ES2248942T3

ES2248942T3 - Complejos con un gran desplazamiento de stokes para marcado fluorescente formado por copulacion de cianina y otros fluorocromos capares de transferir energia de resonancia.

Info

Publication number: ES2248942T3
Application number: ES99110086T
Authority: ES
Inventors: Alan Stuart Waggoner; Swati Ratnaker Mujumdar; Ratnaker Balvant Mujumdar
Original assignee: Carnegie Mellon University
Current assignee: Carnegie Mellon University
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-30
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2016-05-30
Also published as: US6008373A; GB2301833B; DE69617531T2; EP0747700A3; EP0943918B1; DE69635089T2; US6545164B1; EP0747700A2; ATE210292T1; US6673943B2; JP2843296B2; GB9611453D0; ES2170204T3; ATE302412T1; US20030220502A1; CA2178308A1; DE69635089D1; US6130094A; CA2178308C; EP0943918A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE COMPLEJOS PARA ETIQUETACION FLUORESCENTE DE BAJO PESO MOLECULAR CON GRANDES CAMBIOS DE LONGITUD DE ONDA ENTRE LA ABSORCION DE UN COLORANTE EN EL COMPLEJO Y LA EMISION DE OTRO COLORANTE EN EL COMPLEJO. ESTOS COMPLEJOS PUEDEN SER UTILIZADOS, POR EJEMPLO, PARA EL ANALISIS DE CELULAS POR FLUORESCENCIA MULTIPARAMETRO UTILIZANDO UNA SOLA LONGITUD DE ONDA DE EXCITACION. EL BAJO PESO MOLECULAR DEL COMPLEJO PERMITE MARCAR MATERIALES CON EL COMPLEJO PARA PENETRAR EN LAS ESTRUCTURAS DE LAS CELULAS CON EL FIN DE SER UTILIZADAS COMO SONDAS. LOS COMPLEJOS ETIQUETADORES SON SINTETIZADOS ACOPLANDOLOS DE FORMA COVALENTE A TRAVES DE ENLACES PARA FORMAR COMPLEJOS DONANTESRECEPTORES. LA TRANSFERENCIA DE ENERGIA POR RESONANCIA DE UN DONANTE EXCITADO A UN RECEPTOR FLUORESCENTE PROPORCIONA CAMBIOS DE LONGITUD DE ONDA HASTA DE 300 NM. LOS COMPLEJOS ETIQUETADORES FLUORESCENTES CONTIENEN PREFERIBLEMENTE GRUPOS REACTIVOS PARA EL ETIQUETADO DE GRUPOS FUNCIONALES EN COMPUESTOS OBJETIVO, TALES COMO ACIDOS OXIPOLINUCLEICOS Y DEOXIPOLINUCLEICOS, ANTICUERPOS, ENZIMAS, LIPIDOS, CARBOHIDRATOS, PROTEINAS Y OTROS MATERIALES. LOS COMPLEJOS PUEDEN CONTENER GRUPOS FUNCIONALES QUE PERMITAN LA REACCION COVALENTE CON MATERIALES QUE CONTIENEN GRUPOS REACTIVOS.

Description

Complejos con un gran desplazamiento de stokes para marcado fluorescente formado por copulación de cianina y otros fluorocromos capaces de transferir energía de resonancia.

La presente invención se refiere a complejos de marcado fluorescente, y más particularmente a complejos fluorescentes de bajo peso molecular con grandes desplazamientos de Stokes y a su uso en la preparación de derivados fluorescentes de materiales diana.

El marcado por fluorescencia es una tecnología importante para detectar moléculas biológicas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden marcarse con colorantes fluorescentes. La unión de los anticuerpos a sus moléculas diana específicas puede controlarse en base a una señal de fluorescencia, que puede detectarse con un espectrómetro, un instrumento de inmunofluorescencia, un citómetro de flujo, o un microscopio de fluorescencia. De una manera similar las secuencias de ADN pueden detectarse con instrumentos de detección por fluorescencia después de que el ADN se haya hibridado con una secuencia de ADN complementaria que se ha marcado con un colorante fluorescente.

Se conocen complejos de transferencia de energía que contienen moléculas dadoras y aceptoras unidas covalentemente. Por ejemplo, Stryer y Haugland desarrollaron un sistema modelo para el estudio de la dependencia de la transferencia de energía singlete-singlete con la distancia (Stryer, L. y Haugland, R.P., Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 58, pág. 720-26, (1967)). Se ha informado sobre la síntesis y propiedades de nuevos compuestos de modelo fotoquímico que contienen un colorante de cianina y una porfirina (Lindsey et al, Tetrahedron, Vol. 45, Nº 15, pág. 4845-66, (1989)). Se han descrito complejos que contienen cromóforos dadores y aceptores fluorescentes como sustratos para el estudio cinético y ensayo de enzimas hidrolíticas (Carmel et al, FEBS Letters, Vol. 30, Nº 1, p11, (1973)).

La Solicitud de Patente Europea Nº 609894 describe un complejo de marcado que comprende colorante trinúcleo representado por la fórmula general (1).

1

en la que Xa, Xb y Xc son independientemente anillos heterocíclicos sustituidos o no sustituidos que contienen de uno a tres heteroátomos y La y Lb son cadenas de metino conjugadas. Uno de La y Lb puede omitirse de manera que se une a los heterociclos directamente. Los compuestos de estructura (1) pueden incluir un grupo reactivo para formar una unión covalente entre el colorante trinúcleo y una sustancia biológica. Se informa que los compuestos de dicha fórmula tienen un gran desplazamiento de Stokes (50-100 nm). Sin embargo, no se cree que la transferencia de energía de resonancia esté implicada en el proceso de fluorescencia con esos colorantes.

La Solicitud de Patente Europea Nº 601889 describe sondas de ácido nucleico que contienen una secuencia de unión diana, una de cuyas regiones es capaz de formar una o más horquillas imperfectas, y al menos un marcador dador y al menos un marcador aceptor unidos covalentemente a la secuencia de nucleótidos de manera que cuando se forma una o más estructuras de horquilla, uno de los restos dadores y uno de los restos aceptores están muy próximos e manera que permiten la transferencia de energía de resonancia entre ellos. Los marcadores son preferiblemente fluoróforos. Se describe también un método de utilización de dichas sondas para detectar un polinucleótido diana de manera que cuando la sonda interacciona con una secuencia diana hace cambiar la distancia entre los grupos fluorescentes, dando como resultado un cambio en la emisión de fluorescencia de la sonda.

Lee et al, Nucleic Acids Research, 20(10), 2471-2483, (1992) se refieren a terminadores marcados con un colorante fluorescente para usar en la secuenciación de ADN. Se describe un colorante ddG-biflúor compuesto por un colorante de fluoresceína y rodamina unidos covalentemente entre sí y a un nucleótido purina. La absorción máxima del complejo colorante es de 498 nm y de 554 nm y la emisión máxima es de 580 nm.

La Solicitud de Patente Japonesa Nº 05 60698 describe cebadores de ADN de una sola cadena marcados con dos clases de cuerpos fluorescentes en una relación de transferencia de energía para usar en un método de secuenciación.

El análisis de múltiples parámetros usando marcadores fluorescentes con longitudes de onda de emisión claramente diferentes aumenta adicionalmente la importancia de esta tecnología proporcionando una potente herramienta para correlacionar múltiples parámetros antigénicos o genéticos en células individuales. En la microscopía de epifluorescencia, se usa una fuente luminosa continua con diferentes conjuntos de filtro de excitación y emisión para excitar y detectar cada especie fluorescente. Este enfoque funciona especialmente bien si las longitudes de onda de absorción y emisión de cada uno de los fluoróforos están relativamente próximas entre sí (por ejemplo, desplazamientos de Stokes de 15-30 nm). La mayoría de los fluoróforos de bajo peso molecular altamente fluorescentes tales como cianinas y xantenos tienen picos estrechos de absorción y emisión y pequeños desplazamientos de Stokes. Se han analizado hasta 5 marcadores fluorescentes diferentes en la misma muestra por microscopía usando conjuntos de filtro para epifluorescencia como se describe en DeBiasio et al, Journal of Cell Biology, Vol. 105, pág. 1613-1622,
(1987).

Aunque es fácil encontrar un único fluoróforo que se excite eficazmente a una longitud de onda de láser particular, es difícil encontrar marcadores fluorescentes adicionales con desplazamientos de Stokes suficientemente grandes para proporcionar una emisión bien separada de la del primer fluoróforo. Las ficobiliproteínas de origen natural son una clase de proteínas de fotosistema fluorescente multicromóforo que tienen grandes desplazamientos de longitud de onda; véase Oi, V.T., Glazer, A.N. y Stryer, L., Journal of Cell Biology, Vol. 93, pág. 981-986, (1982). Estas pueden acoplarse covalentemente a anticuerpos y se han usado ampliamente en citometría de flujo para el análisis de subconjuntos de linfocitos de 2 colores. R-ficoeritrina (R-PE), una proteína fotosistema que contiene 34 fluoróforos de bilina que pueden excitarse a 488 nm con el láser de iones de argón ampliamente disponible, ha sido especialmente útil. Su fluorescencia máxima es a 575 nm. R-PE y fluoresceína pueden excitarse ambos a 488 nm, aunque R-PE puede discriminarse fácilmente con conjuntos de filtro de interferencia de paso de banda óptica desde la señal de fluoresceína que aparece a 525 nm. Recientemente, se ha hecho posible la inmunofluorescencia de 3 colores mediante citometría de flujo desarrollando un tándem de reactivos de marcado conjugados que contiene un colorante fluorescente reactivo que se excita a 488 nm y fluoresce a 613 nm, y se vende en el mercado con el nombre Duocrhome, véase la Patente de Estados Unidos Nº 4876190. Con otro tándem fluoróforo la transferencia de energía de R-PE excitado al colorante de cianina unido conocido como Cy-5 conduce a fluorescencia a 670 nm (Waggoner et al. Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 677, pág. 185-193, (1993)).

Los marcadores basados en ficobiliproteína son muy fluorescentes y proporcionan excelentes señales en experimentos de 2 y 3 parámetros para la detección de antígenos en la superficie celular. Sin embargo estos reactivos no se han utilizado ampliamente para la medida de antígenos citoplásmicos o para la detección de marcadores cromosómicos por hibridación de fluorescencia in situ debido a que su gran tamaño (PM 210.000 Dalton) limita la penetración en estructuras celulares densas.

No obstante lo anterior, aún faltan compuestos fluorescentes de bajo peso molecular que pueden usarse como marcadores para el marcado covalente de moléculas diana y que proporcionará detección de fluorescencia multicolor usando una sola longitud de onda de excitación. También hay una necesidad de varios de dichos marcadores fluorescentes, cada uno de los cuales puede excitarse óptimamente a una longitud de onda particular de láser pero que fluoresce a longitudes de onda de emisión significativamente diferentes. Ahora se ha descubierto una clase de marcadores fluorescentes de bajo peso molecular que proporcionará detección de fluorescencia multicolor usando una sola longitud de onda de excitación.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un complejo marcador fluorescente de bajo peso molecular que comprende:

a) incubar cada muestra diferente con un marcador diferente de dicho conjunto de marcadores fluorescentes para proporcionar muestras marcadas fluorescentemente;

b) mezclar cada una de dichas muestras marcadas fluorescentemente para formar una mezcla que contiene todas las muestras;

c) irradiar la mezcla con dicha fuente de excitación de una sola longitud de onda; y

d) detectar las emisiones de fluorescencia correspondientes a cada una de las diferentes muestras marcadas fluorescentemente;

caracterizado porque uno o más marcadores de dicho conjunto de marcadores fluorescentes es un complejo marcador fluorescente que comprende:

i) un primer fluorocromo que tiene primeros espectros de absorción y emisión;

ii) un segundo fluorocromo que tiene segundos espectros de absorción y emisión, siendo mayor la longitud de onda de la emisión máxima de dicho segundo fluorocromo que la longitud de onda de la emisión máxima de dicho primer fluorocromo, y una porción del espectro de absorción de dicho segundo fluorocromo solapando una porción del espectro de emisión de dicho primer fluorocromo;

iii) al menos un enlazador para unir covalentemente dichos primer y segundo fluorocromos para transfererir la energía de resonancia entre dichos primer y segundo fluorocromos;

iv) al menos un grupo de unión diana capaz de formar un enlace covalente con dicho compuesto biológico diana;

donde dicho grupo de unión diana es un grupo reactivo para reaccionar con un grupo funcional de los compuestos diana; y donde el peso molecular combinado de dichos primer y segundo fluorocromos y dicho enlazador es menor de aproximadamente 20.000 Dalton.

Preferiblemente al menos uno de dicho primer o segundo fluorocromos es un colorante de cianina.

El enlazador puede ser rígido o flexible para orientar los momentos de transición de los cromóforos dador y aceptor. Para que ocurra una transferencia de energía óptima, los momentos de transición del primer y del segundo fluorocromos se orientan entre sí en una dirección no perpendicular, por ejemplo, generalmente se sitúan en paralelo o en tándem entre sí. Los momentos de transición de los fluorocromos unidos de manera flexible cambiará cuando se flexiona el enlazador, pero como los momentos de transición del el dador y del aceptor son no perpendicular durante el tiempo en estado excitado del dador, tendrá lugar la transferencia de energía. Los complejos preparados y descritos en este documento muestran una transferencia de energía que varía del 50% al 99% de eficacia. La eficacia de transferencia de energía depende de diversos factores tales como solapamiento espectral, separación espacial entre el dador y el aceptor, orientación relativa de las moléculas dadora y aceptora, rendimiento cuántico del dador y tiempo en estado excitado del dador. En una realización preferida, los fluorocromos pueden estar separados por una distancia que proporciona una transferencia de energía eficaz, preferiblemente mejor del
75%.

La mayor proximidad entre los fluoróforos dador y aceptor potenciaría la transferencia de energía, ya que la eficacia de transferencia de energía varía como la inversa de la 6ª potencia de la separación de los centros de los cromóforos de acuerdo con la ecuación de Forster:

ET \propto K^{2} \ \Phi_{D} \ J/R^{6} \ \tau_{D}

en la que ET es la constante de velocidad de transferencia de energía, K^{2} es la orientación relativa de los momentos de transición del dador y del aceptor, \Phi_{D} es el rendimiento cuántico de la molécula dadora, R es la distancia entre los centros de los fluorocromos dador y aceptor, J es el solapamiento entre el espectro de emisión del fluorocromo dador y el espectro de absorción del fluorocromo aceptor, y \tau_{D} es el tiempo en estado excitado de la molécula dadora. Véase, Forster, T. "Intermolcular Energy Transfer and Fluorescence", Ann. Physik., Vol. 2, pág. 55, (1948). La distancia R entre los centros de los fluorocromos dador y aceptor puede ser preferiblemente de 10 a 80 Angstroms. El enlazador debería permitir la transferencia de energía de resonancia entre los fluorocromos. Los fluorocromos no deberían interactuar químicamente o formar enlaces secundarios entre sí. El enlazador puede ser preferiblemente de 2 a 20 longitudes de enlace. Por ejemplo, si el enlazador contiene una cadena alquílica, -(CH_{2})_{n}-, el número de carbonos "n" puede ser de 1 a aproximadamente 15. El enlazador puede incluir parte de los constituyentes que se extienden desde el fluorocromo. En otras palabras, el enlazador se une al colorante cromóforo aunque no es parte de él. Haciendo referencia a los enlazadores mostrados en la Tabla 2, algunos se extienden desde el nitrógeno del anillo en une cianina hasta un grupo funcional en el anillo de benceno de otra cianina. Algunos enlazadores se extienden entre los grupos funcionales en los anillos de benceno de colorantes enlazados. Sin embargo, en estos ejemplos, ninguno de los enlazadores incluye una red de dobles enlaces que permita la conjugación del dador y el aceptor. Con un enlazador relativamente corto y una orientación óptima, puede haber una transferencia de energía de resonancia eficaz incluso cuando el solapamiento espectral se hace pequeño. Por lo tanto, es posible obtener grandes desplazamientos de longitud de onda incluso cuando solo se usan dos cromóforos en el complejo.

Los enlazadores adecuados se selecciona entre el grupo compuesto por cadenas alquílicas que contienen de 1 a 20 átomos de carbono que pueden incluir opcionalmente de 1 a 8 átomos de oxígeno como uniones poliéter, o de 1 a 8 átomos de nitrógeno como uniones poliamina, o de 1 a 4 grupos CO-NH como uniones poliamida, hasta 2 grupos biciclo[2,2,2]octilo y hasta 10 unidades nucleotídicas.

Los complejos de la presente invención incluyen un grupo de unión diana capaz de formar un enlace covalente con un compuesto diana para permitir que el complejo marque a la diana, tal como un material vehículo o un compuesto biológico. El grupo de unión diana puede ser un grupo reactivo para reaccionar con un grupo funcional en el material diana. Como alternativa el complejo puede contener un grupo funcional y la diana puede contener el constituyente reactivo.

Adecuadamente, el grupo reactivo se selecciona entre el grupo compuesto por succinimidil éster, isotiocianatos, diclorotriazina, isocianatos, haloacetamida, maleimida, haluros de sulfonilo, haluros de ácido, alquilimido ésteres, arilimido ésteres, hidrazinas sustituidas, hidroxilaminas sustituidas, carbodiimidas y fosforamiditas.

Adecuadamente, el grupo funcional se selecciona entre el grupo compuesto por amino, sulfhidrilo, carboxilo, hidroxilo, carbonilo, tiofosfato.

Adecuadamente, halo- y haluro se seleccionan entre cloro, bromo y yodo, o cloruro, bromuro y yoduro.

Los materiales diana adecuados pueden incluir anticuerpos, antígenos, proteínas, carbohidratos, lípidos, nucleótidos derivatizados para que contengan un grupo amino, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilo, o carbonilo, y oxi o desoxipoliácidos nucleicos derivatizados para que contengan un grupo amino, hidroxilo, tiofosforilo, sulfhidrilo, carboxilo, o carbonilo, células, partículas poliméricas, o perlas de vidrio. En la realización alternativa, la diana puede derivatizarse para que contenga los grupos reactivos identificados anteriormente para formar enlaces covalentes con los grupos funcionales el complejo.

En una segunda realización, los complejos fluorescentes de la invención pueden contener un grupo polimerizable adecuado para la formación de un polímero que contiene el complejo. Los grupos polimerizables adecuados se seleccionan entre acrilato, metacrilato y acrilamida. La polimerización puede realizarse con un complejo adecuadamente derivatizado de la presente invención usado junto con un segundo material de partida monomérico polimerizable, tal como estireno o viniltolueno, para formar un copolímero que contiene el complejo fluorescente.

Como alternativa, los complejos fluorescentes de la invención no necesitan tener un grupo reactivo cuando se usan para unirse de una manera no covalente a otro material. Por ejemplo, el complejo puede incorporarse durante la polimerización o la formación de las partículas o puede absorberse en o sobre las partículas poliméricas.

El complejo puede incluir también constituyentes de solubilización en agua unidos al mismo para conferir características hidrófilas al complejo. Se unen preferiblemente al sistema de anillo aromático del fluorocromo de cianina. Si el colorante de cianina no contiene el constituyente de solubilización en agua, entonces el otro colorante o el resto enlazador puede contener el grupo solubilizador del agua. Los constituyentes para solubilizar el agua no deben ser reactivos con el grupo de unión diana del complejo. Los constituyentes solubilizadores adecuados pueden seleccionarse entre el grupo compuesto por amida, sulfonato, sulfato, fosfato, amonio cuaternario, hidroxilo, guanidinio y fosfonato. Los grupos sulfonato o ácido sulfónico unidos directamente al anillo aromático del fluorocromo de cianina son particularmente preferidos. La solubilidad en agua puede ser necesaria cuando se marcan proteínas y ácidos oxi y desoxinucleicos derivatizados con grupos amino o grupos sulfhidrilo en soluciones acuosas. Como alternativa, una forma polar menos hidrófila del compuesto de transferencia de energía puede unirse de manera no covalente al ADN por intercalado entre los pares de bases o por interacción en el surco menor del ADN. Dichos compuestos pueden ser útiles para cuantificar o localizar el ADN.

Además de la realización de la invención que incluye un único fluorocromo dador y un único fluorocromo aceptor, el complejo marcador fluorescente puede incluir fluorocromos adicionales. Los fluorocromos adicionales deben tener espectros de absorción o emisión que permitan que ocurra la transferencia de energía. Por ejemplo, un tercer fluorocromo puede unirse al segundo fluorocromo. En este ejemplo, la longitud de onda del espectro de emisión del tercer fluorocromo es mayor que la longitud de onda de emisión del segundo fluorocromo, y una porción del espectro de emisión del segundo fluorocromo solapa con una porción del espectro de absorción del tercer fluorocromo para transferir la energía absorbida del primer fluorocromo al segundo fluorocromo al tercer fluorocromo.

En otra realización de la presente invención, el complejo puede incluir una pluralidad de los primeros fluorocromos, cada uno unido covalentemente mediante un resto enlazador al segundo fluorocromo y cada uno capaz, después de excitarse con luz, de transferir energía al segundo fluorocromo. En una realización adicional de la presente invención, el complejo puede incluir una pluralidad de los segundos fluorocromos, cada uno unido covalentemente mediante un resto enlazador a un primer fluorocromo y cada uno capaz de aceptar energía desde el primer fluorocromo cuando el primer fluorocromo es excitado por la luz. La pluralidad de de primer y segundo fluorocromos puede ser la misma molécula o puede ser diferente. Por ejemplo, puede haber diversos fluorocromos dadores siendo cada uno de ellos excitable a diferentes longitudes de onda para acomodarse a diferentes fuentes luminosas de excita-
ción.

En otra realización más de la presente invención, el complejo puede incluir uno o una pluralidad de los segundos fluorocromos, cada uno unido covalentemente mediante un resto enlazador a uno o una pluralidad del primer fluorocromo y cada uno unido covalentemente mediante un resto enlazador a un tercer fluorocromo. La transferencia de energía transcurre en paralelo en estas realizaciones.

El primer fluorocromo preferiblemente tiene un coeficiente de extinción mayor de 20.000 litros/mol.cm y más preferiblemente mayor de 50.000 litros/mol.cm. El segundo fluorocromo tiene un rendimiento cuántico de fluorescencia mayor de o igual a aproximadamente 0,05. El rendimiento cuántico generalmente está relacionado con la rigidez o planaridad de una molécula e indica la propensión de la molécula a fluorescer, es decir, a emitir energía en forma de luz, en lugar de en forma de calor cuando se proporciona energía a la molécula.

Los complejos de la presente invención preferiblemente incluyen al menos un fluorocromo de cianina y preferiblemente al menos un colorante de polimetino cianina. Las cianinas son particularmente útiles debido al amplio intervalo de variaciones estructurales y propiedades espectrales disponibles que pueden obtenerse variando el número de átomos de carbono en el puente de metino, y los heteroátomos u otros constituyentes de los colorantes de cianina. Es posible sintetizar colorantes que tienen longitudes de onda de excitación particulares para corresponder a una fuente de excitación particular, tal como un láser, por ejemplo, un láser de HeNe o un láser de diodo. Por lo tanto, puede hacerse que los marcadores de transferencia de energía absorban y emitan eficazmente a la mayoría de longitudes de onda en la región visible del espectro. Las fuentes de excitación usadas habitualmente excitan a una línea de láser de 488 nm. Mientras se use esta excitación de longitud de onda para los propósitos de la descripción de la invención, los especialistas en la técnica deben entender que pueden prepararse otros marcadores de transferencia de energía para fuentes de excitación específicas sin alejarse del alcance de la invención.

Los ejemplos de colorantes que pueden usarse como fluorocromos dador y aceptor en los complejos de marcado fluorescente de la presente invención se muestran en las fórmulas 2 y 3,

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2

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y en la fórmula (4),

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3

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en la que X se selecciona entre C(CH_{3})_{2}, azufre y oxígeno, R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por CH_{2}NH_{2}, SO_{3}^{-}, CH_{2}COOH y NCS, P se selecciona entre SO_{3}^{-}, NH_{2} y COOH, m = 1, 2, o 3 y n es un entero de 1-5.

Las cianinas adicionales para usar en complejos de la invención son las monometino cianinas rígidas descritas en la solicitud en trámite junto con la presente de Waggoner et al, titulada "Rigidized Monomethine Cyanines", presentada en la misma fecha que este documento. Los colorantes de monometino rígidos tienen la siguiente estructura general (5).

4

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opcionalmente sustituida con de uno a seis grupos R^{2} a R^{7};

donde T es un grupo de unión tal como:

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5

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es un anillo de seis o siete miembros;

X e Y se seleccionan entre carbono bis-sustituido, oxígeno, azufre, selenio, -CH=CH-, y -N-W donde N es nitrógeno y W se selecciona entre hidrógeno y un grupo -(CH_{2})_{n}R^{8} donde n es un entero de 1 a 26 y R^{8} se selecciona entre hidrógeno, amino, aldehído, acetal, cetal, halo, ciano, arilo, heteroarilo, hidroxilo, sulfonato, sulfato, carboxilato, amino sustituido, amino cuaternario, nitro, amida primaria, amida sustituida, y grupos reactivos con grupos amino, hidroxilo, aldehído, fosforilo, o sulfhidrilo;

los grupos Z^{1} y Z^{2} representan los átomos necesarios para completar uno, dos o tres anillos aromáticos condensados, teniendo cada anillo cinco o seis átomos, seleccionados entre átomos de carbono y, opcionalmente, no más de dos átomos de oxígeno, nitrógeno y azufre; y

R^{2} y R^{3} se unen a los átomos de carbono de T cuando T contiene átomos de carbono.

Los colorantes de monometino cianina rígidos tienen señales nítidas distinguibles de absorción y emisión, que son fotoestables. Algunos de los colorantes de monometino cianina rígidos absorben y emiten luz como máximo a longitudes de onda entre 300 y 500 nm.

Otros fluorocromos de bajo peso molecular además de los fluorocromos de cianina pueden seleccionarse entre fluoresceínas, pireno trisulfonatos (que se venden con la marca comercial "Cascada Azul "), rodaminas, y derivados de los colorantes de difluoruro de bis-pirrometino boro, tal como difluoruro de 3,3',5,5'-tetrametil-2,2'-pirrometeno-1,1'-boro, comercializado con la marca comercial BODIPY de Molecular Probes Inc. Los análogos de BODIPY se describen en las Patentes de Estados Unidos Nº 4774339, 5187223, 5248782 y 5274113 (Haugland y Kang), así como en "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", publicado por Molecular Probes Inc.

Para obtener desplazamientos de longitud de onda de excitación-emisión excepcionalmente grandes, es posible usar etapas secuenciales de transferencia de energía en el complejo. Por ejemplo, se han unido tres cromóforos para proporcionar una emisión máxima a la longitud de onda de un colorante de cianina, la heptametino cianina, CY7, (compuesto 4, X=C(CH_{3})_{2}, R^{1}, R^{2}=-SO_{3}^{-}, P=COOH, n=5, m=3), por encima de 780 nm con excitación a 488 nm. El dador inicial fue isotiocianato de fluoresceína y el fluoróforo intermedio en el complejo fue el colorante de trimetino cianina denominado CY3 (compuesto 4, X=C(CH_{3})_{2}, R^{1}=R^{2}=CH_{2}NH_{2}, P=SO_{3}^{-}, n=4, m=1). La fluoresceína se excitó a 488 nm y casi el 100% de su energía en estado excitado se transfirió a la trimetino cianina, que a su vez transfirió aproximadamente el 90% de su energía en estado excitado al CY7 que fluorescía a 782 nm. Se observó la misma eficacia cuando se usó una pentametino cianina CY5 en lugar de CY7, con fluorescencia a 667 nm. El desarrollo de dichos complejos multicromóforo es particularmente útil para sistemas de detección multicolor.

Aunque varios de los complejos muestran una transferencia de energía eficaz, el rendimiento cuántico global de estos complejos marcadores puede mejorarse adicionalmente. Por ejemplo, el uso de colorantes aceptores con rendimiento cuántico mayor que el de CY5 mejoraría el brillo global del complejo.

Los complejos de marcado fluorescente de la invención tienen pesos moleculares bajos y pueden conjugarse fácilmente con anticuerpos, otras proteínas y sondas de ADN. Peso molecular bajo como se usa en este documento significa que el peso molecular combinado de los fluorocromos y el enlazador del complejo está preferiblemente entre aproximadamente 500 y 10000 Dalton, y para los dos complejos fluorocromo, preferiblemente en el intervalo de 1000 a 2500 Dalton. Por lo tanto, estas especies marcadas tendrán una penetración mucho mayor en los entornos intracelulares de lo que es posible con los grandes marcadores de ficobiliproteína usados actualmente. Los complejos fluorescentes de bajo peso molecular de la presente invención deberían apreciarse no sólo para la citometría de flujo, si no también para microscopía confocal con láser y para otros sistemas de detección que requieren detección multicolor con una única longitud de onda excitación.

La invención incluye un reactivo y un método para preparar el reactivo incluyendo la incubación del complejo marcador fluorescente soluble en agua descrito anteriormente con un material vehículo.

La presente invención proporciona también procesos para la preparación de los complejos de marcado fluorescente que comprenden unir covalentemente fluorocromos tales como fluorocromos de cianina a cianinas u otros fluorocromos, por métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica para formar complejos dador-aceptor de transferencia de energía.

Por ejemplo, los complejos de la presente invención en los que la unión contiene una amida o un éster pueden prepararse por la reacción de un compuesto de fórmula (6) con un compuesto de fórmula (7);

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R --- (M) --- COA

\hskip4.3cm

B --- (N) --- R'

(6)

\hskip6.5cm

(7)

en las que R y R' son diferentes fluorocromos; COA es un grupo carboxilo activado o activable; B es NH_{2} o OH; y M y N son independientemente restos alifáticos que contienen alquilo C_{1-12} y que opcionalmente incluyen una o más funcionalidades de unión fenilo, naftilo, amida, éster, o éter. Véase por ejemplo, Mujumdar, R.B. et al, Bioconjugado Chemistry, Vol. 4, pág. 105-111, (1993); Patente de Estados Unidos Nº 5268486 de Waggoner et al, cuya descripción se incorpora a este documento como referencia. Los grupos A adecuados incluyen halo, por ejemplo cloro o bromo, para-nitrofenoxilo, N-hidroxisuccinimidilo, o OCOR'' donde R'' es alquilo C_{1-6}.

Los complejos de la presente invención en los que la unión contiene un grupo amino, éter o tioéter, pueden prepararse por la reacción de un compuesto de fórmula (8) con un compuesto de fórmula (9);

R --- (M) --- B'

\hskip4.5cm

C --- (N) --- R'

(8)

\hskip6.4cm

(9)

en las que R, R', M y N son como se han definido anteriormente; B' es OH, NH_{2}, o SH; y C es un grupo que puede desplazarse por ejemplo yodo, o para-toluenosulfonato. La reacción se realiza adecuadamente en presencia de una base.

Como alternativa, los complejos de la presente invención pueden prepararse acoplando juntos en primer lugar dos precursores colorantes usando un enlazador no conjugado para dar un intermedio representado por la estructura (10).

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Xa --- (L) --- Xb

\hskip7cm

(10)

en la que Xa y Xb son independientemente precursores heterocíclicos sustituidos o no sustituidos y (L) es un grupo enlazador no conjugado que comprende alquilo C_{1-12}, incluyendo opcionalmente uno o más grupos de unión fenilo, naftilo, biciclo[2,2,2]octilo, éter, amina, éster, o amida, o combinaciones de los mismos. Los precursores heterocíclicos adecuados, Xa y Xb se muestran en la Tabla 1, Compuestos I y II. A modo de ejemplo, la síntesis del intermedio (10) en la que el enlazador consta de una cadena alquílica unida a los átomos de nitrógeno de dos unidades de indolnina, puede conseguirse por la reacción con un \alpha,\omega-dihaloalcano, tal como un 1,6-dibromohexano, en un proceso con una o dos etapas de reacción. Adecuadamente, la reacción se realiza a una temperatura elevada tal como de aproximadamente 100-110ºC, en un disolvente inerte tal como xileno. Véase por ejemplo, Hamer, F.M., "The Cyanine Colorants and Compuestos Relacionados", pág. 676, Wiley Interscience (1964).

El intermedio (10) puede usarse después como precursor en la formación, por métodos conocidos en la técnica, de complejos que contienen dos fluoróforos diferentes conectados mediante el enlazador. Véase por ejemplo, Hamer, F.M., "The Cyanine Colorants and Compuestos Relacionados", pág. 118-119, Wiley Interscience (1964).

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la preparación de los complejos de la presente invención y sus propiedades espectrales.

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(Esquema pasa a página siguiente)

Ejemplo 1 Preparación del Complejo CY5-CY7

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Se mezclaron cloruro cianúrico (triclorotriazina) (5 mg), bicarbonato sódico (2 mg), y dimetilformamida purificada (DMF) (0,25 ml) a 0ºC. A esta solución se le añadieron 5 mg de colorante de amino-cianina (Mujumdar et al, Citometry, Vol. 10, pág. 11-19, (1989)), representado anteriormente por la caja que contiene CY5 y la mezcla se agitó a 0ºC durante 10 minutos. Se continuó agitando durante una noche a temperatura ambiente. La cromatografía en capa fina (TLC) puso de manifiesto una mancha más grande y dos manchas más pequeñas; se determinó que estas últimas manchas eran impurezas.

La mezcla de reacción se trató por precipitación con éter. Se obtuvo un polvo azul oscuro. Se añadió DMF (0,3 ml) para disolver el polvo. A esta solución se le añadió bicarbonato sódico (2 mg) y 4,7 mg del colorante amino-CY7 representado por la caja que contiene CY7. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El producto se precipitó y se lavó varias veces con éter, proporcionando un polvo oscuro. El complejo mostró un espectro de absorción con picos para los fluorocromos individuales a 650 nm (CY5) y 761 nm (CY7), indicando que no se había generado cromóforo nuevo.

Ejemplo 2 Síntesis del Complejo 1 y Compuestos Relacionados (véase la Tabla 2) i) Métodos Generales a) Purificación de los Colorantes

La purificación de los fluorocromos se realizó en una unidad de HPLC analítica Spectra-Physics modelo SP8700 equipado con una columna C8-RP. La purificación podría conseguirse también mediante cromatografía en columna convencional o ultrarrápida en polvo C18-RP disponible en el mercado. Se usaron mezclas agua/metanol para la elución en todos los experimentos. Los colorantes se recuperaron de las fracciones por evaporación rotatoria a 60-70ºC sin pérdida apreciable. Para purificación adicional, el fluorocromo, haciendo pasar una composición de contraiones indeterminada a través de una columna Dowex-50W (en forma de hidrógeno).

b) Medidas Espectroscópicas y Determinaciones Analíticas

Se midieron los espectros ultra-violeta/visible con un espectrofotómetro Hewlett-Packard HP8452 con una serie de diodos. Los espectros de RMN con protón se obtuvieron con un espectrómetro IBM 300 FT-RMN usando D_{2}O, CD_{3}OD o DMSO-d_{6} como disolventes. Las señales de RMN se describen en \delta usando s para singlete, d para doblete, t para triplete, c para cuartete y m para multiplete. Las medidas de fluorescencia se realizaron usando un Sistema SPEX Fluorolog 2. Los rendimientos cuánticos se determinaron por técnicas conocidas como se describe en Mujumdar R.B., et al, "Cyanine Colorant Labelling Reagents Containing Isotiocianate Groups", Citometry, Vol. 10, pág. 11-19 (1989).

c) Preparación de las Células y Citometría de Flujo

Los leucocitos mononucleares se obtuvieron en Histopaque, densidad 1,077, separación de voluntarios sanos. La población de linfocitos se seleccionó por citometría de flujo basándose en características de dispersión hacia delante y lateral. Las sub-poblaciones se identificaron usando anticuerpos monoclonales específicos (CD4, tinción células T-adyuvantes y CD3, población de células T). La concentración óptima de anticuerpo marcado con el Complejo 1 se determinó analizando los resultados de una dilución en serie. La inmunofluorescencia directa se consiguió incubando la cantidad recomendada de anticuerpo marcado con 1-2 x 10^{6} células durante 45 minutos a 4ºC. Las muestras se lavaron después dos veces con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contenía suero bovino fetal al 2% y azida sódica al 0,1%. Después del lavado final, las células se resuspendieron en 1 ml de HBSS que contenía paraformaldehído al 1% y se analizaron en una semana. Las medidas de citrometría de flujo se realizaron con un citómetro de flujo Becton Dickinson FACS 440 de doble láser equipado con un sistema de análisis de datos Consort 40. El láser de iones de argón proporcionó 400 mW de excitación a 488 nm. Las señales de fluorescencia del Complejo 1 y R-ficoeritrina se recogieron usando filtros con paso de banda de 670/13,5 nm y 575/26 nm respectivamente.

d) Cálculo de la Eficacia de Inactivación del Dador (DQE)

Las eficacias de transferencia de energía de resonancia se estimaron a partir de la inactivación de las intensidades de fluorescencia del dador. Se obtuvieron los espectros de absorción y fluorescencia del dador (solo) y el complejo marcador fluorescente para determinar las concentraciones relativas de cada uno en los experimentos de fluorescencia. La excitación del dador se usó para obtener los espectros de emisión de ambos compuestos. Después se calculó la DQE usando:

DQE% = (1 - F^{ET}A/FA^{ET}) x 100

en la que F es la intensidad de fluorescencia del dador solo, F^{ET} es la intensidad de fluorescencia del complejo a la longitud de onda del dador, A es la absorbancia a la longitud de onda de excitación del dador solo y A^{ET} es la absorbancia a la longitud de onda de excitación del complejo marcador fluorescente.

e) Síntesis de Fluorocromos

Las amino cianinas (CY3NH_{2}, CY3(NH_{2})_{2} y CY3NH_{2}SO_{3}) y carboxialquil cianinas (CY5COOH, CY3O(SO_{3})_{2},
CY5(SO_{3})_{2} y CY7(SO_{3})_{2}) necesarias como precursores para fluorocromos de transferencia de energía se sintetizaron mediante los métodos descritos anteriormente en Ernst, L.A. et al, "Cyanine Colorant Labelling Reagents for Sulphydryl Groups", Citometry, Vol. 10, pág. 3-10, (1989), Hammer, F.M., "The Cyanine Colorants and Related Compounds", (Wiley, pub. Nueva York 1964), Mujumdar, R.B. et al, "Cyanine Colorant Reagents Containing Isotiocianate Groups", Citometry, Vol. 10, pág. 11-19, (1989); Mujumdar, R.B. et al, "Cyanine Colorant Labelling Reagents: Sulphoindocyanine succinimidil éster", Bioconjugado Chemistry, Vol. 4, pág. 105-111, (1993); Southwick, P.L. et al, "Cyanine Colorant Labelling Reagents: Carboxymethylindocyanine succinimidyl esters", Citometry, Vol. 11, pág. 418-430, (1990). A continuación se describe la síntesis y propiedades de un fluorocromo de amino-cianina, CY3NH_{2}SO_{3} y su conjugación con el succinimidil éster de CY5(SO_{3})_{2} para formar el Complejo 1. Las propiedades espectrales para todos los fluorocromos se muestran en las Tablas 3 y 4. La trimetinocarbocianina no simétrica, CY3NH_{2}SO_{3}, se sintetizó en cuatro etapas. Se remite a la Tabla 1 para las estructuras (I)-(VI).

TABLA 1

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TABLA 1 (continuación)

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1.5.1 Síntesis de 5-ftalimidometil-1-(\varepsilon-carboxipentil)-2,3,3-trimetilindol (III)

La 5-ftalimidometil-2,3,3-trimetilindolnina (II) se sintetizó de acuerdo con el procedimiento de Gale y Wilshire, "The Amidomethylation and Bromination of Fischer's Base. The Preparation of Some New Polymethyne Colorants", Aust. J. Chem., Vol. 30, pág. 689-694, (1977). Se añadió N-hidroximetilftalimida en polvo (70 g, 0,4 mol) en pequeñas porciones durante un periodo de 45 minutos a una solución agitada de 2,3,3-trimetil-(3H)-indolnina (I) (70 g, 0,44 mol) en ácido sulfúrico concentrado (360 ml) a temperatura ambiente. La solución se agitó durante 70 horas a temperatura ambiente antes de verterla sobre agua enfriada con hielo. La basificación de la solución con hidróxido de amonio concentrado dio un polvo amarillo que se filtró y se secó (111 g, rendimiento 80%, p.f. 180-182ºC). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}), \delta, 7,8-7,95 (m, 4H, ftalimido), 7,4 (s, 1H, 4-H), 7,38 (d, 1H, J=9,0 Hz, 6-H), 7,2 (d, 1H, J=9,0 Hz, 7-H), 4,7 (s, 2H, -CH_{2}), 2,2 (s, 3H, CH_{3}), 1,2 (s, 6H, -(CH_{3})_{2}).

Este polvo seco (10 g, 0,03 mol) y ácido 6-bromohexanoico (9,1 g, 0,05 mol) se mezclaron en 1,2-diclorobenceno (25 ml) y se calentaron a 125ºC durante 12 horas en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se enfrió. El 1,2-diclorobenceno se decantó y la masa sólida se trituró con isopropanol hasta que se obtuvo un polvo libre (11 g, rendimiento 80%, p.f. 124-126ºC). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}), \delta, 7,8-7,95 (m, 4H, ftalimido), 7,4 (s, 1H, 4-H), 7,38 (d, 1H, J=9,0 Hz, 6-H), 7,2 (d, 1H, J=9,0 Hz, 7-H), 4,7 (s, 2H, -CH_{2}), 4,5 (t, 2H, J=7,5 Hz, \alpha-CH_{2}), 2,3 (t, 2H, J=7 Hz, \varepsilon-CH_{2}), 1,99 (m, 2H, \beta-CH_{2}), 2,3-1,7 (m, 4H, \gamma-CH_{2} y \delta-CH_{2} fundido con s de 6H-(CH_{3})_{2}).

1.5.2 Síntesis de 1-(\varepsilon-carboxipentil)-2,3,3-trimetilindolninio-5-sulfonato (IV)

El compuesto (IV) se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en Mujumdar, R.B. et al, Bioconjugado Chemistry, (1993), supra. La sal potásica de 2,3,3-trimetilindolninio-5-sulfonato (11 g, 0,04 mol) y ácido 6-bromohexanoico (9,8 g, 0,05 mol) se mezclaron en 1,2-diclorobenceno, (100 ml) y se calentaron a 110ºC durante 12 horas en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se enfrió. Se decantó 1,2-diclorobenceno y la masa sólida se trituró con isopropanol hasta que se obtuvo polvo libre (11 g, rendimiento 80%). \lambdamax (agua) 275 nm: ^{1}H-RMN (D_{2}O), \delta, 8,13 (s, 1H, 4-H), 8,03 (dd, 1H, J=9,0, 1,1 Hz, 6-H), 7,2 (d, 1H, J=9,0 Hz, 7-H), 4,51 (t, 2H, J=7,5 Hz, \alpha-CH_{2}), 2,25 (t, 2H, J=7,5 Hz, \gamma-CH_{2}), 1,99 (m, 2H, \beta-CH_{2}), 1,35-1,66 (m, 4H, \delta-CH_{2}, \gamma-CH_{2}), 1,61 (s, 6H, -(CH_{3})_{2}). R_{f} = 0,55 (C-18, agua-metanol, 25%).

1.5.3 Síntesis del Intermedio (V)

Una solución de 1-(\varepsilon-carboxipentil)-2,3,3-trimetilindolninio-5-sulfonato (IV) (10 g, 0,03 mol) y N,N-dimetilformamida (7,2 g, 0,04 mol) en ácido acético (20 ml) se calentó a reflujo durante 1 hora. El ácido acético se retiró en un evaporador rotatorio y el producto se lavó con acetato de etilo (3x50 ml) obteniéndose de esta manera un sólido pardo oscuro. \lambdamax (agua) 415 nm R_{f} = 0,32 (C-18, 25% metanol en agua). El producto bruto obtenido de esta manera se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional. El sólido (3,8 g) se disolvió en una mezcla de anhídrido acético (10 ml) y piridina (5 ml). Se añadió 5-ftalimidometil-1-(\varepsilon-carboxipentil)-2,3,3-trimetilindol (III) (2,5 g, 6 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 110ºC durante 1 hora. La solución se enfrió y se diluyó con éter dietílico (500 ml). El producto se separó en forma de un polvo rojo del que se retiró el fluido sobrenadante por decantación. Se disolvió en un volumen mínimo de metanol y volvió a precipitarse con 2-propanol. El producto se recogió en un papel de filtro y se secó hasta un rendimiento de 5,3 g del compuesto (V). Se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna en fase inversa C-18 usando una mezcla agua metanol como eluyente, (1,6 g, rendimiento 30%). \lambdamax (agua) 554 nm; e1,3x10^{5} L/mol.cm. ^{1}H RMN (CD_{3}OD), \delta, 8,5 (t, 1H, J = 14 Hz, \beta-protón del puente), 7,8-8,0 (m, 6H, 4 protones del grupo ftalimido y 4-H y 6-H del anillo de sulfoindol), 7,55 (s, 2H, 4'-H), 7,6 (d, 1H, J=12 Hz, 6'-H), 7,3 (dos d, 2H, 7-H y 7'-H), 6,1-6,3 (t, 2H, \alpha,\alpha'-protones del puente), 4,1 (m, 4H, \alpha,\alpha'-CH_{2}-), 2,9 (t, 2H, J = 7 Hz, -CH_{2}COOH), 1,4-2,0 (m, 21H, tres -CH_{2}, un -CH_{3}, y dos -(CH_{3})_{2}, los protones de metilo del grupo ftalimidometilo se funden en una señal de agua a 4,8.

1.5.4 Hidrólisis de (V) para dar (VI)

El compuesto (V) (1 g, 1,1 mmol) se disolvió en ácido clorhídrico concentrado (5 ml) y se calentó a reflujo durante 12 horas. Después de enfriar, el ácido ftálico cristalino se retiró por filtración. El filtrado se concentró con un evaporador rotatorio y después se neutralizó lentamente con hidróxido de amonio concentrado mientras la temperatura se mantenía por debajo de 30ºC. Se obtuvo el fluorocromo CY3NH_{2}SO_{3} (VI) puro por cromatografía en columna en fase inversa usando una mezcla agua-metanol como eluyente. \lambdamax (metanol) 552 nm. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}), \delta, 8,45 (t, J = 7,2 Hz, 1H, 9-H), 7,3-7,9 (m, 6H, protones aromáticos), 6,55 (dd, 2H, 8 y 8'-H), 4,5 (m, 4H, N-CH_{2}), 4,1 (s, 2H, CH_{2}NH_{2}), 2,15 (t, 2H, CH_{2}COOH), \alpha,\alpha'-protones del puente), 4,1 (m, 4H, \alpha,\alpha'-CH_{2}-), 2,9 (t, 2H, J = 7 Hz, -CH_{2}COOH), 1,25-1,8 (ancho m, 24H, dos -(CH_{2})_{2} y 6-C-(CH_{3})_{2}). R_{f} = 0,415 (RP C18 metanol al 60% en agua).

1.5.5 Síntesis del Complejo I

Polvo seco del succinimidil éster CY5(SO_{3})_{2} (425 mg, 0,26 mmol) preparado por el método de Mujumdar et al, Bioconjugado Chemistry, Vol. 4, pág. 105-111, (1993), se añadió en pequeñas porciones a una solución bien agitada de CY3NH_{2}SO_{3} (200 mg, 0,26 mmol) en 10 ml de tampón carbonato-bicarbonato (0,1 M, pH 9,4). Se continuó agitando durante 30 minutos más después de lo cual la reacción se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna en fase inversa en C-18 en polvo usando agua-metanol (6,3:3,7) como eluyente. Se recogieron fracciones de 5 ml y se controlaron por TLC. Las fracciones que contienen ácido CY5(SO_{3})_{2} y CY3NH_{2}SO_{3} se desecharon. Las fracciones de color violeta se comprobaron bajo luz ultravioleta en metanol y las fracciones que contienen el fluorocromo Complejo 1 (Tabla 2) se combinaron. La evaporación del disolvente dio el Complejo 1 en forma de un polvo violeta, (rendimiento 37%). R_{f} = 0,45 (RP 37% metanol-agua). ^{1}H RMN el espectro registrado en D_{2}O mostró señales anchas y fue difícil asignarlas. El fluorocromo se purificó en una columna de intercambio iónico fuertemente ácida (Dowex 50, forma H^{+}). La espectrometría de masas FAB de alta resolución mostró iones (M+H)^{+} a 1391,83 (C_{73}H_{91}N_{5}O_{16}S_{3} +H requiere 1391,73).

1.5.6 Succinimidil Éster del Colorant de Cianina de Transferencia de Energía

El complejo 1 (60 mg, 0,04 mmol) se disolvió en una mezcla de DMF seca (1 ml) y piridina seca (0,05 ml). Se añadió disuccinimidil carbonato (DSC) (46 mg, 0,18 mmol, 1,5 equiv/grupo carboxilo) y la mezcla se agitó a 55-60ºC durante 90 minutos en una atmósfera de nitrógeno. Después de diluir la mezcla con éter dietílico seco (20 ml), el sobrenadante se decantó. El producto se lavó repetidamente con éter, se filtró y se secó al vacío. La formación del succinimidil éster activo se confirmó por su reacción con bencilamina en DMF o su reacción con taurina en un tampón bicarbonato a pH 9,4. Las manchas de TLC en C-18 en fase inversa para el conjugado, el succinimidil éster y el producto carboxilato hidrolizado para comparación se desarrolló con una mezcla agua-metanol (1:1). R_{f} = 0,78 (Ácido), 0,3 (aducto de bencilamina).

1.5.7 Reacción de Succinimidil Ester con Anticuerpo y Eestreptavidina

Una solución madre del fluorocromo succinimidil éster activo Complejo 1 se preparó en DMF seca (1 mg/100 \mul). En una muestra, se disolvió un miligramo (\gamma-globulina de oveja en 0,25 ml de tampón carbonato/bicarbonato (aproximadamente 6,45 nmol/0,25 ml). En otro ejemplo, se disolvió estreptavidina (1 mg) en 0,25 ml del tampón carbonato/bicarbonato. Los volúmenes apropiados de la solución madre de fluorocromo se añadieron a porciones de 0,25 ml de cada solución de proteína para producir las proporciones de partida deseadas de fluorocromo a anticuerpo, y cada mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El conjugado proteico se separó del fluorocromo sin reaccionar en cada muestra por cromatografía de filtración en gel sobre Sefadex G-50 (columna 0,7x20 cm), usando PBS, pH 7,4, que contiene azida al 0,1%. Las proteínas conjugadas con el colorante se eluyeron como bandas coloreadas bien separadas del fluorocromo sin reaccionar. En la Figura 4 se muestra el espectro de excitación normalizado del conjugado Complejo 1-estreptavidina en PBS. En la Figura 5 se muestra el espectro de absorbancia del Complejo 1-IgI de oveja en PBS. La Figura 6 muestra el análisis por citometría de flujo del Complejo 1-estreptavidina usado para detectar el anticuerpo CD3.

Los complejos dador aceptor adicionales de transferencia de energía de acuerdo con la presente invención se prepararon a partir de fluorocromo de cianinas para investigar la eficacia de la transferencia de energía de dichos compuestos. Las estructuras de estos análogos se muestran en la Tabla 2.

Las propiedades espectrales de las cianinas precursoras se dan en la Tabla 3 y las de los complejos se muestran en la Tabla 4.

TABLA 2

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"A" indica el fluorocromo que actúa como aceptor de energía y "D" indica el fluorocromo que actúa como dador de energía.

Los complejos de transferencia de energía mostrados en la Tabla 2 son de la siguiente manera: Complejo 1, CY3NH_{2}SO_{3} (Dador) + CY5(SO_{3})_{2} (Aceptor); Complejo 2, CY3-O(SO_{3})_{2} (Dador) + CY3NH_{2} (Aceptor); Complejo 3, CY3NH_{2} (Dador) + CY5COOH (Aceptor); Complejo 4, CY3NH_{2} (Dador) + CY5(SO_{3})_{2} (Aceptor); Complejo 5, CY3(NH_{2})_{2} (Dador) + CY7(SO_{3})_{2} (Aceptor); Complejo 6, 2 CY3NH_{2}SO_{3} (Dador) + CY5(SO_{3})_{2} (Aceptor).

TABLA 3

Propiedades Espectrales de los Colorantes de Cianina Usados como Precursores para los
Complejos Fluorescentes de Transferencia de Energía de la Invención.
Colorante	Disolvente	Absorción Máxima (nm)	Emisión Máxima (nm)	Rendimiento Cuántico (M)
Colorantes de Cianina que contienen Amina
CY3NH_{2}	Metanol	552	569	0,05
	PBS	548	563	0,05
CY3(NH_{2})_{2}	Metanol	552	569	0,05
	PBS	548	653	0,05
CY3NH_{2}SO_{3}	Metanol	556	573	0,08
	PBS	548	653	0,09
Colorantes de Cianina que contiene Carboxilo
CY5COOH	Metanol	658	685	0,22
	PBS	648	667	0,13
CY5(SO_{3})_{2}	Metanol	658	677	0,4
	PBS	650	667	0,27
CY3-O(SO_{3})_{2}	Metanol	492	506	0,2
	PBS	486	500	0,09
CY7(SO_{3})_{2}	Metanol	758	789	ND^{a}
	PBS	750	777	ND^{a}
^{a}ND significa no determinado. PBS significa solución salina tamponada con fosfato.

La eficacia de transferencia de energía se estimó calculando la cantidad de inactivación de dador fluorescencia que ocurre (DQE) cuando el aceptor está unido. Es posible que ocurra algo de inactivación por rutas distintas a la transferencia de energía de resonancia cuando el aceptor está unido. Sin embargo, el dador de cianina preferido para los complejos de marcado fluorescente de la presente invención son relativamente insensibles a su entorno molecular. Además, la adición de sustituyentes grandes a las trimetino cianinas normalmente aumenta, en lugar de disminuir, su fluorescencia. Por lo tanto, DQE puede ser igual a la eficacia de transferencia de energía. Las eficacias de transferencia de energía estimadas basadas en medidas de DQE variaron entre el 50% y el 99% y los desplazamientos de longitud de
onda entre la absorción máxima del dador y la emisión máxima del aceptor terminal (DI) varió entre 83 nm y 294 nm.

Dos de los Complejos, 1 y 6, son capaces de absorber luz la longitud de onda del láser de argón, 488 nm. El Complejo 1 contiene un único dador y un único single aceptor, y Complejo 6 contiene 2 dadores por cada aceptor. El Complejo 1 tiene 3 grupos carboxilo y el Complejo 6 tiene 4 grupos carboxilo. Estos se convierten en succinimidil ésteres
activos tras la activación. La Figura 2 muestra los espectros de absorción del Complejo 1 y el Complejo 6 en metanol.

El Complejo 1 se seleccionó para realizar estudios adicionales. Como se muestra en las Figuras 3(a) y 3(b), la absorbancia (línea continua) del Complejo 1 varía ligeramente en solución salina tamponada con fosfato (Figura 3(b)) y metanol (Figura 3(a)) aunque la fluorescencia permanece sin cambios. La emisión del componente dador a 572 nm es muy débil comparada con la emisión del aceptor a 675 nm, como sería de esperar cuando la transferencia de energía es eficaz.

La Figura 5 demuestra que los anticuerpos de oveja pueden marcarse fácilmente con el Complejo 1 activado. Se ensayaron los conjugados preparados a partir del Complejo 1 conjugados con IgG de oveja a diversas proporciones colorante:proteína. La menor proporción colorante:proteína se representa mediante la línea que tiene su primer pico (a aproximadamente 270 nm) a 0,8 y la mayor proporción colorante:proteína se representa mediante la línea que tiene su primer pico (a aproximadamente 270 nm) a un poco menor de 0,4. No se observó formación de dímeros que implique a cualquiera de los fluorocromos dador o aceptor con el aumento de las proporciones colorante:proteína. Cada Complejo 1 contiene hasta 3 grupos reactivos. Pueden usarse más grupos reactivos con la condición de que no ocurra reticulación. Es importante usar condiciones de marcado que eviten la reticulación de la proteína que inactiven la fluorescencia. La reticulación por cianinas doblemente activadas se ha observado previamente en Southwick, P.L. et al, "Cyanine Colorant Labelling Reagents: Carboxymethylindocyanine succinimidil esters", Citometry, Vol. 11, pág. 418-430, (1990) y puede minimizarse limitando la concentración de proteína que se va a marcar a aproximadamente 1 mg/ml.

Después de la unión a los anticuerpos, el rendimiento cuántico del complejo se potenció tres veces como se muestra en la Tabla 4. Se cree que esto ocurre debido a la ruta de desactivación sin radicación de ambos componentes CY3 y CY5 del Complejo 1 se reducen debido a su movilidad restringida cuando se unen a la superficie de la proteína. Se sabe que otros medios para restringir la movilidad conformacional aumentan la eficacia de fluorescencia de los fluorocromos de cianina, como se describe en Mujumdar, R.B. et al, "Cyanine Colorant Labelling Reagents: Sulphoindocyanine Succinimidil Ester", Bioconjugate Chemistry, Vol. 4, pág. 105-111, (1993).

De hecho, cuando el Complejo 1 se disolvió en glicerina, el rendimiento cuántico aumentó varias veces, como se muestra en la Tabla 4.

El Complejo Activado 1 puede usarse como marcador fluorescente para experimentos de citometría de flujo de 2 colores con excitación a 488 nm. El gráfico de dispersión se muestra en la Figura 6. Se usaron linfocitos T humanos para comparar el marcador del Complejo 1 con otro reactivo de dos colores, R-ficoeritrina, que también se excita a 488 nm y emite a 575 nm. Se usó estreptavidina marcada con el Complejo 1 (fluorocromo/proteína \sim4) para detectar anticuerpo CD3 biotinilado, que marca todas las células T. En la misma muestra de linfocitos, se usó anti-CD4 marcado con ficoeritrina (PE) para marcar el subconjunto de Células Adyuvantes de las células T. Por lo tanto, en la población total de linfocitos hay una población de células que no contienen CD3 ni CD4 (es decir, CD3 y CD4 negativo, en la población izquierda inferior del gráfico de dispersión bidimensional en la Figura 6), un subconjunto de células CD3-positivas marcadas con el Complejo 1 que no tienen una señal de ficoeritrina (es decir, CD3 positivo y CD4 negativo, mostrado en la población izquierda superior de la Figura 6), y un tercer subconjunto compuesto por células marcadas con el Complejo 1 que están teñidas con ficoeritrina (es decir, CD3 y CD4 positivo, mostrado en la población derecha superior de la Figura 6). Está claro que el Complejo 1 dio la separación inicial de las poblaciones de células positivas y negativas, y que hubo un derrame mínimo sobre la fluorescencia del Complejo 1 hacia el canal de ficoeritrina. El fluorocromo del Complejo 1 dios una señal tres veces más brillante cuando el fluorocromo se excitó a 514 nm.

Ejemplo 3

Se sintetizaron otros varios complejos con la estructura general mostrada en la fórmula (10) a continuación. La Tabla 5 muestra sus propiedades espectrales en solución en metanol.

11

Esta serie de espectros demuestra la transferencia de energía eficaz grandes desplazamientos de Stokes. Cada espectro de emisión muestra sustancialmente toda la emisión que viene desde el fluorocromo aceptor final en cada serie con sólo la emisión mínima desde cada dador de fluoresceína, o la cianina intermedia.

TABLA 4

Propiedades Espectrales de los Complejos de Transferencia de Energía
Colorante	Abs. Máx.	Longitud de onda	Em. máx.	Rto. Cuántico	Energía	Desplazamiento de
	(nm)	de Excitación (nm)	(nm)	(M)	Transferida	Longitud de Onda^{e}
					(%)	(nm)
Complejo 1ª	556 (9,5),	488	675	0,32	91	119
	652 (14,3)	514	676	0,37	92	120
		600	673	0,49	-	-
Complejo 1^{b}	536 (16),	488	675	0,03	89	139
	658 (16)	514	673	0,04	89	137
		600	668	0,21	-	-
Complejo 1^{c}	558, 658	488	674	0,11	95	116
(PBS)		514	673	0,13	95	116
		600	676	0,14	-	-
Complejo 1^{d}	562, 658	488	674	0,19	ND	ND
		514	674	0,32	ND	ND
		600	674	0,39	ND	ND
Complejo 2ª	490 (13),	466	571	0,15	89	81
	554 (9,5)
Complejo 3ª	545 (9,5),	514	679	0,08	83	133
	658 (14,3)
Complejo 4ª	550 (9,4),	514	674	0,2	96	124
	656 (14,2)
Complejo 5ª	445 (9,5),	520	782	ND	99	226
	754 (14,4)
Complejo 6ª	556 (9,5),	488	674	0,23	49	118
	652 (14,4)	514	674	0,24	50	118
		600	674	0,34	-	-
Complejo 6^{b}	548 (20,0)	488	566	0,05	43	118
	652 (15,0)	514	564	0,05	38	116
		600	668	0,23	-	-
^{a} = en metanol,
^{b} = en PBS,
^{c} = Complejo 1 sobre estreptavidina, d/p = 4
^{d} = en glicerina,
^{e} = diferencia entre Em_{max}(A)-Ab_{max}(D)
ND significa no determinado.

12

\newpage

El análisis de múltiples parámetros puede realizarse en múltiples muestras para detectar la presencia de compuestos biológicos diana. Cada muestra se marca mediante métodos de marcado bien conocidos con un complejo diferente. Por ejemplo, una muestra que se cree que contiene un compuesto biológico diana se incuba con un único fluorocromo, tal como fluoresceína, Cascada Azul, un colorante de BODIPY, o uno de los colorantes de monometino rígidos, o CY3O(SO_{3})_{2}, o CY3(SO_{3})_{2}, todos los cuales emiten en un intervalo de longitud de onda de 500-575 nm (de verde a naranja). Una segunda muestra que se cree que contiene el compuesto biológico diana (el mismo compuesto o un compuesto diferente que en la muestra 1), se incuba con un complejo de la invención, por ejemplo fluoresceína-CY3NH_{2}, que absorberá luz a 488 nm y que emite fluorescencia a 574 nm (naranja). Las muestras adicionales que se cree que contienen otro compuesto diana se incuban con otros complejos marcadores de la invención, tales como fluoresceína-CY3-CY5 y fluoresceína-CY3-CY7, iluminándose ambos a 488 nm, pero emitiendo fluorescencia a 672 nm y 782 nm respectivamente (del rojo al infla-rojo cercano). Después de un periodo adecuado para permitir que los marcadores fluorescentes se unan a los compuestos diana, el marcador no unido se retira por lavado y las muestras marcadas se mezclan. La detección es posible con una fuente de excitación de una única longitud de onda, es decir, una línea de láser a 488 nm. Cada muestra marcada de manera diferente fluorescerá en un color diferente a la longitud de onda de emisión de su marcador particular. Los especialistas en la técnica reconocerán que los complejos de marcado fluorescente de la presente invención pueden usarse para una variedad de técnicas inmunofluorescentes, incluyendo inmunoensayos directos e indirectos, y otros métodos de detección fluorescente. Las condiciones de cada incubación, por ejemplo, pH, temperatura y tiempo se conocen en la técnica, aunque generalmente se prefiere temperatura ambiente. Si se hace reaccionar con una amina, se prefiere pH 9,4. El pH se ajusta dependiendo de las condiciones de reacción óptimas para los grupos reactivos particular de acuerdo con técnicas conocidas.

Los complejos de marcado fluorescente pueden usarse para formar reactivos por unión covalente de los complejos al material vehículo, tal como partículas poliméricas, células, perlas de vidrio, anticuerpos, proteínas, enzimas, carbohidratos, lípidos y nucleótidos o ácido nucleicos (ADN y RNA) y análogos que se han derivatizado para incluir al menos un primer grupo reactivo capaz de formar un enlace covalente con el grupo funcional del complejo marcador (o un grupo funcional capaz de formar un enlace covalente con un grupo reactivo del complejo, como se ha descrito anteriormente) y al menos un segundo grupo reactivo (o un grupo funcional, según el caso), que tiene especificidad para, y que es capaz de formar un enlace covalente con, un compuesto biológico diana, tal como anticuerpos, células, fármacos, antígenos, bacterias, virus y otros microorganismos. Cuando el vehículo tiene grupos funcionales, puede ser un anticuerpo o ADN adecuado para la unión al antígeno o a una secuencia complementaria de ADN, respectivamente. Cuando el material vehículo tiene grupos reactivos sobre él, el vehículo puede ser una partícula polimérica o un antígeno adecuado para la unión al ADN o a un anticuerpo, por ejemplo. Las técnicas para la unión covalente de los fluorocromos a las moléculas de vehículo tales como las mencionadas se conocen bien en la técnica y están fácilmente disponibles en la bibliografía. El material vehículo puede incluir adicionalmente nucleótidos derivatizados para contener un grupo amino, sulfhidrilo, carboxilo, carbonilo o hidroxilo, y poliácidos oxi o desoxinucleicos derivatizados para contener un grupo amino, tiofosforilo, sulfhidrilo, carboxilo, carbonilo o hidroxilo. Los grupos funcionales del material vehículo que son complementarios a, es decir, que forman enlaces covalentes con, los grupos reactivos de los complejos marcadores de la invención incluyen grupos amino, sulfhidrilo, carboxilo, carbonilo e hidroxilo.

En la Tabla 6 a continuación se muestra una comparación de los complejos de transferencia de energía de la presente invención con los colorantes de R-ficoeritrina convencionales.

TABLA 6

Complejo 2 frente a R-Ficoeritrina
	R-Ficoeritrina	Complejo 2
Longitud de onda de	488	488
Excitación (nm)
Longitud de onda de	580	578
Emisión (nm)
Citómetro de Flujo con	La fluorescencia PE se redujo en gran medida	Las señales fueron estables en
línea de láser a 488	a pH 8,5 y se extinguió a pH 9,5	todo el intervalo de pH
PM	240000	1667
Tinción	No penetra fácilmente en los tejidos	El anticuerpo marcado penetra en los
	intracelulares para alcanzar el	tejidos intracelulares para alcanzar
	antígeno diana	el antígeno diana
Velocidad de Unión	La velocidad de unión al antígeno es baja	Unión rápida

Los complejos de transferencia de energía de la presente invención proporcionan un conjunto valioso de marcadores fluorescentes que son particularmente útiles para análisis de múltiples parámetros y además, tienen un peso molecular suficientemente bajo para permitir que los materiales marcados con los complejos fluorescentes penetren en todas las estructuras. Como tales, los complejos son bastante adecuados para usar como sondas de ADN. Los complejos de la invención y los reactivos que pueden prepararse a partir de ellos ofrecen una amplia variedad de marcadores fluorescentes con grandes desplazamientos de Stokes. Los especialistas en la técnica reconocerán que los complejos de la invención pueden usarse en diversas aplicaciones de fluorescencia en un amplio intervalo del espectro visible.

Figuras

La Figura 1 es una ilustración esquemática del solapamiento de los espectros de absorción y emisión de cuatro fluorocromos de cianina que pueden usarse en los complejos marcadores de transferencia de energía de la presente invención.

La Figura 2 ilustra los espectros de absorción de dos complejos de marcado fluorescente, el Complejo 1 (línea continua) en metanol, compuesto por un dador de cianina y un aceptor de cianina, y el Complejo 6 (línea discontinua) en metanol, compuesto por dos dadores de cianina y un aceptor de cianina.

Las Figuras 3(a) y (b) ilustran los espectros de absorción (línea continua) y emisión (línea discontinua) del Complejo 1 de la invención preparado con colorante de trimetino y pentametino cianinas en (a) metanol y (b) PBS.

La Figura 4 ilustra los espectros de excitación normalizados del Complejo 1 en PBS (línea continua), metanol (-...-), glicerol (- - -), y el conjugado Complejo 1-estreptavidina en PBS (- - - - - - -).

La Figura 5 ilustra los espectros de absorbancia en PBS de conjugados de IgG de oveja-Complejo 1 a diversas proporciones molécula de colorante:proteína (1-4:1) lo que demuestra que no hay formación de dímero evidente que implique al dador o al aceptor al aumentar la proporción de colorante:proteína.

La Figura 6 ilustra el análisis de citometría de flujo de dos colores de linfocitos humanos marcados con anti-CD4-PE y anti-CD3-estreptavidina-Complejo 1 para marcar el subconjunto de células adyuvantes de las células T y el subconjunto de células T totales, respectivamente, mostrando un subconjunto de células marcadas con el Complejo 1 sin la señal PE y un segundo subconjunto de células marcadas con el Complejo 1 que está teñido con PE.

Claims

1. Un método multiparámetro para detectar los compuestos biológicos diana presentes en múltiples muestras usando un conjunto de diferentes marcadores fluorescentes incluyendo al menos dos marcadores, siendo capaz cada uno de dichos marcadores de ser excitado por una fuente de excitación de una única longitud de onda y emitiendo fluorescencia cada uno de ellos a una longitud de onda diferente, comprendiendo dicho método:

caracterizado porque uno o más marcadores de dicho conjunto de marcadores fluorescentes es un complejo marcador fluorescente que comprende:

i) un primer fluorocromo que tiene primeros espectros de absorción y emisión;

donde dicho grupo de unión diana es un grupo reactivo para reaccionar con un grupo funcional de los compuestos diana; y

donde el peso molecular combinado de dichos primer y segundo fluorocromos y dicho enlazador es menor de aproximadamente 20.000 Dalton.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho conjunto de marcadores fluorescentes comprende un único fluorocromo seleccionado entre fluoresceína, Cascada Azul, un colorante BODIPY y un colorante de cianina.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 y la reivindicación 2 en el que dicho primer y segundo fluorocromos en dicho uno o más complejos marcadores fluorescentes se seleccionan entre fluoresceína, trisulfonatos de pireno, rodaminas, colorantes de cianina y derivados de colorantes de difluoruro de bis-pirrometino boro.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que al menos uno de dichos primero o segundo fluorocromo en dicho uno o más complejos marcadores fluorescentes es un colorante de cianina.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que dichos complejos marcadores fluorescentes comprenden adicionalmente constituyentes solubilizadores del agua unidos a los mismos, no siendo reactivos dichos constituyentes solubilizadores del agua con dicho grupo de unión diana, donde dichos constituyentes solubilizadores del agua se seleccionan entre el grupo compuesto por amida, sulfonato, sulfato, fosfato, amonio cuaternario, hidroxilo, guanidino y fosfonato.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho grupo reactivo se selecciona entre el grupo compuesto por succinimidil éster, isotiocianato, isocianato, haloacetamida, diclorotriazina, maleimida, haluro de sulfonilo, alquilimidoéster, arilimidoéster, hidrazina sustituida, hidroxilamina sustituida, carbodiimida, haluro de acilo, anhídrido, fosforamidita, acrilato y acrilamida.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que dicho complejo marcador fluorescente se selecciona entre: Complejo 1, CY3NH_{2}SO_{3} (Dador) + CY5(SO_{3})_{2} (Aceptor); Complejo 2, CY3-O(SO_{3})_{2} (Dador) + CY3NH_{2} (Aceptor); Complejo 3, CY3NH_{2} (Dador) + CY5COOH (Aceptor); Complejo 4, CY3NH_{2} (Dador) + CY5(SO_{3})_{2} (Aceptor); Complejo 5, CY3(NH_{2})_{2} (Dador) + CY7(SO_{3})_{2} (Aceptor); Complejo 6, 2 CY3NH_{2}SO_{3} (Dador) + CY5(SO_{3})_{2} (Aceptor).

\newpage

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que uno o más de dichos complejos marcadores fluorescentes comprenden adicionalmente un tercer fluorocromo que tiene un tercer espectro de absorción y emisión unido covalentemente a dicho segundo fluorocromo; la longitud de onda de la emisión máxima de dicho tercer fluorocromo es mayor que la longitud de onda de la emisión máxima de dicho segundo fluorocromo y una porción del espectro de emisión de dicho segundo fluorocromo solapa con una porción del espectro de absorción de dicho tercer fluorocromo de manera que la excitación de dicho primer fluoróforo produce fluorescencia a partir de dicho tercer fluorocromo.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que dicho complejos marcadores se seleccionan entre fluoresceína-CY3NH_{2}, fluoresceína-CY3-CY5 y fluoresceína-CY3-CY7.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que dichos compuestos biológicos diana se seleccionan entre el grupo compuesto por anticuerpos, lípidos, proteínas, carbohidratos, nucleótidos derivatizados para contener un grupo amino, hidroxilo, sulfhidrilo, carbonil., hidroxilo y carboxilo, grupos fosfato y tiofosfato y poliácidos oxi y desoxinucleicos derivatizados para contener un grupo amino, sulfhidrilo, carbonilo, hidroxilo y carboxilo, fosfato y tiofosfato.