ES2327141T3 - Compuestos luminiscentes dotados de un brazo de enlace funcionalizado utilizado en bioconjugacion y marcado de biomoleculas. - Google Patents

Compuestos luminiscentes dotados de un brazo de enlace funcionalizado utilizado en bioconjugacion y marcado de biomoleculas. Download PDF

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Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula general (I) siguiente, que incluye sus tautómeros de valencia:** ver fórmula** en donde Me es un metal de transición o un metal de tierras raras; R es un grupo funcional elegido del grupo constituido por -COOH, -OH, -NH 2, o es -R 10-Y en donde R 10 es una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada, que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio, y en donde Y se elige del grupo constituido por hidrógeno, carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato, isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxilo, fosforamidita, glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido, cloroacetamido, yodo-acetamido, haluro de sulfonilo, haluro de acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de N-hidroxisuccinimidilo, éster de N-hidroxisulfosuccinimidilo, éster de ftalimida, éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina mono- o di-halogensustituida, diazina mono- o di-halogen-sustituida, aziridina, éster de imida, hidrazina, azido-nitrofenilo, azida, 3-(2piridilditio)-propionamida, glioxal, aldehido, -C*CH y -COZ en donde Z es un grupo de partida; A y B son independientemente uno de otro: - de cero a 4 sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por hidrógeno, -COOH, -OH, -NO2, -OCH3, -SO3H, -SO3 - , -R11-Y'', en donde R 11 es una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH-, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio, y en donde Y'' se elige del grupo constituido por hidrógeno, carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato, isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxi-lo, fosforamidita, glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido, cloroacetamido, yodoacetamido, haluro de sulfonilo, haluro de acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de succinimidilo, éster de hidroxi-sulfosuccinimidilo, éster de ftalimida, éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina mono- o di-halogen-sustituida, diazina mono- o di-halogen-sustituida, aziridina, éster de imida, hidrazina, azido-nitrofenilo, azida, 3-(2-piridilditio)-propionamida, glioxal, aldehido, nitrofenilo, dinitrofenilo, trinitrofenilo, -C*CH y arilo opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por -SO 3H, carboxilo (-COOH), amino (-NH 2), carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi y -COZ'', en donde Z'' es un grupo de partida; - un condensado homocíclico o heterocíclico de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por hidrógeno, -SO 3 - , -SO3H, -COOH, -OH, -NO 2, -OCH 3, -NH 2, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R 12-Y'''' y -COZ'''', en donde R 12, Y'''' y Z'''' tienen el significado antes indicado para R10, Y y Z, respectivamente; o - un sistema condensado homocíclico o heterocíclico de 2 ciclos fusionados, que tiene 5 o 6 átomos en cada anillo, opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes elegidos del grupo constituido por hidrógeno, -SO 3 - , -SO3H, -COOH, -OH, -NO2, -OCH3, -NH2, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R13-Y'''''' y -COZ'''''', en donde R10, Y'''''' y Z'''''' tienen el significado antes indicado para R10, Y y Z, respectivamente; X se elige del grupo constituido por -O-, -S-, -Se-, -NH-, -C(CH3)2-NR100- y**ver fórmula** en donde R100 se elige del grupo constituido por hidrógeno y R14-Y'''''''', en donde R14 e Y'''''''' tienen el significado previamente definido para R10 e Y, respectivamente, y R55 y R66 son independientemente una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono está(n) sustituido(s) opcionalmente cada uno por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH-, o una agrupación de átomos de carbono cíclica aromática o no aromática, de 4, 5 o 6 miembros, en donde uno o mas átomos de carbono está(n) opcionalmente cada uno sustituido por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio; M es un contraión; m es un número entre -5 y +5; L1 y L2 son independientemente uno de otro un ligando bidentado elegido del grupo constituido por:** ver fórmulas** en donde D, E, G y Q tienen independientemente el significado definido anteriormente para A y B y T y W tienen cada uno, independientemente, el significado definido anteriormente para X.

Description

Compuestos luminiscentes dotados de un brazo de enlace funcionalizado utilizado en bioconjugación y marcado de biomoléculas.
El presente invento se refiere a compuestos luminiscentes que tienen brazo de enlace funcionalizado, su síntesis y empleo en la bioconjugación y marcado de biomoléculas, tal como, por ejemplo nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos (DNA, ARN o PAN) y proteínas, así como su empleo en la ejecución de ensayos analíticos y de diagnóstico in vitro e in vivo.
Existe una necesidad continua y en aumento para disponer de métodos altamente específicos y rápidos para la detección y cuantificación de sustancias químicas, bioquímicas y biológicas. Son de particular interés métodos para detectar y medir pequeñas cantidades de fármacos, metabolitos, micro-organismos y otros materiales valiosos en diagnóstico, tal como, por ejemplo fármacos para uso terapéutico, hormonas, micro-organismos patogénicos y virus, marcadores de tumores, anticuerpos, enzimas, ácidos nucleicos, narcóticos, venenos y drogas de adicción. Estos materiales se detectan y determinan de conformidad con técnicas ahora bien establecidas que explotan la ligazón de alta especificidad entre componentes bioquímicos, tales como los que se encuentran, por ejemplo, en el antígeno-anticuerpo, sistemas de proteína-ligando y en hibridización de ácido nucleico. En estos métodos la presencia del componente diagnósticamente valioso se detecta típicamente por la presencia o ausencia de una molécula visualizable, un llamado trazador, por medio de una técnica químico-física, tal como, por ejemplo detección de radioactividad, color, luminiscencia, por ejemplo fluorescencia, fosforescencia, quimiluminiscencia y electroquimiluminiscencia.
La electroquimiluminiscencia (ECL), o quimiluminiscencia electro-generada, consiste en la producción de luz en la proximidad de una superficie de electrodo siguiendo la formación de especies que pueden originar reacciones de transferencia de electrones altamente energéticas.
ECL se origina mediante annihilación en una reacción de transferencia de electrones entre una especie oxidada y una reducida, ambas generadas en el electrodo por impulsos alternativos del potencial.
A + e- -> A^{\bullet}
(reducción)
D - e- -> D^{\bullet}+
(oxidación)
A^{\bullet -} + D^{\bullet +} -> A^{*} + D
(formación de estado excitado)
A* -> A + hv
(emisión)
El potencial de electrodo operativo oscila rápidamente entre dos valores potenciales, de modo que genera la especie reducida A^{\bullet +} y la especie oxidada D^{\bullet +}, que reaccionaran luego cerca de la superficie de electrodo para formar el estado emisor A*.
Sin embargo, este tipo de reacción implica el uso de disolventes no acuosos (por ejemplo dimetilformamida, acetonitrilo) rigurosamente purificados y desoxigenados, puesto que el rango de potencial disponible en agua es muy estrecho para generar los precursores altamente energéticos requeridos.
La generación de ECL de una etapa utilizando un co-reactivo apto para generar especies altamente oxidantes o reductoras es de particular interés para aplicaciones prácticas.
Por ejemplo, en el sistema de Ru(bpy)_{3}^{2+}/(CH_{3}CH_{2}CH_{2})_{3}N:
se produce ECL siguiendo la oxidación simultánea de Ru(bpy)_{3}^{2+} y (CH_{3}CH_{2}CH_{2})_{3}N,
100
Este procedimiento implica la formación de una especie altamente reductora, C_{9}H_{20}N^{*}, a través de una secuencia de oxidación inicial.
El estado excitado que se forma en la reacción de ECL es la misma que se forma en una foto-excitación normal y por consiguiente produce la misma luminiscencia que se obtiene de una espectroscopia de foto-luminiscencia.
El reactivo electroquimiluminiscente puede utilizarse para marcar moléculas biológicamente interesantes, tal como ADN o anticuerpos, justo como un reactivo foto-luminiscente. Sin embargo, en contraste con métodos de fluorescencia, ECL no requiere el uso de fuentes de excitación de luz y por consiguiente resulta como inmune de interferencia por impurezas luminiscentes o luz difusa. Los métodos de ECL son de considerable interés para determinar muchas moléculas químicas y biológicas, facilitando análisis altamente sensibles, selectivos y alta gama dinámica. La ECL aparece
muy prometedora para el desarrollo de métodos analíticos para moléculas biológicas y diagnostica mente interesantes.
Los métodos electroquimiluminiscentes para determinar la presencia de analitos de interés son preferibles comparados con otros métodos debido a que se reduce el ruido de fondo, debido a que en las muestras biológicas no existe especie alguna a su vez electroquimiluminiscente que pueda interferir con el ensayo analítico. En adición, la formación de las especies luminiscentes en solución tiene lugar electroquímicamente, mientras que la detección se produce a través de medios ópticos: se elimina de este modo la necesidad de utilizar filtros ópticos en orden a separar la luz de excitación de la luz de emisión, como sucede usualmente en técnicas que utilizan fluorescencia. Los compuestos químicos mas apropiados utilizados en ensayos analíticos basados en electroquimiluminiscencia son complejos de metal de transición, cuyos ligandos están generalmente bidentados. En química, un complejo es una estructura compuesta de un átomo de metal de núcleo o ión circundado por una serie de iones con carga negativa o moléculas neutras que poseen dobletes electrónicos. Un complejo se denomina también compuesto de coordinación o complejo metálico. Los iones o moléculas que circundan el metal se denominan ligandos. Los ligandos son átomos o moléculas capaces de donar un par electrónico al metal, usualmente a través de un doblete electrónico disponible. Ejemplos de ligandos son cloro, amonio, agua, piridina y el grupo tiocianato. Estos tipos de ligandos que forman solo una unión con el átomo de núcleo se denominan monodentados. Los ligandos pueden ser también moléculas aptas para ocupar mas de una posición de coordinación en el mismo metal de núcleo, si en su estructura contienen mas de un átomo capaz de donar dobletes electrónicos. En estos casos se hace referencia a ligandos bidentados, tridentados, quadridentados o, mas genéricamente, polidentados.
Los procesos de ECL son conocidos para muchas moléculas diferentes y particularmente para complejos de metal de transición, tales como rutenio, osmio y renio. Con el fin de ser utilizables en ensayos analíticos y biológicos, los complejos deben contener grupos funcionales que permitan su unión, o su conjugación, a sustancias biológicas analíticamente interesantes, tales como anticuerpos, oligonucleótidos, nucleótidos, biotina, avidin, o a compuestos sintéticos utilizables en ensayos analíticos. Grupos funcionales útiles para conjugación se localizan sobre los ligandos metálicos o en el extremo de una cadena de átomos químicamente enlazados al ligando.
Los complejos de metal de transición utilizables en ensayos analíticos o bioanalíticos son conocidos en el arte. Por ejemplo la patente US 5221605 (Bard and Whitesides) describe complejos de ruetenio y osmio que tienen bipiridina opcionalmente sustituida, bipiracina y fenantrolina como los ligandos, conjugados a sustancias biológicas. La patente EP 0658564 (Massey et al.) describe rutenio electroquimiluminiscente y complejos de osmio, en donde los ligandos son bipiridinas, uno de los cuales se modifica con un grupo reactivo. La patente EP 0178450 (Müller and Schmidt) describe complejos metálicos que tienen ligandos de bipiridina o fenantrolina sulfonados o carboxilados, con el fin de aumentar su solubilidad en soluciones acuosas. La patente US 5981286 (Hermann et al.) describe complejos de metal conteniendo ligandos de bipiridina o fenantrolina hidrofílicos.
Un objeto del presente invento es proporcionar compuestos luminiscentes de tipo complejo de metal de transición provisto con un brazo de enlace apropiado para la formación de un conjugado con una biomolécula, tal como, por ejemplo, nucleósido, nucleótido, ácido nucleico o proteína, o con un segundo compuesto apto para modificar las caracte-
rísticas químico-físicas, electroquímicas y espectroquímicas de compuestos luminiscentes o de formar un par FRET.
Este objeto se obtiene mediante un compuesto que tiene la fórmula general siguiente (I), incluyendo sus tautómeros de valencia:
1
en donde
Me es un metal de transición o un metal de tierras raras;
R es un grupo funcional elegido del grupo constituido por -COOH, -OH, -NH_{2}, o es -R_{10}-Y en donde R_{10} es una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada, que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio, y en donde Y se elige del grupo constituido por hidrógeno, carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato, isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxilo, fosforamidita, glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido, cloroacetamido, yodoacetamido, haluro de sulfonilo, haluro de acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de N-hidroxisuccinimidilo, éster de N-hidroxisulfosuccinimidilo, éster de ftalimida, éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina mono- o di-halogen-sustituida, diazina mono- o di-halogen-sustituida, aziridina, éster de imida, hidrazina, azidonitrofenilo, azida, 3-(2-piridilditio)-propionamida, glioxal, aldehido, -C\equivCH y -COZ en donde Z es un grupo de partida;
A y B son independientemente uno de otro:
- de cero a 4 sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por hidrógeno, -COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3}, -SO_{3}H, -SO_{3}^{-}, -R_{11}-Y', en donde R^{11} es una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH-, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio, y en donde Y' se elige del grupo constituido por hidrógeno, carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato, isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxilo, fosforamidita, glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido, cloroacetamido, yodoacetamido, haluro de sulfonilo, haluro de acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de succinimidilo, éster de hidroxi-sulfosuccinimidilo, éster de ftalimida, éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina mono- o di-halogen-sustituida, diazina mono- o di-halogen-sustituida, aziridina, éster de imida, hidrazina, azidonitrofenilo, azida, 3-(2-piridilditio)-propionamida, glioxal, aldehido, nitrofenilo, dinitrofenilo, trinitrofenilo, -C\equivCH y arilo opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por -SO_{3}H, carboxilo (-COOH), amino (-NH_{2}), carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi y -COZ', en donde Y' y Z tienen el significado definido previamente para R_{10}, Y y Z;
- un condensado homocíclico o heterocíclico de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por hidrógeno, -SO_{3}^{-}, -SO_{3}H, -COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3}, -NH_{2}, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R_{12}-Y'' y -COZ'', en donde R_{12}, Y'' y Z'' tienen el significado antes indicado para R_{10}, Y y Z, respectivamente; o
- un sistema condensado homocíclico o heterocíclico de 2 ciclos fusionados, que tiene 5 o 6 átomos en cada anillo, opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes elegidos del grupo constituido por hidrógeno, -SO_{3}^{-}, -SO_{3}H,
-COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3}, -NH_{2}, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R_{13}-Y''' y -COZ''', en donde R_{10}, Y''' y Z''' tienen el significado antes indicado para R_{10}, Y y Z, respectivamente;
X se elige del grupo constituido por -O-, -S-, -Se-, -NH-, -C(CH_{3})_{2}-NR_{100}- y
2
en donde R_{100} se elige del grupo constituido por hidrógeno y R_{14}-Y'''', en donde R_{14} e Y'''' tienen el significado previamente definido para R_{10} e Y, respectivamente, y R_{55} y R_{66} son independientemente una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono está(n) sustituido(s) opcionalmente cada uno por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH-, o una agrupación de átomos de carbono cíclica aromática o no aromática, de 4, 5 o 6 miembros, en donde uno o mas átomos de carbono está(n) opcionalmente cada uno sustituido por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio;
M es un contraión; m es un número entre -5 y +5;
L_{1} y L_{2} son independientemente uno de otro un ligando bidentado elegido del grupo constituido por:
3
4
en donde D, E, G y Q tienen independientemente el significado definido anteriormente para A y B y T y W tienen cada uno, independientemente, el significado definido anteriormente para X.
De preferencia los grupos de partida Z, Z',Z'',Z''' y Z'''' se eligen independientemente uno de otro del grupo constituido por -Cl, -Br,-I, -OH, -OR_{22}, -OCOR_{22}, en donde R_{22} es alquilo C_{1}-C_{4} lineal o ramificado (por ejemplo metilo, etilo, t-butilo o i-propilo), -O-CO-Ar, en donde Ar es arilo opcionalmente sustituido, -O-CO-Het, en donde Het es un sistema heterocíclico elegido de preferencia entre succinimida, sulfosuccinimida, ftalimida y naftalimida, -NR_{33}R_{44}, en donde R_{33} y R_{44} son cada uno independientemente alquilo C_{1}-C_{10} lineal o ramificado.
La expresión "átomo de carbono opcionalmente sustituido", como se utiliza antes, indica que este átomo de carbono puede estar sustituido por uno de los componentes o heteroátomos antes indicados.
En la continuación de la descripción los compuestos del presente invento ilustrados por la fórmula (I) se referirán como "complejos ECL".
Los complejos ECL son complejos luminiscentes, o sea complejos que son aptos para generar una reacción luminiscente detectable. La reacción luminiscente puede detectarse, por ejemplo, por medio de mediciones fluorescentes o electroquimiluminiscentes. En estos complejos el catión metálico es un metal de transición o un metal de tierras raras, de preferencia elegido del grupo constituido por Ru, Os, Re, Ir, Rh, Mo, Pt, Pd, In, Tc, Cu, W, Fe, Co, Va, Cr. Se prefiere particularmente rutenio, iridio, renio, cromo y osmio.
Los complejos de ECL de conformidad con el presente invento difieren de los complejos metálicos conocidos en el arte porque contienen por lo menos un ligando de tipo piridilbenz-X-azólico funcionalizado, en donde X puede ser -O-, -S-, -Se-, -NH-, -C-, -C(CH_{3})_{2}-, -NR_{100}- o
5
Los ligandos de piridilbenz-X-azólico son particularmente ventajosos comparados con los ligandos conocidos previamente citados puesto que, cambiando simplemente el átomo X, puede obtenerse una serie homóloga de ligandos que permitan modulación de las características electroquímicas y fotofísicas de los complejos sintetizados con estos. Con el empleo de diferentes ligandos piridilbenz-X-azólicos es posible por tanto, sintetizar complejos de metal de transición con diferentes características electroquímicas y fotofísicas y utilizarlos en ensayos analíticos múltiples, o sea ensayos en donde cada analito se detecta de un complejo diferente.
Así pues, ventajosamente, el presente invento proporciona una serie homóloga de compuestos luminiscentes de tipo de complejo de metal de transición conteniendo por lo menos un ligando de tipo piridilbenz-X-azólico, apto para emitir luminiscencia a diferentes longitudes de onda, o caracterizado por diferentes potenciales de oxidación, y también sintetizable con un método similar para todos los elementos de la serie. Los compuestos del presente invento pueden utilizarse, por consiguiente, en análisis analíticos múltiples, facultando la detección simultánea de mas analitos, siendo cada uno de estos conjugado con un compuesto luminiscente diferente de conformidad con el invento.
La síntesis del ligando piridilbenzo-X-azólico contempla una reacción de dos etapas, seguido de la introducción de un grupo funcional (R en la fórmula (I)) conteniendo un grupo reactivo. Los grupos reactivos preferidos son grupos de éster activos, tales como éster de N-hidroxisuccinimilo, ácidos carboxílicos, grupos amino, tioles, maleimidas, hidrazinas. Opcionalmente, además del grupo R funcional, pueden adicionarse grupos funcionales adicionales (A,B en la fórmula (I)).
Para funcionalización con éxito, dadas las drásticas condiciones de reacción en donde se opera, es necesario proteger el grupo reactivo con un grupo protector que pueda separarse fácilmente en condiciones que no comprometan la estructura del propio complejo. En caso que el grupo reactivo sea un ácido carboxílico, se ha establecido que el grupo de bencilo es un grupo protector excelente que satisfaga estas exigencias, el cual se separa con una hidrólisis básica.
Las etapas siguientes pueden esquematizar la síntesis de complejos de ECL del presente invento:
a) síntesis de ligando piridilbenz-X-azólico
b) síntesis del intermedio Me(L_{1})(L_{2})Cl_{2}
c) síntesis del complejo M Me(L_{1})(L_{2})(ligando benz-X-azólico)]^{m}
\vskip1.000000\baselineskip
El ligando benz-X-azólico puede sintetizarse, por ejemplo, a partir de la 4-picolina de conformidad con el esquema siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema 1
\vskip1.000000\baselineskip
6 
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La funcionalización del ligando se lleva a cabo explotando la reactividad del metilo picolínico, cuya baja acidez requiere el uso de bases fuertes, tal como diisopropilamida de litio (LDA). El carbanión así obtenido se hace reaccionar con un bromuro de alquilo, adecuadamente sustituido con el grupo reactivo que ha de introducirse en el ligando, de conformidad con lo que se expone en el Esquema 2. En caso de introducirse un ácido alquil-carboxílico, el uso de LDA requiere la protección del grupo carboxílico como un éster bencílico, separable mediante una hidrólisis básica. El esquema que sigue ilustra la introducción de un brazo de enlace funcionalizado por un ácido carboxílico.
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Esquema 2
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Cuando X en la fórmula (I) es nitrógeno, existen dos formas posibles de obtener el ligando funcionalizado. La primera pasa a través de cuaternarización de uno de los dos átomos de nitrógeno imidazólico con un grupo alquilo (Esquema 3) y la funcionalización subsiguiente a través del metilo picolínico, como se ilustra en el Esquema 2.
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Esquema 3
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En el segundo el ligando se funcionaliza selectivamente en el grupo NH imidazólico mediante desprotonación del grupo NH con ter-butilato potásico y reacción subsiguiente con un haluro de alquilo conteniendo el grupo funcional que ha de introducirse, como se ilustra en el Esquema 4.
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Esquema 4
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Las etapas b) y c) se exponen en los ejemplos 1 a 4 y pueden generalizarse para cualquier ligando L_{1} y L_{2}. En caso de que L_{1} y L_{2} sean dos ligandos diferentes será necesaria una purificación cromatográfica para obtener el compuesto deseado.
Otro objeto del presente invento es un conjugado de fórmula \alpha-\omega_{1}, en donde \alpha es por lo menos un complejo ECL de conformidad con el presente invento y \omega_{1} es una sustancia biológica. Ejemplos de sustancias biológicas que pueden utilizarse son células, virus, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleícos, oligosacáridos, polisacáridos, lipolisacáridos, metabolitos celulares, hormonas, sustancias farmacológicamente activas, alcaloides, esteroides, vitaminas, aminoácidos, azúcares, anticuerpos, antígenos, haptenos y sus fragmentos.
El complejo de ECL se une de preferencia a la sustancia biológica a través de un grupo funcional del propio complejo, que puede enlazarse covalentemente a un grupo funcional presente en la sustancia biológica. En caso de que, por ejemplo, el grupo funcional del complejo de ECL sea un éster reactivo, este puede reaccionar con un grupo amino libre de la biomolécula. En caso de que, por ejemplo, el grupo funcional del complejo de ECL sea una maleimida, este puede reaccionar con un grupo SH libre de la sustancia biológica. De modo análogo los grupos funcionales de la biomolécula pueden activarse y reaccionar, consecuentemente, con ácidos carboxílicos, grupos amino o tiólicos del complejo de ECL. Ejemplos preferidos de sustancias biológicas son biotina, ácidos nucleicos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, antígenos y haptenos.
Un conjugado \alpha-\omega_{2}, en donde \alpha es por lo menos un complejo de ECL de conformidad con el presente invento y \omega_{2} es un colorante fluorescente conjugado al complejo de ECL a través de un grupo funcional de este último, está también dentro del alcance del presente invento. El colorante fluorescente es una molécula apta para absorber a longitudes de onda en donde el complejo de ECL es apto para emitir, por ejemplo una cianina.
Un ejemplo específico no limitativo de un conjugado de esta índole es sal disódica de 1-(4-sulfonatobutil)-1'-{Ru(II) [6-[(2-2'-bipiridina)_{2}{2-[6-({[(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentil]amino}sulfonil)-3H-indol-2-il]esanoil-amino pentan}]}-1'3,3,3',3'-tetrametil-5,5'-disulfonato indodicarbocianina:
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Este conjugado se sintetiza haciendo reaccionar el complejo de ECL del invento bis(2,2'-bipiridina {2-[6-({[ácido 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentil]-amino)sulfonil)-3H-indol-2-il]esanoico rutenio (II) con la sal disódica de 1-(4-sulfonatobutil)-1'-(5-aminopentil)-3,3,3',3'-tetrametil-5,5'-disulfonato indodicarbocianina compuesto con un procedimiento similar al del ejemplo 5, en donde BSA se sustituye por fluoroforo.
Un conjugado de este tipo tiene propiedades ópticas muy interesantes que lo hacen particularmente útil como un trazador en aplicaciones bioanalíticas. Puede evidentemente excitarse electroquímicamente induciendo la emisión del complejo metálico mediante electroquimiluminiscencia a alrededor de 630 nm. Esta emisión se encuentra casi dentro del máximo de absorción de la indodicarbocianina enlazada al complejo que absorbe fotones emitidos por el complejo y a su vez se vuelve fotoexcitada, emitiendo fluorescencia a 665 nm.
En adición, un conjugado del tipo \alpha(\omega_{1}) (\omega_{2}), en donde \alpha es por lo menos un complejo de ECL de conformidad con el presente invento, \omega_{1} es una sustancia biológica como se ha definido antes conjugada al complejo de ECL a través de un primer grupo funcional, y \omega_{2} es un compuesto fluorescente como se ha definido antes conjugado al complejo de ECL a través de un segundo grupo funcional, queda también dentro del alcance del presente invento. Un conjugado de esta índole puede obtenerse haciendo reaccionar el complejo \alpha-\omega_{2}, como se ha definido antes, con una biomolécula \omega_{1}, por ejemplo albúmina de suero bovino (BSA), con un procedimiento similar al expuesto en el ejemplo 5.
Otro objeto del presente invento es el empleo de un conjugado \alpha-\omega_{1} o \alpha(\omega_{1}) (\omega_{2}) en un método para detección cualitativa y/o cuantitativa de un analito en una muestra que ha de probarse. En este contexto el conjugado \alpha-\omega_{1} o \alpha(\omega_{1}) (\omega_{2}) del presente invento se utiliza como un reactivo detectable específico. La especificidad de este reactivo se lleva a cabo por el componente \omega_{1} , que se elige de conformidad con el analito que ha de detectarse. Por el contrario el componente \alpha (complejo de ECL), opcionalmente en combinación con el colorante fluorescente \omega_{2}, representa un grupo marcador, o sea el componente del sistema analítico que es capaz de generar una señal detectable. De preferencia el grupo marcador se detecta por electroquimiluminiscencia, en cuyo caso la luminiscencia se genera electroquímicamente en una superficie de electrodo. Ejemplos de ensayos analíticos de electroquimiluminiscencia en donde se utilizan complejos de metal pueden hallarse en EP-A-0580979, WO 90/05301, WO 90/11511 y WO 92/14138. En adición el grupo marcador puede detectarse mediante fluorescencia, cuyo caso el complejo de ECL se excita por medio de radiación lumínica con una longitud de onda apropiada y se mide la emisión de fluorescencia resultante. Ejemplos de ensayos analíticos fluorescentes utilizando complejos de metal de transición pueden hallarse en EP-A-0178450 y EP-A-0255534, que se incorporan aquí como referencia.
Otro objeto del presente invento es un método analítico para la detección de un analito en una muestra, que comprende las etapas siguientes:
(i) contactar la muestra con un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 o 10, en condiciones apropiadas para la unión del conjugado al analito, de estar presente; y
(ii) determinar la presencia de la cantidad de analito unido al conjugado en la muestra midiendo la luminiscencia emitida por el conjugado unido al analito.
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Este método pueden también incluir una etapa en donde el analito se separe de los otros componentes de muestra antes del contacto con el conjugado. En un tipo de método de esta índole, el conjugado \alpha-\omega_{1} es por ejemplo un conjugado en donde \omega es un anticuerpo.
Además el método puede comprender una etapa en donde el analito se separa de los otros componentes de muestra mediante contacto con un segundo anticuerpo unido a una fase sólida.
Un segundo ejemplo es uno en donde el conjugado \alpha-\omega_{1} es un conjugado en donde \omega_{1} es una sonda de ADN y el analito se separa de los otros componentes de muestra mediante contacto con una segunda sonda de ADN unida a una fase sólida.
Los ejemplos que siguen ilustran la síntesis de algunos complejos de ECL preferidos del invento, su conjugación con moléculas biológicas (BSA, IgG), la caracterización espectroscópica y electroquímica de los mismos y un método analítico que utiliza conjugados de complejos de ECL con sustancias biológicas. Estos ejemplos se proporcionan a título de ilustración y no deben entenderse como limitativos del alcance del invento, como se define en las reivindicaciones anexas.
Ejemplo 1 Síntesis de [Ru(bpy)_{2}(LegN)(PF_{6})_{2}
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1a) Síntesis de [Ru(bpy)_{2}Cl_{2}]
Se disolvieron 1,50 g de RuCl_{3}3H_{2}O (5,74\cdot10^{-3} mol), 1,8 g de 2,2'-dipiridina (1,15.10^{-2} mol y 1,7 g de LiCl en 50 ml de N,N-dimetilformamida. Se desgasea la mezcla bajo Ar durante 15 minutos y luego se somete a reflujo durante 7 horas. Después de enfriamiento a temperatura ambiente se vierte la solución en 200 ml de acetona con rápida agitación. Luego se mantiene la solución durante la noche a 0ºC. El precipitado microcristalino formado se filtra, se lava con 75 ml de agua y 75 ml de éter etílico. se obtiene 1,60 g de [Ru(bpy)_{2}Cl_{2}].2H_{2}O con un rendimiento del 54%.
1b) Síntesis de éster bencílico del ácido 6-bromo-hexanoico
Una mezcla de ácido 6-bromo-hexanoico (0,10 mol), alcohol bencílico (0,10 mol), 4-dimetilaminopiridina
(1,78\cdot10^{-2} mol) y diclorometano (600 ml) se agita y se mantiene a 0ºC con un baño de hielo, luego se le adiciona N,N'-diciclohexilcarbodiimida (0,13 mol) se deja que reaccione durante 16 horas. Al final de la reacción se filtra la solución y se descarta el precipitado, mientras que la solución se lava repetidamente con H_{2}O descartándose el precipitado posiblemente formado. Se agrupan las fases orgánicas y se lavan de nuevo con una solución saturada de NaHCO_{3}, una solución de HCl 0,1 M y luego con agua. Se seca la solución con MgSO_{4}, se filtra y se separa el disolvente mediante evaporación en vacío.
Purificación con cromatografía instantánea, elución con una mezcla de éter de petróleo/acetato de etilo. Se obtiene un líquido oleoso con un rendimiento del 93%.
1c) Síntesis de ácido bencil 6-[2-(4-metilpiridin-2-il)-benzoimidazol-1-il)hexanoico (LegN-benz)
En un matraz de tres cuellos y fondo redondo, equipado con condensador, termómetro y agitador mecánico, se adicionan 450 g de ácido polifosfórico, 40 g (0,29 mol) de amida del ácido 4-metil-piridin-2-carboxílico y 31 g (0,29 mol) de o-fenilendiamina. Se calienta la mezcla a 210ºC durante 4 horas. Al final se enfría la mezcla a 70ºC y se adiciona el crudo a 1 L de agua. Se basifica con una solución acuosa al 50% de hidróxido sódico y se filtra el sólido obtenido. Cristaliza en etanol absoluto. El producto 2-(4-metilpiridin-2-il)-1H-benzoimidazol se obtiene con un rendimiento del 85%. Punto de fusión: 228-9ºC.
Se disuelven 10 g (0,048 mol) del compuesto de 2-(4-metilopiridin-2-il)-1H-benzoimidazol sintetizado en la etapa anterior en 100 ml de dimetilformamida anhidra a temperatura ambiente en un matraz de fondo redondo y tres cuellos y se adicionan 6,3 g (0,056 mol) de ter-butilato potásico recién sublimado. Después de 15 minutos de agitación se adiciona a gotas 46 g (0,16 mol) de éster bencílico del ácido 6-bromo-hexanoico y se calienta a 45ºC durante 15 horas. Después de enfriamiento se adicionan 100 ml de agua desionizada y se extrae la mezcla con acetato de etilo. Después de secado de las fases orgánicas con sulfato sódico anhidro se separa el disolvente mediante evaporación bajo vacío y se purifica el producto crudo mediante cromatografía instantánea sobre columna de gel de sílice, eluyéndose con un gradiente a partir de una mezcla de éter de petróleo/acetato de etilo (95:5) y terminando con una mezcla de éter de petróleo/acetato de etilo (70:30). Se obtiene un aceite ligeramente amarillo con un rendimiento del 75%.
1d) Síntesis de Ru(bpy)_{2}(LegN)](PF_{6})_{2}
En un matraz se disuelve en 50 ml de etilenglicol 7,69\cdot10^{-4} de [Ru(bpy)_{2}Cl_{2}]\cdot2H_{2}O y 1,15\cdot10^{3} mol de LegN-benz. Se desgasea la mezcla con Ar durante 15 minutos y luego se somete a reflujo durante 4 horas. Después de enfriamiento a temperatura ambiente se adicionan 20 ml de agua y 10 ml de una solución acuosa de NH_{4}PF_{6}. Se recoge el precipitado formado y se recristaliza en mezcla de acetonitrilo/etanol 1:1. Se obtiene 0,294 g de Ru(bpy)_{2}(LegN)](PF_{6})_{2} con un rendimiento del 80%. Luego se disuelve el complejo en 80 ml de una solución al 10% de KOH en metanol y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante por lo menos 15 horas. Después de acidificación a pH \approx 2-3 con H_{2}SO_{4}, se separa el metanol mediante evaporación en vacío y se extrae la solución acídica con diclorometano. Se agrupan las fracciones orgánicas, deshidratas con Na_{2}SO_{4} y se separa el disolvente mediante evaporación en vacío. Se obtiene el producto Ru(bpy)_{2}(LegN)](PF_{6})_{2}.
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Ejemplo 2 Síntesis de [Ru(bpy)_{2}(LegO)](PF_{6})_{2}
12
2a) Síntesis de [Ru/bpy)_{2}Cl_{2}]
El intermedio [Ru/bpy)_{2}Cl_{2}] se sintetiza como en el ejemplo 1a)
2b) Síntesis de éster bencílico del ácido 6-bromo-hexanoico
El ligando se sintetiza como en la etapa 1b).
2c) Síntesis de éster bencílico del ácido 6-(2-(benzoxazol-2-il-piridin-4-il)hexanoico (LegO-benz)
En un matraz de tres cuellos y fondo redondo, equipado con un condensador, termómetro y agitación mecánica, se adiciona ácido polifosfórico (220 ml), amida del ácido 4-metil-piridin-2-carboxílico (0,29 mol) y o-aminofenol (0,29 mol). La mezcla se hace reaccionar a 210ºC durante 4 horas, luego se percola la solución en H_{2}O. Se filtra el precipitado y se suspende en una solución acuosa saturada de NaHCO_{3}. Se filtra el precipitado de nuevo y se lava con H_{2}O. El producto 2-(4-metil-piridin-2-il)-benzotiazol se cristaliza en ciclohexano después de haberse filtrado y eliminado las impurezas insolubles.
Luego se carga una mezcla de THF (\sim90 ml) y diisopropilamina (1 equivalente) en un matraz de fondo redondo y tres cuellos, agitada y enfriada a -78ºC; luego se adiciona una solución de butil-litio (n-BuLi, 1,7 M en hexano, 1,1 equivalentes). Se agita la solución a -78ºC durante 10 minutos, se calienta hasta 0ºC y se agita durante 10 minutos, y de nuevo se enfría a -78ºC.
Una solución de 2-(4-metil-piridin-2-il)-benzooxazol (1 equivalente) se canula en THF y se agita la mezcla durante 1 hora a -78ºC, luego se adiciona mediante una jeringa el éster bencílico del ácido 6-bromo-hexanoico anhidrificado (1,1 equivalentes) y se hace reaccionar durante un mínimo de 3 horas a temperatura ambiente. Se detiene la reacción con hielo y NH_{4}Cl y se extrae la solución con acetato de etilo. Se agrupan las fases orgánicas y se anhidrifica con NA_{2}SO_{4} y se separa el disolvente mediante evaporación en vacío. la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía instantánea con elución en gradiente de una mezcla de diclorometano/metanol. Se obtiene un sólido ligeramente amarillo.
2d) Síntesis de Ru(bpy)_{2}(LegN)](PF_{6})_{2}
Se disuelven 0,200 g de [Ru(bpy)_{2}Cl_{2}]\cdot2H_{2}O (3,84.10^{-4} mol) y 0,120 g de (4-metil-2-piridil)benzoxazol (5,71.10^{-3} mol) en 50 ml de etilenglicol. Se desgasea la mezcla con Ar durante 15 minutos y luego se somete a reflujo durante 4 horas. La solución inicialmente violeta cambia progresivamente a una solución rojiza mas clara en alrededor de una hora y después de 4 horas su color es definitivamente rojo.
Después de enfriamiento a temperatura ambiente se adicionan 20 ml de agua y 10 ml de una solución acuosa de NH_{4}PF_{6} (1,0 g/10 ml).
Luego se recoge el precipitado formado, se lava con 10 ml de H_{2}O y se seca con Et_{2}O.
Se obtienen 0,275 de [Ru(bpy)_{2}(LegO-benz](PF_{6})_{2} con un rendimiento de 78,4%. Se disuelve el complejo en 80 ml de una solución del 10% de KOH en metanol y luego se agita durante por lo menos 15 horas a temperatura ambiente. Después de acidificación a pH \approx 2-3, se separa el metanol mediante evaporación a presión reducida, y se extrae la solución acídica con diclorometano.
Se recogen todas las fracciones orgánicas, deshidratadas con Na_{2}SO_{4} y se separa el disolvente mediante evaporación a presión reducida.
Se obtiene el producto [Ru(bpy)_{2}(LegO)](PF_{6})_{2}
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Ejemplo 3 Síntesis de [Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2}
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3a) Síntesis de [Ru/bpy)_{2}Cl_{2}]
Se sintetiza el intermedio [Ru/bpy)_{2}Cl_{2}] como en el ejemplo 1a)
3b) Síntesis de éster bencílico del ácido 6-bromo-hexanoico
El compuesto se sintetiza como en la etapa 1b).
3c) Síntesis de éster bencílico del ácido 6-(2-benzotiazol-2-il-piridin-4-il)hexanoico (LegS-benz)
En un matraz de tres cuellos fondo redondeado, equipado con condensador, termómetro y agitación mecánica, se adiciona ácido polifosfórico (220 ml), amida de ácido 4-metil-piridin-2-carboxílico (0,29 mol) y o-aminotiofenol (0,29 mol).
Se hace reaccionar la mezcla a 210ºC durante 4 horas, luego se percola la solución en H_{2}O. Se filtra el precipitado y suspende en una solución acuosa saturada de NaHCO_{3}.
La solución se filtra de nuevo y se lava el precipitado con H_{2}O. El producto 2-(4-metil-piridin-2-il)-benzotiazol se cristaliza en ciclohexano después de haberse filtrado y eliminado las impurezas insolubles.
Luego se carga una mezcla de THF (\sim90 ml) y diisopropilamina (1 equivalente) en un matraz de fondo redondo y tres cuellos, agitada y enfriada a -78ºC; luego se adiciona una solución de butil-litio (n-BuLi, 1,7 M en hexano, 1,1 equivalentes). Se agita la solución a -78ºC durante 10 minutos, se calienta hasta 0ºC y se agita durante 10 minutos, y de nuevo se enfría a -78ºC.
Una solución de 2-(4-metil-piridin-2-il)-benzooxazol (1 equivalente) se canula en THF y se agita la mezcla durante 1 hora a -78ºC, luego se adiciona rápidamente mediante una jeringa el éster bencílico del ácido 6-bromo-hexanoico anhidrificado (1,1 equivalentes) y se hace reaccionar durante un mínimo de 3 horas a temperatura ambiente.
Se detiene la reacción con hielo y NH_{4}Cl y se extrae la solución con acetato de etilo. Se agrupan las fases orgánicas y se anhidrifica con Na_{2}SO_{4} y se separa el disolvente mediante evaporación en vacío.
La purificación se lleva a cabo mediante cromatografía instantánea con elución en gradiente de una mezcla de éster de petróleo/acetato de etilo. Se obtiene un sólido gris.
3d) Síntesis de [Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2}
Se disuelve en 50 ml de etilenglicol 3,84\cdot10^{-4} de [Ru(bpy)_{2}Cl_{2}]\cdot2H_{2}O y 5,74\cdot10^{3} mol de LegS-benz. Se desgasea la mezcla con Ar durante 15 minutos y luego se somete a reflujo durante 4 horas.
La solución inicialmente violeta cambia progresivamente a una solución rojiza mas clara en alrededor de una hora y después de 4 horas su color es definitivamente rojo.
Después de enfriamiento a temperatura ambiente se adicionan 20 ml de agua y 10 ml de una solución acuosa de NH_{4}PF_{6} (1,0 g/10 ml). Se recoge luego el precipitado formado, se lava con 10 ml de agua y se seca con Et_{2}O. Se obtiene 0,298 g de Ru(bpy)_{2}(LegS-benz)](PF_{6})_{2} con un rendimiento del 83,5%. Luego se disuelve el complejo en 80 ml de una solución al 10% de KOH en metanol y se agita a temperatura ambiente durante por lo menos 15 horas.
Después de acidificación a pH \approx 2-3 con H_{2}SO_{4}, se separa el metanol mediante evaporación a presión reducida y se extrae la solución acídica con diclorometano.
Se agrupan las fracciones orgánicas, deshidratas con Na_{2}SO_{4} y se separa el disolvente mediante evaporación a presión reducida. Se obtiene el producto Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2}.
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Ejemplo 4 Síntesis de [Ru(bpy)_{2}(LegC)](PF_{6})_{2}
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4a) Síntesis de [Ru/bpy)_{2}Cl_{2}]
Se sintetiza el intermedio [Ru/bpy)_{2}Cl_{2}] como en el ejemplo 1a)
4b) Síntesis de éster bencílico del ácido 6-bromo-hexanoico
El compuesto se sintetiza como en la etapa 1b).
4c) Síntesis de éster bencílico del ácido 6-(2-(3H-indol-2-il)piridin-4-il)hexnaoico (LegC-benz)
En un matraz de tres cuellos fondo redondeado, equipado con condensador, termómetro y agitación mecánica, se adiciona ácido polifosfórico (220 ml), amida de ácido 4-metil-piridin-2-carboxílico (0,29 mol) y 2-aminobenzonitrilo (0,29 mol).
Se hace reaccionar la mezcla a 210ºC durante 4 horas, luego se percola la solución en H_{2}O. Se filtra el precipitado y suspende en una solución acuosa saturada de NaHCO_{3}.
La solución se filtra de nuevo y se lava el precipitado con H_{2}O. El producto 2-(4-metil-piridin-2-il)-3H-indol se cristaliza en ciclohexano después de haberse filtrado y eliminado las impurezas insolubles.
Luego se carga una mezcla de THF (\sim90 ml) y diiso-propilamina (1 equivalente) en un matraz de fondo redondo y tres cuellos, agitada y enfriada a -78ºC; luego se adiciona una solución de butil-litio (n-BuLi, 1,7 M en hexano, 1,1 equivalentes). Se agita la solución a -78ºC durante 10 minutos, se calienta hasta 0ºC y se agita durante 10 minutos, y de nuevo se enfría a -78ºC.
Una solución de 2-(4-metil-piridin-2-il)-benzooxazol (1 equivalente) se canula en THF y se agita la mezcla durante 1 hora a -78ºC, luego se adiciona rápidamente mediante una jeringa el éster bencílico del ácido 6-bromo-hexanoico anhidrificado (1,1 equivalentes) y se hace reaccionar durante un mínimo de 3 horas a temperatura ambiente.
Se detiene la reacción con hielo y NH_{4}Cl y se extrae la solución con acetato de etilo. Se agrupan las fases orgánicas y se anhidrifica con Na_{2}SO_{4} y se separa el disolvente mediante evaporación en vacío.
La purificación se lleva a cabo mediante cromatografía instantánea con elución en gradiente de una mezcla de éster de petróleo/acetato de etilo. Se obtiene un sólido ligeramente amarillo.
4d) Síntesis de [Ru(bpy)_{2}(LegC)](PF_{6})_{2}
Se disuelve en 50 ml de etilenglicol 3,84\cdot10^{-4} de [Ru(bpy)_{2}Cl_{2}]\cdot2H_{2}O y 5,74\cdot10^{3} mol de LegS-benz. Se desgasea la mezcla con Ar durante 15 minutos y luego se somete a reflujo durante 4 horas.
La solución inicialmente violeta cambia progresivamente a una solución rojiza mas clara en alrededor de una hora y después de 4 horas su color es definitivamente rojo.
Después de enfriamiento a temperatura ambiente se adicionan 20 ml de agua y 10 ml de una solución acuosa de NH_{4}PF_{6} (1,0 g/10 ml). Se recoge luego el precipitado formado, se lava con 10 ml de agua y se seca con Et_{2}O. Se obtiene 0,304 g de Ru(bpy)_{2}(LegS-benz)](PF_{6})_{2} con un rendimiento del 84%. Luego se disuelve el complejo formado en 80 ml de una solución al 10% de KOH en metanol y se agita a temperatura ambiente durante por lo menos 15 horas.
Después de acidificación a pH \approx 2-3 con H_{2}SO_{4}, se separa el metanol mediante evaporación a presión reducida y se extrae la solución acídica con diclorometano.
Se agrupan las fracciones orgánicas, deshidratas con Na_{2}SO_{4} y se separa el disolvente mediante evaporación a presión reducida. Se obtiene el producto Ru(bpy)_{2}-(LegC)](PF_{6})_{2}.
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Ejemplo 5 Conjugación de [Ru(bpy)_{2}(LegN](PF_{6})_{2} con BSA
En un matraz de fondo redondo conteniendo 5 ml de DMF anhidro se disuelve 1,34.10^{5} mol de Ru(bpy)_{2}-(LegN)]
(PF_{6})_{2}, 2,68.10^{-5} mol de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 2,68.10^{-5} mol de N-hidroxisuccinimida (NHS). Se hace reaccionar la solución durante 5 horas a 70ºC sobre un baño de aceite de silicona. Se obtiene el éster de hidroxisuccinimida del complejo Ru(bpy)_{2}-(LegN)](PF_{6})_{2}.
Después de 5 horas se extraen 56 \mul de la solución de éster (1,50 10^{-7} mol) y se adiciona 1 ml (1,50 10^{-8} mol) de una solución de BSA 1 mg/ml en tampón de borato sódico (pH 8,5), de modo que la relación molar entre [Ru(bpy)_{2}-(LegN-NHS)](PF_{6})_{2} y BSA sea 10:1. Se agrupan las dos porciones y se hace reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente.
Después de 2 horas se adiciona una segunda porción de 56 \mul de [Ru(bpy)_{2}-(LegN-NHS)](PF_{6})_{2} y se prosigue la reacción durante otras 2 horas. El conjugado {[Ru(bpy)_{2}-(LegN-BSA)]}(PF_{6})_{2} obtenido se purifica sobre una columna cromatográfica tipo PD10, conteniendo una resina Sephadex GD25, eluyéndose con tampón de borato sódico pH 8,5. Se recogen fracciones de 1 ml en tubos Eppendorf.
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Ejemplo 6 Conjugación de [Ru(bpy)_{2}(LegS](PF_{6})_{2} con IgG (inmunoglobulina G)
En un matraz de fondo redondo conteniendo 5 ml de DMF anhidro se disuelve 1,34.10^{5} mol de Ru(bpy)_{2}-(LegS)]
(PF_{6})_{2}, 2,68.10^{-5} mol de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 2,68.10^{-5} mol de N-hidroxisuccinimida (NHS). Se hace reaccionar la mezcla durante 5 horas a 70ºC sobre un baño de aceite de silicona.
Después de 5 horas se extraen 56 \mul de la solución de éster (1,50 10^{-7} mol) y se adiciona 1 ml (1,50 10^{-8} mol) de una solución de IgG 2,33 mg/ml en 1 ml de tampón de borato sódico (pH 8,5), de modo que la relación molar entre [Ru(bpy)_{2}-(LegS-NHS)](PF_{6})_{2} e IgG sea 10:1. Se agrupan las dos porciones y se hace reaccionar durante 2 horas e agitación a temperatura ambiente. Después de 2 horas se adiciona una segunda porción de 56 \mul de [Ru(bpy)_{2}-(LegS-NHS)](PF_{6})_{2} y se prosigue la reacción durante otras 2 horas. El conjugado {[Ru(bpy)_{2}-(LegS-IgG)]} obtenido se purifica sobre una columna cromatográfica tipo PD10, conteniendo una resina Sephadex GD25, eluyéndose con tampón de borato sódico pH 8,5. Se recogen fracciones de 1 ml en tubos Eppendorf.
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Ejemplo 7 Caracterización espectroscópica y electroquímica
Los complejos [Ru(bpy)_{2}(LegN)](PF_{6})_{2}, [Ru(bpy)_{2}-(LegO)](PF_{6})_{2}, [Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2} y [Ru(bpy)_{2}(LegC)]-(PF_{6})_{2}, han sido caracterizados mediante punto de vista espectroscópico y electroquímico.
La caracterización electroquímica se llevó a cabo por medio de mediciones voltamétricas cíclicas; se realizaron pruebas en diclorometano, utilizando hexafluorofosfato de tetrabutilamonio como electrolito de soporte. El electrodo de trabajo se obtiene de carbón vítreo (CG), el auxiliar de Pt, mientras que el electrodo de referencia es un SCE normal (Saturated Calomel Electrode). Los potenciales se exponen con respecto al par redox de ferroceno Fc/Fc^{+} que en las condiciones experimentales utilizadas muestra un potencial se semionda E_{1/2} = + 0,46 V.
La compensación de resistencia se llevó a cabo por medio de método de realimentación positiva. En la gama de 50 mV-3 V/s \DeltaE_{p} permanece en el orden de 60 mV, mientras que las corrientes pico i_{p} son directamente proporcionales a la raíz cuadrada del ratio de exploración. Se llevaron a cabo experimentos disolviendo los complejos de ECL en acetonitrilo y utilizando hexafluorofosfato de tetrabutilamonio como electrolito de soporte.
\newpage
El comportamiento electroquímico del complejo [Ru(bpy)_{2}(LegN)](PF_{6})_{2} se caracteriza por dos reducciones monoelectrónicas y una oxidación monoelectrónica, química y electrónicamente reversibles. Los dos procesos de reducción se caracterizan por un potencial de semionda de -1,764 y -2,018 V respectivamente, mientras que el proceso de oxidación muestra un potencial E_{1/2} = 0,793 V.
El comportamiento electroquímico del complejo [Ru(bpy)_{2}(LegO)](PF_{6})_{2} se caracteriza por dos reducciones monoelectrónicas reversibles y una oxidación monoelectrónica reversible. Los dos procesos de reducción se caracterizan por un potencial de semionda de -1,563 y -1,924 V respectivamente, mientras que el proceso de oxidación muestra un potencial E_{1/2} = 1,010 V.
Asimismo el comportamiento electroquímico del complejo [Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2} se caracteriza por dos reducciones monoelectrónicas y una oxidación monoelectrónica, química y electrónicamente reversibles. Los dos procesos de reducción se caracterizan por un potencial de semionda de -1,487 y -1,914 V respectivamente, mientras que el proceso de oxidación muestra un potencial E_{1/2} = 1,008 V.
De modo análogo el comportamiento electroquímico del complejo [Ru(bpy)_{2}(LegC)](PF_{6})_{2} se caracteriza por dos reducciones monoelectrónicas reversibles y una oxidación monoelectrónica reversible. Los dos procesos de reducción se caracterizan por un potencial de semionda de -1,650 y -1,976 V respectivamente, mientras que el proceso de oxidación muestra un potencial E_{1/2} = 0,915 V.
A continuación se resume los datos relevantes para los cuatro complejos utilizados como ejemplos representativos:
15
Ejemplo 8
Detección electroquimiluminiscente del conjugado {[Ru(bpy)_{2}(LegN)]-BSA}(PF_{6})_{2} obtenido en el ejemplo 5 se ha disuelto en tampón PBS para obtener cuatro soluciones con concentración molar igual a 10^{-11}, 10^{-10}, 10^{-9}, 10^{-8}. Los experimentos se han llevado a cabo en la célula electroquímica utilizada en las mediciones voltamétricas cíclicas descritas en el ejemplo 7. La luminiscencia emitida se ha registrado con un tubo fotomultiplicador Hamamatsu R928 conectado a una computadora equipada con un tablero de adquisición de datos. La Tabla 2 resume los resultados obtenidos con diferentes soluciones conjugadas. El tampón PBS solo se ha utilizado como testigo.
TABLA 2
16
Ejemplo 9 Detección simultánea de los conjugados {[Ru(bpy)_{2}(LegN)]-BSA}(PF_{6})_{2} y {[Ru(bpy)_{2}(LegS)]-IgG}(PF_{6})_{2}
De modo análogo al ejemplo precedente se han preparado cuatro soluciones de concentración molar igual a 10^{-11}, 10^{-10}, 10^{-9} y 10^{-8} de los conjugados {[Ru(bpy)_{2}(LegN)]-BSA}(PF_{6})_{2} y {[Ru(bpy)_{2}(LegS)]-IgG}(PF_{6})_{2}, sintetizados en el ejemplo 5 y ejemplo 6 respectivamente. Los experimentos se han llevado a cabo en la célula electroquímica utilizada en las mediciones kilométricas cíclicas descritas en el ejemplo 7. Se ha registrado luminiscencia emitida con dos tubos fotomultiplicadores Hamamatsu R928 conectados a un osciloscopio conectado a una computadora equipada con tablero de adquisición de datos.
El primer tubo fotomultiplicador está equipado con un filtro óptico bandpass XF3028 (630 \pm 22 nm) centrado a 682 nm.
La Tabla 3 resume las emisiones electroquimiluminiscentes detectados con soluciones de conjugados diferentes. El tampón PBS solo se ha utilizado como testigo.
17
Ejemplo 10 Método analítico para detectar Troponina I (TnI) en suero
Como un ejemplo de un método analítico en donde se utiliza el complejo de ECL de conformidad con el presente invento, se describe un emparedado electroquimiluminiscente inmunoquímico para la detección de Troponina I (TnI) en suero. En este tipo de ensayo se utilizan dos anticuerpos monoclonales que son específicos para dos epitopos diferentes del analito TnI. El esquema analítico del ensayo es como sigue: se utiliza el primer anticuerpo anti-TnI Mab^{1} como un anticuerpo de captura y se conjuga con biotina, el segundo anticuerpo anti-TnI Mab_{2} se conjuga con el complejo de ECL [Ru(bpy)_{2}(LegS)]PF_{6})_{2} de conformidad con un procedimiento similar al del ejemplo 6.
La reacción inmunológica entre el analito y el par de anticuerpo monoclonal tiene lugar en fase homogénea, en presencia de una fase sólida, por ejemplo un electrodo de oro revestido con estreptavidina, que constituye el medio de separación libre/unido.
En resumen:
18
en donde |-StAV es el electrodo de oro revestido con estreptavidina, biot-Mab_{1}anti-TnI es el anticuerpo de captura conjugado con bitoina, TnI es Troponina I y Mab_{2}anti-TnI-[Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2} es el anticuerpo conjugado con la ECL sintetizado en el ejemplo 3. Después de lavar el electrodo con un tampón de lavado apropiado quedarán ancladas a la fase sólida una serie de moléculas Mab_{2}anti-TnI-[Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2} iguales a las del analito. Esto permite el cálculo de la concentración de analitos en el suero de partida, mediante la construcción de una curva de titulación con calibradores que tienen una concentración conocida de TnI. La detección se lleva a cabo utilizando un dispositivo análogo al descrito en el ejemplo 8, en donde el electrodo de trabajo de carbón vítreo se sustituye por un electrodo de oro revestido con estreptavidina. La Tabla 4 resume los resultados obtenidos:
19

Claims (18)

1. Un compuesto que tiene la fórmula general (I) siguiente, que incluye sus tautómeros de valencia:
\vskip1.000000\baselineskip
20
en donde
Me es un metal de transición o un metal de tierras raras;
R es un grupo funcional elegido del grupo constituido por -COOH, -OH, -NH_{2}, o es -R_{10}-Y en donde R_{10} es una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada, que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio, y en donde Y se elige del grupo constituido por hidrógeno, carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato, isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxilo, fosforamidita, glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido, cloroacetamido, yodo-acetamido, haluro de sulfonilo, haluro de acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de N-hidroxisuccinimidilo, éster de N-hidroxisulfosuccinimidilo, éster de ftalimida, éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina mono- o di-halogen-sustituida, diazina mono- o di-halogen-sustituida, aziridina, éster de imida, hidrazina, azido-nitrofenilo, azida, 3-(2-piridilditio)-propionamida, glioxal, aldehido, -C\equivCH y -COZ en donde Z es un grupo de partida;
A y B son independientemente uno de otro:
- de cero a 4 sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por hidrógeno, -COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3}, -SO_{3}H, -SO_{3}^{-}, -R_{11}-Y', en donde R^{11} es una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH-, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio, y en donde Y' se elige del grupo constituido por hidrógeno, carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato, isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxi-lo, fosforamidita, glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido, cloroacetamido, yodoacetamido, haluro de sulfonilo, haluro de acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de succinimidilo, éster de hidroxi-sulfosuccinimidilo, éster de ftalimida, éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina mono- o di-halogen-sustituida, diazina mono- o di-halogen-sustituida, aziridina, éster de imida, hidrazina, azido-nitrofenilo, azida, 3-(2-piridilditio)-propionamida, glioxal, aldehido, nitrofenilo, dinitrofenilo, trinitrofenilo, -C\equivCH y arilo opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por -SO_{3}H, carboxilo (-COOH), amino (-NH_{2}), carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi y -COZ', en donde Z' es un grupo de partida;
- un condensado homocíclico o heterocíclico de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por hidrógeno, -SO_{3}^{-}, -SO_{3}H, -COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3}, -NH_{2}, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R_{12}-Y'' y -COZ'', en donde R_{12}, Y'' y Z'' tienen el significado antes indicado para R_{10}, Y y Z, respectivamente; o
- un sistema condensado homocíclico o heterocíclico de 2 ciclos fusionados, que tiene 5 o 6 átomos en cada anillo, opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes elegidos del grupo constituido por hidrógeno, -SO_{3}^{-}, -SO_{3}H,
-COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3}, -NH_{2}, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R_{13}-Y''' y -COZ''', en donde R_{10}, Y''' y Z''' tienen el significado antes indicado para R_{10}, Y y Z, respectivamente;
X se elige del grupo constituido por -O-, -S-, -Se-, -NH-, -C(CH_{3})_{2}-NR_{100}- y
21
en donde R_{100} se elige del grupo constituido por hidrógeno y R_{14}-Y'''', en donde R_{14} e Y'''' tienen el significado previamente definido para R_{10} e Y, respectivamente, y R_{55} y R_{66} son independientemente una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono está(n) sustituido(s) opcionalmente cada uno por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH-, o una agrupación de átomos de carbono cíclica aromática o no aromática, de 4, 5 o 6 miembros, en donde uno o mas átomos de carbono está(n) opcionalmente cada uno sustituido por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio;
M es un contraión; m es un número entre -5 y +5;
L_{1} y L_{2} son independientemente uno de otro un ligando bidentado elegido del grupo constituido por:
22 
\vskip1.000000\baselineskip
220
23
en donde D, E, G y Q tienen independientemente el significado definido anteriormente para A y B y T y W tienen cada uno, independientemente, el significado definido anteriormente para X.
2. Un compuesto, de conformidad con la reivindicación 1, en donde los grupos de partida Z, Z', Z'', Z''' y Z'''' se eligen independientemente del grupo constituido por -Cl, -Br, -I, -OH, -OR_{22}, -OCOR_{22}, en donde R_{22} es alquilo C_{1}-C_{4} lineal o ramificado (por ejemplo metilo, etilo, t-butilo o i-propilo), -O-CO-Ar, en donde Ar es opcionalmente arilo sustituido, -O-CO-Het, en donde Het es un sistema heterocíclico elegido de preferencia entre succinimida, sulfosuccinimida, ftalimida y naftalimida, NR_{33}R_{4,} en donde R_{33} y R_{34} son cada uno independientemente alquilo C_{1}-C_{4} lineal o ramificado.
3. Un compuesto, de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde Me se elige entre rutenio, osmio, iridio, renio y cromo.
4. Un compuesto, de conformidad con la reivindicación 1, elegido del grupo constituido por:
24
240
25
5. Un método para producir un compuesto, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la etapa en donde se hace reaccionar un ligando de piridilbenz-X-azólico (A)
26
con un compuesto de fórmula Me(L_{1})(L_{2})Alg, en donde X, A, R, B, L_{1} y L_{2} son como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y Alg es halógeno.
\newpage
6. Un conjugado con la fórmula \alpha-\omega_{1}, en donde \alpha es un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y \omega_{1} es una sustancia biológica.
7. Un conjugado, de conformidad con la reivindicación 6, en donde \omega_{1} se elige del grupo constituido por células, virus, proteínas, lipopoproteínas, glicoproteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, nucleótidos, sondas de ADN, oligosacáridos, polisacáridos, lipo-polisacáridos, metabolitos celulares, hormonas sustancias farmacológicamente activas, alcaloides, esteroides, vitaminas, aminoácidos, azúcares, anticuerpos, antígenos, haptenos o sus fragmentos.
8. Un conjugado de fórmula \alpha-\omega_{1}, en donde \alpha es un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y \omega_{1} es un colorante fluorescente de absorción a longitudes de onda a las que el compuesto \alpha es capaz de emitir.
9. Un conjugado de conformidad con la reivindicación 8, en donde \omega_{2} es una cianina.
10. Un conjugado de conformidad con la reivindicación 8, en donde \omega_{2} es una indocianina.
11. Un conjugado de fórmula \alpha(\omega_{1})(\omega_{2}), en donde \alpha es un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, \omega_{1} es un sustancia biológica de conformidad c on la reivindicación 6 o 7 y \omega_{2} es un colorante fluorescente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
12. El uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 u 11 como un reactivo detectable específico en un método para detección cualitativa y/o cuantitativa de un analito en una muestra que ha de probarse.
13. Un método analítico para la detección de un analito en una muestra, que comprende las etapas siguientes:
(i) poner en contacto la muestra con un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 u 11, en condiciones apropiadas para la unión del conjugado al analito, de estar presente; y
(ii) determinar la presencia de la cantidad de analito unido al conjugado en la muestra midiendo la luminiscencia emitida por el conjugado unido al analito.
14. El método, de conformidad con la reivindicación 13, en donde el analito se separa de los otros componentes de muestra antes del contacto con el conjugado.
15. El método, de conformidad con la reivindicación 13 o 14, en donde el conjugado es un conjugado de conformidad con la reivindicación 6, en donde \omega_{1} es un anticuerpo.
16. El método, de conformidad con la reivindicación 15, en donde el analito se separa de los otros componentes de muestra mediante contacto con un segundo anticuerpo unido a una fase sólida.
17. El método, de conformidad con las reivindicaciones 13 o 14, en donde el conjugado es un conjugado de conformidad con la reivindicación 7, en donde \omega_{1} es una sonda de ADN.
18. El método, de conformidad con la reivindicación 17, en donde el analito se separa de los otros componentes de muestra mediante contacto con una segunda sonda de ADN unida a una fase sólida.
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