ES2206927T3 - Conjugados de transferencia de energia qumioluminiscente y sus aplicaciones como marcadores en pruebas de union. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una nueva clase de compuestos quimioluminiscentes de acridinium o benzacridinium por medio de la formación de un conjugado de transferencia de energía intramolecular (ETC) entre los compuestos de acridinium o benzacridinium y un luminóforo. La invención también se refiere a un procedimiento para ampliar las longitudes de onda de emisión de los ésteres de acridinium o benzacridinium para reducir más o eliminar la emisión espectral de solape entre los ésteres de acridinium (DMAE) y los ésteres de benzacridinium (LEAE) polisustituidos progenitores. Los ETCs retienen las propiedades asociadas únicas de los compuestos de acridinium y benzacridinium incluyendo la emisión completa de luz en un muy corto periodo de tiempo, espectro de emisión monofásica, simplicidad de iniciar el mecanismo, posibilidad de marcar las moléculas biológicas de interés para formar un trazador y una buena estabilidad. Además, el intervalo del espectro de emisión de un compuesto de acridinium o benzacridinium se puede ahora desviar a voluntad y con un mayor salto a través de la elección de un luminóforo como parte integral de una molécula ETC. La invención se refiere a conjugados quimioluminiscentes marcados que incluyen un medio de acridinium o benzacridinium covalentemente unido a un luminóforo a través de un espaciador, el citado elemento está además conjugado a una molécula de interés, en la que dicho espaciador es de una longitud apropiada para permitir que las citadas especies excitadas generadas por este medio transfieran energía suficiente al citado luminóforo, resultando la emisión de luz en la región espectral del citado luminóforo. La invención también se refiere a ensayos de unión empleando los citados conjugados, kits de comprobación que incluyen los citados conjugados y procedimientos para preparar los conjugados.

Description

Conjugados de trasferencia de energía quimioluminiscente y sus aplicaciones como marcadores en pruebas de unión.

Antecedentes de la invención

Esta invención se relaciona con nuevos conjugados de transferencia de energía ("ETC") o con agentes de marcaje que consisten en un derivado quimioluminiscente de acridinio o benzacridinio covalentemente unido a un luminóforo. Esta invención se relaciona también con una clase de ETC con espectros de longitud de onda de emisión que son distintivamente diferentes de los de los derivados quimioluminiscentes de acridinio o benzacridinio o que se solapan mínimamente con ellos. Esta invención se relaciona también con la nueva aplicación de ETC como marcaje quimioluminiscente en la determinación de analitos en una muestra, tal como en pruebas diagnósticas.

Desde el desarrollo del éster de arilacridinio polisubstituido (DMAE en US #4.745.181) y sus derivados, tales como el DMAE 3-metoxi-substituido, el éster de benz[b]acridinio (LEAE en US #5.395.752) y el éster de 2-metoxibenz[b]acridinio con máximas de longitud de onda de emisión que son 6 nm más cortas o 96 nm y 122 nm más largas que la del DMAE parental (máximo de emisión de 428 nm), continuamos nuestra investigación para identificar nuevos compuestos de acridinio y sus síntesis, particularmente los que prolongan la longitud de onda de emisión de los compuestos de acridinio, incluyendo específicamente el DMAE y, en general, sus análogos conocidos, por ejemplo los ésteres relativamente estables de acridinio con un resto fenoxi mono-orto-substituido (EP 0609885A1; M. Kawaguichi y col., "Stabilized Phenyl Acridinium Esteres for Chemiluminiscent Immunoassay-Bioluminiscence and Chemiluminiscence, Proceedings of 9^{th} International Symposium 1996", editado por Hastings, Kricka y Stanley, John Wiley & Sons, 1997, pp. 480-484), y las acridinio sulfonamidas (US #5.468.646). El propósito último de la investigación es a) mejorar o eliminar el solapamiento espectral de emisión mínimo entre DMAE y LEAE, b) descubrir otro marcaje quimioluminiscente para biomoléculas que tenga una longitud de emisión más larga que la del LEAE y que se solape mínimamente con este último y c) aumentar el rendimiento cuántico del DMAE. Cualesquiera esfuerzos hacia estos fines deben proceder bajo el prerrequisito de que los nuevos marcajes quimioluminiscentes emitirán luz en las mismas condiciones de activación. El cumplimiento del objetivo (a) eliminaría la necesidad de aplicar la rutina de corrección de interferencia en los ensayos de unión de doble analito que emplean los marcajes duales de DMAE y LEAE. Alcanzando el objetivo (b), se dispondría de un tercer marcaje quimioluminiscente para el desarrollo de ensayos de unión de triple analito. El objetivo (c) representa una de las posibles aproximaciones que se basa en el razonamiento de que compuestos quimioluminiscentes de emisión más larga tendrán un estado de menor energía, de aquí que se aumentará la probabilidad de poblar la especie de estado excitado químicamente convertida para permitir un mayor rendimiento cuántico global.

Para el diseño de derivados de acridinio capaces de emitir luz a cualquier rango espectral deseado, la presente invención adoptó el conocido concepto general de la transferencia de energía. A diferencia de muchos ejemplos descritos de transferencia de energía intermolecular que implica dos moléculas independientes donante y aceptora, donde la donante puede ser un compuesto quimioluminiscente o un luminóforo y la aceptora es siempre un luminóforo, tenemos nuestro nuevo diseño de unión del compuesto de acridinio y del luminóforo aceptor entre sí en una molécula para conseguir una transferencia de energía intramolecular más eficiente. Al hacerlo, podemos canalizar de manera efectiva la energía química generada en el resto de acridinio al resto de luminóforo seleccionado, de tal forma que este último pueda ser excitado y emitir luz en su rango característico y deseado de longitud de onda. Con respecto a los objetivos de diseño de operar únicamente dentro del sistema de los compuestos quimioluminiscentes de acridinio y a los requerimientos de alta sensibilidad (femtomolar, fM) en medios acuosos, rápida producción (en unos cuantos segundos) de luz, emisión monofásica (lo que significa sólo un máximo de emisión) y máximos de emisión más largos, existen algunas diferencias entre los fenómenos de transferencia de energía inter- e intramoleculares y deben citarse como sigue:

M.M. Rauhut y col. [J. Amer. Chem. Soc., 89, 6515 (1967)] describieron por primera vez la transferencia de energía intermolecular observada en la quimioluminiscencia generada por las reacciones de oxalatos de arilo electronegativamente substituidos con peróxido de hidrógeno y compuestos fluorescentes. Dado que, en general, la efectividad de la transferencia de energía disminuye a razón de la sexta potencia de la distancia entre el donante y el aceptor [en otras palabras, las moléculas donante y aceptora deben estar dentro de una distancia de <10 nm para dar un 20-100% de eficacia de transferencia; véase Clin. Chem., 29 (9), 1604 (1983), y Am. Rev. Biochem., 47, 819 (1978)], se requiere una concentración milimolar (mM, 10^{12} veces mayor que el requerimiento) del aceptor. Más aún, existen otros varios inconvenientes en el sistema quimioluminiscente de peroxalato que lo hacen inadecuado para uso en ensayos biológicos. Estos inconvenientes incluyen una larga duración (> un minuto) para la emisión total de luz, una menor estabilidad del oxalato en medios acuosos y la necesidad de un solvente orgánico para estabilizar el fluoróforo.

De forma similar, J. Hadjianestis [J. Photochem. Photobiol., A: Chem., 69, 337 (1992] describió una transferencia de energía menos que cuantitativa (79%) entre el luminol quimioluminiscente y la fluoresceína. Para conseguir el máximo resultado, se requieren tanto donante como aceptor para alcanzar una concentración sólo micromolar (\muM, 10^{9} veces superior a lo requerido), debido al efecto de concentración de un surfactante, CTAC. Sin embargo, el perfil bifásico de los espectros de emisión generados por este sistema de luminol/fluoresceína, que se extiende ampliamente de 350 a 600 nm, lo hace inadecuado para un ensayo de unión de múltiples analitos altamente sensible.

Otras observaciones descritas de la transferencia de energía intermolecular incluyen cis-dietoxi-1,2-dioxetano a perileno [T. Wilson y col., J. Amer. Chem. Soc., 93 (17), 4126 (1971)] y N-metilacridona a lucigenina [A.E. Mantaka-Marketou y col., J. Photochem. Photobiol., A: Chem., 48, 337 (1989); A. Larena y col., Monatshefte Chemie, 122, 697 (1991); K. Papadopoulos y col., J. Photochem. Photobiol., A: Chem., 75, 91 (1993)]. Aparte de la necesidad de altas concentraciones (\muM a mM) del aceptor, los artículos se dirigieron a la elucidación de la transferencia de energía y a los estudios mecánicos sobre la quimioluminiscencia de los sistemas de dioxetano y lucigenina. No se sugirió ninguna aplicación del fenómeno de transferencia de energía a ensayos de unión altamente sensibles.

La aplicación de los fenómenos de transferencia de energía intermolecular a inmunoensayos fue descrita por primera vez por A. Patel y col. [Clin. Chem., 29 (9), 1604 (1983)]. Se desarrolló un inmunoensayo de tipo homogéneo utilizando la propiedad de unión específica de un hapteno conjugado con un derivado de isoluminol quimioluminiscente (ABEI) y un anticuerpo marcado con fluoresceína. Como se añadió cada reactivo a la mezcla de ensayo a concentraciones nanomolares (nM) que eran marginales para que se observara transferencia de energía intermolecular entre los restos de isoluminol y fluoresceína, es sólo a través de la mediación de un complejo específico formado entre el conjugado de hapteno y el conjugado de anticuerpo que las moléculas donantes/aceptoras tienen la posibilidad de quedar en estrecha proximidad para permitir que se produzca la transferencia de energía. Este método de inmunoensayo es único en este sentido. Sin embargo, este método sufre inconvenientes principales de utilidad limitada, baja sensibilidad del ensayo (>10^{10} moléculas de analito/prueba) inherente a un formato de ensayo homogéneo e interferencia con la alta señal de fondo que se origina del donante de energía debido a la incompleta transferencia de energía. Además, la exactitud de la determinación del analito tiene que depender de las razones de señales tomadas a partir de la señal decreciente del donante y la señal creciente del aceptor de la mezcla de ensayo que tienen solapamiento espectral significativo.

L.E. Morrison y col. (Solicitud de Patente EP #0070686 A2) muestran un principio inmunoquímico de mayor luminiscencia (enzimática) para detectar antígenos con múltiples sitios de unión empleando transferencia de energía intermolecular desde un substrato de luminol hasta un fluoróforo conjugado a anticuerpo. Esta arquitectura de ensayo más bien compleja contiene también catalasa y una glucosa oxidasa conjugada a anticuerpo como reactivos necesarios. Los conjugados de anticuerpos unidos a antígenos operan juntos en estrecha proximidad para producir una señal específica utilizando los cofactores generados (H_{2}O_{2}) o presentes (luminol) en su vecindad y disponiendo del aceptor de energía requerido. La catalasa sirve como depurador para la porción de H_{2}O_{2} que se difunde del complejo antígeno/anticuerpo, minimizando así la quimioluminiscencia de fondo producida por el luminol en solución, que está demasiado lejos como para ser transferida con eficacia al fluoróforo. No se facilitaron ejemplos de ensayo para demostrar que el concepto es funcional.

Minister van Welzijn (solicitud de Patente NL #8703075A) describió derivados de éster de 10-carboxialquilacridinio y sugirió su conjugación a un anticuerpo o antígeno para uso en un ensayo homogéneo, en base al principio de transferencia de energía intermolecular de quimioluminiscencia descrito por Patel. No se dio ningún ejemplo de ensayo funcional.

En el campo de la transferencia de energía intramolecular, se puede identificar y distinguir la técnica anterior relacionada a partir de lo siguiente:

Se publicaron diversos artículos relacionados concernientes a conjugados de transferencia de energía intramolecular entre el luminol o benzluminol quimioluminiscentes y otros cuatro fluoróforos, a saber, difenilantraceno, benzcarbazol, acridona y benzacridona [E.H. White y col., J. Amer. Chem. Soc., 89, 3944 (1967); E.H. White y col., Mol. Lumin. Int. Conf., 479 (1969), Ed. E. Lim, Publicación W.A. Benjamin Inc., N.Y.; D.F. Roswell y col., J. Amer. Chem. Soc., 92, 4855 (1970); D.R. Roberts y col., J. Amer. Chem. Soc., 92, 4861 (1970); M.A. Ribi y col., Tetrahedron, 28, 481 (1972)]. Los rendimientos cuánticos de dichos conjugados en medios acuosos son todos significativamente inferiores al del luminol parental, variando entre un 26%, 4,4%, 8% y aproximadamente 13% del rendimiento cuántico del luminol, respectivamente. No se sugiere aplicación alguna de estos derivados de luminol en pruebas diagnósticas.

Schaap y col. (WO #90/07511) describieron otro sistema de transferencia de energía intramolecular que implicaba la conjugación de adamantanildioxetanos con fluoróforos, donde el resto de dioxetano está substituido con un grupo escindible X (por ejemplo, fosfato) y, al desaparecer X, lo cual puede producirse por activación enzimática o química, se desprende una mayor quimioluminiscencia. Se dijo que la especie emisora de luz original, el 3-hidroxibenzoato de metilo ("MHB"), que se separa del adamantanildioxetano nativo durante el proceso de quimioluminiscencia, es inherentemente un emisor de luz muy pobre en medios acuosos. Ligando un fluoróforo a MHB, se puede transferir la energía de excitación del MHB al fluoróforo, que tiene una emisión de luz mucho mejor en medios acuosos y da lugar a un aumento del rendimiento cuántico absoluto de desde un 0,017% hasta aproximadamente un 1-2% en presencia de surfactante CTAB. Los usos de este dioxetano estable ligado a fluoróforo no estaban claramente descritos ni reivindicados en la solicitud. Más aún, sólo se aludía brevemente a su utilidad en inmunoensayos ligados a enzimas y sondas de ADN unidas a enzimas, así como en marcajes directos químicamente activables para biomoléculas, en la sección Campo de la Invención. Como en la solicitud de patente relacionada previa sobre otros dioxetanos estables de Bronstein (WO 88/00695), el dioxetano estable ligado a fluoróforo de Schaap hallará muy probablemente uso como substrato para trazadores unidos a enzimas o sondas en ensayos de unión para obtener una mayor quimioluminiscencia. Para este tipo de utilización, sin embargo, Schaap no dio ninguna descripción en cuanto a cómo se puede diseñar un sistema de ensayo de múltiples analitos y ciertamente no sería posible, a menos que se dispusiera y se demostraran claramente diferentes sistemas de enzima-substrato que no interaccionen entre sí. Más aún, la sugerencia de un uso alternativo de este dioxetano estable ligado a fluoróforo como marcaje directo para biomoléculas carece también de evidencia de soporte, ya que, en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones de la estructura general del dioxetano ligado a fluoróforo, no se pueden encontrar disposiciones en cuanto a un grupo funcional específico que hiciera posible su marcaje directo de las biomoléculas. La sugerencia puede ser significativa sólo si se puede preparar dicho conjugado de biomoléculas y demostrar su estabilidad. Adicionalmente, aunque el conocido dioxetano estable con el grupo escindible X es un medio muy útil para la amplificación de señal cuando sirve como substrato para un trazador ligado a enzima, presenta el inconveniente de una lenta emisión de luz debido no sólo al tiempo de retardo necesario (20 min. o más) en la escisión enzimática de X, sino también al lento proceso de desintegración (t_{1/2} mayor de un min.) que comienza con la escisión de X y acaba con la emisión de luz.

Resumen de la invención

Se describe una nueva clase de compuestos quimioluminiscentes de acridinio o benzacridinio en virtud de la formación de un conjugado de transferencia de energía ("ETC") intramolecular entre el compuesto de acridinio o benzacridinio y un luminóforo. Se describe aquí un método de ampliación de las longitudes de onda de emisión de ésteres de acridinio o benzacridinio para reducir aún más o eliminar el solapamiento espectral de emisión entre los ésteres de acridinio ("DMAE") y los ésteres de benzacridinio ("LEAE") polisubstituidos parentales. Los ETC conservan las propiedades únicas deseadas de los compuestos de acridinio o benzacridinio, incluyendo la emisión completa de luz en un período de tiempo muy corto, el espectro de emisión monofásico, la simplicidad del mecanismo de activación, la capacidad de marcaje de las moléculas biológicas de interés para formar un trazador y una buena estabilidad. Adicionalmente, el rango del espectro de emisión de un compuesto de acridinio o benzacridinio puede ahora ser cambiado a voluntad y en un salto más largo mediante la elección de un luminóforo como parte integral de una molécula ETC.

También se ha determinado que toda la transferencia de energía es altamente efectiva independientemente de qué peri-posición en el núcleo de acridinio o benzacridinio esté anclada con el luminóforo. Efectuando el anclaje covalente de un luminóforo en estrecha proximidad en cualquiera de las peri- posiciones del núcleo de acridinio o benzacridinio, se ha demostrado que el ETC opera convirtiendo primeramente su resto de acridinio o benzacridinio en una nueva especie (el estado excitado de la acridona o benzacridona) por el conocido tratamiento con peróxido/hidróxido. La acridona o benzacridona excitada puede entonces transferir eficazmente su energía al resto de luminóforo como medio de excitación del luminóforo y hacer que el luminóforo emita luz en su región característica del espectro.

Con la disponibilidad de los ETC, los ensayos de unión de doble marcaje pueden resultar igualmente precisos incluso en ausencia de una rutina de corrección de interferencia, debido al solapamiento espectral mínimo entre las dos especies emisoras. Un mayor cambio de emisión a una longitud de onda más larga significa también que es posible un ensayo de triple marcaje, debido a la demostración del espectro de emisión trifásico resultante del destello simultáneo de la mezcla del presente ETC y los DMAE y LEAE previamente descritos. En caso de observar aún un resto de emisión de luz de longitud de onda más corta procedente del ETC debido a una incompleta transferencia de energía del resto de acridona excitado al resto de luminóforo, la interferencia resultante con la precisión del ensayo de doble marcaje es sólo unidireccional y se puede corregir por simple resta en el canal de longitud de onda más corta de la porción de señal contribuida por el ETC. Se puede hacer la corrección aplicando la razón predeterminada de intensidad de emisión de la señal de longitud de onda más corta en relación a la señal de longitud de onda más larga en el ETC. Dicha corrección, sin embargo, reduce el rango dinámico de la razón de concentración mensurable de los dos componentes en el ensayo de doble marcaje. Es, por lo tanto, importante que la transferencia de energía sea casi completa. Este requerimiento se cumple mediante los compuestos descritos en esta solicitud.

En consecuencia, es un objeto primario de la invención disponer de ETC quimioluminiscentes basados en acridinio o benzacridinio con una longitud de onda de emisión más flexible y con mayor cambio de la luz azul a la proximidad al infrarrojo.

Otro objeto de la invención es ofrecer métodos para la síntesis de ETC quimioluminiscentes basados en acridinio o benzacridinio y productos intermediarios que pueden ser usados para sintetizar dichos compuestos quimioluminiscentes.

Otro objeto de la invención es proporcionar conjugados ETC formados entre ETC directa o indirectamente con compañeros de unión o moléculas biológicas, algunos de las cuales se incluyen en virtud de su función, tales como haptenos, ligandos, receptores y anticuerpos, mientras que otros se incluyen en virtud de su naturaleza química, tales como polisacáridos, polipéptidos y ácidos nucleicos.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un ETC hidrofílico que lleva uno o más grupos iónicos y/o ionizables con o sin, adicionalmente, los grupos funcionales reactivos útiles para formar unión covalente con otras micro- o macromoléculas o encapsulación en el interior de liposomas.

Otro objeto de la invención es facilitar ensayos que implican el uso de conjugados ETC.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un ensayo de marcaje multiquimioluminiscente simultáneo.

Otro objeto de la invención es facilitar un método para la detección y/o cuantificación simultáneas de al menos dos substancias en una muestra de ensayo mediante el uso de al menos dos compuestos o conjugados quimioluminiscentes diferentes, uno o más de los cuales se asocian a ETC, teniendo cada uno de ellos espectros de emisión discernibles.

Otro objeto de la invención es proporcionar ensayos de múltiples analitos en donde se puede llevar a cabo la determinación de dos o más analitos o substancias o combinaciones de éstos presentes en la muestra como mezcla simultáneamente en el mismo medio de reacción o tubo de transferencia debido a las señales de luz que no interfieren mutuamente o que tienen un mínimo solapamiento, pero que son corregibles, producidas por el mismo tratamiento químico de dos o más trazadores o compuestos quimioluminiscentes diferentes, uno o más de los cuales se asocian a ETC.

Aún otro objeto de la invención es ofrecer kits de ensayo que tienen dos o más reactivos quimioluminiscentes, uno o más de los cuales contienen marcajes ETC, para estudiar simultáneamente al menos dos substancias en una muestra de ensayo.

A la vista de éstos y de otros objetos, como se darán cuenta los expertos en la técnica, la invención radica en la combinación de elementos expuesta en la descripción y amparada por las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Las Figs. 1A-1L son espectros de emisión determinados en un sistema de Barrido Espectral Rápido de los ETC correspondientes a Rodamina-2-AM-DMAE-Bz, Rodamina-2-AM-DMAE-CO_{2}H, Rojo Texas-2-AM-DMAE-CO_{2}H, CNF-2-AM-DMAE- CO_{2}H, Rojo Texas-3-AM-DMAE-CO_{2}H, Rodamina-3-AM-DMAE-\beta-Alanina, Rojo Texas-3-AM-DMAE-\beta-Alanina, Rojo Texas-ED-NCM-DMPAE, Rojo Texas-ED-NSP-DMPAE, Rodamina-2-AM-DMAE-HD-Teofilina, Rojo Texas-3-APO-DMAE-Bz y Rojo Texas-3-ABO-DMAE-Bz.

Las Figs. 1M y 1N son los espectros de emisión de los compuestos de referencia, DMAE-Bz y 2-MeO-LEAE-Bz.

La Fig. 1O es el espectro de emisión de la mezcla de DMAE-Bz y Rodamina-2-AM-DMAE-Bz.

La Fig. 1P es el espectro de emisión de la mezcla de DMAE-Bz, 2-MeO-LEAE-Bz y CNF-2-AM-DMDE-CO_{2}H.

La Fig. 2 es el perfil de transmitancia del filtro OG 550 de Schott.

La Fig. 3 es la eficacia de detección del tubo fotomultiplicador R268 (catálogo Hamamatsu).

La Fig. 4 es la eficacia de detección del dispositivo Acoplado a Carga retroiluminado ("CCD" adelgazado).

La Fig. 5 es la estructura del trazador DMAE-ED-Teofilina.

La Fig. 6 es una comparación de las curvas patrón del ensayo de teofilina ACS de Ciba-Corning Diagnostics Corp., resultantes del uso de los trazadores DMAE-ED-Teofilina y Rodamina-2-AM-DMAE-HD-Teofilina, respectivamente.

La Fig. 7 es la estructura del trazador NSP-DMAE-HD-3-CMO-Cortisol.

La Fig. 8 es el espectro de transmisión del filtro Corion LL-550.

La Fig. 9 es el espectro de transmisión del filtro Corion LS-450.

La Fig. 10 es una curva patrón de teofilina determinada en una mezcla de ensayo de patrones de teofilina y cortisol.

La Fig. 11 es una curva patrón de cortisol determinada en una mezcla de ensayo de patrones de teofilina y cortisol.

La Fig. 12 muestra varios constructos de los conjugados marcados quimioluminiscentes.

Descripción de la realización preferida A. Estructuras y organización general de los ETC

Los ETC basados en acridinio o benzacridinio de la presente invención contienen un resto de acridinio o benzacridinio conjugado con un luminóforo a través de un espaciador. (Para una mayor claridad de la descripción, "resto de acridinio o benzacridinio" en la presente solicitud significa una parte de la Fórmula I o II, respectivamente, que no incluye el resto luminóforo, por ejemplo la Fórmula I y II excluyendo el lumíforo, que se localizaría en la posición R_{1}, R_{2} o R_{3}, mientras que "núcleo de acridinio o benzacridinio" significa aquella parte de la Fórmula I o II que está enmarcada dentro de las líneas discontinuas). El luminóforo (descrito más completamente a continuación) puede anclarse así a cualquiera de las peri-posiciones representadas por los substituyentes R_{1}, R_{2} y R_{3} del núcleo de acridinio o benzacridinio en las siguientes estructuras generales de ETC:

1

donde R_{1}, R_{2} o R_{3} representan -Sp-Lumi y Lumi es un resto luminóforo que sirve como aceptor de energía y Sp representa un espaciador o una primera cadena lateral que tiene una cadena lineal, ramificada o cíclica de alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo o aralquilo de menos de 50 Angstroms con hasta 20 heteroátomos, preferiblemente de menos de 30 Angstroms con hasta 12 heteroátomos y más preferiblemente de menos de 10 Angstroms con hasta 8 heteroátomos. Los términos "espaciador" y "cadena lateral" serán usados indistintamente en esta solicitud. La longitud de la cadena lateral entre el lumíforo y el núcleo de acridinio o benzacridinio es seleccionada de tal forma que sea una longitud apropiada para permitir que la forma excitada de la acridona o benzacridona resultante transfiera energía de forma más o menos completa a dicho lumíforo, dando lugar a la emisión de luz en el rango espectral del lumíforo. Preferiblemente, el espaciador contiene al menos una unión funcional resultante del acoplamiento de las cadenas laterales funcionalizadas del núcleo de acridinio o benzacridinio y el luminóforo funcionalizado. Dichas uniones funcionales incluyen, aunque sin limitación, las siguientes uniones comúnmente halladas: -NHCO- (amida),
-CONH- (amida), -NHCOO- (carbamato), -O- (éter), -C=N-O- (éter de oxima), -S- (tioéter o sulfuro), -S-S- (disulfuro), -NHCO-NH- (urea), -NHCSNH- (tiourea), -C=N- (imino), -NH- (amino), -N=N- (diazo), -COO- (éster), -C=C- (vinilo, alquenilo u olefina) y -SO_{2}NH- (sulfonamida), -C=C- (alquinilo), -OPO_{3}-, -PO_{3}-, -OSO_{3}- y -SO_{3}-.

Los métodos de formación de las anteriores uniones funcionales son bien conocidos para los expertos en la técnica y han sido registrados en los libros de texto de Química Orgánica, por ejemplo en Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, Ed. I-IV, de Jerry March.

Lumi representa un luminóforo, que incluye, para los fines de la presente invención (1) un resto fosforescente, (2) un fluoróforo o (3) el precursor de (1) o (2), que es no fosforescente o no fluorescente, pero convertible en un resto fosforescente o fluorescente por tratamiento químico o enzimático. Los luminóforos adecuados para los fines de la presente invención pueden ser los productos comerciales conocidos y existentes o cualquier nuevo compuesto luminiscente futuro capaz de producir espectros de emisión que cubran desde la región del azul hasta la del infrarrojo (IR). Preferiblemente, los luminóforos pueden ser o haber sido funcionalizados en una posición que no afectaría a su capacidad de emisión de luz y pueden sobrevivir a las condiciones transitorias de bajo y alto pH que se requerirían durante el destello del resto de acridinio o benzacridinio con los que se acoplan los luminóforos.

Cuando uno de los substituyentes del núcleo de acridinio o benzacridinio, es decir, R_{1}, R_{2} o R_{3}, es como se ha descrito antes, los otros dos substituyentes representan lo siguiente:

R_{1}, si no está substituido con -Sp-Lumi, puede ser alternativamente un alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo que contiene eventualmente hasta 20 hetero- átomos.

R_{2} y R_{3}, si no están substituidos con -Sp-Lumi, son alternativamente grupos idénticos o diferentes, simples o múltiples, en C_{1-4} y C_{5-8} para la fórmula (I) y en C_{1-4} y C_{6-11} para la fórmula (II), respectivamente, seleccionados entre hidrógeno, arilo substituido o no substituido (ArR o Ar), haluro, amino, hidroxilo, nitro, sulfonato, -R, -CN, -COOH, -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR o -NHC(O)R.

Por ejemplo, en el Esquema I, en la Rodamina-2-AM-DMAE-Bz, R_{2} es el substituyente que contiene Sp-Lumi, donde Sp y Lumi son como se muestra a continuación, mientras que R_{1} es metilo y R_{3} es hidrógeno.

2

Además, en el Esquema VIII, en Rojo Texas-ED-NCM-DMPAE, R_{1} es Sp-Lumi (mostrado a continuación), mientras que R_{2} y R_{3} son hidrógenos.

3

A^{-} es un contraión que introduce para emparejarse con el nitrógeno cuaternario de las moléculas ETC como resultado de la cuaternización del nitrógeno del anillo de acridina o de benzacridina mediante el uso de agentes alquilantes (por ejemplo, Esquema I) durante la síntesis, la modificación de la cadena lateral R_{1} (por ejemplo, Esquemas II y IX) o los posteriores mecanismos de intercambio que se producen durante la manipulación de las mezclas de reacción y la purificación de los compuestos deseados (por ejemplo, Esquemas I, II, V, VI, VIII y IX) en una solución o fluido que contiene una cantidad en exceso de otros aniones. CH_{3}SO_{4}^{-}, FSO_{3}^{-}, CF_{3}SO_{3}^{-}, C_{4}F_{9}SO_{4}^{-}, CH_{3}C_{6}H_{4}SO_{3}^{-}, haluro, CF_{3}COO^{-}, CH_{3}COO^{-}, NO_{3}^{-} y fosfato.

X es nitrógeno, oxígeno o azufre.

Cuando X es oxígeno o azufre, Z está omitido e Y es un resto de arilo polisubstituido de fórmula:

4

donde R_{4} y R_{8} son grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo (-OR), alquiltiol (-SR) o amino substituido que sirven para estabilizar la unión -COX- entre el núcleo de acridinio o benzacridinio y el resto Y a través de un efecto estérico y/o electrónico. Adicionalmente, R_{4} y R_{8} pueden ser iguales o diferentes; más aún, uno de R_{4} y R_{8} puede ser hidrógeno sin comprometer seriamente la estabilidad de la unión -COX-.

R_{5} y R_{7} son cualquiera de los R_{2} y R_{3} antes definidos;

R_{6} = -R_{9}-R_{10}, conteniendo el substituyente clave el grupo funcional necesario para la conjugación a la molécula biológica de interés,

donde R_{9} es una segunda cadena lateral, no necesaria pero que eventualmente puede ser un alquilo ramificado o de cadena lineal o un arilo o aralquilo substituido o no substituido que contiene eventualmente hasta 20 heteroátomos y R_{10} es un grupo saliente o un grupo funcional electrofílico unido a un grupo saliente, incluyendo:

5

un haluro, -COOH, -Q-R-Nu, -Q-R-(I)nNu-, -Q-Nu-, -R-Nu o -Nu, donde n es un número de al menos 1; Q es -O-, -S-, -N-, -

\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}

-, -NH

\delm{C}{\delm{\dpara}{S}}

NH-, -NH

\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}

NH, -NH

\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}

O-, -NH

\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}

-, -

\delm{C}{\delm{\dpara}{O}}

NH-, diazo, o -NH

\delm{C}{\delm{\dpara}{NH _{2}  ^{+} }}

-;

I es -SO_{3}H, -OSO_{3}H, -PO(OH)_{2}, -OPO(OH)_{2} o -COOH, y Nu es un grupo nucleofílico.

Un grupo nucleofílico para el fin de esta invención se define como un grupo químico rico en electrones, que tiene un par no compartido de electrones que actúan como sitio reactivo y busca un sitio de carga positiva o deficiente en electrones en otra molécula. Como ejemplos de grupos nucleofílicos útiles se incluyen un grupo amino, hidroxilo o sulfhidrilo o un grupo metileno activo adyacente a un fuerte grupo retirador de electrones. Un fuerte grupo retirador de electrones se define como un grupo o substituyente químico que atrae fuertemente a los electrones y que, por lo tanto, intensifica la carga positiva del átomo de carbono (o carbanión) o que anula la carga negativa del átomo de carbono (o ion carbonio) al que está unido el grupo. Como ejemplos de fuertes grupos retiradores de electrones se incluyen -NO_{2}, -CH, -SO_{3}H, -N(R)_{3}^{+}, -S(R)_{2}^{+} y -NH_{3}^{+}, donde R es como se define a continuación.

Los restos metálicos orgánicos son también grupos nucleofílicos útiles para los fines de esta invención. Un resto metálico orgánico se define como un resto orgánico que contiene enlaces carbono-metal. Como ejemplos de restos metálicos orgánicos se incluyen reactivos de Grignard, compuestos de litio y fenilsodio.

Si Nu es N-H_{2}, por ejemplo, como ejemplos de compuestos adecuados para formar conjugados de esta invención se incluyen aquellos compuestos que contienen grupos funcionales capaces de unirse a -NH_{2}, tales como:

(1) grupos carboxilato, como, por ejemplo, en el ácido fólico, la Vitamina B_{12} carboxilada, el hemisuccinato de Vitamina B_{12} en el resto de ribosa, los N-hemisuccinatos del éster metílico de T_{4} y del éster metílico de T_{3}, el tromboxano B_{2}, la carboxipropilteofilina, las penicilinas, la cortisol-3-carboxilmetiloxima, la estradiol-6-carboximetiloxima, el 6-hemisuccinato de morfina y similares;

(2) grupos cetona, como, por ejemplo, en la 3-cetodigoxigenina;

(3) grupos aldehído, como, por ejemplo, en el digoxindialdehído y el bromouridinadialdehído;

(4) haluros, como, por ejemplo, en los derivados dinitrofluorobenceno y clorotriazina de haptenos y proteínas;

(5) ésteres activos, como, por ejemplo, en los derivados N-hidroxisuccinimida e imidato de haptenos y proteínas, y

(6) isocianato y tioisocianato, como, por ejemplo, en los derivados de haptenos y proteínas.

Si Nu es -SH, los ejemplos de compuestos adecuados contendrán grupos funcionales capaces de unirse a -SH, tales como maleimido, ditiopiridino u olefina, tales como los que aparecen, por ejemplo, en los derivados de haptenos y proteínas.

Si Nu es -OH, como ejemplos de compuestos adecuados para formar los conjugados de esta invención se incluyen aquellos compuestos que contienen grupos funcionales capaces de unirse a -OH, tales como oxirano, tales como los que aparecen, por ejemplo, en los derivados de haptenos y proteínas.

Si Nu es un resto de Grignard u otro resto organometálico, como ejemplos de compuestos adecuados para formar los conjugados de esta invención se incluyen aquellos compuestos que contienen grupos funcionales capaces de unirse al resto, tales como cetona y aldehído, como los que aparecen, por ejemplo, en los haptenos apróticos.

Se apreciará que se pueden utilizar otros muchos grupos Nu adecuados en los ésteres de acridinio de esta invención. Queda para el experto en la técnica seleccionar qué combinación de éster de acridinio y compuesto conjugante sirve mejor a las necesidades de la aplicación deseada.

R_{5} y R_{6} y R_{6} y R_{7} son intercambiables y R es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo que contiene eventualmente hasta 20 heteroátomos.

Cuando X es nitrógeno, Y es (1) un grupo alquilo de cadena ramificada o lineal que contiene hasta 20 átomos de carbono y eventualmente hasta 10 heteroátomos, o (2) un grupo arilo o heteroarilo substituido o no substituido que contiene hasta 20 átomos de carbono; Z es -SO_{2}-Y' e Y' se define igual que el Y anterior (en caso de que X sea nitrógeno). Y e Y' pueden tener una composición química idéntica o diferente.

En la Fig. 12A se muestra un constructo preferido del conjugado marcado quimioluminiscente (que contiene el ETC conjugado a una molécula biológica) según se ha descrito antes. Un diseño alternativo del ETC (según se muestra en la Fig. 12B) es la translocación del grupo funcional de R_{10} antes descrito. En lugar de formar parte de R_{6} en el resto Y, R_{10}, cuyo propósito es facilitar la unión covalente para la molécula biológica, se localiza ahora en la primera cadena lateral.

(-Sp-). Un ejemplo de dicho espaciador funcionalizado es la molécula trifuncional lisina, en donde los grupos \alpha-amino y \alpha-carboxilato sirven para entrecruzar el núcleo de acridinio o benzacridinio y el luminóforo, mientras que el grupo varepsilon-amino de la cadena lateral de la lisina puede ser utilizado para la conjugación. Otras permutaciones (u orientaciones) del entrecruzamiento de la lisina y la utilización de otras moléculas trifuncionales son también posibles y deberían ser obvias para los expertos en la técnica del entrecruzamiento. Para la elección de este diseño, se advierte a los expertos, sin embargo, frente a la posibilidad de una menor detección de la luz. Como es sabido, tras el destello, el éster de acridinio dará lugar a la acridona emisora de luz y al grupo fenoxi. En lugar de quedar retenidas con el grupo fenoxi como en el diseño previo, las moléculas biológicas permanecerían ahora ligadas a la acridona y competirían con el luminóforo para absorber la luz, dando como resultado la reducción del rendimiento cuántico global del ETC. El grado de efecto inhibitorio es, por supuesto, función de las características cromofóricas de las moléculas biológicas y de las distancias entre el éster de acridinio y la molécula biológica o el luminóforo.

Otro diseño alternativo de los ETC (mostrado en la Fig. 12C) podría surgir, de forma similar, de la translocación del grupo R_{10} del resto de acridinio o benzacridinio al resto luminóforo. Este diseño requeriría un luminóforo bifuncional, el cual se une en un extremo covalentemente a un núcleo de acridinio o benzacridinio con o sin la mediación de un espaciador, y en el otro extremo se une a la molécula biológica. Se aplicará una precaución similar contra la reducción del rendimiento cuántico para este diseño. Dependiendo de las características estructurales del luminóforo del que se dispone, variará también la facilidad de introducción de grupos bifuncionales en un luminóforo y su reacción por etapas con un espaciador, el compuesto de acridinio o benzacridinio y la molécula biológica en cualquier secuencia especial. Para un experto en la técnica de la síntesis orgánica o bioorgánica, esto significaría la apropiada selección de diferentes grupos protectores para los diversos grupos funcionales con objeto de poder llevar a cabo las reacciones de manera selectiva y de un modo compatible.

Otro diseño alternativo (véase la Fig. 12D) similar a las dos alternativas anteriores para los ETC resultaría de la translocación de todo el grupo R_{6} desde el grupo fenólico del resto de acridinio o benzacridinio en las Fórmulas I y II hasta el núcleo de acridinio o benzacridinio. En este diseño, R_{6} substituye a uno de los tres grupos R_{1}, R_{2} y R_{3} del núcleo de acridinio o benzacridinio, donde R_{6} es un ligante para conjugar la biomolécula al núcleo de acridinio o benzacridinio y uno de los otros dos grupos (R_{1}/R_{2} o R_{2}/R_{3} o R_{1}/R_{3}) representa -Sp-Lumi según se definió anteriormente. La posición originalmente ocupada por R_{6} en el resto de fenoxi es entonces substituida por un grupo equivalente a H, R_{1}, R_{2} o R_{3}. R_{1}, R_{2} o R_{3} en este caso tienen la misma definición, pero excluyendo -Sp-Lumi. Una vez más, se aplicará aquí una advertencia similar contra la reducción del rendimiento cuántico para este diseño alternativo, debido a la unión directa de las biomoléculas al núcleo de acridinio o benzacridinio.

Un compuesto ETC quimioluminiscente o un conjugado marcado con ETC se caracterizan por el hecho de que, tras el tratamiento químico, el compuesto o conjugado emite una luz azul-verde, verde, amarilla, naranja, rojo-naranja o próxima al IR que tiene un pico o máximo de espectro de emisión discernible. En una realización, es decir, un compuesto ETC, el máximo de emisión es mayor de 600 nm y, en otras realizaciones preferidas, mayor de 620 nm y de 700 nm, respectivamente.

Se describen varias aproximaciones sintéticas para la formación de diversos ETC, consistentes en la unión de diferentes luminóforos mediante diferentes espaciadores a las peri-posiciones del núcleo de acridinio y benzacridinio, particularmente en C_{2}, C_{3} y el nitrógeno del anillo.

Se describe un método sintético de bloques invertidos para la preparación de conjugados ETC-biomoléculas para soslayar la posible complicación cuando el resto luminóforo del ETC contiene un grupo funcional adicional (por ejemplo, un grupo carboxilato o sulfonato en el área de entrada de la Rodamina y del Rojo Texas) que podría coactivarse con el de R_{6} en el resto del éster de acridinio y daría como resultado subproductos indeseables de conjugados ETC-biomoléculas. La solución para esta complicación se obtuvo revirtiendo la secuencia sintética de construcción del conjugado ETC-biomolécula, es decir, que la molécula biológica fue primeramente conjugada con el éster de acridinio, que a su vez fue acoplado al luminóforo apropiadamente activado. La ETC-biomolécula así construida resultó útil como trazador en la prueba diagnóstica.

B. Selección del luminóforo

Para la elección del luminóforo, se puede usar un luminóforo preactivado y/o funcionalizado, tal como los ya disponibles de fuentes comerciales (por ejemplo, Molecular Probes, Eugene, Oregon). Los criterios para la elección de los diversos luminóforos están jerarquizados como sigue en base a la necesidad: (1) los rangos espectrales de excitación y de emisión requeridos; (2) una estabilidad razonablemente buena del compuesto, y de ahí la conservación de la capacidad de excitación y de emisión de luz en ambos extremos de pH de ácido y base requeridos para la conversión química del resto de acridinio y benzacridinio; (3) una buena eficacia cuántica de luminiscencia; (4) disponibilidad del grupo funcional correspondiente (con o sin preactivación) necesario para acoplarse con el acridinio o benzacridinio funcionalizado antes descrito. La mayoría de los luminóforos ya existentes en la literatura llevan la información necesaria para comprobar los criterios de selección. Para los luminóforos de utilidad potencial en base a sus propiedades de luminiscencia, se puede disponer de una información completa por autoverificación o posterior derivatización del compuesto conocido, si es necesario, hasta que se cumplan los cuatro criterios. Así, por ejemplo, se han escogido luminóforos tales como la Rodamina funcionalizada con éster de carboxilato de N-hidroxisuccinimida en la posición 5 ó 6 (Molecular Probe, Cat. # C-1309), Rojo Texas funcionalizado con cloruro de sulfonilo en la posición 5 (Molecular Probe, Cat. # T-353) y carboxinaftofluoresceína funcionalizada con éster de carboxilato de N- hidroxisuccinimida en la posición 5 ó 6 (Molecular Probe, Cat. # 653) en la presente invención por sus útiles propiedades, que cumplen los cuatro criterios de manera satisfactoria.

Reconociendo que los luminóforos conocidos para los fines de la presente invención son abundantes, los ejemplos pretenden ilustrar, y no limitar, la invención al uso de sólo aquellos luminóforos que se dan como ejemplo. Los cuatro criterios servirán, por lo tanto, como guía para que los expertos en la técnica seleccionen el luminóforo conocido o futuro que resulte adecuado para la construcción de los ETC.

C. Síntesis de intermediarios clave y ETC objeto

Con objeto de introducir la cadena lateral funcionalizada en cierta peri-posición deseada (por ejemplo, 2 ó 3 o N) del núcleo de acridinio o benzacridinio, se utilizaron los métodos de la descripción previa y procedimientos recién descubiertos. Por ejemplo, se puede conseguir la introducción de substituyentes en la posición 2 ó 3 del núcleo de acridinio por redistribución catalizada por base de una N-arilisatina con un substituyente en el resto de arilo o de isatina. Así, partiendo de las arilisatinas apropiadamente substituidas, se pueden obtener los intermediarios clave del ácido acridina-9-carboxílico 2- o 3-substituido como se muestra en los siguientes Esquemas I-VII para la preparación de diversos ETC.

\newpage

En la solicitud copendiente, CIP de LEAE, ahora Patente EE.UU. Nº 5.879.894, se vio que se podría aplicar una aproximación similar a la preparación de ácido benzacridina-12-carboxílico 2- o 3-substituido empleando N-arilbenzisatina apropiadamente substituida.

Como los peri-substituyentes de la presente solicitud incluyen una cadena lateral funcionalizada, es necesario un cuidado y/o etapas adicionales, según se ilustra en las etapas iniciales de los siguientes Esquemas I y V, para introducir la cadena lateral funcionalizada adecuadamente protegida en la porción arilo de la N-arilisatina o N-arilbenzisatina. La protección dada a la cadena lateral funcionalizada pretendida en la N-arilisatina o N-arilbenzisatina puede evitar cualquier posible interferencia del grupo funcional de la cadena lateral y garantizar la formación uniforme del ácido acridina- o benzacridinacarboxílico apropiadamente substituido. Así, la cadena lateral funcionalizada deseada de aminometilo fue protegida con anhídrido ftálico para formar una cadena lateral de ftalimidometilo. La protección del grupo amino en la presente solicitud era bastante única, en el sentido de que vimos que la protección no seguía totalmente intacta después de pasar por la redistribución catalizada por base, según se muestra en la hidrólisis parcial del resto de ftalimida. No obstante, la protección había sido suficiente como para hacer que la formación del ácido acridinacarboxílico no resultara alterada. En las etapas siguientes, se volvió a formar el resto de ftalimida por tratamiento con SOCl_{2}, ya que la protección seguía siendo necesaria en la etapa de esterificación para la formación de los ésteres de acridina y en la etapa de metilación para la formación del éster de acridinio. Se expuso de nuevo el grupo amino por tratamiento con hidrazina para eliminar la protección de ftaloílo justo antes de la necesidad de conjugar el éster de acridinio substituido con un luminóforo funcionalizado para formar ETC. Así, es importante que la presente solicitud describe un procedimiento único para sintetizar ETC basados en ésteres de acridinio, que utiliza la estrategia de la protección con ftalimido de la cadena lateral amino-funcionalizada. Dicha protección atraviesa efectivamente (o sobrevive a) varias reacciones y finalmente se elimina en condiciones que pueden dejar intacto el éster de acridinio para la actividad quimioluminiscente necesaria.

En los ejemplos se dan descripciones detalladas para la síntesis de ésteres clave de acridinio con cadenas laterales funcionalizadas en las peri-posiciones y su posterior derivatización a ETC.

Otra enseñanza de la formación de ETC en las otras peri-posiciones del éster de acridinio conlleva la introducción de la cadena lateral funcionalizada de aminoetilcarbamoilmetilo (AECM) en el nitrógeno del anillo del núcleo de acridinio o benzacridinio como substituyente R_{1}. La ruta sintética aparece mostrada en el Esquema VIII y se describe brevemente a continuación.

Partiendo del éster modelo de acridina, el éster de dimetilfenilacridina ("DMPAeE"), se unió la cadena lateral de etoxicarbonilmetilo al nitrógeno del anillo para formar el éster de N-etoxicarbonilmetildime-tilfenilacridinio ("NECM-DMPAE") según describen Zomer y col. (EP 0324202). Vimos que la saponificación de NECM-DMPAE no daba el N-carboximetil-DMPAE (NCM-DMPAE) deseado, como describieron Zomer y col. Alternativamente, descubrimos que se puede obtener DMPAE con una cadena lateral funcionalizada prolongada de aminoetilcarbamoilmetilo en el nitrógeno del anillo por reacción de etilendiamina directamente con NECM-DMPAE para dar el intermediario clave ED-NCM-DMPAE, que fue entonces acoplado con el luminóforo (Rojo Texas) funcionalizado para dar el ETC deseado.

De forma similar, la introducción de otra cadena lateral funcionalizada de aminoetilsulfonamidilpropilo (-CH_{2}CH_{2}
CH_{2}-SO_{2}NHCH_{2}CH_{2}NH_{2}, al que también se hace referencia como ED-NSP) en el nitrógeno del anillo del núcleo de acridinio o benzacridinio resultó también posible. En el Esquema IX descrito a continuación, se ilustra la ruta sintética para el éster ED-NSP acridinio y el posterior compuesto ETC.

También es posible la unión de ésteres de acridinio o benzacridinio con luminóforos a través de otro grupo funcional, tal como un grupo hidroxi, en la posición 3 del núcleo de acridina. Se puede preparar el derivado necesario 3-hidroxiacridina-9-carboxilato por la conocida condensación de isatina con un compuesto fenólico apropiado, el resorcinol (EP#0322926 A2). Para facilitar el posterior acoplamiento con luminóforos, se puede derivatizar primeramente el grupo 3-OH del éster de acridina o benzacridina antes del acoplamiento para producir un espaciador éter alquílico o aralquílico amino-funcionalizado. Una realización preferida de dicha modificación dio lugar a la introducción de un espaciador aminobenciloxi (ABO), según se muestra en la sección de ejemplos (síntesis de Rojo Texas-3-ABO-DMAE-Bz). La inserción del espaciador aminobenciloxi resultó inesperadamente producir un mayor efecto estabilizador sobre el resto luminóforo (Rojo Texas) en el ETC cuando se trató con una base fuerte, según se requiere por las condiciones generales de destello de los ésteres de acridinio. No se observó ningún cambio en el espectro de absorción de un acridona-N-ABO-Rojo Texas modelo cuando se agitó a temperatura ambiente durante 1 día en NaOH 0,1 N. Habría que observar aquí, sin embargo, que, para los fines de la presente invención, como la luz emitida por los ETC se completa en su mayor parte en un período de tiempo muy corto, no se requiere la estabilidad de los restos luminóforos en condiciones básicas por encima de los 10 segundos.

Después del acoplamiento con cloruro de sulfonilo de Rojo Texas, se produce un conjugado de éster de acridina-3-ABO-Rojo Texas. A diferencia de otras aproximaciones sintéticas antes descritas, el resto de acridina en esta realización preferida que contiene ABO fue N-metilado en la última etapa para obtener un ETC activo, como se ilustra en el Esquema X descrito a continuación.

También se preparó otra realización preferida del ETC con una unión 3-aminopropiloxi (Rojo Texas-3-APO-DMAE-Bz) de un modo similar (descrito a continuación en el Esquema XI).

Se ha desarrollado un constructo similar de DMAE-etilendiamina-Teofilina previamente como trazador en el ensayo de teofilina ACS de Ciba-Corning. Una modificación natural y un perfeccionamiento del trazador para la presente invención consiste en utilizar el precursor similar de teofilina, la teofilina-hexanodiamina (Teo-HD), que lleva un grupo amino libre. Como el ETC de rodamina-2-AM-DMAE lleva dos grupos carboxilato, uno del resto de DMAE y uno del resto de rodamina en el área de entrada, la activación directa de rodamina -2-AM-DMAE para formar el éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), seguido del acoplamiento con Teo-HD daría posiblemente lugar a una mezcla de conjugados, algunos de los cuales pueden contener una nueva unión en el grupo carboxilato indeseable del área de entrada, que debe mantenerse libre. Se contempló, por lo tanto, una síntesis de bloque por etapas y se llevó ésta a cabo para este caso activando primeramente un 2-AM-DMAE adecuadamente protegido y acoplando a continuación el derivado de 2-AM-DMAE activado y protegido con Teo-HD, eliminando el grupo protector 2-AM y acoplando el intermediario con el derivado comercial de rodamina específicamente activado con NHS en el grupo 5- o 6-carboxilato. La síntesis completa es mostrada a continuación en el Esquema XII.

Se demostró también que las características de emisión de la rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina eran esencialmente las de la rodamina-2-AM-DMAE, según se muestra en la sección siguiente. De forma similar, se pueden construir moléculas biológicas marcadas con rodamina-2-AM-DMAE distintas de teofilina en base a la anterior aproximación.

D. Moléculas biológicas marcadas con un ETC

Se pueden usar los ETC funcionalizados antes descritos y sus derivados obvios para acoplarlos covalentemente con moléculas biológicas que contienen grupos funcionales emparejables con fines de marcaje. Las uniones covalentes resultantes de amida y tioéter son sólo unos cuantos ejemplos de los más comúnmente anticipados por los expertos en la técnica. Otros tipos de uniones posibles que pueden formarse en medios orgánicos (por ejemplo, éter, cetona, éster, azo, etc.) o acuosos (por ejemplo, disulfuro) y que están bien registrados en la literatura tendrían que ser considerados obvios sin la demostración de sus beneficios inesperados.

La conjugación de ETC que no contienen grupos funcionales interferentes/competitivos en el resto luminóforo con moléculas biológicas tendría que ser obviamente el marcaje directo del ETC preformado y activado para las moléculas biológicas. Para ilustrar cómo se puede conjugar una molécula biológica con un ETC para formar un trazador en la prueba diagnóstica, y para obtener evidencias de que se pueden conservar las mismas características de emisión del ETC en el trazador, se describe la síntesis del conjugado de rodamina-2-AM-DMAE-hexanodiami-na-teofilina.

E. Espectros de emisión de la luz

Se determinaron los espectros de emisión de la luz de los ETC y de los compuestos de referencia DMAE-Bz y 2-MeO-LEAE-Bz por medio de un Sistema de Barrido Espectral Rápido ("FSSS") de Photo Research (una división de Kollmorgen Corp.), de Burbank, California, EE.UU. Se llevó a cabo el experimento en una habitación obscura. Se disolvió cada compuesto en acetonitrilo o N,N- dimetilformamida. Se diluyó el concentrado resultante con el mismo solvente para formar la solución de trabajo, la cual, después de ser sometida a destello, dio una emisión de luz con una intensidad adecuada. Un experimento típico utilizó 10-100 \mug de la muestra en 500 \mul del solvente contenido en un tubo de ensayo de borosilicato de 13 x 100 mm. Se puso el tubo en una gradilla de tubos de ensayo elevada a una altura apropiada. Se puso un trozo de hoja de aluminio en la parte posterior del tubo para aumentar la detectabilidad de la luz emitida. Se puso el cabezal óptico FSSS enfrente del tubo a una distancia aproximada de 130 mm con su lente enfocada hacia el líquido del tubo. Se trató primeramente la solución de muestra con 0,35 ml del Reactivo de Destello #1 (Ciba-Corning Diagnostics), que contenía HNO_{3} 0,1 N y un 0,1% de H_{2}O_{2}. Se obscureció entonces la habitación y se añadieron inmediatamente 0,35 ml del Reactivo de Destello #2 (Ciba-Corning Diagnostics), que contenía NaOH 0,25 N y un 0,2% de ARQUAD, a la mezcla de reacción. (Véase la Pat. EE.UU. Nº 4.927.769, de asignación común). La luz generada instantáneamente después de la adición del Reactivo #2 fue registrada por el FSSS durante 5 segundos comenzando aproximadamente un segundo antes de añadir el Reactivo #2. En las Figuras 1A-N se dan los diversos espectros de emisión determinados en FSSS, y se resumen también en la Tabla 1.

TABLA 1

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* Se establece el rango para la región espectral con intensidad de señal por encima del 5% de la altura del pico.

^ El rango del espectro de emisión va más allá del límite de barrido (380-780 nm) del FSSS.

F. Espectros de emisión de luz que no interfieren mutuamente

Para demostrar las emisiones de luz mutuamente no interferentes entre DMAE, LEAE y ETC, se sometieron a destello mezclas de dos o tres de estos compuestos que tienen diferentes rangos de emisión en las condiciones descritas anteriormente. En el primer experimento, se sometió a destello una mezcla de DMAE-Bz y rodamina-2-AM-DMAE-Bz. En el segundo experimento, se sometió a destello una mezcla de DMAE-Bz, 2-MeO-LEAE-Bz y CNF-2-AM-DMAE-CO_{2}H. Como indican sus respectivos espectros en las Figuras 1O y 1P, el máximo y el perfil de emisión de cada componente de la mezcla no cambian.

G. Eficacia de emisión de luz

Se determinó la eficacia de emisión de luz de ETC representativos en un luminómetro Berthold Magic Lite Analyzer-1 (MLA-1) (Ciba-Corning Diagnostics) sin filtro óptico. Se preparó cada muestra en acetonitrilo o N,N-dimetilformamida a 1 mg/ml, se diluyó seriadamente a 10 \mug/ml con acetonitrilo o N,N-dimetilformamida y luego con tampón fosfato 10 mM que contenía NaCl 0,15 M, 0,1% de BSA, 0,05% de NaN_{3}, pH 8, para obtener la solución de trabajo a una concentración de 1 pg/ml para todas las muestras que aparecen en la Tabla 2, excepto para el DMAE-Bz, a una concentración de 0,1 pg/ml.

Para determinar la eficacia de emisión de la luz, se sometieron a destello 25 \mul de matriz de tampón blanco o de la solución de trabajo de cada muestra por duplicado inyectando 0,3 ml del Reactivo de Destello #1, seguido, después de una pausa de 0,1 segundos, de inyección de 0,3 ml del Reactivo de Destello #2. Se recogió la emisión de luz durante 2 segundos y los resultados se dan en la Tabla 2.

Se repitió también la anterior medición poniendo un filtro OG550 (Schott Glass Technologies, Inc.) enfrente del tubo fotomultiplicador ("PMT"). En la Tabla 2 se dan los resultados. La Figura 2 muestra el perfil de transmisión del filtro OG550.

El número de cuentas de los ETC detectadas en MLA1 es 5-13 veces inferior al del DMAE-Bz libre. Como se indica en la Figura 3, la eficacia de detección del PMT usado en este experimento es como media de un 22% en el rango de 400-500 nm, donde el DMAE-Bz emite luz, mientras que la eficacia de detección se reduce a un 2-3% para la región del espectro que está por encima de los 600 nm, donde todos los ETC emiten luz. Esta diferencia de eficacia de detección del PMT en diferentes regiones de longitud de onda explica la pérdida mayor de los RLU de los ETC. Existen otros dispositivos de detección de luz comerciales. Su eficacia de detección en la región de longitud de onda larga es mucho mayor que la del PMT usado en este experimento. Por ejemplo, el Dispositivo Acoplado a Carga retroiluminado adelgazado ("CCD" adelgazado) mostrado en la Figura 4 puede alcanzar desde un 80% de eficacia a 400 nm hasta un 90% de eficacia a 700 nm. Por lo tanto, se predice que, con el dispositivo mejorado de detección de luz, como el CCD adelgazado, las emisiones de luz de los ETC detectadas deberían aumentar significativamente y se espera que sean iguales o mejores que las de los DMAE.

TABLA 2 Eficacia de emisión de luz de ETC determinada en MLA-1 con y sin filtro óptico

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H. Cinética de destello de la emisión de luz

Se determina la cinética de destello global de los ETC mediante dos factores: la cinética quimioluminiscente del resto de AE en el conjugado como donante de energía y la cinética fluorescente del resto luminóforo como aceptor de energía. La cinética quimioluminiscente del resto de AE de los ETC es en gran medida debida a la naturaleza de los efectos electrónicos y/o estéricos de diferentes substituyentes en el resto de AE. Por lo tanto, se anticiparía que los diversos conjugados ETC tienen varias velocidades de destello incluso en condiciones idénticas, debido al diferente resto de AE. Aunque los aceptores de energía seleccionados en este estudio son luminóforos que tienen una cinética muy rápida, también pueden ser luminóforos que tengan una cinética lenta. Para determinar la cinética de destello global de los ETC, se llevó a cabo un estudio de curso temporal a lo largo de un período de 10 segundos sometiendo los ETC a destello y normalizando todas las señales recogidas durante diferentes períodos de tiempo hasta 10 segundos. En la Tabla 3 se resumen los resultados.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

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1,2: Compuestos que tienen una cinética de destello muy lenta con t_{1/2} mucho mayor de 10 segundos.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de Rodamina-2-AM-DMAE-Bz - Esquema I

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4-Ftalimidometilbromobenceno

A una suspensión de 10 g (44,94 mmol) de clorhidrato de 4-bromobencilamina en 200 ml de cloroformo se añadieron 12,5 ml (89,62 mmol) de trietilamina, seguido de adición de 8,99 g (60,67 mmol) de anhídrido ftálico. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos para obtener una solución homogénea, que fue luego calentada a 75ºC durante tres horas. Se evaporó entonces la mezcla de reacción para eliminar el cloroformo y se suspendió el residuo en 400 ml de tolueno, seguido de adición de 700 mg de ácido p-toluensulfónico monohidrato. Se sometió brevemente la mezcla resultante a reflujo a 140ºC y se añadieron 3 ml adicionales de trietilamina para formar una solución homogénea. Se sometió la solución a reflujo a 140ºC durante 2 horas y se recogió el agua formada a través de una trampa de Dean-Stark. Se enfrió entonces la solución hasta la temperatura ambiente, se lavó con hidróxido de sodio al 3% (2 x 200 ml), agua (1 x 200 ml) y salmuera (1 x 200 ml) y se secó sobre sulfato de sodio. La eliminación del solvente a presión reducida dio 12,07 g (85% de rendimiento) de 4-ftalimidometilbro-mobenceno como un sólido blanco. Rf: 0,6 (gel de sílice, acetato de etilo:hexano = 1:2). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \deltappm 4,79 (2H, s), 7,31, 7,44 (2H cada uno, AA'BB'), 7,73, 7,84 (2H cada uno, m).

N-(4-Ftalimidometil)fenilisatina

Se trató una solución de 1,863 g (12,66 mmol) de isatina en 80 ml de N,N-dimetilformamida (DMF) anhidra a temperatura ambiente con 0,608 g (15,19 mmol) de hidruro de sodio (dispersión al 60%) durante aproximadamente 40 minutos hasta cesar el burbujeo de hidrógeno. Se añadieron entonces yoduro cuproso (CuI 5,303 g, 27,85 mmol) y 4-ftalimidometilbromobenceno (6 g, 18,99 mmol); se agitó la reacción bajo nitrógeno a 160ºC durante 16 horas. Se enfrió la reacción hasta la temperatura ambiente y se mezcló con 400 ml de cloroformo. Se filtró la mezcla resultante. Se evaporó el filtrado a sequedad bajo presión reducida y se separó el residuo en una columna instantánea de sílice (éter 5 a 20%/tolueno), para obtener 1,76 g del producto deseado (rendimiento del 36,4%). Rf: 0,2 (gel de sílice, éter 10%/tolueno). MS (MALDI-TOF): m/z 384,437 (observado).

Ácido 2-(2'-carboxibenzamido)metilacridina-9-carboxílico

Se agitó una mezcla de 1,26 g (3,3 mmol) de N-(4-ftalimidometil)fenilisatina en 70 ml de KOH al 10% a 120ºC durante 2 horas. Se diluyó la solución resultante en 250 ml de agua y se acidificó después en un baño de hielo para obtener un precipitado amarillo. Se recogió el precipitado, se lavó con agua y se secó al aire, para obtener 1,26 g (rendimiento del 87,5%) del compuesto del título en forma de un sólido amarillo. Rf: 0,5 (gel de sílice, CHCl_{3}/MeOH/H_{2}O = 55:45:4). MS (MALDI-TOF): m/z 401,577 (M+1).

2-Ftalimidometilacridina-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo

Se sometió a reflujo ácido 2-(2'-carboxibenzamido)metilacridina-9-carboxílico (905 mg, 2,29 mmol) en 10 ml de cloruro de tionilo durante 2 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, se redujo la solución a aproximadamente la mitad de su volumen insuflando nitrógeno y se vertió después en 75 ml de éter anhidro. Se recogió el precipitado amarillo y se lavó con éter (3 x 20 ml). Después de secarlo a vacío, se suspendió el sólido amarillo en 30 ml de piridina anhidra, seguido de adición de 515,8 mg (2,01 mmol) de 3,5-dimetil-4-hidroxibenzoato de bencilo y 100 mg (0,41 mmol) de N,N-dimetilaminopiridina (DMAP). Se agitó la reacción a 110ºC durante 2 horas y luego a 55ºC durante otras 16 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, se filtró la mezcla. Se evaporó el filtrado a sequedad bajo presión reducida y se separó el residuo en una columna instantánea de sílice (acetato de etilo 2 a 5%/cloruro de metileno), para obtener 115 mg (rendimiento del 20% en base a la recuperación del material de partida) del producto deseado. Rf: 0,5 (gel de sílice, EtOAc 10%/CH_{2}Cl_{2}). MS (MALDI-TOF): m/z 620,206 (observado).

Trifluorosulfonato de 2-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenil

Se trató una solución de 2-ftalimidometilacridina-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo
(317,39 mg, 0,512 mmol) en 15 ml de cloruro de metileno anhidro con trifluorometanosulfonato de metilo (0,58 ml, 5,12 mmol). Se agitó la reacción bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante 16 horas. Se eliminó entonces el solvente insuflando nitrógeno. Se purificó el residuo en una columna de HPLC de fase invertida (YMC, Wilmington, NC, 30 x 500 mm, ODS-A, S-10, 120 \ring{A}). El producto eluyó con un tiempo de retención de 19 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 60% B a 100% B en 30 min.; velocidad de flujo 30 ml/min.; monitorización a 260 nm. La eliminación de los solventes dio 326,6 mg (85% de rendimiento) del compuesto del título. Rf: 0,7 (gel de sílice, éter). MS (ESI): m/z 635 (M).

Trifluoroacetato de 2-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo

Se agitó una solución de trifluorometanosulfonato de 2-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo (17,2 mg, 0,023 mmol) e hidrazina (21,7 \mul, 0,69 mmol) en 3 ml de DMF anhidra a temperatura ambiente durante 16 horas. Se separó entonces la mezcla de reacción en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120 \ring{A}). El producto deseado (4,6 mg, rendimiento del 31%) eluyó con un tiempo de retención de 20 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 30% B durante 15 min., luego hasta el 60% B en 5 min. y después durante 20 min.; velocidad de flujo 20 ml/min.; monitorización a 260 nm. MS (ESI): m/z 505 (M).

Rodamina-2-AM-DMAE-Bz

A una solución de 8,89 mg (0,0144 mmol) de trifluoroacetato de 2-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo en 1 ml de DMF anhidra, se añadieron 9,81 \mul (0,0704 mmol) de trietilamina y 16,68 mg (0,0264 mmol) de 5-(y 6)-carboxi-X-rodamina, éster succinimidílico, secuencialmente. Se agitó entonces la reacción a temperatura ambiente durante 16 horas. Se aisló el producto en un HPLC analítico Beckman Modelo 126 (Columbia, MD) con columna semi-prep de fase invertida Phenomenex (Torrance, CA, 300 x 7,8 mm, Bondclone C18, 10 mm). Eluyó con un tiempo de retención de 30 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 30% B a 60% B en 30 min., 60% B durante otros 10 min.; velocidad de flujo: 2 ml/min.; monitorización a 260 nm. Se obtuvieron 2,56 mg del producto (rendimiento del 17,4%). MS(ESI): m/z 1022 (M).

Ejemplo 2 Síntesis de Rojo Texas-2-AM-DMAE-COOH - Esquema II

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Bromuro de 2-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxil-2',6'-dimetil)fenilo

Se agitó una mezcla de 200 mg (0,255 mmol) de trifluorometanosulfonato de 2-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil)-2',6'-dimetil)fenilo en 4 ml de HBr 30%/AcOH a 55ºC durante 2 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, se insufló la mezcla de reacción con nitrógeno para reducir el volumen a aproximadamente 1 ml y se vertió después en 15 ml de éter. Se recogió el precipitado y se lavó con un exceso de éter. Después de secar al aire, se obtuvieron 150 mg (rendimiento del 89,5%) de producto como un sólido naranja. Se analizó este producto en una columna HPLC de fase invertida Phenomenex (Torrance, CA, 300 x 3,90 mm, Bondclone C18, 10 mm). Eluyó con un tiempo de retención de 23,6 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 30% B durante 15 min., luego hasta el 60% B en 5 min. y después durante 20 min.; velocidad de flujo: 1 ml/min.; monitorización a 260 nm. MS(ESI) m/z
545 (M).

Trifluoroacetato de 2-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxil-2',6'-dimetil)fenilo

Se agitó una solución de bromuro de 2-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxil-2',6'-dimetil)fenilo (130 mg, 0,21 mmol) e hidrazina (104,5 \mul, 3,33 mmol) en 4 ml de DMF a temperatura ambiente durante 2 horas. Se separó entonces la reacción en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado eluyó como un pico mayor con un tiempo de retención de 20 minutos en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 5% B a 60% B en 30 min., 60% B durante otros 5 min.; velocidad de flujo: 25 ml/min; monitorización a 260 nm. La eliminación de los solventes dio 56 mg (rendimiento del 51%) del producto. MS (ESI): m/z
415 (M).

Rojo Texas-2-AM-DMAE-COOH

Se agitó una solución de trifluoroacetato de 2-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxil-2',6'-dimetil)fenilo (2,4 mg, 0,0045 mmol) y cloruro de sulfonilo de Rojo Texas (15 mg) en 1 ml de DMF anhidra que contenía 6,34 \mul de Et_{3}N a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 horas. Se separó entonces la reacción en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (1,5 mg) eluyó con un tiempo de retención de 30 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 5% B a 60% B en 30 min., 60% B durante otros 5 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (ESI): m/z 1003 (M+1).

Ejemplo 3 Síntesis de rodamina-2-AM-DMAE-COOH - Esquema III

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A una solución de trifluoroacetato de 2-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carbo-xil-2',6'-dimetil)fenilo (5 mg, 0,0095 mmol) en 2 ml de DMF anhidra se añadió trietilamina (19,8 \mul, 0,142 mmol), seguido de adición de éster succinimílico de 5-(y 6)-carboxi-X-rodamina (17,96 mg, 0,0284 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 16 horas. Se aisló el producto en un HPLC analítico Beckman Modelo 126 (Columbia, MD) con columna semi-prep de fase invertida Phenomenex (Torrance, CA, 300 x 7,8 mm, Bondclone C18, 10 mm). Eluyó con un tiempo de retención de 37,2 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 25% B durante 10 min., luego hasta el 55% B en 30 min. y luego hasta el 100% B en 5 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. Se obtuvieron 2 mg del producto. MS (MALDI-TOF): m/z 934,25 (M+1).

Ejemplo 4 Síntesis de CNF-2-AM-DMAE-COOH - Esquema IV

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Se agitó una solución de 8,7 mg (0,013 mmol) de trifluoroacetato de 2-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxil-2',6'-dimetil)fenilo y 4 mg (0,0062 mmol) de éster succinimidílico de 5-(y 6)-carboxinaftofluoresceína en 1 ml de DMF anhidra que contenía 5,3 \mul (0,31 mmol) de Et_{3}N a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 horas. Se separó entonces la reacción en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (1,5 mg) eluyó con un tiempo de retención de 32 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 20% B a 50% B en 30 min., 50% B durante otros 10 min.; velocidad de flujo: 10 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (ESI): m/z 873.

Ejemplo 5 Síntesis de Rojo Texas-3-AM-DMAE-COOH - Esquema V

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140

3-Ftalimidometilbromobenceno

Se sometió a reflujo una mezcla de clorhidrato de 3-bromobencilamina (10 g, 45 mmol), anhídrido ftálico (9,33 g, 63 mmol) y trietilamina (12,5 ml, 90 mmol) en 200 ml de tolueno a 130ºC durante 13 horas y se recogió el agua formada en la reacción por medio de una trampa de Dean-Stark. Se enfrió entonces la reacción hasta la temperatura ambiente y se añadieron otros 200 ml de tolueno, seguido de adición de 1 g de ácido p-toluensulfónico monohidrato. Se sometió de nuevo la mezcla resultante a reflujo a 130ºC durante 3 horas con la trampa de Dean-Stark. Se enfrió la mezcla hasta la temperatura ambiente y se lavó con una solución de hidróxido de sodio al 3% (3 x 200 ml), agua (3 x 200 ml) y salmuera (1 x 200 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio. La eliminación del solvente dio 13,2 g (rendimiento del 92%) del producto deseado. Rf: 0,7 (gel de sílice, éter 30%/hexano). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \deltappm 4,77 (2H, s), 7,15 (1H, t, J=7,8Hz), 7,34 (2H, t, J=7,8Hz), 7,53 (1H, s), 7,68 (2H, m) y 7,82 (2H, m).

N-(3-Ftalimidometil)fenilisatina

Se trató una solución de isatina (2,17 g, 14,77 mmol) en 200 ml de DMF anhidra con NaH (dispersión al 60%, 0,709 g, 17,72 mmol) a temperatura ambiente durante media hora. Se trató la mezcla marrón resultante con 3-ftalimidometilbromobenceno (7 g, 22,15 mmol) y yoduro cuproso (5,61 g, 29,54 mmol). Se calentó la mezcla a 160ºC bajo nitrógeno durante 18 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, se diluyó la mezcla con 800 ml de cloroformo. Se filtró la mezcla resultante y se evaporó el filtrado a presión reducida para obtener el producto bruto como un material de color marrón. Rf: 0,9 (gel de sílice, éter 20%/hexano).

Ácido 3-(2'-carboxibenzamido)metilacridina-9-carboxílico

Se sometió la N-(3-ftalimidometil)fenilisatina bruta a reflujo en 200 ml de hidróxido de potasio al 10% a 130ºC durante 3 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, se filtró la mezcla. Se lavó la torta del filtro con 20 ml de hidróxido de potasio al 10%. Se acidificó el filtrado combinado en un baño de hielo con ácido clorhídrico concentrado y agitación a pH 1-2. Se lavó el sólido resultante con agua (4 x 100 ml), se secó al aire y se secó después con pentóxido de fósforo a 100ºC durante la noche, para obtener 5,36 g del producto deseado (rendimiento del 91% a partir de isatina). Rf: 0,5 (gel de sílice, cloroformo/metanol/agua, 55:45:5). MS (MALDI-TOF): m/z 401,665 (M+1).

3-Ftalimidometilacridina-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo

Se calentó una mezcla de ácido 3-(2'-carboxibenzamido)metilacridina -9-carboxílico (3,1 g) en cloruro de tionilo (60 ml) a 110ºC durante una hora para formar una solución homogénea, que fue calentada aún durante 1,5 horas más. Se enfrió la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiente y se redujo a aproximadamente 30 ml en un respirador de agua. Se vertió el concentrado resultante en 150 ml de éter anhidro. Se recogió el precipitado, se lavó con éter (2 x 50 ml) y se secó a vacío, para obtener 1,91 g de un producto marrón claro (rendimiento del 57%). Se disolvió este material (1,91 g, 4,38 mmol) en 100 ml de piridina anhidra y se trató con 3,5-dimetil-4-hidroxibenzoato de bencilo (1,12 g, 4,38 mmol) a temperatura ambiente bajo nitrógeno y con agitación durante 15 horas. Se evaporó entonces la solución a presión reducida a sequedad. Se separó el residuo en columna de cromatografía instantánea de sílice mediante elución con 4 litros de acetato de etilo al 25% en hexano. Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado. La eliminación de los solventes a presión reducida dio 470 mg del compuesto del título (rendimiento del 17%). Rf: 0,8 (gel de sílice, metanol 10%/cloroformo). MS (ESI): m/z 621,3 (M+1).

Trifluorosulfonato de 3-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo

Se trató una solución de 3-ftalimidilmetil-acridinacarboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo (100 mg, 0,1613 mmol) en 5 ml de cloruro de metileno anhidro con trifluorometilsulfonato de metilo (182 ml, 1,613 mmol). Se agitó la solución a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 horas. Se redujo el volumen de la mezcla resultante a aproximadamente 2 ml insuflando nitrógeno. Se trató la mezcla resultante con 10 ml de éter anhidro. Se recogió el precipitado y se lavó con éter (5 x 5 ml), para obtener 110 mg (87%) de un producto amarillo intenso. MS (ESI): m/z 635,6 (M^{+}).

Bromuro de 3-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxi-2',6'-dimetil)fenilo

Se calentó una mezcla de trifluorosulfonato de 3-ftalimidilmetil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo (105 mg) en 2 ml de bromuro de hidrógeno al 30% en ácido acético con agitación a 55ºC durante 2 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, se trató la mezcla con 20 ml de éter anhidro. Se recogió el precipitado amarillo y se lavó con éter (6 x 5 ml), para obtener 90 mg del producto cuantitativamente. MS (ESI): m/z 545,7 (M^{+}).

Trifluoroacetato de 3-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxil-2',6'-dimetil)fenilo

Se agitó una solución de bromuro de 3-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxi-2',6'-dimetil)fenilo (60 mg, 0,112 mmol) e hidrazina (60,4 \mul, 1,927 mmol) en 2 ml de DMF a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 4 horas para obtener una suspensión. La filtración eliminó el sólido y se evaporó el filtrado a presión reducida a sequedad. Se separó el residuo en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}) y se eluyó en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 5% B a 60% B en 30 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. El producto deseado eluyó como un pico amplio con un tiempo de retención de 23,5 min. a 25,2 min. La eliminación de los solventes a presión reducida dio 21 mg (rendimiento: 36%) del producto deseado.

^{1}H RMN (MeOD-d_{4}): \deltappm 1,60 (6H, s), 3,57 (3H, s), 4,20 (2H, s), 7,10 (1H, dt, J_{1}=7,8Hz, J_{2}=0,8Hz), 7,16 (dd, J_{1}=8,0Hz, J_{2}=1,6Hz), 7,29 (d, J=8,4Hz), 7,35 (d, J=1,2Hz), 7,48 (dt, J_{1}=7,2Hz, J_{2}=1,6Hz), 7,58 (2H, s), 7,60 (dd, J_{1}=7,8Hz, J_{2}=1,6Hz) y 7,66 (d, J=7,9Hz).

Rojo Texas-3-AM-DMAE-COOH

Se trató una solución de trifluoroacetato de 3-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxi-2',6'-dimetil)fenilo (12 mg, 0,027 mmol) en 1 ml de DMF anhidra que contenía 31,7 \mul (0,27 mmol) de Et_{3}N con cloruro de sulfonilo de Rojo Texas (30 mg, 0,0475 mmol) con agitación a temperatura ambiente y bajo nitrógeno durante 16 horas. Se separó la mezcla de reacción en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (3,4 mg) eluyó con un tiempo de retención de 33 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 5% B a 60% B en 30 min., 60% B durante otros 5 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (ESI): m/z 1003 (M+1).

Ejemplo 6 Síntesis de rodamina-3-AM-DMAE-\beta-alanina - Esquema VI

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Trifluoroacetato de 3-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxietilamidocarbonil-2',6'-dimetil)fenilo

Se trató una solución de bromuro de 3-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxil-2',6'-dimetil)fenilo (65 mg, 0,104 mmol) en un solvente mixto de DMF (2 ml) y acetonitrilo (3 ml) con 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 70 mg, 0,335 mmol) y N-hidroxisuccinimida (NHS, 36 mg, 0,313 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 5 horas y se evaporó después a sequedad. Se reconstituyó el residuo resultante en 2 ml de DMF anhidra y se eliminaron los materiales insolubles por filtración. Se añadió al filtrado una solución de \beta-alanina (93 mg, 1,04 mmol) en 2 ml de tampón carbonato 0,2 M, pH 9, seguido de adición de otros 3 ml de DMF. Se dejó la reacción en agitación a temperatura ambiente durante 16 horas y se separó luego en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (45,2 mg, rendimiento del 59%) eluyó con un tiempo de retención de 27 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 30% B durante 15 min., luego hasta 60% B en 5 min. y a 60% B durante 20 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (MALDI-TOF): m/z 618 (M+2).

Trifluoroacetato de 3-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxietilamidocarbonil-2',6'-dimetil)fenilo

Se trató una solución de trifluoroacetato de 3-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxietilamidocarbonil-2',6'-dimetil)fenilo (45,2 mg, 0,0734 mmol) en 2 ml de DMF anhidra con 46 \mul (0,147 mmol) de hidrazina durante 2 horas. Se separó la mezcla de reacción en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (29 mg, rendimiento del 71%) eluyó con un tiempo de retención de 27 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 5% B a 60% B en 30 min., 60% B durante otros 10 min. y luego hasta 100% B en 5 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (MALDI- TOF): m/z 487 (M+1).

Rodamina-3-AM-DMAE-\beta-alanina

A una solución que contenía trifluoroacetato de 3-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxietilamidocarbonil-2',6'-dimetil)fenilo (2,82 mg, 0,004 mmol) y trietilamina (11 \mul, 0,0791 mmol) en 1 ml de DMF anhidra, se añadió éster succinimidílico de 5-carboxi-X-rodamina (5 mg, 0,0079 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas y se separó después en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (1,56 mg) eluyó con un tiempo de retención de 30,8 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 5% B a 60% B en 30 min., 60% B durante otros 10 min. y luego hasta 100% B en 5 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (MALDI-TOF): m/z 1000 (M-3).

Ejemplo 7 Síntesis de Rojo Texas-X-3-AM-DMAE-\beta-alanina - Esquema VII

16

Se trató una solución que contenía trifluoroacetato de 3-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4'-carboxietilamidocarbonil-2',6'-dimetil)fenilo (2,18 mg, 0,0031 mmol) y trietilamina (8,5 \mul, 0,061 mmol) en 1 ml de DMF anhidra con éster succinimidílico de Rojo Texas-X (5 mg, 0,0061 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 16 horas. Se separó la mezcla en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (0,85 mg) eluyó con un tiempo de retención de 41 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 25% B durante 10 min., luego hasta 55% B en 30 min. y hasta 100% B en 5 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (MALDI-TOF): m/z 1188 (M+1).

Ejemplo 8 Síntesis de Rojo Texas-ED-NCM-DMPAE - Esquema VIII

17

170

Yoduro de 10-etoxicarbonilmetilacridinio-9-carboxilato de (2',6'-dimetil)fenilo

Se suspendió acridina-9-carboxilato de (2',6'-dimetil)fenilo (0,5 g, 1,53 mmol) en \sim8 ml de yodoacetato de etilo y se calentó la reacción en un baño de aceite bajo una atmósfera de nitrógeno a 90ºC durante 16 horas. Se enfrió la reacción, que se había vuelto marrón obscura, hasta la temperatura ambiente y se vertió en una mezcla de éter dietílico (25 ml) y hexanos (50 ml). Se separó un sólido marrón. Se completó la precipitación del producto enfriando la suspensión en la mezcla de éter/hexano en refrigerador durante 2 horas. Se recogió entonces el precipitado por filtración y se disolvió de nuevo en una mezcla de cloroformo y metanol. La concentración a presión reducida dio 0,23 g de un polvo marrón rojizo (rendimiento del 28%). TLC (sílice) R_{f} = 0,6 (metanol al 2% en cloroformo). MS (MALDI-TOF): m/z 414,1 (M^{+}).

Trifluoroacetato de 10-aminoetilcarbamoilmetilacridinio-9-carboxilato de (2',6'-dimetil)fenilo

Se agitó yoduro de carboxilato de 10-etoxicarbonilmetilacridinio-9-carboxilato de (2',6'-dimetil)fenilo (77 mg) con \sim2 ml de etilendiamina a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno durante 16 horas. Se concentró entonces la mezcla de reacción a presión reducida y se disolvió el residuo en metanol (1 ml). Se purificó el producto bruto por HPLC preparatoria en una columna C_{18} (YMC 30 x 300 mm) a una velocidad de flujo de solvente = 16 ml/minuto y detección por UV a 260 nm usando un gradiente de 0-60% de MeCN en ácido trifluoroacético acuoso (0,05%) a lo largo de 40 minutos. En estas condiciones, el producto eluyó como un pico amplio centrado a los 26 minutos. Se liofilizó la fracción de HPLC que contenía el producto a sequedad, para obtener 7,8 mg de un polvo amarillo (rendimiento del 10%). MS (ESI): m/z 428,7 (M^{+}).

Rojo Texas-ED-NCM-DMPAE

Se añadió cloruro de sulfonilo de Rojo Texas (10 mg, 0,016 mmol) a una solución de 3,02 mg (0,004 mmol) de trifluoroacetato de 10-aminoetilcarbamoilmetil-acridinio-9-carboxilato de (2',6'-dimetil)fenilo y 5,58 \mul (0,04 mmol) de Et_{3}N en 1 ml de DMF anhidra. Se agitó la reacción a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 horas y se separó después en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (2,42 mg) eluyó con un tiempo de retención de 42 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 5% B a 60% B en 30 min., 60% B durante otros 5 min. y luego hasta 100% B en 5 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (ESI): m/z 1017 (M+1).

Ejemplo 9 Síntesis de Rojo Texas-ED-NSP-DMPAE - Esquema IX

18

Trifluoroacetato de N-aminoetilaminosulfonilpropilacridinio-9-carboxilato de (2',6'-dimetil)fenilo

Se suspendió éster de N-sulfopropil-2',6'-dimetilfenilacridinio (0,1 g) en cloruro de tionilo (2 ml) y se sometió la suspensión a reflujo bajo una atmósfera de nitrógeno durante 3-4 horas. La reacción se volvió transparente con el reflujo. Se enfrió entonces la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiente y se añadió éter dietílico (\sim25-35 ml). Apareció un precipitado amarillo. Se decantó el éter y se lavó el precipitado con éter tres veces para eliminar las trazas de cloruro de tionilo. Finalmente, se trató el sólido restante con etilendiamina (1 ml) y piridina (1 ml). Se agitó la reacción resultante a temperatura ambiente durante 2-3 horas y se concentró después a presión reducida. Se disolvió el residuo en metanol (\sim1 ml) y se purificó el producto por HPLC preparatoria en una columna C_{18} (YMC 30 x 300 mm) a una velocidad de flujo del solvente = 16 ml/minuto, con detector UV a 260 nm y un gradiente de 0-60% de MeCN en ácido trifluoroacético acuoso (0,05%) a lo largo de 40 minutos. En estas condiciones, el producto eluyó como un pico amplio centrado a los 34 minutos. Se liofilizó la fracción de HPLC que contenía el producto a sequedad, para obtener un polvo amarillo. Rendimiento de 26 mg (25%). MS (ESI): m/z 492,8 (M+H)^{+}.

Rojo Texas-ED-NSP-DMPAE

Se trató una solución de trifluoroacetato de 10-aminoetilaminosulfonilpropil)acridinio-9-carboxilato de (2',6'-dimetil)fenilo (4 mg, 0,005 mmol) y Et_{3}N (9,59 \mul, 0,075 mmol) en 1 ml de DMF anhidra con cloruro de sulfonilo de Rojo Texas (10 mg, 0,016 mmol), con agitación a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 horas. Se separó la mezcla resultante en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (0,3 mg) eluyó con un tiempo de retención de 37,8 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 5% B a 60% B en 30 min., 60% B durante otros 5 min; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (MALDI-TOF): m/z 1083 (M+2).

Ejemplo 10 Síntesis de Rojo Texas-3-ABO-DMAE-Bz - Esquema X

19

Éster metílico del ácido 3-hidroxiacridina-9-carboxílico

Se preparó ácido 3-hidroxiacridina-9-carboxílico de forma análoga a EP 0322926 A2. Se disolvió el ácido 3-hidroxiacridina-9-carboxílico (7,8 g, 32,6 mmol) en 200 ml de una solución de bicarbonato de sodio (10%) y se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. Se separó la sal sódica precipitada en un embudo Büchner y se secó, con un rendimiento de 7,8 g (91%). Se esterificó la sal sódica (7,0 g, 26,8 mmol) con yoduro de metilo (5,6 g, 37,5 mmol) en 50 ml de DMSO a temperatura ambiente. Al cabo de 2 horas, se vertió la solución en 600 ml de agua y se separó el precipitado, se lavó con agua y se secó a vacío a 50ºC. Rendimiento: 5,8 g (86%), p.f. >250ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 10,80 (1H, s, OH, intercambiable), 8,20-7,30 (7H, ar.) y 4,18 ppm (3H, s, CH_{3}). MS: M^{+}=253.

Éster metílico del ácido 3-(m-nitrobenciloxi)acridina-9-carboxílico

Se disolvió éster metílico del ácido 3-hidroxiacridina-9-carboxílico (14,6 g, 57,7 mmol) en 500 ml de DMF, se añadieron luego carbonato de potasio (25,0 g, 181 mmol) y bromuro de m-nitrobencilo (15,0 g, 69,4 mmol) y se agitó a temperatura ambiente. Después de 4 horas, se filtró la mezcla y se evaporó el filtrado a sequedad a vacío. Se disolvió el residuo en CH_{2}Cl_{2} y se lavó con HCl 1 N, NaOH 1 N y una solución de cloruro de sodio (10%). Después de secar con sulfato de sodio y de evaporar a sequedad, se sometió el residuo a cromatografía instantánea (columna: 10 cm de diámetro) en CH_{2}Cl_{2} + 1% de metanol (fracciones de 200 ml). Se combinaron las fracciones 7-23, se evaporaron y se recogió el residuo en un embudo Büchner y se lavó con éter dietílico. Rendimiento: 8,7 g (39%), p.f. >250ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 5,35 (2H, s, CH_{2}) y 4,22 ppm (3H, s, CH_{3}). MS: M^{+}: 388.

Ácido 3-(m-nitrobenciloxi)acridina-9-carboxílico

Se sometió a reflujo éster metílico de ácido 3-(m-nitrobenciloxi)acridona-9-carboxílico (6,5 g, 16,7 mmol) en 400 ml de dioxano y 300 ml de NaOH 1N. Después de 2 horas, se enfrió la solución y se acidificó a pH 1 con HCl conc. y se evaporó luego a vacío. Se recogió el precipitado en un embudo Büchner, se lavó con agua y se secó a vacío a 50ºC. Rendimiento: 5,9 g (95%), p.f. >250ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 8,44 (1H, s, ar.), 8,23 (1H, d, ar), 8,10 (2H, t, ar.), 8,03 (1H, d, ar.), 7,95 (1H, d, ar.), 7,72 (2H, m, ar.), 7,42 (2H, m, ar.), 7,27 (1H, d, ar.) y 5,50 ppm (2H, s, CH_{2}). MS: M^{+}: 374.

3-(m-Nitrobenciloxi)acridina-9-carboxilato de (4'-bencil-oxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo

Se agitó cloruro de p-toluolsulfonilo (38,0 g, 0,2 mol) y ácido 3-(m-nitrobenciloxi)acridina-9-carboxílico (3,75 g, 0,02 mol) en 300 ml de piridina a temperatura ambiente. Después de 2 horas, se añadió éster bencílico de ácido 4-hidroxi-3,5-dimetilbenzoico (3,1 g, 0,023 mol, preparado a partir de ácido 4-hidroxi-3,5-dimetilbenzoico, carbonato de potasio y bromuro de bencilo en DMF a temperatura ambiente, p.f. 104-106ºC) a la solución transparente. Después de 18 horas, se evaporó la solución, se disolvió el residuo en acetato de etilo y se lavó con HCl 1 N, NaOH 1 N y una solución de NaCl (10%). Después de secar sobre sulfato de sodio y de evaporar, se sometió el residuo (42 g) a cromatografía instantánea (columna: 7 cm de diámetro) con CH_{2}Cl_{2} + 5% de acetato de etilo. Rendimiento: 5,2 g (87%), cristalizados a partir de acetato de etilo/hexano. P.f. 147-148ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 8,42-7,32 (18H, ar.) y 5,50 ppm (4H, s, 2CH_{2}).

3-(m-Aminobenciloxi)acridina-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo

Se sometió una mezcla de 3-(m-nitrobenciloxi)acridina-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo (3 g, 5,1 mmol), carbón (1,3 g), cloruro de hierro(III) hexahidrato (0,18 g, 0,7 mmol), 40 ml de N,N-dimetilhidrazina y 250 ml de metanol seco a reflujo con agitación. Al cabo de 4 horas, se enfrió la mezcla y se filtró y se extrajo exhaustivamente el residuo con CHCl_{3} y se evaporó el filtrado a sequedad. Se recogió entonces el residuo en un embudo Büchner y se lavó con éter dietílico. Rendimiento: 2,5 g (84%), p.f. 184-186ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 5,40 (2H, s, CH_{2}), 5,20 (2H, s, CH_{2}) y 3,75 ppm (2H, s, NH_{2}, intercambiable). MS: M^{+}=582.

Rojo Texas-3-ABO-DMAeE-Bz

Se agitó una mezcla de Rojo Texas (cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101, 0,625 g, 1,0 mmol), 3-(m-aminobenciloxi)acridina-9-carboxilato de (4'-bencil-oxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo (1,164 g, 2,0 mmol) y 30 ml de CH_{2}Cl_{2} bajo argón a temperatura ambiente. Después de 20 horas, se evaporó la solución y se sometió el residuo a cromatografía instantánea en gel de sílice (columna: 5,5 cm de diámetro) con CHCl_{3} + 3% de metanol (fracciones de 50 ml). Se recogieron las fracciones 21-38, se evaporaron y se cromatografiaron una vez más sobre Al_{2}O_{3} (Brockman, Neutral, Akt. 1). La primera zona roja (disulfonamida) eluyó con CHCl_{3} + 3% de metanol y una segunda zona roja de Rojo Texas-3-ABO-DMAeE-Bz eluyó con CHCl_{3} + 6% de metanol. Rendimiento: 0,40 g (34%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 8,89 (1H, d, ar.), 8,41 (1H, s, NH, intercambiable), 8,32-7,13 (20H, ar.), 6,70 (2H, s, ar.), 5,40 (2H, s, CH_{2}), 5,19 (2H, s, CH_{2}), 3,28, 2,78, 2,48 , 1,90 (24H, m, 12CH_{2}) y 2,40 ppm (6H, s, 2CH_{3}). M S: MH^{+} = 1170,8. UV/VIS (CHCl_{3}): \lambda_{máx} = 578 nm.

Rojo Texas-3-ABO-DMAE-Bz

Se dejaron reposar Rojo Texas-3-ABO-DMAeE-Bz (46,8 mg, 4 x 10^{-5} mol) y trifluorometanosulfonato de metilo (78,7 mg, 48 x 10^{-5} mol) en 10 ml de CH_{2}Cl_{2} a temperatura ambiente. Después de 18 horas, se evaporó la solución a vacío a temperatura ambiente y se recogió el residuo con éter dietílico en un embudo Büchner y se secó durante 24 horas a temperatura ambiente bajo un alto vacío. Rendimiento: 45 mg (95%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 9,82 (1H, s, intercambiable), 8,53-7,33 y 6,40 (23H, ar.), 5,40 (4H, s, 2CH_{2}), 3,45 (3H, s, CH_{3}NH^{+}) y 2,46 ppm (6H, s, 2CH_{3}). MS: M^{+} = 1148,8. UV/VIS (CHCl_{3}): \lambda_{máx} = 590 nm.

Ejemplo 11 Síntesis de Rojo Texas-3-APO-DMAE-Bz - Esquema XI

20

200

p-Tolilsulfonato de \omega-azidopropilo

A una mezcla de azida sódica (26,0 g, 0,4mol) y 200 ml de DMF, se añadió 3-bromopropanol (35,0 g, 0,4 mol) gota a gota con agitación a temperatura ambiente y se calentó después a 110ºC. Después de 23 horas, se enfrió la mezcla y se añadieron 1.000 ml de éter dietílico y 500 ml de agua y se realizó la separación. Se extrajo la fase acuosa dos veces con 500 ml de éter dietílico y se lavó la fase orgánica cuatro veces con 600 ml de agua. La desecación sobre sulfato de sodio y la evaporación dieron 16,3 g (40%) de \omega-azidopropanol como un líquido amarillento.

A una mezcla de \omega-azidopropanol bruto (10,1 g, 0,1 mol) y 50 ml de piridina, se añadió cloruro de p-toluolsulfonilo (19,1 g, 0,1 mol) con agitación a 0ºC en 6 porciones. Después de 3 horas, se vertió la mezcla en agua, se extrajo con éter dietílico y se lavó con HCl 1 N. La desecación sobre sulfato de sodio y la evaporación dieron 22,5 g (88%) de p-tolilsulfonato de \omega-azidopropilo como un líquido amarillento. ^{1}H RMN: 7,80, 7,63 (4H, A_{2}B_{2}, ar.), 4,12 (2H, t, CH_{2}), 3,40 (2H, t, CH_{2}), 2,46 (3H, s, CH_{3}) y 1,90 ppm (2H, quint., CH_{2}).

Éster metílico del ácido 3-(\omega-azidopropiloxi)acridina-9-carboxílico

Se disolvió 3-hidroxiacridina-9-carboxilato de metilo (0,2 g, 0,04 mol) en 1.000 ml de DMF, se añadieron luego carbonato de potasio (22,2 g, 0,16 mol) y p-tolilsulfonato de \omega-azidopropilo (15,2 g, 0,15 mol) y se agitó a temperatura ambiente. Al cabo de 5 horas, se añadió otra cantidad de la azida (5,2 g, 0,05 mol) y se continuó agitando a temperatura ambiente durante 19 horas. Se filtró el carbonato de potasio y se evaporó el filtrado a vacío a sequedad. Se sometió el residuo a cromatografía instantánea con CH_{2}Cl_{2} + 5% de acetato de etilo. Rendimiento: 8,0 g, cristalizados a partir de éter diisopropílico. P.f. = 96-97ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 8,18 (1H, d, ar.), 7,97 (1H, d, ar.), 7,90 (1H, d, ar.), 7,78 (1H, m, ar.), 7,55 (1H, m, ar.), 7,49 (1H, s, ar.), 7,28 (1H, d, ar.), 4,30 (2H, t, CH_{2}), 4,20 (3H, s, CH_{3}), 3,60 (2H, t, CH_{2}) y 2,18 ppm (2H, quint., CH_{2}). MS: M^{+} = 366.

Ácido 3-(\omega-azidopropiloxi)acridina-9-carboxílico

Se sometió a reflujo éster metílico de ácido 3-(\omega-azidopropiloxi)acridina-9-carboxílico (0,673 g, 2,0 mmol) en 40 ml de dioxano y 30 ml de NaOH 1 N. Después de 1 hora, se enfrió la solución, se acidificó a pH 1 con HCl conc. y se evaporó luego a vacío. Se recogió el precipitado en un embudo Büchner, se lavó con agua y se secó a vacío a 50ºC. Rendimiento: 0,58 g (86%), p.f. 252ºC (desc.). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 8,20-7,35 (7H, ar.), 4,32 (2H, t, CH_{2}), 3,60 (2H, t, CH_{2}) y 2,10 (2H, quint., CH_{2}). MS: M+H^{+} = 323.

3-(\omega-Azidopropiloxi)acridina-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo

Se agitaron cloruro de p-toluolsulfonilo (57 g, 0,3 mol) y ácido 3-(\omega-azidopropiloxi)acridina-9-carboxílico (9,5 g, 0,03 mol) en 750 ml de piridina a temperatura ambiente. Después de 3 horas, se añadió éster bencílico de ácido 4-hidroxi-3,5-dimetilbenzoico (9,2 g, 0,036 mol). Después de 20 horas, se evaporó la solución, se disolvió el residuo en acetato de etilo y se lavó con HCl 1 N, NaOH 1 N y una solución de NaCl (10%). Después de secar sobre sulfato de sodio y de evaporar, se sometió el residuo a cromatografía instantánea (columna de 10 cm de diámetro) con CH_{2}Cl_{2} + 5% de acetato de etilo. Rendimiento. 13,2 g (78%), cristalizados a partir de éter diisopropílico. P.f. 91-93ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 8,40-7,33 (14H, ar.), 5,40 (2H, s, CH_{2}), 4,32 (2H, t, CH_{2}), 3,10 (2H, t, CH_{2}), 2,48 (6H, s, 2CH_{3}) y 2,20 ppm (2H, quint., CH_{2}). MS: M^{+} = 560.

3-(\omega-Aminopropiloxi)acridina-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo

Se agitaron 3-(\omega-azidopropiloxi)acridina-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo (2,8 g, 5
mmol) y trifenilfosfina (2,6 g, 10 mmol) en 100 ml de THF a temperatura ambiente durante 6 horas, se añadió luego agua (2,5 ml) y se continuó agitando durante 17 horas. Se evaporó entonces la solución y se añadieron 200 ml de éter dietílico y 80 ml de HCl 1 N. Se filtró el precipitado y se repartió entre 100 ml de CHCl_{3} y 50 ml de NaOH 1 N; se lavó entonces la fase orgánica con una solución de NaCl (10%), se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó a sequedad. Rendimiento: 3,3 g de aceite viscoso (96%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 8,40-7,30 (14H, ar.), 5,40 (2H, s, CH_{2}), 4,30 (2H, t, CH_{2}), 2,95 (2H, t, CH_{2}), 2,45 (6H, s, 2CH_{3}) y 2,08 ppm (2H, quint., CH_{2}). MS: M^{+} = 534.

Rojo Texas-3-APO-DMAeE-Bz

Se agitó una mezcla de Rojo Texas (cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101, 1,068 g, 1 mmol), 3-(\omega-aminopropiloxi)acridina-9-carboxilato de (4'-benciloxicarbonil-2',6'-dimetil)fenilo (0,626 g, 2 mmol) y 70 ml de CH_{2}Cl_{2} bajo argón a temperatura ambiente. Después de 20 horas, se evaporó la solución y se cromatografió sobre Al_{2}O_{3} (Brockman, A, Akt. 1) con CHCl_{3} + 3% de metanol (fracciones de 30 ml). Las primeras 5 fracciones contenían la disulfonamida. La segunda zona roja contenía el producto deseado, se recogieron las fracciones 16-38 y se evaporaron a sequedad. Rendimiento: 0,265 g (24%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 8,88, 8,38-7,23 y 6,80 (19H, ar.), 5,85 (1H, t, NH, intercambiable), 5,40 (2H, s, CH_{2}), 2,44 (6H, s, 2 CH_{3}), 4,25, 4,40, 2,95, 2,75, 2,69, 2,20, 2,02 y 1,88 ppm (30H, 15, m, CH_{2}). MS: MH^{+} = 1122,8. UV/VIS (CHCl_{3}): \lambda_{máx} = 577 nm.

Rojo Texas-3-APO-DMAE-Bz

Se dejaron rojo Texas-3-APO-DMAeE-Bz (45 mg, 4 x 10^{-5} mol) y trifluorometanosulfonato de metilo (78,7 mg, 48 x 10^{-5} mol) en 10 ml de CH_{2}Cl_{2} en reposo a temperatura ambiente. Después de 20 horas, se evaporó la solución a vacío a temperatura ambiente y se recogió el residuo con éter dietílico en un embudo Büchner y se secó durante 24 horas a temperatura ambiente a alto vacío. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 8,68, 8,50-7,35 y 6,67 (19H, ar.), 8,56 (1H, d, intercambiable), 5,40 (2H, s, CH_{2}), 3,78 (3H, s, CH_{3}), 2,45 (6H, s, 2 CH_{3}), 4,56, 3,51, 3,02, 2,75, 2,32, 2,10 y 1,75 ppm (30H, m, 15CH_{2}). MS: M^{+} = 1136,7. UV/VIS (CHCl_{3}): \lambda_{máx} = 592 nm.

Ejemplo 12 Síntesis de rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina - Esquema XII

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210

Aminohexilamidoteofilina (Teofilina-HD)

A una solución que contenía 30 mg (0,113 mmol) de 8-carboxipropilteofilina en 1,5 ml de DMF anhidra se añadieron 69,7 mg (0,339 mmol) de DCC y 77,8 mg (0,678 mmol) de NHS. Se dejó agitar a la reacción a temperatura ambiente durante 16 horas para formar el éster NHS de la 8-carboxipropilteofilina. Se trató éste entonces con una solución de 131 mg (1,13 mmol) de 1,6-hexildiamina en 1 ml de tampón carbonato 0,2 M, pH 9,0, y 0,5 ml de DMF. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante tres horas y luego se separó en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (55 mg) eluyó con un tiempo de retención de 26 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: a 10% B durante 15 min. y luego hasta el 30% B en 10 min., a 30% B durante 10 min. y luego hasta el 100% B en 5 min; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (MALDI-TOF): m/z 365 (M+1).

Trifluoroacetato de 2-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de [4-(teofilina-8-butanoilamido)hexilamidocarbonil-2,6-dimetil]fenilo

Se trató una solución de bromuro de 2-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de (4-carboxil-2,6-dimetil)fenilo (10 mg, 0,0152 mmol) en un solvente mixto de acetonitrilo anhidro (1 ml) y DMF (0,5 ml) con DCC (12,5 mg, 0,061 mmol) y NHS (10,5 mg, 0,092 mmol). Después de 4 horas, se evaporó la reacción a presión reducida a sequedad. Se redisolvió el residuo en 1 ml de DMF anhidra y se filtró luego para eliminar los materiales insolubles. Se trató el filtrado con trietilamina (19 \mul, 0,137 mmol), seguido de adición de aminohexil-amidoteofilina (20 mg, 0,0547 mmol). Se dejó agitar a la reacción a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 horas. Se separó entonces la mezcla en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (18 mg) eluyó con un tiempo de retención de 25,6 min. en gradiente de etapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 30% B durante 15 min., luego hasta 60% B en 5 min. y a 60% B durante 20 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (MALDI-TOF): m/z 891 (M+1).

Trifluoroacetato de 2-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de [4-(teofilina-8-butanoilamido)hexilamidocarbonil-2,6-dimetil]fenilo

Se trató una solución de trifluoroacetato de 2-ftalimidometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de [4-(teofilina-8-butanoilamido)hexilamidocarbonil-2,6-dimetil]fenilo (15 mg, 0,0149 mmol) en 1,6 ml de metanol con hidrazina (42,2 ml, 1,345 mmol) durante una hora. Se separó la mezcla de reacción en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A, S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (12,8 mg) eluyó con un tiempo de retención de 25,6 min. en gradiente de tapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 20% B a 60% B en 30 min., 60% B durante otros 5 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (MALDI-TOF): m/z 762 (M+1).

Rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina

Se trató una solución de trifluoroacetato de 2-aminometil-10-metilacridinio-9-carboxilato de [4-(teo-filina-8-butanoilamido)hexilamidocarbonil-2,6-dimetil]fenilo (2 mg, 0,00233 mmol) en 1 ml de DMF anhidra que contenía 16,5 \mul (0,0297 mmol) de trietilamina con éster succinimidílico (5 mg, 0,00791 mmol) agitando a temperatura ambiente durante 3 horas. Se separó la mezcla de reacción en un sistema de HPLC Beckman prep-60 ADD-ON (YMC, Wilmington, NC, 300 x 20 mm, ODS-A,S-10, 120\ring{A}). El producto deseado (3,75 mg) eluyó con un tiempo de retención de 24,5 min. en gradiente de tapas mezclando TFA 0,05%/H_{2}O (solvente A) y TFA 0,05%/CH_{3}CN (solvente B) del siguiente modo: 20% B a 60% B en 30 min., 60% B durante otros 5 min.; velocidad de flujo: 16 ml/min; monitorización a 260 nm. MS (MALDI-TOF): m/z 1279 (M+1).

Ejemplo 13 Aplicación de un trazador ETC en un ensayo de unión competitiva

Se evaluó la funcionalidad de rendimiento de ensayo de la rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina (Esquema XII) como trazador ETC por comparación directa con el trazador de referencia DMAE-ED-teofilina (Figura 5). Se utilizó el ensayo automatizado de teofilina de Ciba-Corning ACS™, llevado a cabo en un sistema de quimioluminiscencia automatizado de Ciba-Corning: 180® (ACS: 180), con este fin. En este ensayo, las teofilinas marcadas con éster de acridinio y los patrones de teofilina (Ciba Corning Diagnostics Corp.) compiten por una cantidad limitada de anticuerpo monoclonal anti-teofilina murino, que fue covalentemente acoplado a una fase sólida de partículas paramagnéticas. Se incubó una mezcla de reacción que contenía 20 \mul de patrón de teofilina, 450 \mul de fase sólida y 100 \mul de sonda a 37ºC durante 7,5 minutos. Los patrones de teofilina contenían teofilina en concentraciones de 0,00, 1,25, 2,50, 5,00, 10,0, 20,0 y 40,0 \mug/ml. Se recogió la fase sólida en una disposición de imanes permanentes y se lavó dos veces con agua desionizada para eliminar el trazador no unido. Se inició la reacción quimioluminiscente según se ha descrito con anterioridad. Se recogieron los datos como fotones detectados por el ACS: 180 y se expresaron como RLU.

Existe una relación inversa no lineal entre la concentración de teofilina presente en el patrón y las RLU detectadas por el ACS:180. Los valores medios de RLU resultantes de una concentración específica de teofilina y representados aquí como \mu fueron calculados a partir de tres réplicas. Los reactivos de ensayo no trazadores también contribuyen con un número pequeño y a veces significativo de RLU. Por lo tanto, se llevó a cabo una reacción de control, que contenía todos los reactivos de ensayo excepto el trazador, paralelamente para determinar el fondo de reactivos no trazadores, representados aquí como b. Las RLU medias, \mu, fueron corregidas para representar las RLU obtenidas sólo del trazador, aquí representado B, donde B = \mu -b. Cuando la concentración de teofilina era de 0,00 \mug/ml, el valor medio corregido de RLU fue representado como B_{0}. Se examinaron varios criterios del ensayo competitivo estándar para evaluar la funcionalidad del trazador rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina. El parámetro principal para esta evaluación comparativa era %B/B_{0}. Además de %B/B_{0}, los indicadores secundarios del rendimiento comparativo eran la concentración mínima detectable de analito (sensibilidad) y %c.v.

Como con la concentración de teofilina y las RLU, existe una relación inversa no lineal entre la concentración de teofilina presente en el patrón y %B/B_{0}. El cálculo para %B/B_{0} era simplemente %B/B_{0} = 100 x B/B_{0}. La curva patrón, representada con la concentración de teofilina en el eje de las x frente a %B/B_{0} en el eje de las y, era común para los dos trazadores rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina y DMAE-ED-teofilina (Figura 6).

El desplazamiento competitivo del trazador rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina de la fase sólida por la teofilina indicaba la competencia funcional de la rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina como trazador para la cuantificación de la concentración de teofilina (Tabla 4).

TABLA 4 Cambio en %B/B_{0} en relación a la concentración de teofilina

22

Se usó regresión exponencial para aproximar la forma de la curva patrón a la forma de ecuación y = bm^{x} o

\hbox{x =}

(lny-lnb)/lnm. La sensibilidad teórica fue calculada como la concentración de teofilina para un valor B obtenido restando dos desviaciones estándar de la media corregida B_{0}. La concentración mínima detectable de teofilina usando rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina como trazador era comparable a la obtenida del trazador DMAE-ED-teofilina (Tabla 4).

Los valores de %c.v. para las tres réplicas a una concentración específica de teofilina fueron calculados como %c.v. = (100 x desviación estándar/\mu). Mientras que los valores %c.v. eran ligeramente superiores en conjunto para el trazador rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina, no lo eran de manera perjudicial, ya que los valores %c.v. objeto deben ser menores o iguales al cinco por ciento (Tabla 5).

TABLA 5 % C.V. para tres réplicas

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Aplicación de un trazador ETC en un ensayo de unión simultánea de doble analito Ensayo de unión doble de teofilina/cortisol

Se evaluó la funcionalidad de la rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina como trazador en un ensayo de doble analito para la cuantificación de teofilina con la determinación paralela de la concentración de cortisol usando un trazador NSP-DMAE-HD-3-CMO-cortisol (Figura 7). Se utilizó un ensayo manual que empleaba componentes idénticos o similares en cuanto a naturaleza a los antes descritos para este fin. Como con la interacción entre el trazador rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina, el patrón de teofilina y la fase sólida de unión a teofilina, el trazador NSP-DMAE-HD-3-CMO-cortisol y el cortisol de patrones que contenían cortisol (Ciba Corning Diagnostics Corp.) compiten por una cantidad limitada de anticuerpo policlonal anti-cortisol de conejo, covalentemente acoplado a una fase sólida de partículas paramagnéticas. Se incubó una mezcla de reacción que contenía 20 \mul de patrón de teofilina, 20 \mul de patrón de cortisol, 450 \mul de fase sólida de teofilina, 250 \mul de fase sólida de cortisol, 100 \mul de trazador rodamina-2-AM-DMAE-HD-teofilina y 50 \mul de trazador NSP-DMAE-HE-3-CMO-cortisol a temperatura ambiente durante 2 h. Los patrones de cortisol contenían cortisol en concentraciones de 0,00, 10,0, 20,0, 60,0, 120, 300 y 800 ng/ml, mientras que los patrones de teofilina eran los mismos que los antes descritos. La fase sólida fue recogida en una disposición de imanes permanentes y lavada dos veces con agua desionizada para eliminar el trazador no unido. Se inició la reacción quimioluminiscente como se ha descrito anteriormente. Se recogieron los datos como fotones en dos canales detectados por un Ciba-Corning Dual-PMT Fixture® (luminómetro dual) equipado con un filtro óptico Corion LL-550 (Figura 8) en PMT 1 y un filtro óptico Corion LS450 (Figura 9) en PMT 2. Los datos fueron expresados como RLU.

Como con el ensayo de teofilina, existe una relación inversa no lineal entre la concentración de cortisol presente en el patrón de cortisol y las RLU detectadas por el luminómetro dual. Se calcularon los parámetros del ensayo competitivo estándar como se ha descrito antes. La curva patrón, representada con la concentración de teofilina y cortisol en el eje de las x frente a %B/B_{0} en el eje de las y, ilustraba que las curvas patrón podían ser independientemente construidas a partir de un ensayo de analitos mixtos (Figuras 10 y 11).

Claims (23)

1. Un conjugado quimioluminiscente consistente en un resto de acridinio o benzacridinio covalentemente unido a un luminóforo mediante un espaciador, cuyo resto está además conjugado a una molécula biológica de interés, donde dicho espaciador es una primera cadena lateral que permite a la especie excitada generada por dicho resto transferir energía a dicho luminóforo, lo que da como resultado la emisión de luz en la región espectral de dicho luminóforo, cuyo conjugado tiene la fórmula (I) o (II):

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donde

uno de R_{1}, R_{2} o R_{3} es luminóforo unido a la primera cadena lateral que tiene una cadena lineal, ramificada o cíclica de alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo o aralquilo de menos de 50 Angstroms de longitud con hasta 20 heteroátomos;

cuando R_{1} no está substituido con un luminóforo unido a una primera cadena lateral, entonces R_{1} es alternativamente alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo que contiene eventualmente hasta 20 heteroátomos;

cuando R_{2} o R_{3} no están substituidos con un luminóforo unido a una primera cadena lateral, entonces R_{2} y R_{3} son alternativamente grupos idénticos o diferentes, sencillos o múltiples, en C_{1-14} y C_{5-8} para la fórmula (I) y en C_{1-4} para la fórmula (II), respectivamente, seleccionados entre el grupo consistente en hidrógeno, arilo substituido o no substituido, haluro, amino, hidroxilo, nitro, sulfonato, -R, -CN, -COOH, -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR y -NHC(O)R;

A^{-} es un contraión;

X es nitrógeno, oxígeno o azufre;

cuando X es oxígeno o azufre, Z se omite e Y es un resto arilo polisubstituido de fórmula:

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donde R_{4} y R_{8} son iguales o diferentes y cada uno es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo (-OR), alquiltiol (-SR) o amino substituido que sirve para estabilizar la unión -COX- entre el núcleo de acridinio o benzacridinio y el resto Y a través de un efecto estérico y/o electrónico, o uno de R_{4} y R_{8} es hidrógeno sin comprometer seriamente la estabilidad de la unión -COX-;

R_{5} y R_{7} son seleccionados entre el grupo consistente en hidrógeno, arilo substituido o no substituido, haluro, amino, hidroxilo, nitro, sulfonato, -R, -CN, -COOH, -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR y -NHC(O)R;

R_{6} es -R_{9}-R_{10}, donde R_{9} es una segunda cadena lateral, no necesaria pero que eventualmente puede ser un alquilo ramificado o de cadena lineal o un arilo o aralquilo substituido o no substituido que contiene eventualmente hasta 20 heteroátomos y R_{10} es un grupo saliente o un grupo funcional electrofílico unido a un grupo saliente seleccionado entre el grupo consistente en:

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un haluro, -COOH, -Q-R-Nu, -Q-R-I_{n}Nu-, -Q-Nu-, -R-Nu o -Nu, donde n es un número de al menos 1; Nu es un grupo nucleofílico; Q es una unión funcional e I es un grupo iónico o ionizable;

cuando X es nitrógeno, Y es (1) un grupo alquilo de cadena ramificada o lineal que contiene hasta 20 átomos de carbono y eventualmente hasta 10 heteroátomos, o (2) un grupo arilo o heteroarilo substituido o no substituido que contiene hasta 20 átomos de carbono; Z es

-SO_{2}-Y'; Y' se define igual que el Y anterior, donde Y e Y' son iguales o diferentes;

R es seleccionado entre el grupo consistente en alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y aralquilo que contienen de 0 a 20 heteroátomos;

R_{5}, R_{6} y R_{7} son intercambiables, y

R_{6} o R_{10} se conjugan con una molécula biológica de interés, y

donde dicho luminóforo es seleccionado entre el grupo consistente en (1) un resto fosforescente, (2) un fluoróforo o (3) el precursor de (1) o (2) que no es fosforescente o que no es fluorescente, pero que es convertible en un resto fosforescente o fluorescente mediante tratamiento químico o enzimático.

2. Un conjugado marcado quimioluminiscente según la reivindicación 1, donde dicha primera cadena lateral tiene menos de 30 Angstroms de longitud y hasta 12 heteroátomos, preferiblemente menos de 10 Angstroms y hasta 8 heteroátomos.

3. Un conjugado marcado quimioluminiscente según la reivindicación 1 ó 2, donde dicho espaciador contiene al menos una unión resultante del acoplamiento de las cadenas laterales del resto de acridinio o benzacridinio y dicho luminóforo, donde dicha unión es seleccionada entre el grupo consistente en -NHCO-, -CONH-, -NHCOO-, -O-,
-C=N-O-, -S-, -S-S-, -NHCO-NH-, -NHCSNH-, -C=N-, -NH-, -N=N-, -COO-, -C=C- y -SO_{2}NH-, -C=C-, -OPO_{3}-, -OSO_{3}- y -SO_{3}-.

4. Un conjugado marcado quimioluminiscente según la reivindicación 1, 2 ó 3, donde dicho luminóforo es capaz de producir un espectro de emisión en la región del azul al infrarrojo.

5. Un conjugado marcado quimioluminiscente según la reivindicación 4, donde dicho luminóforo es seleccionado entre el grupo consistente en un resto fosforescente, un resto fluorescente y un precursor de un resto fluorescente o fosforescente convertible en un resto fluorescente o fosforescente.

6. Un conjugado marcado quimioluminiscente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha molécula biológica de interés es seleccionada entre el grupo consistente en haptenos, ligandos, polisacáridos, polipéptidos, receptores, anticuerpos y ácidos nucleicos.

7. Un conjugado marcado quimioluminiscente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho R_{10} está unido a dicha cadena lateral y acoplado con dicha molécula biológica de interés y R_{6} es hidrógeno o R_{9}.

8. Un conjugado marcado quimioluminiscente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde (a) dicho luminóforo está covalentemente unido a través de la primera cadena lateral directa o indirectamente a dicho núcleo de acridinio o benzacridinio y a través de R_{10} a dicha molécula biológica de interés, y (b) R_{6} es hidrógeno o R_{9}.

9. Un conjugado marcado quimioluminiscente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde R6 está unido a dicha molécula biológica de interés y su localización está intercambiada con la de R_{1}, R_{2} o R_{3}, siendo dichos R_{1}, R_{2} o R_{3} substituyentes sin luminóforo.

10. Un agente de marcaje quimioluminiscente para conjugación con una molécula biológica de interés consistente en un resto de acridinio o benzacridinio covalentemente unido a un luminóforo mediante un espaciador, donde dicho espaciador es una primera cadena lateral que permite a la especie excitada generada por dicho resto transferir energía a dicho luminóforo, dando como resultado la emisión de luz en la región espectral de dicho luminóforo, cuyo agente tiene la fórmula (I) o (II):

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donde

uno de R_{1}, R_{2} o R_{3} es luminóforo unido a la primera cadena lateral que tiene una cadena lineal, ramificada o cíclica de alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo o aralquilo de menos de 50 Angstroms de longitud con hasta 20 heteroátomos;

cuando R_{1} no está substituido con un luminóforo unido a una primera cadena lateral, entonces R_{1} es alternativamente alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo que contiene eventualmente hasta 20 heteroátomos;

cuando R_{2} o R_{3} no están substituidos con un luminóforo unido a una primera cadena lateral, entonces R_{2} y R_{3} son alternativamente grupos idénticos o diferentes, sencillos o múltiples, en C_{1-14} y C_{5-8} para la fórmula (I) y en C_{1-4} y C_{6-11} para la fórmula (II), respectivamente, seleccionados entre el grupo consistente en hidrógeno, arilo substituido o no substituido, haluro, amino, hidroxilo, nitro, sulfonato, -R, -CN, -COOH, -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR y -NHC(O)R;

A^{-} es un contraión;

X es nitrógeno, oxígeno o azufre;

cuando X es oxígeno o azufre, Z se omite e Y es un resto arilo polisubstituido de fórmula:

28

donde R_{4} y R_{8} son iguales o diferentes y cada uno es un grupo alquilo, alquinilo, alcoxilo (-OR), alquiltiol (-SR) o amino substituido que sirve para estabilizar la unión -COX- entre el núcleo de acridinio o benzacridinio y el resto Y a través de un efecto estérico y/o electrónico, o uno de R_{4} y R_{8} es hidrógeno sin comprometer seriamente la estabilidad de la unión -COX-;

R_{5} y R_{7} son seleccionados entre el grupo consistente en hidrógeno, arilo substituido o no substituido, haluro, amino, hidroxilo, nitro, sulfonato, -R, -CN, -COOH, -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR y -NHC(O)R;

R_{6} es -R_{9}-R_{10}, donde R_{9} es una segunda cadena lateral, no necesaria pero que eventualmente puede ser un alquilo ramificado o de cadena lineal o un arilo o aralquilo substituido o no substituido que contiene de 0 a 20 hetero-átomos y R_{10} es un grupo saliente o un grupo funcional electrofílico unido a un grupo saliente seleccionado entre el grupo consistente en:

29

un haluro, -COOH, -Q-R-Nu, -Q-R-I_{n}Nu-, -Q-Nu-, -R-Nu o -Nu, donde n es un número de al menos 1; Nu es un grupo nucleofílico; Q es una unión funcional e I es un grupo iónico o ionizable;

cuando X es nitrógeno, Y es (1) un grupo alquilo de cadena ramificada o lineal que contiene hasta 20 átomos de carbono y eventualmente hasta 10 heteroátomos, o (2) un grupo arilo o heteroarilo substituido o no substituido que contiene hasta 20 átomos de carbono; Z es

-SO_{2}-Y'; Y' se define igual que el Y anterior, donde Y e Y' pueden tener composiciones químicas iguales o diferentes;

R es seleccionado entre el grupo consistente en alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y aralquilo que contienen de 0 a 20 heteroátomos;

R_{5}, R_{6} y R_{7} son intercambiables, y

R_{6} o R_{10} son capaces de conjugarse con una molécula biológica de interés, y donde dicho luminóforo es seleccionado entre el grupo consistente en (1) un resto fosforescente, (2) un fluoróforo o (3) el precursor de (1) o (2) que no es fosforescente o que no es fluorescente, pero que es convertible en un resto fosforescente o fluorescente mediante tratamiento químico o enzimático.

11. Un agente de marcaje quimioluminiscente según la reivindicación 10, donde dicha primera cadena lateral tiene menos de 30 Angstroms de longitud y hasta 12 heteroátomos, preferiblemente menos de 10 Angstroms de longitud y hasta 8 heteroátomos.

12. Un agente de marcaje quimioluminiscente según la reivindicación 10 ó 11, donde R_{10} está unido a dicha primera cadena lateral y es capaz de acoplarse con dicha molécula biológica de interés y R_{6} es hidrógeno o R_{9}.

13. Un agente de marcaje quimioluminiscente según la reivindicación 10 ó 11, donde R_{10} está unido a dicho luminóforo, cuyo luminóforo está covalentemente unido en un extremo a través de la primera cadena lateral a dicho núcleo de acridinio o benzacridinio y en el otro extremo es capaz de acoplarse con dicha molécula biológica de interés a través de R_{10} y R_{6} es hidrógeno o R_{9}.

14. Un agente de marcaje quimioluminiscente según la reivindicación 10 ó 11, donde R_{6} es capaz de unirse a dicha molécula biológica de interés e intercambia su localización con la de R_{1}, R_{2} o R_{3}, siendo R_{1}, R_{2} o R_{3} substituyentes sin luminóforo.

15. Un ensayo de unión consistente en:

a. poner en contacto un analito y al menos un compuesto o macromolécula marcada quimioluminiscente y

b. determinar (1) el grado de unión entre dicho analito y dicho compuesto o macromolécula marcada quimioluminiscente o (2) el desplazamiento competitivo o exclusión mutua de dicho compuesto o macromolécula marcada quimioluminiscente con respecto a una molécula de captura, donde dicho compuesto o macromolécula marcada quimioluminiscente es un conjugado marcado quimioluminiscente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

16. Un ensayo de unión según la reivindicación 15, donde se determinan al menos dos analitos usando al menos dos compuestos marcados quimioluminiscentes diferentes, siendo al menos uno de dichos compuestos dicho conjugado quimioluminiscente y teniendo cada uno de dichos compuestos o conjugados espectros de emisión discernibles.

17. Un ensayo de unión según la reivindicación 16, donde se determinan tres analitos usando tres compuestos marcados quimioluminiscentes diferentes, siendo al menos uno de dichos compuestos dicho conjugado quimioluminiscente y teniendo cada uno de dichos compuestos o conjugados espectros de emisión discernibles.

18. Un ensayo de unión según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde dicha determinación de dichos analitos puede ser realizada simultáneamente en el mismo medio de reacción.

19. Un kit de ensayo para determinar la presencia de al menos un analito en una muestra de ensayo, consistente en al menos un recipiente de un conjugado marcado quimioluminiscente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que tiene un espectro de emisión discernible.

20. Un kit de ensayo según la reivindicación 19, que además incluye un recipiente de un compuesto marcado quimioluminiscente, donde cada uno de dichos compuestos y dichos conjugados tienen espectros de emisión discernibles.

21. Un método de preparación de un agente de marcaje quimioluminiscente según la reivindicación 10 ó 11, que consiste en unir covalentemente un luminóforo activado a través de dicha primera cadena lateral a dicho núcleo de acridinio o benzacridinio.

22. Un método de producción de un conjugado marcado quimioluminiscente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, consistente en (a) unir covalentemente dicha molécula biológica de interés al R_{6} de dicho resto de acridinio o benzacridinio y unir luego covalentemente la primera cadena lateral de dicho resto de acridinio o benzacridinio a un luminóforo activado, o (b) unir covalentemente un luminóforo activado a la primera cadena lateral de dicho resto de acridinio o benzacridinio y unir luego covalentemente el R_{6} de dicho resto de acridinio o benzacridinio a dicha molécula biológica de interés.

23. Un método de producción de un conjugado marcado quimioluminiscente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, consistente en unir covalentemente dicha molécula biológica de interés a dicho resto de arilo substituido de dicho resto de acridinio o de benzacridinio y unir luego covalentemente dicho resto de acridinio o benzacridinio a un luminóforo a través de dicha primera cadena lateral.