物の決定(例えば、診断試験)における化学発光標識としてのETCの新規適用に関する。多置換アリールアクリジニウムエステル(米国特許第4,745,181号ではDMAE)およびその誘導体(例えば、3-メトキシ置換DMAE、ベンズ[b]アクリジニウムエステル(米国特許第5,395,752号ではLEAE)および2-メトキシベンズ[b]アクリジニウムエステル)であって親DMAEの発光波長最大(428nmの発光最大)よりも６nm短いかまたは96nmおよび122nm長い発光波長最大を有するものの開発以来は、本発明者は研究を続けて、新規なアクリジニウム化合物およびそれらの合成、特に、発光波長を伸長したアクリジニウム化合物を同定し、これらには、具体的には、DMAEおよび一般に周知のその類似物、例えば、モノ-オルト置換フェノキシ部分を有する比較的に安定なアクリジニウムエステル(EP 0609885A1；M．Kawaguichiら、「 Stabilized Phenyl Acridinium Esters For Chemiluminescent Immunoassay−Bi oluminescence and Chemiluminescence，Proceedings of 9th International Sy mposium 1996」Hastings，KrickaおよびStanley著、John Wiley & Sons，1997， pp.480〜484)、およびアクリジニウムスルホンアミド(米国特許第5,468,646号) が含まれる。この研究の最終的な目的は、a)DMAEおよびLEAEの間の最小発光スペクトル重なりを改善するかまたはなくすこと、b)生体分子用の他の化学発光標識であって、LEAEより長い発光波長を有し後者と最小限に重なっているものを発見すること、c)DMAEの量子収量を高めることである。これらの目標に向けたいずれの努力も、新しい化学発光標識が同じ誘発条件下で光を発光するという前提の必要条件下にて、進めなければならない。目的(a)が達成されると、DMAEおよびLEAEの二重標識を使用する二重分析物結合アッセイにおいて、クロストーク補正ルーチンの適用の必要がなくなる。目的(b)が達成すると、第三の化学発光標識が、三重分析物結合アッセイの開発に利用できる。目的(c)は、より長い化学発光化合物はより低いエネルギー状態を有し、従って、化学変換された励起状態種を留める可能性が改善されて、良好な全量子収量が得られるという理論的根拠に基づいた可能な解決法の１つを表わしている。任意の所望のスペクトル範囲で光を発光できるアクリジニウム誘導体の設計のために、本発明は、エネルギー移動の周知の一般概念を採用した。２個の別個の供与分子および受容分子が関与する分子間エネルギー移動の多くの報告例(この場合、この供与体は、化学発光化合物または発光団であり得、そしてこの受容体は、常に、発光団である)とは異なり、本発明者らは、より効率的な分子内エネルギー移動を達成するために、このアクリジニウム化合物および受容体発光団を共に１分子に連結する新規な設計を有する。そうする際に、本発明者らは、このアクリジニウム部分で発生した化学エネルギーを選択発光団部分へ効果的に伝えることができ、その結果、後者は、その特徴的な予想波長範囲で励起して、光を発光できる。この化学発光アクリジニウム化合物の系内で独特に操作する設計目標、および水性媒体中での高い感受性(フェントモル、fM)、光の迅速発生(数秒) 、単相発光(１個だけの発光最大という意味である)およびより長い発光最大に対する必要条件に関して、分子間および分子内エネルギー移動現象の間には、ある程度明白な相違が存在し、以下のように述べられるべきである。 M.M．Rauhutら[J．Amer．Chem．Soc.，89，6515(1967)]は、まず、電気陰性置換したシュウ酸アリールと過酸化水素および蛍光化合物との反応により発生した化学発光で観察される分子間エネルギー移動を報告した。一般に、エネルギー移動の効力は、供与体と受容体との間の距離の６倍の速度で減少するので、[言い換えれば、供与体および受容体分子は、20〜100％の移動効率を得るためには、＜10nmの距離以内であるべきである；Clin．Chem.，29(9)，1604(1983)およびA nn．Rev．Biochem.，47，819(1978)を参照せよ]、ミリモル(mM、この必要条件の 10¹²倍高い)濃度の受容体が必要である。さらに、この化学発光過シュウ酸塩系では、それの生体アッセイでの使用を不適当にする他のいくつかの欠点がある。これらの欠点には、全ての光を放射するための長い持続時間(＞１分間)、水性媒体中でのこのシュウ酸塩の安定性低下、および蛍光体を溶解するための有機溶媒の必要性が挙げられる。同様に、J．Hadjianestis[J．Photochem．Photobiol.，A：Chem，69，337(199 2)]は、化学発光ルミノールとフルオレセインとの間の定量未満(79％)のエネルギー移動を報告した。最高の結果を達成するためには、供与体および受容体の両方は、界面活性剤、CTACの濃縮効果のために、マイクロモル(uM、必要条件より1 0⁹倍高い)濃度でのみ達する必要がある。しかしながら、350〜600nmの広い範囲にわたるこのルミノール/フルオレセイン系で発生する発光スペクトルの二相性プロフィールは、非常に感度が高い多分析物結合アッセイには、適当ではなくなる。報告された分子間エネルギー移動の他のものを見ると、ペリレンへのシス-ジエトキシ-1,2-ジオキセタン[T．Wilsonら、J．Amer．Chem．Soc.，93(17)4126(1 971)]、ルシゲニン(lucigenin)へのN-メチルラクリドン[A.E．Mantaka-Marketou ら、J．Photochem．Photobiol.，A：Chem.，48，337(1989)；A．Larenaら、Mona tshefte Chemie，122，697(1991)；K．Papadopoulosら、J．Photochem．Photobi ol.，A：Chem.，75，91(1993)]が挙げられる。高濃度(uM〜mM)の受容体の必要性は別として、これらの文献は、エネルギー移動の解明およびジオキセタンおよびルシゲニン系の化学発光でのメカニズムの研究に焦点を当てていた。エネルギー移動現象の高感度結合アッセイへの適用は、示唆されていなかった。分子間エネルギー移動現象のイムノアッセイへの適用は、A．Patelら[Clin．C hem.，29(9)，1604(1983)]により最初に報告された。均一型イムノアッセイは、化学発光イソルミノール誘導体(ABEI)で共役したハプテンおよびフルオレセインで標識した抗体の特異的結合特性を使用することにより、開発された。各試薬は、ナノモル(nM)濃度(これは、そのイソルミノール部分とフルオレセイン部分の間で分子間エネルギー移動を観察する限界である)で、アッセイミックスに添加したので、このハプテン共役物と抗体共役物の間で形成された特定の錯体の媒介によってのみ、これらの供与体/受容体分子は、エネルギー移動が起こるように、その近傍へと引き出される可能性がある。このイムノアッセイ法は、このことに関して、独特である。しかしながら、この方法は、限定された有用性、均一アッセイフォーマットに固有の低いアッセイ感度(＞10¹⁰分析物分子/試験１回)および不完全なエネルギー移動を原因とするエネルギー供与体から生じる高い背景信号の妨害から損害を受ける。そのほかに、この分析物測定の精度は、このアッセイミックスの減少する供与体信号および増加する受容体信号(これらは、重要なスペクトル重なりがある)から取り出した信号比に依存しなければならない。 L.E．Morrisonら(EP特許出願第0070686A2号)は、ルミノール基質から抗体共役発蛍光団への分子間エネルギー移動を使用することにより、複数結合部位で抗原を検出するための高めた(酵素的)発光免疫化学原理を教示している。このかなり複雑なアッセイ構造はまた、必要な試薬として、カタラーゼおよび抗体共役グルコースオキシダーゼを含有する。この抗原結合抗体共役物は、近くで発生した(H₂ O₂)または存在する(ルミノール)共因子を利用することにより、そして必要なエネルギー受容体と共に提供することにより、特定の信号を発生するように、近接して共に作用する。このカタラーゼは、この抗原/抗体錯体から離れて拡散するH₂ O₂部分用のスカベンジャーとして役立ち、したがって、溶液中ルミノールにより発生する背景化学発光を最小にするが、これは、この発蛍光団に効果的に移動するには遠すぎる。この概念が機能することを証明するアッセイ例は提供されていなかった。 Minister van Welzijn(NL特許出願第8703075A号)は、10-カルボキシアルキル- アクリジニウムエステル誘導体を記述し、そしてPatelにより記述された化学発光分子間エネルギー移動の原理に基づいて、均一アッセイで使用するための抗体または抗原に対するその共役を示唆した。機能的アッセイの例は示されていなかった。分子内エネルギー移動の分野では、関連した先行技術は、以下から同定され区別できる：化学発光ルミノールまたはベンズルミノール間から４個の他の発蛍光団(すなわち、ジフェニルアントラセン、ベンズカルバゾール、アクリドンおよびベンズアクリドン)への分子内エネルギー移動共役物に関して、いくつかの関連した文献が公開された[E.H．Whiteら、J．Amer．Chem．Soc.，89，3944(1967) ；E.H．Whiteら、Mol．Lumin．Int．Conf.，479(1969)，Ed.：E．Lim，Publishe r：W.A．Benjamin Inc.，N.Y.；D.F．RosweIIら、J．Amer．Chem．Soc.，92，48 55(1970)；D.R．Robertsら、J．Amer．Chem．Soc.，92，4861(1970)；M.A．Ribi ら、Tetrahedron，28，481(1972)]。水性媒体中でのこのような共役物の量子収量は、全て、親ルミノールよりも著しく低く、それぞれ、26％、4.4％、８％および約13％の範囲のルミノール量子収量である。診断試験でのこれらのルミノール誘導体の適用は、示唆されていなかった。 Schaapら(WO第90/07511号)は、アダマンタニルジオキセタンと発蛍光団との共役が関与している他の分子内エネルギー移動系を記述し、ここで、このジオキセタン部分は、開裂可能基Ｘ(例えば、リン酸塩)で置換されており、Ｘ(これは、酵素的または化学的に誘発できる)が離れると、高い化学発光が発生する。最初の光放射種である3-ヒドロキシ安息香酸メチル(MHB)は、この発光過程中にて、天然アダマンタニルジオキセタンから分かれるが、本来、水性媒体中では、非常に乏しい光放射体であることが報告された。発蛍光団をMHBに繋ぐことにより、M HBの励起エネルギーは、この発蛍光団に移動できるが、この発蛍光団は、水性媒体中にて、ずっと良好な光の放射を有し、そしてCTAB界面活性剤の存在下では、 0.017％から約１〜２％までの絶対量子収量の改善が得られる。この発蛍光団に繋いだ安定性ジオキセタンの使用は、この出願では、明らかには教示されておらず、また、請求されてもいなかった。さらに、酵素連結イムノアッセイおよび酵素連結DNAプローブだけでなく、直接の化学的に誘発可能な生体分子用標識でのその有用性は、発明の分野の章において、簡単に暗示されているに過ぎなかった。他の安定なジオキセタンに関するBronsteinによる先の関連出願(WO 88/00695) と同様に、Schaapの発蛍光団に繋いだ安定性ジオキセタンは、高い化学発光を達成するために、結合アッセイにて、酵素連結トレーサーまたはプローブ用の基質としての使用が見出される可能性が最も高い。しかし、この種の用途については、Schaapは、いかにして多分析物アッセイシステムが発明できるかに関して、何ら教示しておらず、互いに相互作用しない異なる酵素-基質系が利用可能ではなく明らかに呈示されていないなら、それは、可能ではないようである。さらに、生体分子用の直接標識としての、この発蛍光団に繋いだ安定性ジオキセタンの代替用途の示唆もまた、この発蛍光団体に繋いだジオキセタンの一般構造の明細書および請求の範囲では、生体分子の直接標識化を可能にする特定の官能基に対する供給を見いだせないので、このことを支持する証拠に欠けている。この示唆は、このような生体分子共役物が調製でき、また、その安定性が証明されるという条件においてのみ、意味をなし得る。さらに、開裂可能基Ｘを有する周知の安定性ジオキセタンは、酵素結合トレーサーに対する基質として働くとき、単一増幅のための非常に有用な手段であるものの、それは、Ｘの酵素的開裂で必要な長い遅延時間(20分以上)だけでなく、Ｘの開裂に始まり光の放射と共に終わる遅い分解過程(１分より長いｔ_1/2)に起因する、遅い光放射という欠点を被る。発明の要旨アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム化合物と発光団との間で分子内エネルギー移動共役物(ETC)を形成することによって、新規な種類の化学発光アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム化合物が開示されている。親の多置換アリールアクリジニウムエステル(DMAE)およびベンズアクリジニウムエステル(LEA E)の間の発光スペクトル重なりをさらに低下させるかまたはなくすために、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウムエステルの発光波長を伸長する方法が、本明細書中で開示されている。これらのETCは、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウムの独特の所望の特性を保持しており、これには、非常に短時間での完全な光放射、単相の発光スペクトル、誘発機構の簡潔性、目的の生体分子を標識してトレーサーを形成する能力、および良好な安定性が挙げられる。さらに、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム化合物の発光スペクトルの範囲は、今ここで、ETC分子の一体化部分として発光団を選択することにより、随意に長いリープ(leap)でシフトできる。このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核のどの周囲位置がこの発光団で固定されているかにかかわらず、全てのエネルギー移動は、非常に効果的であることも決定された。このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核の周囲位置のいずれかに近接して、発光団を共有結合的に固定することにより、周知の過酸化物/水酸化物処理によって、そのアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分を新規種(励起状態のアクリドンまたはベンズアクリドン)にまず転化することにより、ETCが作用することが証明された。励起したアクリドンまたはベンズアクリドンは、次いで、この発光団の励起の手段として、そのエネルギーを発光団部分に効果的に移動でき、その特徴的なスペクトル領域にて、この発光団を光放射させる。これらのETCの利用可能性と共に、この二重標識結合アッセイは、２個の放射種間での最小のスペクトル重なりのために、クロストーク補正ルーチンなしでも、同程度に正確にすることができる。さらに長い波長への放射のより大きなシフトはまた、現ETCと先に報告したDMAEおよびLEAEとの混合物の同時フラッシングから生じる三相発光スペクトルの表示のために、三重標識アッセイが可能であることを意味する。励起したアクリドン部分から発光団部分への不完全なエネルギー移動のために、このETCに由来のより短い波長の残余光放射が観察される場合、二重標識アッセイの精度に対して生じる干渉は、一方向にすぎず、このETCを原因とする信号部分のより短い波長チャンネルでの簡単な引き算により、補正可能である。この補正は、ETCでのより長い波長信号に対するより短い波長信号の放射強度の所定の比を適用することにより、行うことができる。このような補正は、しかしながら、二重標識アッセイでの２成分の測定可能濃度比の動的範囲を低下させる。それゆえ、このエネルギー移動は、殆ど完全であることが重要である。この必要条件は、本明細書で記述される化合物により、満たされる。従って、本発明の主要な目的は、青色光から近赤外へのよりフレキシブルで、さらに放射のシフトを有するアクリジニウムまたはベンズアクリジニウムベースの化学発光ETCを提供することにある。本発明の他の目的は、このような化学発光化合物を合成するのに使用できるアクリジニウムまたはベンズアクリジニウムベースの化学発光ETCおよび中間体生成物の合成方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、結合パートナーまたは生体分子を伴って、直接的または間接的に、ETC間で形成されたETC共役物を提供することにあり、その一部は、その機能によって含まれ、例えば、ハプテン、配位子、受容体および抗体が挙げられるのに対して、他は、その化学的性質によって含まれ、例えば、多糖類、ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。本発明のさらなる目的は、親水性ETCを提供することにあり、これは、リポソーム内部での他のマイクロ分子もしくはマクロ分子またはカプセル化を伴って、共有結合を形成するのに有用な反応性官能基を有しまたはそれなしで、１個またはそれ以上のイオン性基および/またはイオン化可能基をさらに備えている。本発明のさらなる目的は、ETC共役物の使用を包含する試験アッセイを提供することにある。本発明のさらなる目的は、同時の複数化学発光標識アッセイを提供することにある。本発明の他の目的は、少なくとも２個の異なる化学発光化合物または共役物( その１個またはそれ以上は、ETCと会合しており、それぞれ、識別可能な発光スペクトルを有する)の使用により、試験試料にて、少なくとも２個の物質の同時検出および/または定量のための方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、多分析物アッセイを提供することにあり、ここで、混合物として試料中に存在する２個またはそれ以上の分析物または物質またはそれらの組み合わせの測定は、２個またはそれ以上の異なる化学発光トレーサーまたは化合物(その１個またはそれ以上は、ETCと会合している)の同じ化学処理により生成する相互に非干渉性であるかまたは最小重なりであるが補正可能な光信号のために、同じ反応媒体または移動管にて、同時に行うことができる。本発明のさらに別の目的は、試験試料での少なくとも２個の物質を同時にアッセイするための、２個またはそれ以上の化学発光試薬(その１個またはそれ以上は、ETC標識を含有する)を有する試験キットを提供することにある。これらの目的および他の目的を考慮すると、当業者に明らかなように、本発明は、本明細書で述べた要素の組み合わせにあり、そこに添付した請求の範囲に含まれる。図面の簡単な説明図1A〜1Lは、ETCのFast Spectral Scanning Systemにて測定した発光スペクトルであり、ローダミン-2-AM-DMAE-Bz、ローダミン-2-AM-DMAE-CO₂H、テキサスレッド-2-AM-DMAE-CO₂H、CNF-2-AM-DMAE-CO₂H、テキサスレッド-3-AM-DMAE-CO₂H、ローダミン-3-AM-DMAE-β-アラニン、テキサスレッド-3-AM-DMAE-β-アラニン、テキサスレッド-ED-NCM-DMPAE、テキサスレッド-ED-NSP-DMPAE、ローダミン-2-W -DMAE-HD-テオフィリン、テキサスレッド-3-APO-DMAE-Bzおよびテキサスレッド- 3-ABO-DMAE-Bzに対応している。図1Mおよび1Nは、参照化合物であるDMAE-Bzおよび2-MeO-LEAE-Bzの発光スペクトルである。図1Oは、DMAE-Bzおよびローダミン-2-AM-DMAE-Bzの混合物の発光スペクトルである。図1Pは、DMAE-Bz、2-MeO-LEAE-BzおよびCNF-2-AM-DMDE-CO₂Hの混合物の発光スペクトルである。図２は、Schott's OG 550フィルターの透過率プロフィールである。図３は、R268光電子増倍管(Hamamatsuカタログ)の検出効率である。図４は、薄くした後方照射したCharge Coupled Device(薄くしたCCD)の検出効率である。図５は、DMAE-ED-テオフィリントレーサーの構造である。図６は、Ciba Corning Diagnostics Corp．ACSテオフィリンアッセイの標準曲線の比較であり、これは、それぞれ、DMAE-ED-Theophylineおよびローダミン-2- AM-DMAE-HD-テオフィリントレーサーの使用により、得られる。図７は、NSP-DMAE-HD-3-CMO-Cortisolトレーサーの構造である。図８は、Corion LL-550フィルターの透過スペクトルである。図９は、Corion LS-450フィルターの透過スペクトルである。図10は、テオフィリンおよびコルチゾール標準のアッセイ混合物から測定したテオフィリン標準曲線である。図11は、テオフィリンおよびコルチゾール標準のアッセイ混合物から測定したコルチゾール標準曲線である。図12は、化学発光標識共役物の種々の構成物を示す。好ましい実施態様の説明Ａ．ETCの構造および一般的な組立本発明のアクリジニウムまたはベンズアクリジニウムベースのETCは、スペーサーを介して発光団に共役されたアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分を包含する。(記述を明確にするために、本願での「アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分」とは、それぞれ、発光団部分を含まない式Ｉまたは式 II部分、例えば、発光団(これは、R₁、R₂またはR₃位置に位置する)を除いた式Ｉおよび式IIを意味するのに対して、「アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核」とは、点線内の四角で囲んだ式ＩまたはII部分を意味する)。この発光団( これは、以下でさらに詳細に記述する)は、それゆえ、以下の一般構造のETCにて、このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核のR₁、R₂およびR₃置換基により表わされるように周囲位置のいずれか１個で、固定できる：ここで、R₁、R₂またはR₃は、-Sp-Lumiを表わし、そしてLumiは、エネルギー受容体として役立つ発光団部分であり、そしてSpは、20個までのヘテロ原子を有し50 オングストローム未満、好ましくは、12個までのヘテロ原子を有し30オングストローム未満、最も好ましくは、８個までのヘテロ原子を有し10オングストローム未満の線状、分枝状または環状のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、アルコキシル鎖またはアラルキル鎖を含有するスペーサーまたは第一側鎖を表わす。「スペーサー」および「側鎖」との用語は、本願では、交換可能に使用される。この発光団とアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核との間の側鎖の長さは、それが、励起形状の得られたアクリドンまたはベンズアクリドンを、その発光団に多少完全にエネルギー移動させて、この発光団のスペクトル範囲で光の放射を生じるのに適当な長さであるように、選択される。好ましくは、このスペーサーは、このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核の官能基化側鎖と官能基化発光団とのカップリングにより生じる少なくとも１個の官能性結合を含有する。その官能性結合には、以下の一般的に見られるものが挙げられるが、それらに限定されない：-NHCO-(アミド)、-CONH-(アミド)、-NHCOO-(カーバメート)、-O-(エーテル)、-C＝N-O-(オキシムエーテル)、-S-(チオエステルまたはスルフィド)、-S-S-(ジスルフィド)、-NHCO-NH-(尿素)、-NHCSNH-(チオ尿素)、-C ＝N-(イミノ)、-NH-(アミノ)、-N＝N-(ジアゾ)、-COO-(エステル)、-C＝C-(ビニル、アルケニルまたはオレフィン)、-SO₂NH-(スルホンアミド)、-C≡C-(アルキニル)、-OPO₃-、-PO₃-、-OSO₃-および-SO₃-。上記官能性結合を形成する方法は、当業者に周知であり、有機化学教本(例えば、Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，Ed ．I-IV，by Jerry March)で、詳しく記載されている。 Lumiは、発光団を表わし、これには、本発明の目的上、(1)燐光部分、(2)発蛍光体団または(3)(1)または(2)いずれかの前駆体であって、非燐光体または非蛍光体であるが、化学処理または酵素処理により、燐光体または蛍光体部分に転化できるものが挙げられる。本発明の目的上で適当な発光団は、周知の現存している市販製品または任意の将来の新規な発光化合物(これは、青色から赤外(IR)領域をカバーする発光スペクトルを生じることができる)であり得る。好ましくは、この発光団は、その発光性能に影響を与えない位置にて、官能基化できるかまたは官能基化されており、これらの発光団がカップリングするアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分のフラッシング中に必要な一時的な低および高pH 状態に耐えることができる。このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核上の置換基(すなわち、R₁ 、 R₂またはR₃)の１個が、上で記述のようであるとき、他の２個の置換基は、以下を表わす： R₄は、もし、-Sp-Lumi-で置換されていないなら、代替的に、必要に応じて20 個までのヘテロ原子を含有するアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルであり得る； R₂およびR₃は、もし、-Sp-Lumi-で置換されていないなら、代替的に、同一または異なり、それぞれ、式(Ｉ)に対するC₁ _〜4およびC₅ _〜8ならびに式(II)に対するC₁ _〜4およびC₆ _〜11での単一または複数の基であり、水素、置換または非置換アリール(ArRまたはAr)、ハライド、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、-R、-CN、-COOH、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NHRまたは-NHC(O)Rからなる群から選択される。例えば、スキームＩでは、ローダミン-2-AM-DMAE-Bzにて、R₂は、Sp-Lumiを含有する置換基であり、ここで、SpおよびLumiは、以下で示されるのに対して、R₁ は、メチルであり、そしてR₃は、水素である。さらに、スキームVIIIでは、テキサスレッド-ED-NCM-DMPAEにて、R₁は、Sp-Lumi である(以下で示す)のに対して、R₂およびR₃は、水素である。 A^-は、対イオンであり、これは、合成中のアルキル化剤の使用によるアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム環窒素を四級化すること(例えば、スキームＩ)、R₁側鎖の変性(例えば、スキームIIおよびIX)、または過剰量の他のアニオンを含有する溶液または流体中での反応混合物の仕上げおよび所望の化合物の精製中に生じる引き続いた交換機構(例えば、スキームＩ、II、Ｖ、VI、VIIIおよびIX)のいずれかの結果として、このETC分子の四級窒素と対になるように、導入される。これらの対イオンの例には、CH₃SO₄ ^-、FSO₃ ^-、CF₃SO₃ ^-、C₄F₉SO₄ ^-、CH₃ C₆H₄SO₃ ^-、ハライド、CF₃COO^-、CH₃COO^-、NO₃ ^-、およびリン酸塩が挙げられる。 Xは、窒素、酸素またはイオウである； Xが酸素またはイオウのとき、Zは省略され、そしてYは、次式の多置換アリール部分である：ここで、R₄およびR₈は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル(- OR)、アルキルチオール(-SR)、または立体効果および/または電子効果によってアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核とY部分との間の-COX-結合を安定化するのに役立つ置換アミノ基である。さらに、R₄およびR₈は、同一または異なり得、さらに、R₄およびR₈の１個は、-COX-結合の安定性を著しく弱めることなく、水素であり得る。 R₅およびR₇は、上で定義したR₂およびR₃のいずれかである； R₆＝-R₉-R₁₀であり、これは、目的の生体分子と共役するのに必要な官能基を含有する重要な置換基である、ここで、R₉は、第二側鎖であり、必須ではなく必要に応じて、分枝または直鎖アルキル、必要に応じて20個までのヘテロ原子を含有する置換または非置換アリールまたはアラルキルであり得、そしてR₁₀は、以下を含む残基または残基に結合した求電子性官能基である：-Q-R-Nu、-Q-R-(I)nNu-、-Q-Nu、-R-Nuまたは-Nu、ｎは、少なくとも１の数であり、ここで、Qは、-O-、-S-、-N-、である。 Iは、-SO₃H、-OSO₃H、-PO(OH)₂、-OPO(OH)₂または-COOHである；そしてNuは、求核性基である。本発明の目的上の求核性基は、電子に富む化学基として定義され、反応部位として作用する非共有電子対を有し、そして他の分子上に正に荷電した(すなわち、電子が欠乏した)部位を求める。有用な求核性基の例には、アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、または強い電子吸引性基と隣接した活性メチレン基が挙げられる。強い電子吸引性基とは、電子を強力に引きつけ、従って、その基が結合している炭素原子の正電荷(または、カルボアニオン)を強化するか、または炭素原子の負電荷(または、カルボニウムイオン)を無効にする化学基または置換基として、定義される。強い電子吸引性基の例には、-NO₂、-CN、-SO₃H、-N(R)₃+、- S(R)₂+および-NH₃+が挙げられ、ここで、Rは、以下で定義するとおりである。有機金属部分もまた、本発明の目的上、有用な求核性基である。有機金属部分は、炭素-金属結合を含有する有機部分として定義される。有機金属部分の例には、グリニャール試薬、リチウム化合物およびフェニルナトリウムが挙げられる。例えば、NuがN-H₂である場合、本発明の共役物を形成するのに適当な化合物の例には、-NH₂と結合できる官能基を含有する化合物、例えば、以下が挙げられる： (1)カルボキシレート基(例えば、葉酸にあるもの)、カルボキシル化ビタミンB₁₂ 、リボース部分にあるビタミンB₁₂-ヘミスクシネート、T₄メチルエステルおよびT₃メチルエステルのN-ヘミスクシネート、トロンボキサンB₂、カルボキシプロピル-テオフィリン、ペニシリン、コルチゾール-3-カルボキシメチルオキシム、エストラジオール-6-カルボキシメチルオキシム、モルヒネ-6-ヘミスクシネートなど；(2)ケトン基(例えば、3-ケトジゴキシゲニンにあるもの)；(3)アルデヒド基(例えば、ジゴキシン-ジアルデヒドおよびブロモウリジンジアルデヒドにあるもの)；(4)ハライド(例えば、ジニトロフルオロベンゼン、およびハプテンおよびタンパク質のクロロトリアジン誘導体にあるもの)；(5)活性エステル(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド、ならびにハプテンおよびタンパク質のイミデート誘導体にあるもの)；(6)イソシアネートおよびチオイソシアネート(例えば、ハプテンおよびタンパク質誘導体にあるもの)。 Nuが-SHの場合、適当な化合物の例は、-SHと結合できる官能基(例えば、マレイミド、ジチオピリジノ、または例えば、ハプテンおよびタンパク質誘導体に見出されるようなオレフィン)を含有する。 Nuが-OHの場合、本発明の共役物を形成できる適当な化合物の例には、-OHと結合できる官能基(例えば、ハプテンおよびタンパク質誘導体に見出されるようなオキシラン)を含有する化合物が挙げられる。 Nuがグリニャール部分または他の有機金属部分である場合、本発明の共役物を形成できる適当な化合物の例には、この部分に結合できる官能基(例えば、非プロトン性ハプテンに見出されるようなケトンおよびアルデヒド)を含有する化合物が挙げられる。本発明のアクリジニウムエステルでは、他の多くの好適なNu基が使用できることが分かる。このアクリジニウムエステルおよび共役化合物のどの組み合わせが、所望の用途の必要性に最もよく役立つかは、技術者の選択のために残されている。 R₅およびR₆、ならびにR₆およびR₇は、交換可能である；そして Rは、必要に応じて、20個までのヘテロ原子を含有するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキルである。 Xが窒素のとき、Yは、(1)20個までの炭素原子および必要に応じて10個までのヘテロ原子を含有する分枝または直鎖アルキル基、または(2)20個までの炭素原子を含有する置換または非置換アリール基あるいはヘテロアリール基である；Z は、-SO₂-Y'であり、Y'は、上記Y(Xが窒素である場合)と同じように定義される；YおよびY'は、同一または異なる化学組成のいずれかを有し得る。上記化学発光標識共役物(これは、生体分子に共役したETCを含有する)の好ましい構造物を、図12Aで示す。(図12Bで示すような)ETCの代替設計は、上記R₁₀の官能基の転位である。Y部分にR₆の一部を形成する代わりに、R₁₀(その目的は、この生体分子に対する共有結合を促進することにある)は、今ここで、第一側鎖( -Sp-)に位置している。このような官能基化スペーサーの一例には、三官能性分子であるリシン(ここで、そのα-アミノ基およびα-カルボキシレート基は、このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核および発光団を架橋するのに役立つ)であり、一方、そのリシン側鎖のε-アミノ基は、共役のために使用できる。他の順列(または配向)のリシン架橋および他の三官能性分子の使用もまた可能であり、架橋技術分野において、当業者に明らかなはずである。この設計の選択について、当業者は、しかしながら、より少ない光検出の可能性に対して警告している。フラッシングすると、このアクリジニウムエステルが、光放射性アクリドンおよびフェノキシ基を生じることは周知である。先の設計のようなフェノキシ基と共に保持される代わりに、この生体分子は、今ここで、アクリドンと繋がったままになり、光を吸収する発光団と競合して、その結果、このETCの全体的な量子収量の低下が生じる。この阻害効果の程度は、もちろん、この生体分子の発色性およびこのアクリジニウムエステルと生体分子または発光団との間の距離の関数である。 (図12Cで示すような)これらのETCのさらに別の設計は、同様に、このR₁₀基を、このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分から発光団部分へと転位することにより、生じ得る。この設計は、二官能性発光団(これは、一端では、スペーサーの媒介を伴ってまたはそれなしで、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核に共有結合し、また、他端では、この生体分子に結合する)を必要としている。量子収量の低下に対する類似の警告はまた、この設計に適用する。当面、発光団の構造的な特徴に依存して、二官能性基を発光団に導入すること、および任意の特定の順序でそれらを段階的にスペーサー、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム化合物、および生体分子と反応させることの容易性もまた変わるであろう。有機合成および生物有機合成分野の当業者には、このことは、選択的で適合可能な様式でこれらの反応を実施できるために、種々の官能基に対する異なる保護基の適切な選択を意味する。 ETCに対する他の代替設計(図12Dを参照)(上記の２個の代替物と類似している) は、式ＩおよびIIのアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分のフェノール性基からアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核への全R₆基の転位から生じる。この設計では、R₆は、このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核にて、３個の基、R₁、R₂およびR₃の１個を置換するが、この場合、R₆は、このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核への生体分子の共役のためのリンカーであり、そして２個の他の基(R₁/R₂またはR₂/R₃またはR₁/R₃)の１個は、先に定義した-Sp-Lumiを表わす。このフェノキシ部分でR₆が最初に占める位置は、次いで、H、R₁、R₂またはR₃、R₁、R₂またはR₃と等価の基で置換され、この場合、-Sp-Lumiを除いた同じ定義を有する。再度、ここで、この代替設計に対して、このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核への生体分子の直接結合のために、量子収量の低下に対する同じ警告が適用される。化学発光ETC化合物またはETC標識共役物は、化学処理すると、この化合物または共役物が、識別可能な発光スペクトルピークまたは最大を有する青-緑色、緑色、黄色、橙色、赤-橙色または近IR光を放射する点に特徴付けられる。１つの実施態様(すなわち、ETC化合物)では、その発光最大は、600nmより大きく、他の好ましい実施態様では、それぞれ、620nmおよび700nmより大きい。種々のETCの形成に対して、いくつかの合成法が記述されており、これは、特に、C₂、C₃および環窒素にて、異なるスペーサーを介して、このアクリジニウムおよびベンズアクリジニウム核の周囲位置に、異なる発光団を結合することを包含する。このETCの発光団部分がさらなる官能基(例えば、ローダミンおよびテキサスレッドの入り込んだ領域でのカルボキシレート基またはスルホネート基)を含有し、これが、このアクリジニウムエステル部分にて、R₆の部分と共に活性化でき、 ETC-生体分子共役物の望ましくない副生成物を生じ得るとき、起こり得る厄介な問題を回避するために、ETC-生体分子共役物の調製について、逆ブロック合成法が記述されている。この厄介な問題の解決は、このETC-生体分子共役物を構築する合成配列を逆にすることによりなされ、すなわち、この生体分子は、まず、このアクリジニウムエステルと共役し、これは、次に、適切に活性化した発光団とカップリングした。そのように構築したETC-生体分子は、診断試験でのトレーサーとして有用であることが分かった。Ｂ．発光団の選択この発光団の選択のために、あらかじめ活性化したおよび/または官能基化した発光団(例えば、企業(例えば、Molecular Probes，Eugene，Oregon)から容易に入手できるもの)を使用できる。種々の発光団の選択規準は、必要性を基準にして、以下のような順序である：(1)必要な励起および発光スペクトル範囲、（2 ）化合物の適度に良好な安定性であって、それゆえ、このアクリジニウムおよびベンズアクリジニウム部分の化学転化に必要な酸および塩基の両方の極端なpHでの励起保持および光放射能力、(3)良好な化学発光量子効率、(4)官能基化アクリジニウムまたはベンズアクリジニウムとカップリングするのに必要な整合官能基 (予備活性化したまたはそれをしない)の利用可能性。文献で既に存在している発光団の殆どは、選択規準を検査する人が必要な情報を伴っている。それらの発光特性に基づく潜在的有用性を有する発光団に関して、必要であれば、４つの全ての基準が満たされるまで、自己試験、または公知化合物のさらなる誘導体化によって、完全な情報が入手可能にできる。それゆえ、例えば、５位置または６位置にてN-ヒドロキシスクシンイミドカルボン酸エステルで官能基化したローダミン (Molecular Probe Cat# C-1309)、５位置にてスルホニルクロリドで官能基化したテキサスレッド(Molecular Probe Cat# T-353)、および５位置または６位置にてN-ヒドロキシスクシンイミドカルボン酸エステルで官能基化したカルボキシナフトフルオレセイン(Molecular Probe Cat# C-653)は、本発明にて、４つの基準をうまく満たす有用な特性について、選択されている。本発明の目的上で公知の発光団は、非常に多いことが認められているものの、それらの例は、例示することを意図しており、例示した発光団のみの使用に本発明を限定する意図はない。これらの４つの基準は、従って、これらのETCの構築に適当な公知の発光団または将来新規な発光団のいずれかを選択するために、当業者のためのガイドとして役立っている。Ｃ．重要な中間体および標的ETCの合成このアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核の一定の望ましい周囲位置 (例えば、2-、3-またはN-)にて官能基化側鎖を導入するためには、先に開示の方法、および新たに発見された手法が使用される。例えば、このアクリジニウム核の2-位置または3-位置への置換基の導入は、そのアリール部分またはイサチン部分に置換基を有するN-アリールイサチンの塩基触媒再配置により、達成できる。それゆえ、正しく置換したアリールイサチンを用いて出発すると、2-または3-置換アクリジン-9-カルボン酸の重要な中間体は、種々のETCの調製に対する以下のスキームＩ〜VIIで示されるように、得ることができる。同時係属出願(LEAEの部分継続出願であって、現在では、米国特許第5,879,894 号である)では、適切に置換したN-アリールベンズイサチンを使用することにより、2-または3-置換ベンズアクリジン-12-カルボン酸の調製に対して、類似の方法が適用できることが分かった。本願での周囲置換基は、官能基化した側鎖を含有するので、このN-アリールイサチンまたはN-アリールベンズイサチンのアリール部分に、適切に保護した官能基化側鎖を導入するためには、以下のスキームＩおよびＶの最初の工程で図示しているように、さらなる注意および/または工程が必要である。N-アリールイサチンまたはN-アリールベンズイサチン上の意図した官能基化側鎖に与えられた保護は、この側鎖の官能基に由来の任意の可能な妨害を防止でき、また、適切に置換したアクリジンまたはベンズアクリジンカルボン酸の円滑な形成を保証できる。それゆえ、アミノメチルの所望の官能基化側鎖は、フタルイミドメチル側鎖を形成するために、無水フタル酸で保護した。本願でのアミノ基の保護は、この保護が、このフタルイミド部分の部分加水分解で示される塩基触媒再配置を経験した後、全体的に無傷というわけではないことを本発明者が発見した点で、極めて独特であった。それにもかかわらず、この保護は、アクリジンカルボン酸の形成をかき乱さないのに充分であった。連続工程では、このアクリジンエステルを形成するエステル化工程およびアクリジニウムエステルを形成するメチル化工程にてこの保護が引き続き必要であるので、このフタルイミド部分を、SOCl₂処理により再形成した。このアミノ基を、次いで、この置換アクリジニウムエステルを官能基化発光団と共役してETCを形成する必要の直前に、このフタロイル保護を除去するために、ヒドラジン処理により再露出した。それゆえ、重要なことには、本願はまた、アクリジニウムエステルベースのETCを合成する独特の方法を開示しており、これは、このアミノ官能基化側鎖のフタルイミノ保護のストラテジーを利用する。その保護は、効果的に、種々の反応を経験して(すなわち、それに耐えて)、最終的に、必要な化学発光活性のためのアクリジニウムエステルを無傷で残すことができる条件下にて、除去される。その周辺位置で官能基化側鎖を有する重要なアクリジニウムエステルを合成すること、およびそれらのETCへのさらなる誘導体化についての詳細な説明は、実施例で示している。このアクリジニウムエステルの他の周囲位置でETCを形成するそれ以上の教示は、R₁置換基としてのアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核の環窒素へのアミノエチルカルバモイルメチル(AECM)の官能基化側鎖の導入が関与している。この合成経路は、スキームVIIIで示されており、以下で簡単に記述する。 Zomerら(EP 0324202)により記述されているように、モデルアクリジンエステルであるジメチルフェニルアクリジンエステル(DMPAeE)から開始して、そのエトキシカルボニルメチル側鎖を、その環窒素に結合して、N-エチルオキシカルボニルメチル-ジメチルフェニルアクリジニウムエステル(NECM-DMPAE)を形成した。本発明者らは、NECM-DMPAEのケン化が、Zomerらが報告したように、所望のN-カルボキシメチル-DMPAE(NCM-DMPAE)を生じないことを見出した。あるいは、本発明者らは、その環窒素上に伸長したアミノエチルカルバモイルメチルの官能基化側鎖を有するDMPAEが、エチレンジアミンをNECM-DMPAEと直接反応させてED-NCM- DMPAEの重要中間体を生じることにより、得ることができることを発見し、これは、次いで、官能基化発光団(テキサスレッド)とカップリングして、所望のETC を得た。同様に、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核の環窒素への他の官能基化側鎖のアミノエチルスルホンアミジル-プロピル(-CH₂CH₂CH₂-SO₂NHCH₂CH₂NH₂ 、これはまた、ED-NSPと呼ばれている)の導入もまた、可能であることが分かった。ED-NSPアクリジニウムエステルおよび引き続いたETC化合物の合成経路は、以下で記載のスキームIXで図示されている。他の官能基(例えば、アクリジン核の3-位置での水酸基)を介した発光団のアクリジニウムまたはベンズアクリジニウムエステルの結合もまた、可能である。必要な3-ヒドロキシ-アクリジン-9-カルボキシレート誘導体は、適当なフェノール性化合物であるレゾルシノールを用いたイサチンの周知の縮合により、調製できる(EP第0322926 A2号)。発光団との引き続いたカップリングを容易にするために、アクリジンまたはベンズアクリジンエステルの3-OH基は、まず、カップリング前に、アミノ官能基化アルキルまたはアラルキルエステルスペーサーを生じるように、誘導体化できる。このような変性の１つの好ましい実施態様は、実施例の章(テキサスレッド-3-ABO-DMAE-Bzの合成)で示したアミノベンジルオキシ(ABO) スペーサーの導入の結果となった。このアミノベンジルオキシスペーサーの挿入は、予想外にも、アクリジニウムエステルの一般的なフラッシング条件により必要とされる強塩基で処理したとき、このETCにて、この発光団(テキサスレッド) 部分に対する高い安定化効果を生じることが分かった。0.1N NaOH中にて、１日間にわたって、室温で攪拌したとき、モデルアクリドン-N-ABO-テキサスレッドの吸収スペクトルには、変化が観察されなかった。しかしながら、本明細書では、本発明の目的上、これらのETCにより放射される光が非常に短時間で殆ど終了するので、塩基性状態に対するこの発光団部分の10秒間を越える安定性は、全く必要とはされない。テキサスレッドスルホニルクロリドとカップリングした後、アクリジンエステル-3-ABO-テキサスレッドの共役物が得られる。上記の他の合成方法とは異なり、このABOを含有する好ましい実施態様でのアクリジン部分を、下記のスキームＸで図示したような活性ETCを得るために、最後の工程にてN-メチル化した。 3-アミノプロピルオキシ結合を有するETCの他の好ましい実施態様(テキサスレッド-3-APO-DMAE-Bz)もまた、類似の様式で調製した。(下記のスキームXIに記載される)。 DMAE-エチレンジアミン-テオフィリンのより簡単な構成物は、Ciba Corning's ACSテオフィリンAssayでのトレーサーとして、以前に開発された。本発明用のトレーサーの自然修飾および改良は、類似のテオフィリン前駆体であるテオフィリン-ヘキサンジアミン(Theo-HD)(これは、遊離のアミノ基を備えている)を利用することにある。ローダミン-2-AM-DMAEのETCは、２個のカルボキシレート基（D MAE部分に由来の１個および入り込んだ領域でのローダミン部分に由来の１個）を備えているので、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを形成するためのローダミン-2-AM-DMAEの直接活性化に続いて、Theo-HDとのカップリングは、共役物の混合物を生じる可能性があり、その一部は、望ましくない入り込んだ領域カルボキシレート基にれは、遊離のままにしなければならない)にて、新しい結合を含有し得る。従って、段階的なブロック合成が考案され、そして、この場合のために、まず、適切に保護した2-AM-DMAEを活性化することにより、引き続いて、活性化し保護した2-AM-DMAE誘導体をTheo-HDとカップリングし、この2-AM 保護基を除去し、そしてこの中間体を、その5-または6-カルボキシレート基にて NHSで特異的に活性化した市販のローダミン誘導体とカップリングすることにより、行った。この完全な合成は、スキームXIIにて、以下で示す。ローダミン-2-AM-DMAE-HD-テオフィリンの発光特性はまた、本質的に、以下の章で示すようなローダミン-2-AM-DMAEのものであることが立証された。同様に、テオフィリン以外のローダミン-2-AM-DMAE標識生体分子は、上記方法に基づいて、構築できる。Ｄ．ETCで標識した生体分子上記官能基化ETCおよびそれらの明らかな誘導体は、標的化の目的のためのマッチング官能基を含有する生体分子と共有的にカップリングするのに使用できる。得られたアミドおよびチオエーテルの共有結合は、当業者により最も一般的に予想されるほんの一握りの例である。有機(例えば、エーテル、ケトン、エステル、アゾなど)または水性(例えば、ジスルフィド)媒体下で形成でき文献でよく記録されている他の種類の可能な連鎖は、予想外の利点を示すことなく、明らかであると考えるべきである。発光団部分にて、その生体分子に対する妨害/競合官能基を含有しないETCの共役は、明らかに、あらかじめ形成し活性化したETCの生体分子への直接標識化であるべきである。どのようにして生体分子がETCに共役して診断試験でのトレーサーを形成できるかを説明するために、また、ETCの同じ発光特性が、このトレーサー上にて保持できる証拠を提供するために、ローダミン-2-AM-DMAE-ヘキサンジアミン-テオフィリン共役物の合成を記述する。Ｅ．光放射スペクトル ETCおよび参照化合物であるDMAE-Bzおよび2-MeO-LEAE-Bzの光放射スペクトルを、Burbank，Calif.，U.S.A.のPhoto Research(a division of Kollmorgen Cor p)のFast Spectral Scanning System(FSSS)により測定した。この実験は、暗室で行った。各化合物を、アクリロニトリルまたはN,N-ジメチルホルムアミドに溶解した。得られた濃縮物を同じ溶媒で希釈して、検量線用溶液を形成し、これは、フラッシングすると、充分な強度の光の放射を生じた。典型的な実験は、13× 100mmのホウケイ酸塩の試験管に含有された500ulの溶媒中の10〜100ugの試料を使用した。この管を、適当な高さに持ち上げた試験管ラックに置いた。一片のアルミニウム箔を、この放射した光の検出能を高めるために、この管の後ろに置いた。FSSS光学ヘッドを、およそ130mmの距離で、この管の前に置き、そのレンズは、この管中の液体に焦点を合わせた。この試料溶液を、まず、0.1N HNO₃および0.1％ H₂O₂を含有するFlashing Reagent #1(Ciba-Corning Diagnostics)0. 35mlで処理した。この部屋を、次いで、暗くして、直ちに、この反応混合物に、 0.25N NaOHおよび0.2％ ARQUADを含有するFlashing Reagent #2(Ciba-Corning D iagnostics)0.35mlを添加した。(同一人に譲渡された米国特許第4,927,769号を参照)。Reagent #2の添加に続いて瞬間的に発生した光は、Reagent #2の添加前の約１秒から開始して、５秒間、FSSSにより記録した。FSSSにより測定された種々の発光スペクトルは、図1A〜Nで示し、また、表１で要約している。 ^*範囲は、５％より大きなピーク高さの信号強度を有するスペクトル領域について、設定する。＾発光スペクトル範囲は、FSSSの走査限界(380〜780nm)を越える。Ｆ．相互に妨害しない光放射スペクトル DMAE、LEAEおよびETCの間で相互に妨害しない光放射を立証するために、異なる発光範囲を有するこれらの化合物の２種または３種の混合物を、上記条件下にて、フラッシュした。第一の実験では、DMAE-Bzおよびローダミン-2-AM-DMAE-Bz の混合物をフラッシュした。第二の実験では、DMAE-Bz、2-MeO-LEAE-BzおよびCN F-2-AM-DMAE-CO₂Hの混合物をフラッシュした。図1Oおよび1Pでのこれらの各スペクトルで示されるように、この混合物中の各成分の発光最大およびプロフィールは、変わらない。Ｇ．光放射効率代表的なETCの光放射効率を、光学フィルターなしで、Berthold照度計Magic L ite Analyzer-1(MLA-1)(Ciba-Corning Diagnostics)にて測定した。各試料を、アセトニトリルまたはN,N-ジメチルホルムアミド中にて１mg/mlで調製し、アセトニトリルまたはN,N-ジメチルホルムアミドで10ug/mlまで連続希釈し、そして0 .15M NaCl、0.1％ BSA、0.05％ NaN₃を含有する10mMリン酸緩衝液(pH８)でさらに希釈して、表２で挙げた全ての試料用に、１pg/mlの濃度の検量線用溶液にした(但し、DMAE-Bzについては、0.1pg/mlの濃度)。光放射効率を測定するために、各試料のブランク緩衝液マトリックスまたは検量線用溶液25ulを、Flashing Reagent #1(0.3ml)を注入することにより、続いて、0.1秒遅れて、Flashing Reagent #2(0.3ml)を注入することにより、２通りでフラッシュした。２秒間にわたって、光の放射を集め、これらの結果は、表２に示す。上記測定はまた、光電子増倍管(PMT)の前部にOG550フィルター(Schott Glass Technologies，Inc.)を置くことにより、繰り返した。これらの結果は、表２で示す。図２は、このOG550フィルターの透過率プロフィールを示す。 MLA1で検出したETCのカウント数は、遊離DMAE-Bzのものより５〜13倍低い。図３で示すように、この実験で使用したPMTの検出効率は、400〜500nmの範囲(ここでは、DMAE-Bzが光を放射する)内で、平均して、22％であるのに対して、600nm より高いスペクトル領域(ここでは、すべてのETCが光を放射する)については、その検出効率は、２〜３％まで低下する。異なる波長領域にわたるPMTの検出効率のこの差は、ETCの検出RLUの主要な損失を説明している。市販されている他の光検出装置がある。長波長領域でのそれらの検出効率は、この実験で使用したPM Tのものよりずっと高い。例えば、図４で示すような薄くした後方照射したCharg e Coupled Device(薄くしたCCD)は、400nmで80％の効率から700nmで90％の効率まで到達できる。従って、薄くしたCCDのような改良された光検出装置を用いると、検出したETCの光放射は、著しく高くなるはずであり、DMAEのそれと同じかまたはより良好であると予想される。Ｈ．光放射のフラッシュ動力学：これらのETCの全体的なフラッシュ動力学は、以下の２つの要因により、測定した：エネルギー供与体としての共役物中のAE部分の化学発光動力学およびエネルギー受容体としての発光団部分の蛍光動力学。ETCのAE部分の化学発光動力学は、大部分は、AE部分上の異なる置換基の電子効果および/または立体効果の性質による。従って、種々のETC共役物は、その異なるAE部分のために、同一条件下においてさえ、種々のフラッシング速度を有すると予測される。この研究で選択したエネルギー受容体は、非常に速い動力学を有する発光団であるものの、それらはまた、遅い動力学を有する発光団でもあり得る。これらのETCの全体的なフラッシュ動力学を測定するために、これらのETCをフラッシングし、そして10 秒までの異なる時間長で集めた全ての信号を規格化することにより、10秒間にわたる時間経過研究を行った。これらの結果を、表３で要約する。１、２：10秒よりずっと長いｔ_1/2で、非常に遅いフラッシュ動力学を有する化合物実施例実施例１．ローダミン-2-AM-DMAE-Bzの合成-スキームＩ 4- フタルイミドメチルブロモベンゼン 4-ブロモベンジルアミン塩酸塩10ｇ(44.94mmol)のクロロホルム200ml懸濁液に、トリエチルアミン12.5ml(89.62mmol)を添加し、続いて、無水フタル酸8.99ｇ( 60.67mmol)を添加した。この混合物を室温で10分間攪拌して、均一溶液を得、これを、次いで、75℃で３時間加熱した。この反応混合物を、次いで、蒸発させて、このクロロホルムを除去し、その残留物をトルエン400mlに懸濁し、続いて、p -トルエンスルホン酸一水和物700mgを添加した。得られた混合物を140℃で簡単に還流し、追加のトリエチルアミン３mlを添加して、均一溶液を形成した。この溶液を140℃で２時間還流した；そして形成された水を、Dean-Starkトラップ装置によって集めた。この溶液を、次いで、室温まで冷却し、３％水酸化ナトリウム(２×200ml)、水(１×200ml)、ブライン(１×200ml)で洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下での溶媒の除去により、白色固形物として、4-フタルイミドメチルブロモベンゼン12.07ｇ(収率85％)を得た。Rf：0.6(シリカゲル、酢酸エチル：ヘキサン＝１：２)。 N-(4- フタルイミドメチル)フェニルイサチンイサチン1.863ｇ(12.66mmol)の無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)80ml溶液を、水素気泡の形成がなくなるまで、室塩にて、約40分間にわたって、水素化ナトリウム(60％分散体)0.608ｇ(15.19mmol)で処理した。次いで、ヨウ化第一銅(C uI、5.303ｇ、27.85mmol)および4-フタルイミドメチルブロモベンゼン(6ｇ、18. 99mmol)を添加した；この反応系を、窒素下にて、160℃で、16時間攪拌させた。この反応系を室温まで冷却し、そしてクロロホルム400mlと混合した。得られた混合物を濾過した。その濾液を、減圧下にて、乾燥状態まで蒸発させ、その残留物をシリカゲルフラッシュカラム(５〜20％エーテル/トルエン)上で分離して、1 .76ｇ(収率36.4％)で、所望生成物を得た。Rf：0.2(シリカゲル、10％エーテル/ トルエン)。MS(MALDI-TOF)：m/z 384.437(観察された)。2-(2'- カルボキシベンズアミド)メチル-アクリジン-9-カルボン酸 10％ KOH(70ml)中のN-(4-フタルイミドメチル)フェニルイサチン1.26ｇ(3.3mm ol)の混合物を、120℃で、２時間攪拌した。得られた溶液を水250mlで希釈し、次いで、氷浴中にて酸性化して、黄色の沈殿物を得た。この沈殿物を集め、水で水洗し、そして空気乾燥して、黄色の固形物として、表題化合物1.26ｇ(収率87. 5％)を得た。Rf:0.5(シリカゲル、CHCl₃/MeOH/H₂O＝55：45：４)。MS(MALDI-TOF )：m/z 401.577(M＋1)。2- フタルイミドメチル-アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル -2',6'-ジメチル)フェニル 2-(2'-カルボキシベンズアミド)メチル-アクリジン-9-カルボン酸(905mg、2.2 9mmol)を、塩化チオニル10ml中にて、２時間還流した。室温まで冷却した後、この溶液を、窒素を吹き込むことにより、その容量の約半分まで低下させ、次いで、無水エーテル75・ｌに注いだ。黄色の沈殿物を集め、そしてエーテル(３×20m l)で洗浄した。真空下にて乾燥した後、黄色の固形物を無水ピリジン30mlで懸濁し、続いて、3,5-ジメチル-4-ヒドロキシ安息香酸ベンジル515.8mg(2.01mmol)およびN,N-ジメチルアミノピリジン(DMAP)100mg(0.41mmol)を添加した。この反応系を110℃で２時間攪拌し、次いで、55℃で、さらに16時間攪拌した。室温まで冷却した後、この混合物を濾過した。その濾液を、減圧下にて、乾燥状態まで蒸発させ、その残留物をシリカフラッシュカラム(２〜５％酢酸エチル/塩化メチレン)上で分離して所望生成物115mg(出発物質の回収に基づく収率20％)を得た。Rf ：0.5(シリカゲル、10％ EtOAc/CH₂Cl₂)。MS(MALDI-TOF)：m/z 620.206(観察された)。2- フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロスルホン酸塩 2-フタルイミドメチル-アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル(317.39mg、0.512mmol)の無水塩化メチレン15ml溶液を、トリフルオロメタンスルホン酸メチル(0.58ml、5.12mmol)で処理した。この反応系を、窒素下にて、室温で、16時間攪拌した。この溶媒を、次いで、窒素を吹き込むことにより、除去した。その残留物を逆相HPLCカラム(YMC、Wilmingt on、NC、30×500mm、ODS-A、S-10、120Å)上で精製した。この生成物を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、19分間の保持時間で溶出した：30分間で60％Ｂ〜100％Ｂ；30ml/分の流速；260nmでモニターした。溶媒の除去により、表題化合物326.6mg(収率85％)を得た。Rf：0.7(シリカゲル、エーテル)。MS(ESI)：m/z 635(M)。2- アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩 2-フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロメタンスルホン酸塩 (17.2mg、0.023mmol)およびヒドラジン(21.7ul、0.69mmol)の無水DMF(３ml)溶液を、室温で、16時間攪拌した。この反応混合物を、次いで、Beckman prep-60 AD D-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300×20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05 ％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、20分間の保持時間で溶出した：15分間で30％Ｂに次いで、５分間、およびさらに20分間で60％Ｂまで；20ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(ESI)：m/z 505(M)。ローダミン-2-AM-DMAE-Bz 2-アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩8.89mg(0.0144mmol) の無水DMF(１ml)溶液に、トリエチルアミン9.81ul(0.0704mmol)および5-(および -6)-カルボキシ-X-ローダミンスクシンイミジルエステル16.68mg(0.0264mmol)を連続的に添加した。この反応系を、次いで、室温で、16時間攪拌した。この生成物を、Phenomenex逆相semi-prepカラム(Torrance、CA、300×7.8mm、Bondclone C18 10mm)を備えたBeckman分析用HPLC Model 126(Columbia、MD)上で単離した。それを、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、30分間の保持時間で溶出した：30分間で30％Ｂ〜60％Ｂ、60％Ｂでさらに10分間；２ml/分の流速；260nmでモニターした。この生成物は、2.56mg(収率17.4％)で得た。MS(ESI)：m/z 1022(M)。実施例２．テキサスレッド-2-AM-DMAE-COOHの合成-スキームII 2- フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシル-2',6'-ジメチル)フェニル・臭化物 30％ HBr/AcOH(４ml)中の2-フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9 -カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロメタンスルホン酸塩200mg(0.255mmol)の混合物を、55℃で、２時間攪拌した。室温まで冷却した後、この反応混合物に窒素を吹き込んで、その容量を約１ml まで低下させ、次いで、エーテル15mlに注いだ。その沈殿物を集め、そして過剰量のエーテルで洗浄した。空気乾燥した後、橙色の固形物して、その生成物150m g(収率89.5％)を得た。この生成物を、Phenomenex逆相HPLCカラム(Torrance、CA 、300×3.90mm、Bondclone C18 10mm)上で分析した。それを、以下の様式で、0. 05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、23.6分間の保持時間で溶出した：15分間で30％Ｂに次いで、５分間およびさらに20分間で60％Ｂまで；１ml/分の流速；260nmでモニターした。MS (ESI)：m/z 545(M)。2- アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシル-2', 6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩 2-フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシル-2',6'-ジメチル)フェニル・臭化物(130mg、0.21mmol)およびヒドラジン(10 4.5ul、3.33mmol)のDMF(４ml)溶液を、室温で、２時間攪拌した。この反応系を、次いで、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300× 20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物を、以下の様式で、0.05 ％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、20分間の保持時間で、主要ピークとして溶出した：30分間で５％Ｂ〜60％Ｂ、60％Ｂでさらに５分間；25ml/分の流速；260nmでモニターした。溶媒の除去により、この生成物56mg(収率51％)を得た。MS(ESI)：m/z 415(M)。テキサスレッド-2-AM-DMAE-COOH 2-アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシル-2 ',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩(2.4mg、0.0045mmol)およびテキサスレッドスルホニルクロリド(15mg)の無水DMF(6.34ulのEt₃Nを含有する)１ml 溶液を、室温で、窒素下にて、16時間攪拌した。この反応系を、次いで、Beckma n prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300×20mm、ODS-A、S-1 0、120Å)上で分離した。所望生成物(1.5mg)を、以下の様式で、0.05％ TFA/ H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、30分間の保持時間で溶出した：30分間で５％Ｂ〜60％Ｂ、60％Ｂでさらに５分間；16ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(ESI)：m/z 1003(M＋1)。実施例３．ローダミン-2-AM-DMAE-COOHの合成-スキームIII 2-アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシル-2 ',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩(５mg、0.0095mmol)の無水DMF(２ ml)溶液に、トリエチルアミン(19.8ul、0.142mmol)を添加し、続いて、5-(および-6)-カルボキシ-X-ローダミンスクシンイミジルエステル(17.96mg、0.0284mmo l)を添加した。この反応系を、室温で、16時間攪拌した。この生成物を、Phenom enex逆相Semi-prepカラム(Torrance、CA、300×7.8mm、Bondclone C18 10mm)を備えたBeckman分析用HPLC Model 126(Columbia、MD)上で単離した。それを、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、37.2分間の保持時間で溶出した：10分間で25％Ｂに次いで、30分間で55％Ｂまで、次いで、５分間で100％Ｂまで；16ml/分の流速；260nmでモニターした。この生成物は、２mgで得た。MS(MALDI-TOF)：m/z 934. 25(M＋1)。実施例４．CNF-2-AM-DMAE-COOHの合成-スキームIV 2-アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシル-2 ',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩8.7mg(0.013mmol)および5-(および-6)-カルボキシナフトフルオレセインスクシンイミジルエステル４mg(0.0062m mol)の無水DMF(5.3ul(0.031mmol)のEt₃Nを含有する)１ml溶液を、室温で、窒素下にて、16時間攪拌した。この反応系を、次いで、Beckman prep-60 ADD-ON HPL Cシステム(YMC、Wilmington、NC、300×20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物(1.5mg)を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05 ％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、32分間の保持時間で溶出した：30分間で20％Ｂ〜50％Ｂ、50％Ｂでさらに10分間；10ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(ESI)：m/z 873。実施例５．テキサスレッド-3-AM-DMAE-COOHの合成-スキームＶ 3- フタルイミドメチルブロモベンセントルエン200ml中の3-ブロモベンジルアミン塩酸塩(10ｇ、45mmol)、無水フタル酸(9.33g、63mmol)およびトリエチルアミン(12.5ml、90mmol)の混合物を、130 ℃で、13時間還流し、そしてこの反応系に形成された水を、DeanStarkトラップ装置を介して集めた。この反応系を、次いで、室温まで冷却し、他のトルエン20 0mlを添加し、続いて、p-トルエンスルホン酸一水和物１ｇを添加した。得られた混合物を、このDean Sｔarkトラップ装置を用いて、さらに、130℃で、３時間還流した。この混合物を室温まで冷却し、そして３％水酸化ナトリウム溶液(３ ×200ml)、水(３×200ml)、ブライン(１×200ml)で洗浄し、そして硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒の除去により、所望生成物13.2ｇ(収率92％)を得た。Rf： 0.7(シリカゲル、30％エーテル/ヘキサン)。 N-(3- フタルイミドメチル)フェニルイサチンイサチン(2.17ｇ、14.77mmol)の無水DMF(200ml)溶液を、室温で、半時間にわたって、NaH(60％分散体、0.709ｇ、17.72mmol)で処理した。得られた褐色の混合物を、3-フタルイミドメチルブロモベンゼン(７ｇ、22.15mmol)およびヨウ化第一銅(5.61ｇ、29.54mmol)で処理した。この混合物を、窒素下にて、160℃で、 18時間加熱した。室温まで冷却した後、この混合物を、クロロホルム800mlで希釈した。得られた混合物を濾過した；その濾液を減圧下にて蒸発させて、褐色の物質として、粗生成物を得た。Rf：0.9(シリカゲル、20％エーテル/ヘキサン)。3-(2'- カルボキシベンズアミド)メチル-アクリジン-9-カルボン酸この粗N-(3-フタルイミドメチル)フェニルイサチンを、10％水酸化カリウム20 0ml中にて、130℃で、３時間還流した。室温まで冷却した後、この混合物を濾過した。その濾過ケーキを10％水酸化カリウム20mlで洗浄した。合わせた濾液を、氷浴中にて、攪拌しながら、pH１〜２まで、濃塩酸で酸性化した。得られた固形物を水(４×100ml)で洗浄し、空気乾燥し、さらに、100℃で一晩、五酸化リンで乾燥して、5.36ｇで、所望生成物を得た(収率：イサチンから91％)。Rf:0. 5(シリカゲル、クロロホルム/メタノール/水55：45：５)。MS(MALDI-TOF)：m/z 401.665(M＋1)。3- フタルイミドメチル-アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル -2',6'-ジメチル)フェニル塩化チオニル(60ml)中の3-(2'-カルボキシベンズアミド)メチル-アクリジン-9 -カルボン酸(3.1ｇ)の混合物を、110℃で、１時間加熱して、均一溶液を形成し、これを、さらに、1.5時間加熱した。この反応混合物を室温まで冷却し、そして水レスピレーターにて、約30mlまで減らした。得られた濃縮物を無水エーテル 150mlに注いだ。この沈殿物を集め、エーテル(２×50ml)で洗浄し、そして真空下にて乾燥して、淡褐色の生成物1.91ｇ(収率57％)を得た。この物質(1.91ｇ、4 .38mmol)を無水ピリジン100mlに溶解し、そして室温で、窒素下にて、攪拌しながら、15時間にわたって、3,5-ジメチル-4-ヒドロキシ安息香酸塩(1.12ｇ、4.38 mmol)で処理した。この溶液を、次いで、減圧下にて、乾燥状態まで蒸発させた。その残留物を、ヘキサン中の25％酢酸エチル４リットルを用いた溶出により、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーカラムにて分離した。所望生成物を含有する画分を合わせた。減圧下での溶媒の除去により、470mg(収率：17％)で、表題化合物を得た。Rf：0.8(シリカゲル、10％メタノール/クロロホルム)。MS(E SI)：m/z 621.3(M＋1)。3- フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロスルホン酸塩 3-フタルイミジルメチル-アクリジンカルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル(100mg、0.1613mmol)の無水塩化メチレン５ml溶液を、トリフルオロメチルスルホン酸メチル(182ml、1.613mmol)で処理した。この溶液を、室温で、窒素下にて、16時間攪拌した。得られた混合物の容量を、窒素を吹き込むことにより、約２mlまで低下させた。得られた混合物を無水エーテル 10mlで処理した。その沈殿物を集め、そしてエーテル(５×５ml)で洗浄して、山吹色の生成物110mg(87％)を得た。MS(ESI)：m/z 635.6(M⁺)。3- フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシ -2',6'-ジメチル)フェニル・臭化物 30％臭化水素２ml中の3-フタルイミジルメチル-10-メチル-アクリジニウム-9- カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロスルホン酸塩105mgの混合物を、攪拌しながら、55℃で、２時間加熱した。室温まで冷却した後、この混合物を、無水エーテル20mlで処理した。その黄色の沈殿物を集め、そしてエーテル(６×５ml)で洗浄して、定量的に、この生成物90 mgを得た。MS(ESI)：m/z 545.7(M⁺)。3- アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシル-2', 6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩 3-フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシ-2',6'-ジメチル)フェニル・臭化物(60mg、0.112mmol)およびヒドラジン(60.4 ul、1.927mmol)のDMF(２ml)溶液を、室温で、窒素下にて、４時間攪拌して、懸濁液を得た。濾過により、この固形物を除去し、その濾液を、減圧下にて、乾燥状態まで蒸発させた。その残留物を、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YM C，Wilmington、NC、300×20mm、ODS-A、S-10，120Å)上で分離し、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、溶出した：30分間で５％Ｂ〜60％Ｂ；16ml/分の流速；260 nmでモニターした。所望生成物を、23.5〜25.2分間の保持時間で、ブロードなピークとして、溶出した。減圧下での溶媒の除去により、所望生成物21mg(収率36 ％)を得た。テキサスレッド-3-AM-DMAE-COOH 3-アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシ-2', 6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩(12mg、0.027mmol)の無水DMF(31.7u l(0.27mmol)のEt₃Nを含有する)１ml溶液を、攪拌しながら、室温で、窒素下にて、16時間にわたって、テキサスレッドスルホニルクロリド(30mg、0.0475 mmol)で処理した。この反応混合物を、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(Y MC、Wilmington、NC、300×20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物(3.4mg)を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN( 溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、33分間の保持時間で溶出した：3 0分間で５％Ｂ〜60％Ｂ、60％Ｂでさらに５分間；16ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(ESI)：m/z 1003(M＋1)。実施例６．ローダミン-3-AM-DMAE-β-アラニンの合成-スキームVI 3- フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシエチルアミドカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩 DMF(２ml)およびアセトニトリル(３ml)の混合溶媒中の3-フタルイミドメチル- 10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシル-2',6'-ジメチル)フェニル・臭化物(65mg、0.104mmol)の溶液を、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、70mg、0.335mmol)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS、36mg、0. 313mmol)で処理した。この反応系を室温で５時間攪拌し、次いで、乾燥状態まで蒸発させた。得られた残留物を、無水DMF(２ml)で再構成し、その不溶物質を濾過により除去した。その濾液に、β-アラニン(93mg、1.04mmol)の0.2M炭酸塩緩衝液(pH９)２ml溶液を添加し、続いて、別のDMF(３ml)を添加した。この反応系を室温で16時間攪拌させ、次いで、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC 、Wilmington、NC、300×20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物 (45.2mg、収率59％)を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ T FA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、27分間の保持時間で溶出した：15分間で30％Ｂに次いで、５分間で60％Ｂ、そして60％Ｂで20分間；16 ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(MALDI-TOF)：m/z 618(M＋2)。3- フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシエチルアミドカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩 3-フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシエチルアミドカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩(45. 2mg、0.0734mmol)の無水DMF(２ml)溶液を、２時間にわたって、ヒドラジン46ul( 0.147mmol)で処理した。この反応混合物を、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300×20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物(29mg、収率71％)を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0. 05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、27分間の保持時間で溶出した：30分間で５％Ｂ〜60％Ｂ、60％Ｂでさらに10分間に次いで、５分間で100％Ｂ；16ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(MALDI-TOF)：m/z 487( M＋1)。ローダミン-3-AM-DMAE-β-アラニン 3-アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4'-カルボキシエチルアミドカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩(2.82mg、0 .044mmol)およびトリエチルアミン(11ul、0.0791mmol)の無水DMF(１ml)溶液に、 5-カルボキシ-X-ローダミンスクシンイミジルエステル(５mg、0.0079mmol)を添加した。この反応系を、室温で、３時間攪拌させ、次いで、Becklnan prep-60 A DD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300×20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物(1.56mg)を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、30.8分間の保持時間で溶出した：30分間で５％Ｂ〜60％Ｂ、60％Ｂでさらに10分間に次いで、５分間で100％Ｂ；16ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(MALDI-TOF)： m/z 1000(M−3)。実施例７．テキサスレッド-X-3-AM-DMAE-β-アラニンの合成-スキームVII 無水DMF(１ml)中に3-アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸( 4'-カルボキシエチルアミドカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩(2.18mg、0.0031mmol)およびトリエチルアミン(8.5ul、0.061mmol)を含有する溶液を、テキサスレッド-Xスクシンイミジルエステル(５mg、0.0061mmol) で処理した。この反応系を、室温で、16時間攪拌させた。この混合物を、Beckma n prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300×20mm、ODS-A、S-1 0、120Å)上で分離した。所望生成物(0.85mg)を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂ O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、41分間の保持時間で溶出した：10分間で25％Ｂ、次いで、30分間で55％Ｂまで、次いで、５分間で100％Ｂまで；16ml/分の流速；260nmでモニターした。MS( MALDI-TOF)：m/z 1188(M＋1)。実施例８．テキサスレッド-ED-NCM-DMPAEの合成-スキームVIII 10- エトキシカルボニルメチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(2',6'-ジメチル) フェニル・ヨウ化物アクリジン-9-カルボン酸(2',6'-ジメチル)フェニル(0.5ｇ、1.53mmol)を、８ mlまでのヨード酢酸エチルに懸濁し、その反応系を、油浴中で、窒素雰囲気下にて、90℃で、16時間加熱した。この反応系は、暗褐色に変わったが、室温まで冷却し、そしてジエチルエーテル(25ml)およびヘキサン(50ml)の混合物に注いだ。褐色の固形分が分離した。この生成物の沈殿は、このエーテル/ヘキサン混合物中の懸濁液を冷蔵庫中にて２時間冷却することにより、完結させた。この沈殿物を、次いで、濾過により集め、そしてクロロホルムおよびメタノールの混合物に再溶解した。減圧下での濃縮により、赤褐色の粉末0.23ｇを得た。(収率2８％) 。TLC(シリカ)Rf＝0.6(クロロホルム中の２％メタノール)。MS(MALDI-TOF)：m/z 414.1(M⁺)。10- アミノエチルカルバモイルメチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩 10-エトキシカルボニルメチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(2',6'-ジメチル )フェニル・ヨウ化物(77mg)を、室温で、窒素雰囲気下にて、16時間にわたって、２mlまでのエチレンジアミンと共に攪拌した。この反応混合物を、次いで、減圧下にて濃縮し、その残留物を、メタノール(１ml)に溶解した。その粗生成物を、40分間にわたって、トリフルオロ酢酸水溶液(0.05％)中の０〜60％ MeCNの勾配を用いて、溶媒流速＝16mL/分および260nmでのUV検出で、C₁₈カラム(YMC30×3 00mm)上での分離用HPLCにより、精製した。これらの条件下にて、この生成物を、26分間で、中心にある広いピークとして、溶出した。この生成物を含有するHP LC画分を、乾燥状態まで凍結乾燥して、黄色の粉末7.8mg(収率10％)を得た。MS( ESI)：m/z 428.7(M⁺)。テキサスレッド-ED-NCM-DMPAE 10-アミノエチルカルバモイルメチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(2',6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩3.02mg(0.004mmol)およびEt₃N(5.58ul、0 .04mmol)の無水DMF(１ml)溶液に、テキサスレッドスルホニルクロリド(10mg、0. 016mmol)を添加した。この反応系を、室温で、窒素下にて、16時間攪拌し、次いで、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300 ×20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物(2.42mg)を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、42分間の保持時間で溶出した：30分間で５％Ｂ〜60％Ｂ、60％Ｂでさらに5分間に次いで、５分間で100％Ｂまで；16ml/分の流速；260nm でモニターした。MS(ESI)：m/z 1017(M＋1)。実施例９．テキサスレッド-ED-NSP-DMPAEの合成-スキームIXI N- アミノエチルアミノスルホニルプロピル-アクリジニウム-9-カルボン酸(2',6' -ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩 N-スルホプロピル-2',6'-ジメチルフェニルアクリジニウムエステル(0.1ｇ)を塩化チオニル(２mL)に懸濁し、この懸濁液を、窒素雰囲気下にて、３〜４時間還流した。この反応系は、還流すると、透明に変わった。この反応混合物を、次いで、室温まで冷却し、そしてジエチルエーテル(約25〜35mLまで)を添加した。黄色の沈殿物が現れた。このエーテルをデカントし、この沈殿物をエーテルで３回リンスして、微量の塩化チオニルを除去した。最後に、残りの固形物を、エチレンジアミン(１mL)およびピリジン(１mL)で処理した。得られた反応系を、室温で、２〜３時間攪拌し、次いで、減圧下にて、濃縮した。その残留物をメタノール (１mLまで)に溶解し、その生成物を、40分間にわたって、トリフルオロ酢酸水溶液(0.05％)中の０〜60％ MeCNの勾配を用いて、溶媒流速＝16mL/分および260nm でのUV検出で、C₁₈カラム(YMC 30×300mm)上での分離用HPLCにより、精製した。これらの条件下にて、この生成物を、34分間で、中心にある広いピークとして、溶出した。この生成物を含有するHPLC画分を、乾燥状態まで凍結乾燥して、黄色の粉末を得た。収量26mg(25％)。MS(ESI)：m/z 492.8(M＋H⁺)。テキサスレッド-ED-NSP-DMPAE 10-アミノエチルアミノスルホニルプロピル-アクリジニウム-9-カルボン酸(2' ,6'-ジメチル)フェニル・トリフルオロ酢酸塩(４mg、0.005mmol)およびEt₃N(9.5 9ul、0.075mmol)の無水DMF(１ml)溶液を、攪拌しながら、室温で、窒素下にて、 16時間にわたって、テキサスレッドスルホニルクロリド(10mg、0.016mmol)で処理した。得られた混合物を、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmi ngton、NC、300×20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物(0.3mg) を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、37.8分間の保持時間で溶出した：30分間で５％Ｂ〜60％Ｂ、60％Ｂでさらに５分間；16ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(MALDI-TOF)：m/z 1083(M＋2)。実施例10．テキサスレッド-3-ABO-DMAE-Bzの合成-スキームＸ 3- ヒドロキシアクリジン-9-カルボン酸メチルエステル： 3-ヒドロキシアクリジン-9-カルボン酸を、EP 0322926 A2と同様に調製した。 3-ヒドロキシアクリジン-9-カルボン酸(7.8ｇ；32.6mmol)を、重炭酸ナトリウム溶液(10％)200mlに溶解し、そして室温で２時間攪拌した。沈殿したナトリウム塩をブフナー漏斗にて分離し、そして乾燥した（収量7.8ｇ(91％)）。このナトリウム塩(7.0ｇ；26.8mmol)を、室温で、DMSO(50ml)中のヨウ化メチル(5.6 ｇ；37.5mmol)でエステル化した。２時間後、この溶液を水600mlに注ぎ、その沈殿物を分離し、水で洗浄し、そして真空中にて50℃で乾燥した。収量5.8ｇ(86％ )、Fp＞250℃。 3-(m- ニトロベンジルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸メチルエステル 3-ヒドロキシアクリジン-9-カルボン酸メチルエステル(14.6ｇ；57.7mmol)を、DMF(500ml)に溶解し、次いで、炭酸カリウム(25.0ｇ；181mmol)および臭化m- ニトロベンジル(15.0ｇ；69.4mmol)を添加し、そして室温で攪拌した。４時間後、この混合物を濾過し、その濾液を、真空中にて、乾燥状態まで蒸発させた。その残留物をCH₂Cl₂に溶解し、そして１N HCl、１N NaOHおよび塩化ナトリウム溶液(10％)で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し乾燥状態まで蒸発させた後、その残留物を、CH₂Cl₂＋１％メタノール(200mlの画分)にて、フラッシュクロマトグラフィー(カラム：直径10cm)にかけた。画分７〜23を合わせ、蒸発させ、その残留物をブフナー漏斗にて集め、そしてジエチルエーテルで洗浄した。収量8.7ｇ( 39％)、Fp＞250℃。 3-(m- ニトロベンジルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸 3-(m-ニトロベンジルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸メチルエステル(6.5ｇ；16.7mmol)を、ジオキサン400mlおよび１N NaOH(300ml)中にて、還流した。２時間後、この溶液を冷却し、そして濃HClでpH１まで酸性化し、次いで、真空中にて蒸発させた。その沈殿物をブフナー漏斗にて集め、水で洗浄し、そして真空中にて50℃で乾燥した。収量5.9ｇ(95％)、Fp＞250℃。 3-(m- ニトロベンジルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル：ピリジン300ml中のp-トルオールスルホニルクロリド(38.0ｇ；0.2mol)および3 -(m-ニトロベンジルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸(3.75ｇ；0.02mol)を、室温にて、攪拌した。２時間後、この透明な溶液に、4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル- 安息香酸ベンジルエステル(3.1ｇ；0.023mol；室温で、DMF中にて、4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-安息香酸、炭酸カリウムおよび臭化ベンジルから調製した、Fp ．104〜106℃)を添加した。18時間後、この溶液を蒸発し、その残留物を酢酸エチルに溶解し、そして１N HCl、１N NaOHおよびNaCl溶液(10％)で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し蒸発させた後、その残留物(42ｇ)を、CH₂Cl₂＋５％酢酸エチルを用いて、フラッシュクロマトグラフィー(カラム：直径７cm)にかけた。酢酸エチル/ヘキサンから結晶化した収量5.2ｇ(87％)。Fp．147〜148℃。 3-(m- アミノベンジルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル： 3-(m-ニトロベンジルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル(３ｇ；5.1mmol)、木炭(1.3ｇ)、塩化鉄(III )六水和物(0.18ｇ；0.7mmol)、N,N-ジメチルヒドラジン40mlおよび無水メタノール250mlの混合物を、攪拌下にて、還流した。４時間後、この混合物を冷却し、そして濾過し、その残留物をCHCl₃で充分に抽出し、その濾液を乾燥状態まで蒸発させた。この残留物を、次いで、ブフナー漏斗にて集め、そしてジエチルエーテルで洗浄した。収率2.5ｇ(84％)、Fp．184〜186℃。テキサスレッド-3-ABO-DMAeE-Bz：テキサスレッド(スルホローダミン101スルホニルクロリド；0.625ｇ；1.0mmol )、3-(m-アミノベンジルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル(1.164ｇ；2.0mmol)およびCH₂Cl₂(30ml)の混合物を、アルゴン下にて、室温で攪拌した。20時間後、この溶液を蒸発させ、その残留物を、CHCl₃＋３％メタノールを用いて、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにかけた(カラム：直径5.5cm)(50mlの画分)。画分21〜38を集め、蒸発させ、Al₂O₃(Brockman、Neutral、Akt．1)上でもう一度クロマトグラフィーにかけた。最初の赤色ゾーン(ジスルホンアミド)をCHCl₃＋３％メタノールで溶出し、そしてテキサスレッド-3-ABO-DMAeE-Bzの第二赤色ゾーンをCHCl₃＋６％メタノールで溶出した。収量0.40ｇ(34％)。テキサスレッド-3-ABO-DMAE-Bz： CH₂Cl₂(10ml)中のテキサスレッド-3-ABO-DMAeE-Bz(46.8mg；４×10^-5mol)およびトリフルオロメタンスルホン酸メチル(78.7mg；48×10^-5mol)を、室温に静置した。18時間後、この溶液を、真空中にて、室温で蒸発させ、その残留物を、ブフナー漏斗上にて、ジエチルエーテルと共に集め、そして高真空中、室温で24時間乾燥させた。収量45mg(95％)。実施例11．テキサスレッド-3-APO-DMAE-Bzの合成-スキームXI ω-アジドプロピル-p-トリルスルホン酸：アジ化ナトリウム(26.0ｇ；0.4mol)およびDMF(200ml)の混合物に、攪拌下にて、室温で、3-ブロモプロパノール(35.0ｇ；0.4mol)を滴下し、次いで、110℃まで加熱した。23時間後、この混合物を冷却し、そしてジエチルエーテル1000mlおよび水500mlを添加して分離した。その水相をジエチルエーテル500mlで２回抽出し、その有機相を水600mlで４回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し蒸発すると、黄色がかった液体として、粗ω-アジド-プロパノール16.3ｇ(40％)が得られた。粗ω-アジドプロパノール(10.1ｇ；0.1mol)およびピリジン50mlの混合物に、攪拌下にて、０℃で、６つに分けて、p-トルオール-スルホニルクロリド(19.1ｇ；0.1mol)を添加した。３時間後、この混合物を水に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出し、そして１N HClで洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し蒸発すると、黄色がかった液体として、ω-アジドプロピル-p-トリルスルホン酸22.5g(88％)が得られた。 3-( ω-アジドプロピルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸メチルエステル 3-ヒドロキシ-アクリジン-9-カルボン酸メチル(0.2ｇ；0.04mol)をDMF(1000ml )に溶解し、次いで、炭酸カリウム(22.2ｇ；0.16mol)およびω-アジドプロピル- p-トリルスルホン酸(15.2ｇ；0.15mol)を添加し、そして室温で攪拌した。５時間後、このアジドの追加量(5.2ｇ；0.05mol)を添加し、そして室温での攪拌を19 時間続けた。この炭酸カリウムを濾過し、その濾液を、真空中にて、乾燥状態まで蒸発させた。その残留物を、CH₂Cl₂＋５％酢酸エチルを用いて、フラッシュクロマトグラフィーにかけた。ジイソプロピルエーテルから結晶化した収量8.0ｇ。Fp．＝96〜97℃。 3-( ω-アジドプロピルオキシ)-アクリジン-9-カルボン酸 3-(ω-アジドプロピルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸メチルエステル(0.673 ｇ；2.0mmol)を、ジオキサン40mlおよび１N NaOH(30ml)中で還流した。１時間後、この溶液を冷却し、濃HClでpH１まで酸性化し、次いで、真空中にて蒸発させた。その沈殿物をブフナー漏斗にて集め、水で洗浄し、そして真空中にて、50℃ で乾燥した。収量0.58ｇ(86％)、Fp．252℃(分解)。 3-( ω-アジドプロピルオキシ)-アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニルピリジン750ml中のp-トルオールスルホニルクロリド(57ｇ；0.3mol)および3 -(ω-アジドプロピルオキシ)-アクリジン-9-カルボン酸(9.5ｇ；0.03mol)を、室温で攪拌した。３時間後、4-ヒドロキシ-3,5-ジメチル-安息香酸ベンジルエステル(9.2ｇ；0.036mol)を添加した。20時間後、この溶液を蒸発させ、その残留物を酢酸エチルに溶解し、そして１N HCl、１N NaOHおよびNaCl溶液(10％)で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し蒸発させた後、その残留物を、CH₂Cl₂＋５％酢酸エチルを用いて、フラッシュクロマトグラフイー(カラム：直径10cm)にかけた。ジイソプロゾルエーテルから結晶化した収量13.2ｇ(78％)、Fp＞91〜93℃。 3-( ω-アジドプロピルオキシ)-アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル 3-(ω-アジドプロピルオキシ)-アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル(2.8ｇ；5mmol)およびトリフェニルホスフィン(2.6ｇ；10mmol)を、THF(100ml)中にて、室温で、６時間にわたって攪拌し、次いで、水(2.5ml)を添加し、そして攪拌を17時間継続した。次いで、この溶液を蒸発させ、そしてジエチルエーテル200mlおよび１N HCl(80ml)を添加した。その沈殿物を濾過し、そしてCHCl₃(100ml)および１N NaOH(50ml)に分配した；その有機相を、次いで、NaCl溶液(10％)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして乾燥状態まで蒸発させた。収量3.3ｇの粘稠なオイル(96％)。テキサスレッド-3-APO-DMAeE-Bz：テキサスレッド(スルホローダミン101スルホニルクロリド；1.068ｇ；１mmol) 、3-(ω-アミノプロピルオキシ)アクリジン-9-カルボン酸(4'-ベンジルオキシカルボニル-2',6'-ジメチル)フェニル(0.626ｇ；２mmol)およびCH₂Cl₂(70ml) の混合物を、アルゴン下にて、室温で攪拌した。20時間後、この溶液を蒸発させ、そしてCHCl₃＋３％メタノール(30mlの画分)を用いて、Al₂O₃(Brockman、A、Ak t．1)上でクロマトグラフィーにかけた。最初の５個の画分は、ジスルホンアミドを含有していた。第二の赤色ゾーンは、所望生成物を含有しており、画分16〜 38を集めて、乾燥状態まで蒸発させた。収量0.265ｇ(24％)。テキサスレッド-3-APO-DMAE-Bz： CH₂Cl₂(10ml)中のテキサスレッド-3-APO-DMAeE-Bz(45mg；４×10^-5mol)およびトリフルオロメタンスルホン酸メチル(78.7mg；48×10^-5mol)を、室温で静置した。20時間後、この溶液を、真空中にて、室温で蒸発させ、その残留物を、ブフナー漏斗にて、ジエチルエーテルと共に集め、そして高真空中にて、室温で、24 時間乾燥した。実施例12．ローダミン-2-AM-DMAE-HD-テオフィリンの合成-スキームXII アミノヘキシルアミド-テオフィリン(TheophyIIine-HD) 無水DMF(1.5ml)中に8-カルボキシプロピル-テオフィリン30mg(0.113mmol)を含有する溶液に、DCC(69.7mg、0.339mmol)およびNHS(77.8mg、0.678mmol)を添加した。この反応系を室温で16時間攪拌させて、8-カルボキシプロピルテオフィリンのNHSエステルを形成した。これを、次いで、0.2M炭酸塩緩衝液(pH9.0)１mlおよびDMF(0.5ml)中の1,6-ヘキシルジアミン131mg(1.13mmol)の溶液で処理した。この反応系を室塩で３時間攪拌し、次いで、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300×20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物(55mg)を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃ CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、26分間の保持時間で溶出した：15分間で10％Ｂに次いで、10分間で30％Ｂまで、10分間で30％Ｂに次いで、５分間で100％Ｂまで；16ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(MALDI-TOF)：m/ z 365(M＋1)。2- フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸[4-(テオフィリン-8-ブタノイルアミド)ヘキシルアミドカルボニル-2,6-ジメチル]フェニル・トリフルオロ酢酸塩無水アセトニトリル(１ml)およびDMF(0.5ml)の混合溶媒中の2-フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸(4-カルボキシル-2,6-ジメチル) フェニル・臭化物(10mg、0.0152mmol)の溶液を、DCC(12.5mg、0.061mmol)および NHS(10.5mg、0.092mmol)で処理した。４時間後、この反応系を、減圧下にて、乾燥状態まで蒸発させた。その残留物を無水DMF(１ml)に再溶解し、次いで、濾過して、不溶物質を除去した。この濾液をトリエチルアミン(19ul、0.137mmol)で処理し、続いて、アミノヘキシルアミド-テオフィリン(20mg、0.0547mmol)を添加した。この反応系を、室温で、窒素下にて、２時間攪拌させた。この混合物を、次いで、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300× 20mm、ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物(18mg)を、以下の様式で、0.05％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、25.6分間の保持時間で溶出した：15分間で30％Ｂに次いで、５分間で60％Ｂまで、そして60％Ｂで20分間；16ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(MALDI-TOF)：m/z 891(M＋1)。2- アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸[4-(テオフィリン-8- ブタノイルアミド)ヘキシルアミドカルボニル-2,6-ジメチル]フェニル・トリフルオロ酢酸塩 2-フタルイミドメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸[4-(テオフィリン-8-ブタノイルアミド)ヘキシルアミドカルボニル-2,6-ジメチル]フェニル・トリフルオロ酢酸塩(15mg、0.0149mmol)の1.6mlのメタノール中の溶液を、１時間にわたって、ヒドラジン(42.2ml、1.345mmol)で処理した。この反応混合物を、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300×20mm、OD S-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物(12.8mg)を、以下の様式で、0.05 ％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、25.6分間の保持時間で溶出した：30分間で20％Ｂ〜60％Ｂ、60％Ｂでさらに５分間；16ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(MALDI-TOF)：m/z 7 62(M＋1)。ローダミン-2-AM-DMAE-HD-テオフィリン 2-アミノメチル-10-メチル-アクリジニウム-9-カルボン酸[4-(テオフィリン-8 -ブタノイルアミド)ヘキシルアミドカルボニル-2,6-ジメチル]フェニル・トリフルオロ酢酸塩(２mg、0.00233mmol)の無水DMF(これは、トリエチルアミン16.5ul( 0.0297mmol)を含有する)１ml溶液を、攪拌しながら、室温で、３時間にわたって、スクシンイミジルエステル(５mg、0.00791mmol)で処理した。この反応混合物を、Beckman prep-60 ADD-ON HPLCシステム(YMC、Wilmington、NC、300×20mm、 ODS-A、S-10、120Å)上で分離した。所望生成物(3.75mg)を、以下の様式で、0.0 5％ TFA/H₂O(溶媒Ａ)および0.05％ TFA/CH₃CN(溶媒Ｂ)を混合することにより、段階的勾配で、24.5分間の保持時間で溶出した：30分間で20％Ｂ〜60％Ｂ、60％Ｂでさらに５分間；16ml/分の流速；260nmでモニターした。MS(MALDI-TOF)：m/z 1279(M＋1)。実施例13．競合的結合アッセイでのETCトレーサーの適用 ETCトレーサーとしてのローダミン-2-AM-DMAE-HD-テオフィリン(スキームXII) のアッセイ性能機能性を、参照DMAE-ED-テオフィリントレーサー(図５)との直接比較により、評価した。自動化Ciba-Corning ACS^TMテオフィリンAssayは、Ciba この目的に使用した。このアッセイでは、このアクリジニウムエステル標識テオフィリンおよびテオフィリン標準(Ciba Corning Diagnostics Corp.)は、限定量のムリンモノクローナル抗テオフィリン抗体(これは、常磁性粒子固相に共有結合した)と競争する。テオフィリン標準20μl、固相450μlおよびプローブ100μl を含有する反応混合物を、37℃で、7.5分間インキュベートした。テオフィリン標準は、0.00、1.25、2.50、5.00、10.0、20.0および40.0μg/mlの濃度でテオフィリンを含有していた。この固相を、永久磁石のアレーにて集め、そして脱イオン水で２回洗浄して、結合していないトレーサーを除去した。先に記述したようにして、化学発光反応を開始した。ACS：180で検出した光子として、データを収集し、RCLとして表した。この標準中に存在するテオフィリン濃度と、ACS：180により検出したRLUとの間には、非線形で逆の関係が存在している。特定のテオフィリン濃度から得た中間RLU値(ここでは、μと表わす)は、３個の複製から計算した。非トレーサーアッセイ試薬もまた、少ないがしばしば有意な数のRLUに寄与している。従って、トレーサー以外の全てのアッセイ試薬を含有する対照反応は、非トレーサー試薬バックグラウンド(ここで、ｂと表わす)を決定することと平行して行った。中間 RLU、μは、このトレーサーのみから得たRLU(ここでは、Ｂと表わし、Ｂ＝μ−b である)を表わすように補正した。このテオフィリン濃度が0.00μg/mlの場合、補正した中間RLU値は、Ｂ₀で表わした。いくつかの標準競合アッセイ規準を試験して、ローダミン-2-AM-DMAE-HD-テオフィリントレーサーの機能性を評価した。この競合評価のための主要なパラメータは、％Ｂ/Ｂ₀あった。％Ｂ/Ｂ₀に加えて、競合性能の第二の指標は、最小検出可能分析物濃度(感度)であり、％ｃ.ν.である。テオフィリン濃度およびRLUと同様に、この標準中に存在するテオフィリン濃度と％Ｂ/Ｂ₀との間には、非線形で逆の関係が存在している。％Ｂ/Ｂ₀の計算は、単に、％Ｂ/Ｂ₀＝100×Ｂ/Ｂ₀であった。この標準曲線は、ｘ軸にテオフィリン濃度対ｙ軸に％Ｂ/Ｂ₀でグラフにしたが、ローダミン-2-AM-DMAE-HD-テオフィリンおよびDMAE-ED-テオフィリントレーサーの両方に対して、一般的であった(図６)。テオフィリンによる固相からのローダミン-2-AM-DMAE-HD-テオフィリントレーサーの競合的変位は、テオフィリン濃度の定量化のためのトレーサーとしての、ローダミン-2-W-DMAE-HD-テオフィリンの機能的な性能を示した。ｙ＝ｂｍ^xまたはｘ＝(1ny−1nb)/1nmの方程式の形における近似標準曲線形状に、指数関数回帰を使用した。理論的な感度は、補正したＢ₀平均値からの２個の標準偏差の差し引きにより得た値Ｂに対するテオフィリン濃度として、算出した。トレーサーとしてローダミン-2-AM-DMAE-HD-テオフィリンを用いる最小検出可能テオフィリン濃度は、DMAE-HD-テオフィリントレーサーから得たものと匹敵していた(表４)。特定のテオフィリン濃度における３個の複製に対する％ｃ.ν.値は、％ｃ.ν. ＝(100×標準偏差/μ)として、算出した。この％ｃ.ν.値は、ローダミン-2-AM- DMAE-HD-テオフィリントレーサーについて、全体的に僅かに高かったものの、標的％ｃ.ν.値が５％に等しいかそれ未満であるべきなので、それには、有害ではなかった(表５)。同時の二重分析物結合アッセイでのETCトレーサーの適用：二重のテオフィリン/コルチゾール結合アッセイ−テオフィリンの定量化のための二重分析物アッセイでのトレーサーとしてのローダミン-2-AM-DMAE-HD-テオフィリンの機能性は、NSP-DMAE-HD-3-CMO-コルチゾールトレーサーを用いるコルチゾール濃度の平行分析で評価した(図７)。この目的のために、先に記述のものと本質的に同一または類似した成分を使用する手動アッセイを使用した。ローダミン-2-AM-DMAE-HD-テオフィリントレーサー、テオフィリン標準およびテオフィリン結合固相間の相互作用と同様に、コルチゾール含有標準(Ciba Corning Diag nostics Corp.)に由来のNSP-DMAE-HD-3-CMO-コルチゾールトレーサーおよびコルチゾールは、限定量のポリクローナルウサギ抗コルチゾール抗体(これは、常磁性粒子固相に共有結合した)と競争する。テオフィリン標準20μl、コルチゾール標準20μl、テオフィリン固相450μl、コルチゾール固相250μl、ローダミン-2- AM-DMAE-HD-テオフィリントレーサー100μlおよびNSP-DMAE-HD-3-CMO-コルチゾールトレーサー50μlを含有する反応混合物を、室温で、２時間インキュベートした。コルチゾール標準は、0.00、10.0、20.0、60.0、120、300および800ng/ml の濃度で、コルチゾールを含有していたのに対して、テオフィリン標準は、上記のものと同じであった。この固相を、永久磁石のアレーにて集め、そして脱イオン水で２回洗浄して、結合していないトレーサーを除去した。先に記述したよう計)(これは、PMT1上に、Corion LL-550光学フィルター(図８)を備えており、そしてPMT2上に、Corion LS450光学フィルター(図９)を備えている)により、２個のチャンネルでの光子として、集めた。データは、RLUとして表わした。テオフィリンアッセイと同様に、このコルチゾール標準中に存在するコルチゾール濃度と、この二重照度計により検出されたRLUとの間には、非線形で逆の関係が存在する。標準的な競合アッセイパラメータは、上記のようにして算出した。この標準曲線は、ｘ軸にテオフィリンおよびコルチゾール濃度対ｙ軸に％Ｂ/ Ｂ₀でグラフにし、この標準曲線が、混合分析物アッセイから個々に構成できることを示した(図10および11)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ナトラジャン，アナンドアメリカ合衆国ニューハンプシャー 03104，マンチェスター，マデリンロード 77 (72)発明者シャープ，デイビッドアメリカ合衆国マサチューセッツ 02035，フォックスボロ，クロスストリート 61 (72)発明者バーマン，マルクススイス国シーエイチ―4053 バーゼル, アルシェイマーストラッセ 18 (72)発明者ヒルフィカー，ロルフスイス国シーエイチ―4123 アルシュウィル，オバーワイラーストラッセ 39 (72)発明者シュミッド，エリカスイス国シーエイチ―4052 バーゼル, レディングストラッセ 20／４ (72)発明者セン，ポールスイス国シーエイチ―4431 ベンウィル，カプフウェグ６ (72)発明者トーメン，フリッズスイス国シーエイチ―4410 リースタイル，ウェイドウェグ 13 (72)発明者ワルドナー，エイドリアンスイス国シーエイチ―4123 アルシュウィル，ホリーウェグ 39 (72)発明者アルダー，アレックススイス国シーエイチ―4422 アリスドルフ，ハグルストラッセ 22 (72)発明者ロー，セイ−ジョンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02090，ウエストウッド，フォーブスロード 15 【要約の続き】ム部分を含有する化学発光標識共役物が開示され、該部分は、目的の生体分子にさらに共役されており、ここで、該スペーサーは、該部分から発生した励起種が該発光団にエネルギーを効率的に移動させるのに適当な長さであり、その結果、その発光団のスペクトル領域において、光の放射が生じる。その共役物を用いる結合アッセイ、該共役物を包含する試験キットおよびこの共役物を調製する方法もまた、開示される。

Claims

【特許請求の範囲】１．スペーサーを介して発光団に共有結合されたアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分を含有する化学発光標識共役物であって、該部分は、目的の生体分子にさらに共役されており、ここで、該スペーサーは、該部分から発生した励起種が該発光団にエネルギーを移動できるように、20個までのヘテロ原子を有し50オングストローム未満、好ましくは、12個までのヘテロ原子を有し30オングストローム未満、最も好ましくは、８個までのヘテロ原子を有し10オングストローム未満の線状、分枝状または環状のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、アルコキシル鎖またはアラルキル鎖を含有する第一側鎖であり、その結果、該発光団のスペクトル領域において、光の放射が生じ、該共役物は、式(Ｉ)および (II)を有する：ここで、 R₁、R₂またはR₃の１個は、第一側鎖に連結された発光団であり、ここで、該側鎖は、該アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分から発生した励起種が該発光団にエネルギーを移動できるように、20個までのヘテロ原子を有し50オングストローム未満、好ましくは、12個までのヘテロ原子を有し30オングストローム未満、最も好ましくは、８個までのヘテロ原子を有し10オングストローム未満の線状、分枝状または環状のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、アルコキシル鎖またはアラルキル鎖を含有し、その結果、該発光団のスペクトル領域において、光の放射が生じる； R₁が、第一側鎖に連結された発光団で置換されていないとき、R₁は、代替的に、必要に応じて20個までのヘテロ原子を含有するアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルである； R₂またはR₃が、第一側鎖に連結された発光団で置換されていないとき、R₂およびR₃は、代替的に、同一または異なり、それぞれ、式(Ｉ)に対するC₁ _〜4およびC₅ _〜8 および式(II)に対するC₁ _〜4およびC₆ _〜11での単一または複数の基であり、水素、置換または非置換アリール、ハライド、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、-R、-CN、-COOH、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R、-C(O)OR、-C( O)NHRおよび-NHC(O)Rからなる群から選択される； A^-は、対イオンである； Xは、窒素、酸素またはイオウである； Xが酸素またはイオウのとき、Zは省略され、そしてYは、次式の多置換アリール部分である：ここで、R₄およびR₈は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル(-OR )、アルキルチオール(-SR)、または立体効果および/または電子効果によって該アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核と該Y部分の間の-COX-結合を安定化するのに役立つ置換アミノ基である；さらに、R₄およびR₈は、同一または異なり得る；さらに、R₄およびR₈の１個は、該-COX-結合の安定性を著しく損なうことなく、水素であり得る； R₅およびR₇は、水素、置換または非置換アリール、ハライド、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、-R、-CN、-COOH、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O )R、-C(O)OR、-C(O)NHRおよび-NHC(O)Rからなる群から選択される； R₆は、-R₉-R₁₀であり、ここで、R₉は、第二側鎖であり、必須ではなく必要に応じて、分枝または直鎖アルキル、必要に応じて20個までのヘテロ原子を含有する置換または非置換アリールまたはアラルキルであり得る、そして R₁₀は、 Q-R-Nu、-Q-R-InNu-、-Q-Nu、-R-Nuおよび-Nuからなる群から選択される残基または残基に結合した求電子性官能基であり、ここで、ｎは、少なくとも１の数であり、Nuは、求核性基であり、Qは、官能性結合であり、Iは、イオン性基またはイオン化可能基である； Xが窒素のとき、Yは、(1)20個までの炭素原子および必要に応じて10個までのヘテロ原子を含有する分枝または直鎖アルキル基または(2)20個までの炭素原子を含有する置換または非置換アリール基またはヘテロアリール基である；Zは、- SO₂-Y'であり、Y'は、上記Yと同じように定義される；YおよびY'は、同一または異なる化学組成を有し得る； Rは、０個〜20個のヘテロ原子を含有するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択される； R₅、R₆およびR₇は、交換可能である；そして R₆またはR₁₀は、目的の生体分子と共役されている；ここで、該発光団は、(1)燐光部分、(2)発蛍光団または(3)(1)または(2)の前駆体であって、非燐光性または非蛍光性であるが、化学処理または酵素処理すると燐光部分または蛍光部分に転化できるもの、からなる群から選択される。２．前記スペーサーが、前記アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分の側鎖と前記発光団とのカップリングから得られる少なくとも１個の結合を含有し、該結合が、-NHCO-(アミド)、-CONH-(アミド)、-NHCOO-(カーバメート)、-O-、 -C＝N-O-、-S-、-S-S-、-NHCO-NH-(尿素)、-NHCSNH-(チオ尿素)、-C＝N-、-NH- 、-N＝N-、-COO-(エステル)、-C＝C-、-SO₂NH-(スルホンアミド)、-C≡C-、-OPO₃ -、-PO₃-、-OSO₃-および-SO₃-からなる群から選択される、請求項１に記載の化学発光標識共役物。３．前記発光団が、青領域から赤外領域までを含む発光スペクトルを生じることができる、請求項１に記載の化学発光標識共役物。４．前記発光団が、燐光部分、蛍光部分、および蛍光または燐光部分に転化できる蛍光または燐光部分前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の化学発光標識共役物。５．前記目的の生体分子が、ハプテン、配位子、多糖類、ポリペプチド、受容体、抗体および核酸からなる群から選択される、請求項１に記載の化学発光標識共役物。６．目的の生体分子との共役のための化学発光標識化剤であって、該化学発光標識化剤は、スペーサーを介して発光団に共有結合されたアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分を含有し、ここで、該スペーサーは、該部分から発生した励起種が該発光団にエネルギーを移動できるように、20個までのヘテロ原子を有し50オングストローム未満、好ましくは、12個までのヘテロ原子を有し30オングストローム未満、最も好ましくは、８個までのヘテロ原子を有し10オングストローム未満の線状、分枝状または環状のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、アルコキシル鎖またはアラルキル鎖を含有する第一側鎖であり、その結果、該発光団のスペクトル領域において、光の放射が生じ、該剤は、式(Ｉ)および(I I)を有する：ここで、 R₁、R₂またはR₃の１個は、第一側鎖に連結された発光団であり、ここで、該側鎖は、該アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分から発生した励起種が該発光団にエネルギーを移動できるように、20個までのヘテロ原子を有し50オングストローム未満、好ましくは、12個までのヘテロ原子を有し30オングストローム未満、最も好ましくは、８個までのヘテロ原子を有し10オングストローム未満の線状、分枝状または環状のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、アルコキシル鎖またはアラルキル鎖を含有し、その結果、該発光団のスペクトル領域において、光の放射が生じる； R₁が、第一側鎖に連結された発光団で置換されていないとき、R₁は、代替的に、必要に応じて20個までのヘテロ原子を含有するアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアラルキルである； R₂またはR₃が、第一側鎖に連結された発光団で置換されていないとき、R₂およびR₃は、代替的に、同一または異なり、それぞれ、式(Ｉ)に対するC₁ _〜4およびC₅ _〜8 および式(II)に対するC₁ _〜4およびC₆ _〜11での単一または複数の基であり、水素、置換または非置換アリール、ハライド、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、-R、-CN、-COOH、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R、-C(O)OR、-C( O)NHRおよび-NHC(O)Rからなる群から選択される； A^-は、対イオンである； Xは、窒素、酸素またはイオウである； Xが酸素またはイオウのとき、Zは省略され、そしてYは、次式の多置換アリール部分である：ここで、R₄およびR₈は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル(-OR )、アルキルチオール(-SR)、または立体効果および/または電子効果によって該アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核と該Y部分の間の-COX-結合を安定化するのに役立つ置換アミノ基である；さらに、R₄およびR₈は、同一または異なり得る；さらに、R₄およびR₈の１個は、該-COX-連鎖の安定性を著しく損なうことなく、水素であり得る； R₅およびR₇は、水素、置換または非置換アリール、ハライド、アミノ、ヒドロキシル、ニトロ、スルホネート、-R、-CN、-COOH、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C (O)R、-C(O)OR、-C(O)NHRおよび-NHC(O)Rからなる群から選択される； R₆は、-R₉-R₁₀であり、ここで、R₉は、第二側鎖であり、必須ではなく必要に応じて、分枝または直鎖アルキル、０個〜20個のヘテロ原子を含有する置換または非置換アリールまたはアラルキルであり得る、そして R₁₀は、Q-R-Nu、-Q-R-InNu-、-Q-Nu、-R-Nuおよび-Nuからなる群から選択される残基または残基に結合した求電子性官能基であり、ここで、ｎは、少なくとも１の数であり、Nuは、求核性基であり、Qは、官能性結合であり、Iは、イオン性基またはイオン化可能基である； Xが窒素のとき、Yは、(1)20個までの炭素原子および必要に応じて10個までのヘテロ原子を含有する分枝または直鎖アルキル基または(2)20個までの炭素原子を含有する置換または非置換アリール基またはヘテロアリール基である；Zは、- SO₂-Y'であり、Y'は、上記Yと同じように定義される；YおよびY'は、同一または異なる化学組成を有し得る； Rは、０個〜20個のヘテロ原子を含有するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択される； R₅、R₆およびR₇は、交換可能である；そして R₆またはR₁₀は、目的の生体分子と共役されることが可能である；ここで、該発光団は、(1)燐光部分、(2)発蛍光団または(3)(1)または(2)の前駆体であって、非燐光性または非蛍光性であるが、化学処理または酵素処理すると燐光部分または蛍光部分に転化できるもの、からなる群から選択される。７．前記スペーサーが、前記アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分の側鎖と前記発光団とのカップリングから得られる少なくとも１個の結合を含有し、該結合が、-NHCO-(アミド)、-CONH-(アミド)、-NHCOO-(カーバメート)、-O-、 -C＝N-O-、-S-、-S-S-、-NHCO-NH-(尿素)、-NHCSNH-(チオ尿素)、-C＝N-、-NH- 、-N＝N-、-COO-(エステル)、-C＝C-、-SO₂NH-(スルホンアミド)、-C≡C-、-OPO₃ -、-PO₃-、-OSO₃-および-SO₃-からなる群から選択される、請求項６に記載の化学発光標識化剤。８．前記発光団が、青領域から赤外領域までを含む発光スペクトルを生じることができる、請求項６に記載の化学発光標識化剤。９．前記発光団が、燐光部分、蛍光部分、および蛍光または燐光部分に転化できる蛍光または燐光部分前駆体からなる群から選択される、請求項８に記載の化学発光標識化剤。 10．R₁₀が、前記第一側鎖に結合され、かつ前記目的の生体分子にカップリングされており、そしてR₆が、水素またはR₉である、請求項１に記載の化学発光標識共役物。 11．(a)前記発光団が、前記第一側鎖を介して、直接または間接に、前記アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核に共有結合されており、そしてR₁₀を介して、前記目的の生体分子に共有結合されており、そして(b)R₆が、水素またはR₉ である、請求項１に記載の化学発光標識共役物。 12．R₆が、前記目的の生体分子に結合されており、その位置が、R₁、R₂またはR₃ の位置と交換されており、該R₁、R₂またはR₃が、発光団なしの置換基である、請求項１に記載の化学発光標識共役物。 13．前記第一側鎖が、前記アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分の前記側鎖と前記発光団とのカップリングから得られる少なくとも１個の結合を含有し、該結合が、-NHCO-(アミド)、-CONH-(アミド)、-NHCOO-(カーバメート)、-O- 、-C＝N-O-、-S-、-S-S-、-NHCO-NH-(尿素)、-NHCSNH-(チオ尿素)、-C＝N-、-NH -、-N＝N-、-COO-(エステル)、-C＝C-、-SO₂NH-(スルホンアミド)、-C≡C-、-OP O₃-、-PO₃-、-OSO₃-または-SO₃-を含有する、請求項６に記載の化学発光標識化剤。 14．前記発光団が、青領域から赤外領域までを含む発光スペクトルを生じることができる、請求項６に記載の化学発光標識化剤。 15．前記発光団が、燐光部分、蛍光部分、および蛍光または燐光部分に転化できる蛍光または燐光部分前駆体からなる群から選択される、請求項14に記載の化学発光標識化剤。 16．前記目的の生体分子が、ハプテン、配位子、多糖類、ポリペプチド、受容体、抗体および核酸からなる群から選択される、請求項６に記載の化学発光標識化剤。 17．R₁₀が、前記第一側鎖に結合され、かつ前記目的の生体分子にカップリングでき、そしてR₆が、水素またはR₉である、請求項６に記載の化学発光標識化剤。 18．R₁₀が、前記発光団に結合されており、該発光団が、一端にて、前記第一側鎖を介して、前記アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核に共有結合されており、そして他端にて、R₁₀を介して、前記目的の生体分子にカップリングでき、そしてR₆が、水素またはR₉である、請求項６に記載の化学発光標識化剤。 19．R₆が、前記目的の生体分子に結合されることができ、その位置が、R₁、R₂またはR₃の位置と交換されており、該R₁、R₂またはR₃が、発光団なしの置換基である、請求項６に記載の化学発光標識化剤。 20．以下を包含する結合アッセイ： a．分析物と少なくとも１個の化学発光標識化合物または高分子とを接触させること、および b．(1)該分析物と該化学発光標識化合物または高分子との間の結合度あるいは (2)捕捉分子からの該化学発光標識または高分子化合物の競合置換または相互排除のいずれかを決定すること；該方法は、該化学発光標識化合物または高分子が、請求項１に記載の化学発光標識共役物であることにより特徴付けられる。 21．少なくとも２個の分析物が、少なくとも２個の異なる化学発光標識化化合物を用いて決定され、該化合物の少なくとも１個が、前記化学発光共役物であり、該化合物または共役物のそれぞれが、識別可能な発光スペクトルを有する、請求項20に記載の結合アッセイ。 22．３個の分析物が、３個の異なる化学発光標識化化合物を用いて決定され、該化合物の少なくとも１個が、前記化学発光共役物であり、該化合物または共役物のそれぞれが、識別可能な発光スペクトルを有する、請求項21に記載の結合アッセイ。 23．前記分析物の前記決定が、同じ反応媒体中にて同時に実施できる、請求項20 に記載の結合アッセイ。 24．試験試料中の少なくとも１個の分析物の存在を決定するための試験キットであって、該試験キットは、識別可能な発光スペクトルを有する請求項１に記載の化学発光標識共役物の少なくとも１個の容器を包含する。 25．さらに、化学発光標識化合物の容器を包含し、前記化合物および前記共役物のそれぞれが、識別可能な発光スペクトルを有する、請求項24に記載の試験キット。 26．請求項６に記載の化学発光標識化剤を、調製するための方法であって、該方法は、第一側鎖を介して、活性化発光団をアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核に共有結合することを包含する。 27．前記第一側鎖が、０個〜20個のヘテロ原子を含有し50オングストローム長未満の線状、分枝状または環状のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、アルコキシル鎖またはアラルキル鎖である、請求項26に記載の方法。 28．前記第一側鎖が、０個〜12個のヘテロ原子を含有し30オングストローム長未満である、請求項27に記載の方法。 29．前記第一側鎖が、０個〜8個のヘテロ原子を含有し10オングストローム長未満である、請求項28に記載の方法。 30．前記第一側鎖が、前記アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分の側鎖と前記発光団とのカップリングから得られる少なくとも１個の結合を含有し、該結合が、-NHCO-(アミド)、-CONH-(アミド)、-NHCOO-(カーバメート)、-O-、-C ＝N-O-、-S-、-S-S-、-NHCO-NH-(尿素)、-NHCSNH-(チオ尿素)、-C＝N-、-NH-、- N＝N-、-COO-(エステル)、-C＝C-、-SO₂NH-(スルホンアミド)、-C≡C-、-OPO₃- 、-PO₃-、-OSO₃-または-SO₃-を含有する、請求項26に記載の方法。 31．請求項１に記載の化学発光標識共役物を、製造するための方法であって、該方法は、(a)目的の生体分子をアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分のR₆に共有結合し、次いで、該アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分の第一側鎖を活性化発光団に共有結合すること、または(b)該アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分の該第一側鎖に活性化発光団を共有結合し、次いで、該アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分のR₆を該目的の生体分子に共有結合することを包含する。 32．請求項１に記載の化学発光標識共役物を、製造するための方法であって、該方法は、目的の生体分子をアクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分の多置換アリール部分に共有結合すること、次いで、第一側鎖を介して、該アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム部分を発光団に共有結合することを包含する。 33．前記第一側鎖が、０個〜20個のヘテロ原子を含有し50オングストローム長未満の線状、分枝状または環状のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、アルコキシル鎖またはアラルキル鎖である、請求項32に記載の方法。 34．前記第一側鎖が、０個〜12個のヘテロ原子を含有し30オングストローム長未満である、請求項33に記載の方法。 35．前記第一側鎖が、０個〜８個のヘテロ原子を含有し10オングストローム長未満である、請求項34に記載の方法。 36．前記第一側鎖が、前記アクリジニウムまたはベンズアクリジニウム核の官能基化側鎖と前記官能基化発光団とのカップリングから得られる少なくとも１個の結合を含有する、請求項32に記載の方法。 37．前記結合が、-NHCO-(アミド)、-CONH-(アミド)、-NHCOO-(カーバメート)、- O-、-C＝N-O-、-S-、-S-S-、-NHCO-NH-(尿素)、-NHCSNH-(チオ尿素)、-C＝N-、- NH-、-N＝N-、-COO-(エステル)、-C＝C-、-SO₂NH-(スルホンアミド)、-C≡C-、 -OPO₃-、-PO₃-、-OSO₃-または-SO₃-を含有する、請求項36に記載の方法。